CN102046661A

CN102046661A - 多肽-聚合物偶联物和其使用方法

Info

Publication number: CN102046661A
Application number: CN2009801201240A
Authority: CN
Inventors: K·E·希利; S·T·沃尔; K·萨哈
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California San Diego UCSD
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2011-05-04
Also published as: JP2017122092A; JP2011517451A; US9925237B2; US9428561B2; EP2268673B1; WO2009120893A3; AU2009228217A1; US11291707B2; EP2268673A4; KR101694405B1; US20180325999A1; WO2009120893A2; US10350267B2; US20170112899A1; JP2015091828A; US20220265763A1; CA2719250A1; EP2268673A2; ES2656350T3; CA2719250C

Abstract

本发明提供多肽-聚合物偶联物。也提供主题多肽-聚合物偶联物的各种应用。

Description

多肽-聚合物偶联物和其使用方法

交叉参考

本申请要求2008年3月28日提交的美国临时专利申请61/040,556的优先权，通过引用将该申请全文纳入本文。

背景技术

使用化学系链产生固相形式的生物学活性物质是各种医疗和生物学应用中的广泛主题。可使用化学系链将生物学活性肽或蛋白质连接于表面、将生物学活性赋予多孔性或水凝胶植入物、或用于药物递送应用。固相递呈可改变生物学活性分子在生物环境中的作用方式。

发明概述

附图说明

图1描绘了将重组蛋白(Shh，sonic hedgehog)嫁接于聚合物透明质酸(HyA)的生物偶联物方案。

图2A和2B描绘了Shh以及它与聚(丙烯酸)(pAAc)(图2A)和HyA(图2B)的偶联产物的凝胶电泳。

图3描绘了Shh信号转导途径和提出的Shh的多价性影响其生物学活性的机理的示意图。

图4描绘了可溶性Shh(◆，粗线)，可溶性Shh和可溶性HyA(■，虚线)，以及化学计量比为0.6∶1(△)、3.5∶1(○)、7∶1(◇)、14∶1(□)和22∶1(x)的Shh-HyA偶联物的C3H10T1/2生物学活性结果。

图5A-C代表阴性对照样品(图5A)、游离的可溶性Shh(图5B)和14∶1Shh/HyA多价形式(图5C)的鸡胚尿囊膜(CAM)反应的一系列显微照片。

图6描绘了通过对CAM实验的显微照片进行图像分析获得的血管新生定量结果。

图7描绘了在C3H10T1/2细胞中Shh-HyA偶联物的生物学活性的数值模型结果。上图代表在掺入空间相互作用的模型中，活性与Shh浓度的关系，其中化学计量比为1∶1-30∶1。下图代表在两个模型和实验组中，EC₅₀与取代水平的关系图。

定义

术语“肽”“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度氨基酸的多聚形式，可包含编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽主链的多肽。术语“多肽”包括融合蛋白，包括但不限于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合蛋白，具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫学标记的蛋白质等。术语“多肽”包括含有一个或多个脂肪酸部分、脂质部分、糖部分和碳水化合物部分的多肽。术语“多肽”包括翻译后修饰的多肽。

本文所用术语“共聚物”指含有多于一种亚基类型的聚合物。该术语包括具有两种、三种、四种、五种或六种亚基类型的聚合物。

术语“对象”、“个体”、“宿主”或“患者”在本文中可互换使用，指任何哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个成员。因此，对象和患者包括但不限于，人、非人灵长动物、犬、猫、有蹄类(如马、牛、猪(如家猪))、禽类、啮齿类(如大鼠、小鼠)和其他对象。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如非人灵长动物、鼠科动物(如小鼠、大鼠)、兔类动物等可用于实验研究。

“治疗”病症和疾病包括：(1)预防该病症的至少一种症状，即使得可能暴露于或倾向于发生该疾病，但尚未经历或显示该疾病的症状的哺乳动物不显著发生该疾病的症状，(2)抑制该疾病，即阻滞或降低该疾病或其症状的发展，或(3)缓解该疾病，即引起该疾病或其临床症状的消退。

“治疗有效量”或“有效量”指在一个或多个剂量中，与其它药物联合给予或单独给予哺乳动物或其它对象治疗疾病时，足以治疗这种疾病的化合物的用量。“治疗有效量”取决于化合物、疾病及其严重程度、所治疗对象的年龄、体重等。

本文所用术语“单位剂型”指适合作为单一剂量用于人或动物对象的物理上独立的单位，各单位含有预定量的本发明化合物和药学上可接受的稀释剂、载体或运载体，该预定量经计算足以产生所需效果。本发明新型单位剂型的规格依赖于所用的具体化合物和要达到的效果，以及各化合物在宿主中的相关药效学性质。

术语“生理条件”包括与活细胞相容的条件，例如温度、pH、盐度等与活细胞相容的基本为水性的条件。

“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的辅料”指用于制备通常安全、无毒、没有不良的生物学或其它性质的药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和辅料，包括对于兽医应用和人体药物应用而言可接受的赋形剂、稀释剂、载体和辅料。说明书和权利要求书中所用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和辅料”包括这类赋形剂、稀释剂、载体和辅料中的一种和一种以上。

在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。应理解，本文所用术语的目的只是描述具体实施方式，不应为限制性，因为本发明范围仅受所附权利要求书的限制。

应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它标称或间插数值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，排除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。本文所述的所有发表物通过引用纳入本文，以公开或描述与所引用发表物有关联的方法和/或材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“一种合成基材”包括多种这类基材，提到“一种重组多肽”包括本领域技术人员已知的一种或多种重组多肽和其等同物，等等。还注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选要素。同样，这种说明应用作引用权利要求元素相关地使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等，或使用“负”限制的前提基础。

本文讨论的发表物只是因为其公开日期早于本申请申请日。本文中没有任何内容可被解释为承认本发明因在先发明而不早于这篇发表物。另外，所提供的发表日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独验证。

发明详述

本发明提供多肽-聚合物偶联物，其中这类偶联物具有受控的连接化学计量性质。也提供主题多肽-聚合物偶联物的各种应用。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物具有下式：

X-(Y)_n-Z，

其中X是生物活性多肽；

Y是任选的接头部分，以使n为0或1到约10的整数；和

Z是包含约50-100,000个亚基的生物相容性聚合物。

相对于可溶形式多肽的活性，如相对于未偶联于该聚合物的多肽的活性，偶联于聚合物基材的多肽的生物学活性提高。在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽的生物学活性比可溶(未偶联)形式多肽的生物学活性高至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或1000倍以上。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽的生物学活性比以1∶1摩尔比偶联于聚合物的多肽的生物学活性高至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或1000倍以上。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽的生物学活性比与聚合物混合的多肽的生物学活性高至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或1000倍以上。

例如，在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽的EC₅₀比可溶(未偶联形式)的多肽的EC₅₀低至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或1000倍以上。

不难利用合适的生物学活性实验测定主题多肽-聚合物偶联物的多肽的生物学活性是否相对于可溶(未偶联)形式多肽的生物学活性提高。

所述多肽与聚合物的摩尔比可以是约5∶1至约100∶1、例如约5∶1至约7∶1、约7∶1至约10∶1、约10∶1至约12∶1、约12∶1至约15∶1、约15∶1至约20∶1、约20∶1至约25∶1、约25∶1至约30∶1、约30∶1至约35∶1、约35∶1至约40∶1、约40∶1至约45∶1、约45∶1至约50∶1、约50∶1至约60∶1、约60∶1至约70∶1、约70∶1至约80∶1、约80∶1至约90∶1或约90∶1至约100∶1。

例如，当主题多肽-聚合物偶联物包含诱导血管新生的多肽(如，该多肽是血管新生多肽)时，在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的血管新生多肽诱导的新生血管比与聚合物混合的、可溶(未偶联)形式的或以1∶1摩尔比偶联于聚合物的血管新生多肽诱导的新生血管多至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍或1000倍以上。

聚合物

偶联生物活性多肽的合适聚合物包括含有约50个亚基至约100,000个亚基，例如约50个亚基至约100个亚基、约100个亚基至约500个亚基、约500个亚基至约1,000个亚基、约1,000个亚基至约5,000个亚基、约5,000个亚基至约10,000个亚基、约10,000个亚基至约25,000个亚基、约25,000个亚基至约50,000个亚基或约50,000个亚基至约100,000个亚基的生物相容性聚合物。在一些实施方式中、所述直链聚合物包含100,000个以上亚基。

亚基可以全部相同，例如该聚合物是均聚物。在其它实施方式中，存在多于一种亚基，例如，该聚合物是杂聚物或共聚物。在一些实施方式中，该聚合物是直链聚合物。在其它实施方式中，该聚合物可包括一条或多条支链。

合适的聚合物包括天然聚合物、半合成聚合物和合成聚合物。

合适的天然聚合物包括透明质酸、胶原、粘多糖、纤维素、多糖等。

合适的半合成聚合物包括但不限于：与醛或其前体交联的胶原、二羧酸或其卤化物、二胺、纤维素衍生物、透明质酸、壳多糖、壳聚糖、结冷胶、黄原胶、果胶或果胶酸、聚糖(polyglycans)、甘露聚糖(polymannan)、琼脂、琼脂糖、天然树胶和葡糖胺基葡聚糖。

合适的合成聚合物包括但不限于衍生自下述化合物的聚合物或共聚物：聚二

烷、聚磷腈、聚砜树脂、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸)丁酯、聚(乙二醇)、聚(丙烯)、聚氨酯树脂、聚(甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)-甲酯、聚(甲基丙烯酸)-正丁酯、聚(甲基丙烯酸)-叔丁酯、聚四氟乙烯、聚全氟丙烯、聚N-乙烯基咔唑、聚(甲基异丙烯酮)、聚α甲基苯乙烯、聚乙烯乙酸酯、聚(氧甲烯)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚氨酯、聚(乙烯基醇)和聚对苯二甲酸乙二醇酯；乙烯乙烯醇共聚物(通常称作商品名EVOH或商品名EVAL)；聚甲基丙烯酸丁酯；聚(羟基戊酸酯)；聚(L-乳酸)；聚己酸内酯；聚(丙交酯-乙交酯共聚物)；聚(羟基丁酸酯)；羟基丁酸酯-戊酸酯共聚物；聚二

烷酮；聚原酸酯；聚酐；聚(乙醇酸)(PGA)；聚(D，L-乳酸)(PLA)；PGA和PLA的共聚物；乙醇酸-三亚甲基碳酸酯共聚物；聚磷酸酯；聚磷酸酯聚氨酯；聚(氨基酸)；氰基丙烯酸酯；聚三亚甲基碳酸酯；聚(碳酸亚胺酯)；(醚-酯)共聚物(如PEO/PLA)；聚草酸亚烷基酯；聚磷腈；聚氨酯；硅酮；聚酯；聚烯烃；聚异丁烯和乙烯-α烯烃共聚物；丙烯酸类聚合物和共聚物；卤乙烯聚合物和共聚物、如聚氯乙烯；聚乙烯醚、如聚乙烯基甲醚；聚偏二卤乙烯、如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯基芳族化合物、如聚苯乙烯；聚乙烯酯、如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体相互形成和与烯烃形成的共聚物、如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；聚酰胺、如尼龙66和聚己内酰胺；醇酸树脂；聚碳酸酯；聚氧甲烯；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚氨酯；人造丝；人造丝-三乙酸酯；纤维素；纤维素乙酸酯；纤维素丁酸酯；纤维素乙酸丁酸酯；玻璃纸；硝酸纤维素；纤维素丙酸酯；纤维素醚；无定形特氟龙；和羧甲基纤维素。

生物活性多肽偶联的聚合物可包括多个选自下组的亚基：透明质酸、丙烯酸、乙二醇、乙烯基、丙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、四氟乙烯、甲醛、糖(如葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯糖等)、牛磺酸、甜菜碱、改性纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、改性淀粉、疏水改性淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、氧化淀粉、氨基酸和任何上述物质的共聚物。在一些实施方式中，该聚合物不包含氨基酸。

在一些实施方式中，该聚合物是透明质酸或透明质酸衍生物。透明质酸衍生物包括例如，部分或所有羧基官能团被脂肪族、芳香族、芳基脂肪族、环脂肪族或杂环系列的醇酯化的透明质酸酯；与透明质酸或透明质酸的偏酯或全酯形成的琥珀酸半酯或琥珀酸半酯的重金属盐；硫酸化或N-硫酸化透明质酸。

多肽

主题多肽-聚合物偶联物的多肽组分具有生物学活性，例如，在体内和/或体外具有一种或多种生物学活性。生物学活性包括例如，抗原结合；在真核细胞中激活信号传导途径；诱导细胞增殖；诱导细胞分化；诱导血管新生；诱导凋亡；诱导血管新生；抑制血管新生；减少凝集；减少细胞粘附；提高细胞粘附；控制细胞命运；等。

主题多肽-聚合物偶联物的多肽组分可以是天然产生的多肽、重组多肽或合成多肽。所述多肽可包含一个或多个非氨基酸部分，如脂质部分、糖部分、碳水化合物部分等。

在一些实施方式中，将一种多肽连接于聚合物，例如将具有相同氨基酸序列的多个多肽连接于聚合物。在其它实施方式中，将两种或多种多肽连接于聚合物，其中第一多肽具有第一氨基酸序列，第二多肽具有不同于第一氨基酸序列的第二氨基酸序列(例如，第二氨基酸序列与第一氨基酸序列的相同性为约95％-99％、约90％-95％、约85％-90％、约80％-85％、约75％-80％、约70％-75％、约65％-70％、或小于65％)。例如，所述第一和第二多肽可靶向不同的细胞表面受体，例如，第一多肽可通过整联蛋白受体提供细胞粘附，第二多肽可活化结合的细胞，例如通过生长因子受体等。在另一实例中，在目标全能、多潜能和多能祖细胞中，第一和第二多肽可诱导细胞分化，例如，第一和第二多肽均可诱导肌生成，第一和第二多肽均可诱导心肌生成，第一和第二多肽均可诱导神经发生，第一和第二多肽均可诱导祖细胞分化成软骨细胞，或者第一和第二多肽均可诱导血细胞生成。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽组分是重组多肽，例如，该多肽包括通常不以酰胺键连接于该多肽的一个或多个氨基酸。例如，可工程改造该多肽以包含有利于连接于多肽-聚合物偶联物的聚合物组分的氨基酸。例如，可工程改造该多肽以包含有利于连接于多肽-聚合物偶联物的聚合物组分的半胱氨酸残基。

该多肽的大小范围可以是从2kDaa至约2000kDa，例如约2kDa至约5kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约25kDa、约25kDa至约50kDa、约50kDa至约100kDa、约100kDa至约250kDa、约250kDa至约500kDa、约500kDa至约1000kDa、约1000kDa至约2000kDa。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物的多肽组分包含可检测标记物。合适的标记物包括例如，放射性同位素(如¹²⁵I；³⁵S等)；其产物产生可检测信号的酶(如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)；荧光标记物(如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白等)；通过金属螯合基团如EDTA连接于抗体的荧光发射金属如¹⁵²Eu，或者其它镧系元素；化学发光化合物，如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶

盐等；生物发光化合物，如萤光素；荧光蛋白(如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)；等。

可用于连接于聚合物以产生主题多肽-聚合物偶联物的感兴趣多肽包括例如生长因子、受体、受体的多肽配体、酶、抗体、凝集因子、抗凝集因子、血管新生因子、抗-血管新生因子等。合适的多肽包括直链多肽和环状多肽。合适的多肽包括天然产生的多肽、合成多肽等。

合适的多肽包括但不限于：干扰素(如IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-ω；IFN-τ)；胰岛素(如诺和灵、优泌林、优泌乐、来得时、特慢胰岛素等)；红细胞生成素(“EPO”；如普罗科

易普莱克斯

或易普基(依泊汀-α)；阿耐斯普

(达贝泊汀-α)；新雷克猛

易普金

(依泊汀-β)等)；抗体(如单克隆抗体)(如利妥昔

(利妥昔单抗)；雷米克得

(英夫利昔单抗)；贺赛汀

(曲妥珠单抗)；休米拉(Humira)^TM(阿达木单抗)；仙莱尔

(奥马珠单抗)；贝克萨

(托西莫单抗)；拉普替瓦(Raptiva)^TM(依法利珠单抗(efalizumab))；艾比特斯^TM(西妥昔单抗)；等)、包括单克隆抗体的抗原结合片段；血液因子(如、

(阿替普酶)组织纤溶酶原激活物；诺瓦赛文

(重组人因子VIIa)；因子VIIa；因子VIII(如克肌内特

)；因子IX；β-珠蛋白；血红蛋白；等)；集落刺激因子(如纽迫基(非格司亭；G-CSF)；纽拉斯塔(Neulasta)(培非司亭)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、巨核细胞集落刺激因子；等)；生长激素(例如、促生长素、如健豪宁

纽托品

诺德人体生长激素

恩增

斯洛替姆

优猛茁

等；人生长激素；等)；白介素(如IL-1；IL-2，包括例如阿地白介素

IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9；等)；生长因子(如雷格耐斯

(贝卡普勒明(beclapermin)；PDGF)；菲普拉斯(曲弗明；bFGF)；斯特基(安西司亭；干细胞因子)；角质形成细胞生长因子；酸性成纤维细胞生长因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等)；受体(如结合TNF-α的可溶性受体如恩利

(依那西普)；VEGF受体；白介素受体；γ/δT细胞受体等)；神经递质受体(如烟酸乙酰基胆碱受体、谷氨酸受体、GABA受体等)；酶(如α-葡糖苷酶；塞拉酶(伊米苷酶；β-葡糖脑苷脂酶、西利酶(阿糖脑苷酶)；酶激活物(如组织纤溶酶原激活物)；趋化因子(如IP-10；Mig；Groα/IL-8、RANTES；MIP-1α；MIP-1β；MCP-1；PF-4；等)；血管新生剂(如血管内皮生长因子(VEGF)；抗血管新生剂(如VEGF受体)；神经活性肽如缓激肽、胆囊收缩素、胃泌素、促胰液素、催产素、促性腺素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、促生长素抑制素、促乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、神经降压肽、促胃动素、促甲状腺激素、神经肽Y、黄体生成素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、加压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽等；其他蛋白质如血栓溶解剂、心房利钠肽、骨形态发生蛋白、血小板生成素、松弛素、胶质细胞原纤维酸性蛋白、促卵泡激素、人α-1抗胰蛋白酶、白血病抑制因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、黄体生成素、巨噬细胞活化因子、肿瘤坏死因子、嗜中性粒细胞趋化因子、神经生长因子、金属蛋白酶的组织抑制剂；血管活性肠肽、血管生成素、促血管素、纤维蛋白；水蛭素；白血病抑制因子；IL-1受体拮抗剂(如金奈特

(阿那白滞素))；离子通道、如、囊性纤维化跨膜通道调节因子(CFTR)；抗肌萎缩蛋白；肌养相关蛋白、肿瘤抑制蛋白；溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)；等。

合适的多肽包括sonic hedgehog蛋白(Shh)、骨形态发生蛋白-4、白介素-3(IL-3)、干细胞因子-1(SCF-1)、fms-样酪氨酸激酶-3(Flt3)配体、白血病抑制因子(LIF)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和表皮生长因子(EGF)。合适的多肽包括脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-5(NT-5)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)和蛋白酶微管连接蛋白-1。合适的血管新生多肽包括神经生长因子-1多肽、血管内皮生长因子(VEGF)多肽、血小板衍生生长因子(PDGF)多肽、成纤维细胞生长因子(FGF)多肽和促血管生成素多肽。

合适的多肽也包括凝集因子，如凝血酶等。合适的多肽也包括抗凝剂。合适的多肽也包括细胞结合多肽。

合适的多肽也包括例如，干蛋白、波形蛋白、普罗敏蛋白(Prominin)/CD133、Sonic hedgehog蛋白和其他hedgehog配体、Wnt配体、神经聚糖/生腱蛋白C、Nurr 1、Pax-6、Sox-2、Musashi-1、NG2/CSPG-4、NeuroD3、神经发生素1以及这些多肽的活性片段和子序列。

合适的多肽还包括例如，β微管蛋白III、MAP2、神经元特异性烯醇酶、NCAM、CD24、HAS、突触蛋白I、突触小泡蛋白、CAMK Iia、酪氨酸羟化酶、谷氨酸转运蛋白、谷氨酸受体、胆碱受体、烟酸A2、EphB2、GABA-A受体、5-羟色胺(5HT-3)受体、胆碱乙酰基转移酶、以及上述序列的片段和子序列。

合适的多肽还包括例如，钙通道；T-细胞抗原受体；趋化因子受体；钾通道；神经递质受体(如5-羟色胺受体；GABA受体；谷氨酸受体；烟酸乙酰基胆碱受体；等)；生长因子受体(如表皮生长因子受体；血管内皮生长因子受体等)；骨形态发生蛋白；激活细胞信号传导途径的多肽；等。

主题多肽-聚合物偶联物的多肽组分具有生物学活性。本领域技术人员不难通过设计用于检验特定生物学活性的许多熟知实验确定给定多肽受否具有该生物学活性。测定特定生物活性多肽的有用实验的例子包括但不限于：GMCSF(Eaves，A.C.和Eaves C.J.，培养中的促红细胞生成素(Erythropoiesisin culture).刊于：McCullock E A(编)《细胞培养技术-血液临床学》(Cellculture techniques--Clinics in hematology).W B Saunders，Eastbourne，第371-91页(1984)；Metcalf，D.，International Journal of Cell Cloning 10：116-25(1992)；Testa，N.G.，等，造血生长因子测定(Assays for hematopoietic growth factors)，刊于：Balkwill F R(编)《细胞因子，实践方法》(Cytokines A practical Approach)，第229-44页；IRL牛津出版社，1991)EPO(生物试验(bioassay)：Kitamura等，J.Cell.Physiol.140 p323(1989))；水蛭素(血小板凝集实验：Blood CoagulFibrinolysis 7(2)：259-61(1996))；IFN α(抗-病毒实验：Rubinstein等，J.Virol.37(2)：755-8(1981)；抗增殖实验：Gao Y等，Mol Cell Biol.19(11)：7305-13(1999)；和生物实验：Czarniecki等，J.Virol.49 p490(1984))；GCSF(生物实验：Shirafuji等，Exp.Hematol.17p116(1989)；鼠NFS-60细胞的增殖(Weinstein等，Proc Natl Acad Sci 83：5010-4(1986))；胰岛素(3H-葡萄糖摄取实验：Steppan等，Nature 409(6818)：307-12(2001))；hGH(Ba/F3-hGHR增殖实验：J ClinEndocrinol Metab 85(11)：4274-9(2000)；生长激素国际标准：Horm Res，51期增刊1：7-12(1999))；因子X(因子X活性实验：Van Wijk等Thromb Res22：681-686(1981))；因子VII(采用前凝血酶凝集时间的凝集实验：Belaaouaj等，J.Biol.Chem.275：27123-8(2000)；Diaz-Collier等，Thromb Haemost 71：339-46(1994))。

本领域已知用于活化细胞信号传导途径的实验。本领域已知用于诱导细胞增殖的实验，它们包括例如，³H-胸苷摄取实验等。用于诱导血管新生的实验包括例如，鸡胚尿囊膜(CAM)实验、体外内皮细胞实验、基质胶实验、圆盘血管新生系统等。本领域已知用于诱导细胞分化的实验，包括检测与分化细胞类型有关的基因产物的实验。

接头

如上所述，在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物包含将多肽连接于聚合物的接头基团。合适的接头包括肽接头和非肽接头。

接头肽可具有各种氨基酸序列。示范性肽接头的长度约为6-40个氨基酸，或者约为6-25个氨基酸。示范性接头包括聚(甘氨酸)接头(如(Gly)_n，其中n是2-约10的整数)；包含Gly和Ser的接头；等。

偶联

可利用各种偶联方法和化学方式将多肽偶联于聚合物。可采用多种零长度的、同质-双功能和异质-双功能交联试剂。零长度交联试剂包括将两个内在的化学基团直接偶联而不引入外源物质。催化形成二硫键的试剂属于这一类别。另一个例子是诱导羧基和伯氨基缩合形成酰胺键的试剂，如碳二亚胺、氯甲酸乙酯，伍德沃德试剂K(Woodward′s reagent K)(2-乙基-5-苯基异

唑

-3′-磺酸盐)和羰二咪唑。同质-和异质-双功能试剂通常分别含有两个相同或两个不同的位点，它们可能与氨基、巯基、胍基、吲哚或非特定基团反应。

在一些实施方式中，该聚合物包含与多肽上或接头上的伯胺基团反应的氨基反应性基团。合适的氨基反应性基团包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨酸酯、异氰酸酯、酰基卤、芳基叠氮、对硝基苯基酯、醛和磺酰氯。

在一些实施方式中，聚合物包含巯基反应性基团，例如用于与多肽中的半胱氨酸残基反应。合适的巯基反应性基团包括但不限于：马来酰亚胺、烷基卤、吡啶基二硫化物和硫代邻苯二甲酰亚胺。

在其它实施方式中，将可溶于水和有机溶剂的碳二亚胺用作羧基反应性试剂。这些化合物能与游离羧基反应形成假脲，然后可偶联于可获得的胺，产生酰胺连接。

如上所述，在一些实施方式中，用同质双功能交联剂将多肽偶联于聚合物。

在一些实施方式中，同质双功能交联剂可与伯胺反应。可与伯胺反应的同质双功能交联剂包括NHS酯、亚氨酸酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基卤、芳基叠氮、对-硝基苯基酯、醛和磺酰氯。

同质双功能NHS酯的非限制性例子包括二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基-DST)、双2-(琥珀酰亚胺基氧基羰氧基)乙基砜(BSOCOES)、双2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基羰氧基)乙基砜(磺基-BSOCOES)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯(DSP)和二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯(磺基-DSP)。同质双功能亚氨酸酯的非限制性例子包括丙二酸亚氨酸二甲酯(dimethyl malonimidate，DMM)、琥珀酸亚氨酸二甲酯(dimethyl succinimidate，DMSC)、己二酸亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate，DMA)、庚二酸亚氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate，DMP)、辛二酸亚氨酸二甲酯(dimethyl suberimidate，DMS)、二甲基-3，3′-氧基二丙酸亚氨酸酯(dimethyl-3，3′-oxydipropionimidate，DODP)、二甲基-3，3′-(亚甲基二氧)二丙酸亚氨酸酯(dimethyl-3，3′-(methylenedioxy)dipropionimidate，DMDP)、二甲基-，3′-(二亚甲基二氧)二丙酸亚氨酸酯(dimethyl-，3′-(dimethylenedioxy)dipropionimidate，DDDP)、二甲基-3，3′-(四亚甲基二氧)二丙酸亚氨酸酯(dimethyl-3，3′-(tetramethylenedioxy)dipropionimidate，DTDP)和二甲基-3，3′-二硫代二丙酸亚氨酸酯(dimethyl-3，3′-dithiobispropionimidate，DTBP)。

同质双功能异硫氰酸酯的非限制性例子包括：对-亚苯基二异硫氰酸酯(DITC)和4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸芪(DIDS)。同质双功能异氰酸酯的非限制性例子包括二甲苯-二异氰酸酯、甲苯-2，4-二异氰酸酯、甲苯-2-异氰酸酯-4-异氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲基-4，4′-二异氰酸酯、2，2′-二羧基-4，4′-苯偶氮基二异氰酸酯和六亚甲基二异氰酸酯。同质双功能芳基卤的非限制性例子包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜。同质双功能脂族醛试剂的非限制性例子包括乙二醛、丙醛和戊二醛。同质双功能酰化试剂的非限制性例子包括二羧酸的硝基苯基酯。同质双功能芳族磺酰氯的非限制性例子包括酚-2，4-二磺酰氯和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。氨基-反应性同质双功能试剂的其他非限制性例子包括赤藓醇二碳酸酯，它能与胺反应生成双氨基甲酸酯。

在一些实施方式中，同质双功能交联剂可与游离巯基反应。可与游离巯基反应的同质双功能交联剂包括例如，马来酰亚胺、吡啶基二硫化物和烷基卤。

同质双功能马来酰亚胺的非限制性例子包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺、N，N′-(1，2-亚苯基)双马来酰亚胺、苯偶氮基二马来酰亚胺和双(N-马来酰亚胺甲基)醚。同质双功能吡啶基二硫化物的非限制性例子包括1，4-二-3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺基丁烷(DPDPB)。同质双功能烷基卤的非限制性例子包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘乙酰胺基偶氮苯、α，α′-二碘-对二甲苯磺酸、α，α′-二溴-对二甲苯磺酸、N，N′-双(b-溴乙基)苄胺、N，N′-二(溴乙酰基)苯基肼和1，2-二(溴乙酰基)氨基-3-苯基丙烷。

如上所述，在一些实施方式中，用异质双功能试剂将多肽偶联于聚合物。合适的异质双功能试剂包括含有吡啶基二硫化物部分的氨基反应性试剂；含有马来酰亚胺部分的氨基反应性试剂；含有烷基卤部分的氨基反应性试剂；和含有烷基二卤部分的氨基反应性试剂。

具有吡啶基二硫化物部分和氨基反应性NHS酯的异质双功能试剂的非限制性例子包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基己酸酯(LC-SPDP)、磺基琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基己酸酯(磺基-LCSPDP)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)和磺基琥珀酰亚胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基己酸酯(磺基-LC-SMPT)。

含有马来酰亚胺部分和氨基反应性NHS酯的异质双功能试剂的非限制性例子包括琥珀酰亚胺基马来酰亚胺基乙酸酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯(BMPS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺基己酸酯(EMCS)、琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基苯甲酸酯(SMB)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)和磺基琥珀酰亚胺基4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。

含有烷基卤部分和氨基反应性NHS酯的异质双功能试剂的非限制性例子包括N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亚胺基-6-(碘乙酰基)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基-6-(6-((碘乙酰基)-氨基)己酰基氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亚胺基-6-(((4-(碘乙酰基)-氨基)甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀酰亚胺基-4((碘乙酰基)-氨基)甲环己烷-1-羧酸酯(SIAC)。

含有氨基反应性NHS酯和烷基二卤部分的异质双功能试剂的非限制性例子是N-羟基琥珀酰亚胺基2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。含有烷基卤部分和氨基反应性对-硝基苯基酯部分的异质双功能试剂的非限制性例子包括对-硝基苯基碘代乙酸酯(NPIA)。

组合物

本发明提供包含主题多肽-聚合物偶联物的组合物，包括药物组合物。

在一些实施方式中，主题组合物包含主题多肽-聚合物偶联物，其中主题多肽-聚合物偶联物是均质的，例如多肽-聚合物偶联物的所有多肽均包含相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方式中，主题组合物包含多种(如多个拷贝)的主题多肽-聚合物偶联物，其中各多肽-聚合物偶联物分子含有均具有相同氨基酸序列的多肽。

在其它实施方式中，主题组合物包含两种或多种主题多肽-聚合物偶联物，例如，主题组合物包含第一多肽-聚合物偶联物和至少一种第二多肽-聚合物偶联物；其中第一多肽-聚合物偶联物包含第一氨基酸序列的多肽，第二多肽-聚合物偶联物包含不同于第一氨基酸序列的第二氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，主题组合物包含第三或附加的多肽-聚合物偶联物。作为一个非限制性例子，第一多肽-聚合物偶联物包含能结合整联蛋白的第一多肽；第二多肽-聚合物偶联物包含能激活细胞信号传导途径的第二多肽。也可使用第一、第二等等多肽的各种其他组合。主题组合物中所述第一多肽-聚合物偶联物与所述第二多肽-聚合物偶联物的比例可变，例如约为0∶001∶10³至10³∶0.001。类似地，主题组合物包含第一、第二和第三多肽-聚合物偶联物时，第一、第二和第三多肽-聚合物偶联物的比例可变。

除主题多肽-聚合物偶联物以外，主题组合物可包含以下一种或多种物质：盐，如NaCl、MgCl、KCl、MgSO₄等；缓冲剂，如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等；增溶剂；去污剂，如非离子型去污剂，如吐温-20等；蛋白酶抑制剂等。

本发明提供包含主题多肽-聚合物偶联物和药学上可接受的赋形剂的组合物。合适的赋形剂运载体是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，和其组合。此外，如果需要，该运载体可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。本领域技术人员了解或明白制备这类剂型的实际方法。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pa.)，第17版，1985。在任何情况下，给予的组合物或制剂含有足以在所治疗对象中实现所需状态的药物用量。药学上可接受的赋形剂，如运载体、佐剂、载体或稀释剂容易通过公共渠道获得。而且，药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等容易通过公共渠道获得。

本文所用术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”可互换使用，包括与主题多肽-聚合物偶联物联用时不显著影响该偶联物的生物学活性、不诱导宿主免疫应答并且不会对宿主产生任何显著的不良生理影响的任何材料。例子包括但不限于：任何标准药用载体，如磷酸缓冲盐水、水、乳液如油/水乳液，以及各种湿润剂。其他载体也可包括无菌溶液、片剂包括包衣片和胶囊。这类载体通常含有赋形剂如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、二醇或其他已知赋形剂。这类载体也可包括调味剂和着色添加剂，或其他成分。通过熟知的常规方法配制含有这类载体的组合物。

可根据所选的给药方式配制药物组合物，包括例如局部、口服、经鼻、静脉内、颅内、腹膜内、肿瘤内、肿瘤周(peritumoral)、皮下或肌肉内给药。就胃肠道外给药，如皮下注射而言，载体可包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。就口服给药而言，可采用任何上述载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解微球(如聚乳酸聚乙醇酸)也可用作主题药物组合物的载体。合适的生物可降解微球参见例如，美国专利4,897,268和5,075,109。

在一些实施方式中，通过胃肠道外，如静脉内途径给予主题药物组合物。因此，本发明提供胃肠道外给药组合物，其包含溶解于或悬浮于可接受的载体，优选水性载体如水、缓冲水、盐水、磷酸-缓冲盐水等的主题偶联物。该组合物可视需要含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂、去污剂等。

可通过常规灭菌技术对主题组合物灭菌，或者可以对其进行过滤除菌。可将所得的水溶液原样包装以供使用，或者将其冻干，在临给药前将冻干制剂与无菌水性载体混合。该制剂的pH范围可以是3至11，例如约pH 5至pH 9，或者约pH 7至pH 8。

可植入的组织和装置

在一些实施方式中，将主题多肽-聚合物偶联物涂布在可植入的组织和装置上、层积在可植入的组织和装置上、掺入可植入的组织和装置中或形成可植入的组织或装置，可植入的组织和装置可以是，例如，人造组织；组织植入物；可植入装置(如血管内支架、人造关节、支架、植入物(如主动脉移植物)、人造心脏瓣膜、脑脊液分流器、冠状动脉分流器、起搏器电极、心内膜电极等)的涂层；可植入药物递送系统；等。人造组织包括例如，合成心脏瓣膜(如合成的主动脉瓣、合成的僧帽瓣等)。支架包括例如，自膨胀支架、随球囊而膨胀的支架和支架-移植物。生物材料包括例如，膜、凝胶、海绵、纱布、无纺布、膜、微球、微胶囊、线、导槽等。

例如，在一些实施方式中，将主题多肽-聚合物偶联物层积在或涂布于基质上，或者连接于基质，以形成合成的可植入装置。例如，基质(也称为“生物相容性基材”)是适合植入对象且上面层积有、涂有或连接有主题多肽-聚合物偶联物的的材料。生物相容性基材植入对象后不引起毒性或损伤效应。在一个实施方式中，生物相容性基材是具有可形成需要修复或替换的所需结构的表面的聚合物。生物相容性基材也可形成需要修复或替换的结构的一部分。生物相容性基材提供层积、涂布或连接主题多肽-聚合物偶联物的支持框架。

在一些实施方式中，连接有主题多肽-聚合物偶联物的基质或支架还包含结合于含有多肽-聚合物偶联物的基质或支架的一种或多种细胞和/或一种或多种细胞类型。这类基质或支架可用于组织工程改造、细胞培养、细胞移植等。

在一些实施方式中，药物递送装置包含主题多肽-聚合物偶联物。例如，药物释放装置可基于扩散系统、对流系统或易腐蚀系统(如，基于腐蚀的系统)。例如，药物释放装置可以是电化学泵、渗透泵、电渗泵、汽压泵或渗透爆发基质，例如，将药物掺入聚合物且伴随着浸渍了药物的聚合材料(如可生物降解的、浸渍药物的聚合材料)降解，聚合物释放药物制剂。在其它实施方式中，药物释放装置基于电扩散系统、电解泵、泡腾泵、压电泵、水解系统等。

在一些实施方式中，可对可植入药物递送系统进行编程以便给予活性剂。可编程的可植入系统的例子包括可植入输液泵。可植入输液泵或与这类泵联用的装置的例子参见例如，美国专利号4,350,155；5,443,450；5,814,019；5,976,109；6,017,328；6,171,276；6,241,704；6,464,687；6,475,180；和6,512,954。另一示范性装置是思科洛美(Synchromed)输注泵(麦德托尼克公司(Medtronic))。

可使用可植入药物递送装置递送任何药剂，例如，免疫应答修饰剂、抗增殖剂、抗凋亡剂、抗-有丝分裂剂、抗血小板剂、铂配位络合物、激素、抗凝剂、纤维蛋白溶解剂、抗分泌药、抗迁移药、免疫抑制剂、血管新生剂、血管紧张素受体阻断剂、氮氧化物供体、反义寡核苷酸、细胞周期抑制剂、皮质类固醇、血管抑制性类固醇、抗寄生物药、抗青光眼药物、抗生素、分化调节剂、抗病毒药、抗癌药和消炎药。

用途

主题多肽-聚合物偶联物可用于各种应用，包括治疗应用(如药物递送、可植入装置、组织工程、再生医学)、诊断应用、药物发现和研究应用。

治疗应用

主题多肽-聚合物偶联物可用于各种治疗应用。

例如，如上所述，主题多肽-聚合物偶联物可连接于药物递送装置，其中多肽-聚合物偶联物的生物活性多肽组分产生功能性，药物递送装置提供治疗剂。例如，需要用治疗剂治疗时，生物活性多肽可提供对特定细胞类型或组织类型的靶向，而药物递送装置可以局部方式提供治疗剂。

作为另一个实例，主题多肽-聚合物偶联物的生物活性多肽组分本身可以是治疗剂，例如，能够诱导肿瘤细胞凋亡；在治疗部位诱导血液凝结；抑制血小板聚集；诱导血管新生；诱导细胞分化等。

作为另一个实例，如上所述，主题多肽-聚合物偶联物可连接于可植入医疗器械，如支架、分流器、人造阀、导线、人造关节、移植物、电极等，其中主题多肽-聚合物偶联物的生物活性多肽组分提供所需活性，如减轻新内膜增生性再狭窄；抑制细胞增殖；抑制细胞粘附等。

作为另一个实例，如上所述，主题多肽-聚合物偶联物可连接于基质或支架，其中该多肽-聚合物偶联物提供细胞结合。在细胞移植、组织工程等方法中，可将所述包含主题多肽-聚合物偶联物的基质或支架(含有或不含结合于多肽-聚合物偶联物的细胞)引入个体体内。

在一些实施方式中，主题多肽-聚合物偶联物可用于在需要的个体中、在缺血组织中或其附近诱导血管新生(如当多肽是诱导血管新生的多肽时)。

研究应用

主题多肽-聚合物偶联物可用于各种研究应用，例如，用于研究细胞信号传导途径等。可将主题多肽-聚合物偶联物给予实验性非人动物疾病模型，以检测主题多肽-聚合物偶联物对模型中的生理应答的影响。主题多肽-聚合物偶联物也可用于药物筛选应用。

实施例

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不应限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有和仅有的实验。努力保证所用数值(如含量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可采用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下等。

实施例1：多肽-聚合物偶联物的合成和鉴定

通过采用碳二亚胺和马来酰亚胺化学的两步反应将Shh的修饰重组形式生物偶联于直链聚合物聚丙烯酸(pAAc)和透明质酸(HyA)，以便产生Sonichedgehog蛋白(Shh)的活性很高的多价形式。即使在化学剂量比为30个Shh分子/直链HyA链(即30∶1 Shh∶HyA)时，偶联效率也有～75％。通过细胞实验测定0.6∶1 Shh∶HyA至22∶1 Shh∶HyA范围内的Shh分子/HyA直链化学计量比的偶联物的生物学活性。结果表明，低偶联比能降低Shh生物学活性，而高比例则将此种活性提高到单体Shh的强度之上，其中可溶性Shh单体和Shh∶HyA为7∶1的偶联Shh活性大约相等。此外，经体内鸡胚尿囊膜(CAM)实验测定，高比例构建物能提高血管新生。通过Shh∶HyA偶联物和细胞表面受体之间多种相互作用的动力学模型获得这些结果，在较低的总Shh浓度下产生较高水平的细胞信号转导。

方法

重组Shh和生物偶联技术

使用以前所述大鼠Shh的N末端信号转导结构域的cDNA(15)，通过PCR在蛋白质C末端上加入编码额外半胱氨酸残基和6x His标签的碱基对，以便分别进行基于巯基的反应和蛋白质纯化。根据该蛋白质的此区域远离其活性位点和连接的惰性分子不改变蛋白质活性的研究(16)，特别选择这一系链连接位点。将所产生的修饰的Shh PCR产物插入pBAD-HisA(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))质粒中，通过DNA测序确认得到的质粒，通过阿拉伯糖诱导在BL21(DE3).pLys.E大肠杆菌(E.coli)中表达该蛋白。诱导蛋白质表达后，裂解细胞，并用NiNTA(加州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen，Valencia，CA))结合纯化表达的Shh，然后进行咪唑洗脱。用含有10％甘油、2mM EDTA和50μM ZnSO₄的pH 7.4PBS透析纯化的蛋白质。

通过两步反应将纯化的Shh偶联于直链聚合物，一个是在聚合物的羧酸基团上的碳二亚胺化学反应，另一个是在蛋白质C末端半胱氨酸上的马来酰亚胺反应(图1)。第一个步骤是将[N-ε-马来酰亚胺己酸]酰肼(EMCH，美国伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology，Rockford，IL))加入所述直链聚合物以便随后连接于该蛋白。用相同步骤将此种非免疫原性酰肼-马来酰亚胺异质双功能交联剂加入这两种直链聚合物，但反应条件略有不同。就pAAc偶联物而言，将2mg/ml的450,000 Da pAAc(宾夕法尼亚州沃灵顿的多利科学公司(Polysciences，Warrington，PA))与3.9mg/ml的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1.1mg/ml的N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)和0.5mg/ml EMCH在pH 6.5 MES缓冲液中室温下反应2小时，如小肽序列的连接中所述(17)。就HyA活化而言，采用类似于以前所述用于连接酰肼的方法(9)，以及10⁶ Da MW HyA(马萨诸塞州剑桥的基酶公司(Genzyme，Cambridge MA))。将其溶解，并在0.1M MES缓冲液pH 5.0中以3mg/ml与pAAc反应中所用的相同浓度的EDC、磺基-NHS和EMCH反应过夜。连接EMCH后，通过在50,000MW截止值离心滤器(PG公司(Pall Gellman))中进行连续的稀释和离心，从未偶联试剂中分离所得的马来酰亚胺活化的直链聚合物。

然后将不同的化学计量给料比的活化聚合物与Shh反应，以产生分子取代程度不同的偶联物。在含有50μM三(2-羧基乙基)盐酸膦(TCEP，美国伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯生物技术公司)的0.1M MES缓冲液(pH 6.5)中4℃反应过夜，以便在反应持续期间保证C-末端Shh半胱氨酸呈还原状态。反应后，通过加入0.5mM二硫苏糖醇并在4℃培育1小时将所述直链聚合物上所有剩余的马来酰亚胺基团还原。

通过凝胶电泳测定所有偶联反应，将反应溶液与等质量的未反应Shh作比较以观察蛋白质偶联效率。此外，利用Spectra/

Float-A-

装置(美国加州RD的SL公司(Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA))在0.1MES缓冲液(pH 6.5)中透析多组一式三份的Shh∶HyA偶联反应液(Shh与HyA的摩尔给料比为20∶1和10∶1)过夜，以去除未偶联的Shh。然后，用微型BCA测定(美国伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯生物技术公司)定量分析透析后的HyA-Shh溶液中的蛋白质浓度。

生物学活性测定

为了检测生物学活性，通过接触Shh诱导鼠胚胎C3H10T1/2细胞(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Manassas VA))，使其分化成成骨细胞系，如其它文献所述(18，19)。简要说，以5000个细胞/孔的密度将细胞接种于含有正常生长培养基(αMEM加10％FBS)的96孔板。2天后，用低FBS(2％)培养基更换培养基，并补充加入蛋白质和偶联物反应溶液。测试条件包括1-100nM的可溶性Shh；相同浓度范围的可溶性Shh和50μg/ml的未偶联HyA；或者Shh∶HyA偶联物，其含量应使培养基溶液中的Shh浓度为1-100nM。再培育3天后，洗涤和裂解细胞，用荧光探针9-H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO，俄勒冈州尤金的分子探针有限公司(Molecular Probes，Eugene，OR))测定碱性磷酸酶(ALP)活性以确定细胞裂解物的分化水平。未偶联的聚丙烯酸能够抑制细胞分化，因此未对这些偶联物进行生物学活性检测。

血管新生测定

Shh是已知的血管新生剂(20)。用CAM窗口实验测定可溶性Shh和Shh∶HyA偶联物诱导血管新生。在37℃的湿润环境中孵育受精的白来杭鸡蛋(美国康奈提格州富兰克林的查尔斯河(Charles River，Franklin CT))直到第8天，此时从鸡蛋钝端取出2ml蛋白，并且在鸡蛋壳的另一侧开出一个1cm x 1cm的小窗口。将载有无菌PBS、0.1μg Shh或相当于0.1μg Shh的20∶1 Shh∶HyA给料比偶联物的无菌滤纸方块直接放在正在发育的CAM上。然后，用帕拉胶膜封住该窗，并将鸡蛋放回孵育箱。3天后，用奥林巴斯SZX7立体显微镜评价测试材料周围的血管新生情况。用附连的QQ(QImaging Qfire)相机拍摄高分辨率的显微照片。用图像分析软件ImageJ分析这些图像，以便对环绕植入物且离开其边缘0.1和0.25cm的正方形区域内每单位长度上的血管数量进行定量。测定每组的线形密度测量值，以便用单向ANOVA对0.1和0.25cm距离的数据进行统计学显著性分析，然后对每组进行成对贺牧t检验(Holm’st-tests)。

对Shh∶HyA偶联物细胞信号转导进行分子建模

建立描述对Shh单体起反应的Gli转录效应物表达的结合和运输数值模型(21，22)和描述多价配体-受体结合的数值动力学模型(23)(图3)，以便对Shh∶HyA偶联物细胞信号转导建模。在图3中，显示了在一个代表性细胞周围的涉及多价偶联物的Shh核心信号转导网络和假拟反应。蛋白质之间的箭头代表结合或解离，从基因到蛋白质的箭头代表表达，从蛋白质到基因的箭头代表激活或抑制。Smo，平滑蛋白(Smoothened)。在细胞水平，Shh通过与其跨膜受体Patched(Ptc)相互作用诱导细胞命运转换。不存在Shh时，Ptc抑制跨膜蛋白Smo的信号转导活性，因而用作Shh信号转导的阻抑物，如文献所述(Lai等，2004)。gli上调代表正反馈，而ptc上调导致负反馈。模拟研究以下各种机制的作用：HyA∶Shh偶联物的结合(亲合力)；偶联物-Ptc复合物的内化；和HyA∶Shh的降解。

Shh信号转导的无量纲方程式如下：

对于可溶性Shh信号转导

\frac{&PartialD; B}{&PartialD; τ} = - α_{off} B + α_{on} AD - β_{in} B + γ_{out} C

\frac{&PartialD; C}{&PartialD; τ} = β_{in} B - γ_{out} C - Θ_{C} C

\frac{&PartialD; E}{&PartialD; τ} = - ϵ_{out} E + δ_{in} D - Θ_{E} E

AP＝k_APG₁

对于偶联物信号转导

利用细胞表面多价受体复合物(价态i(Bcom_i)和最高价态f)的以下表达式代替上述

表达式：

i＝1时

\frac{&PartialD; B {com}_{1}}{&PartialD; τ} = 2 α_{off} {Bcom}_{2} - k_{x} α_{on} (f - 1) {Bcom}_{1} D - α_{on} AD - α_{off} {Bcom}_{1} + α_{on} AD - β_{in} {Bcom}_{1} + γ_{out} {Ccom}_{1}

i＝[2，f-1]时

\frac{&PartialD; {Bcom}_{i}}{&PartialD; τ} = - i α_{off} {Bcom}_{i} + k_{x} α_{on} (f - i + 1) {Bcom}_{i - 1} D - (f - i) k_{x} α_{on} {Bcom}_{i} D + (i + 1) α_{off} {Bcom}_{i + 1} - β_{in} {Bcom}_{i} + γ_{out} {Ccom}_{i}

i＝f时

\frac{&PartialD; {Bcom}_{f}}{&PartialD; τ} = - f α_{off} {Bcom}_{f} + k_{x} α_{on} {Bcom}_{f - 1} D - β_{in} {Bcom}_{f} + γ_{out} {Ccom}_{f}

用内化多价受体复合物(价态i(Ccom_i))的以下表达式代替上述

表达式：

i＝[1，f]时

\frac{{&PartialD; Ccom}_{i}}{&PartialD; τ} = β_{in} {Bcom}_{i} - γ_{out} {Ccom}_{i} - Θ_{C} {Ccom}_{i}

用下述表达式代替上述

表达式：

在表1中列出了初始条件、参数和变量描述，以及它们的文献来源。术语“促进(promoter)”和“基本(basal)”已有定义(Lai，Robertson等，2004)。在可溶性Shh网络中的参数灵敏度分析参见Saha和Schaffer，《发育》(Development)，2006。

为了开发如图4所示的C3H10T1/2生物学活性数据的最简单模型，设定以下假设：Patched(Ptc)对平滑蛋白的抑制不受Ptc受体聚集的影响；在所有价态下配体诱导的内化速率相同；碱性磷酸酶活性与细胞内的Gli1水平线性相关；和C3H10T1/2细胞分化不会改变其对Shh的响应。假定HyA∶Shh偶联物的初始结合速率遵循单体Shh-Ptc结合速率，但来自偶联物的Shh部分与其它Ptc受体的所有其他结合均以较高的速率进行。这种假设被称为等同位点假设，以便考虑多价偶联物初始结合后的加速结合(24)。

模型参数来自文献(21，22)；然而，许多参数是由图4的生物学活性数据直接估计得来的。首先，由可溶性Shh生物学活性曲线估计单体Shh-Ptc结合常数k_on/k_off和碱性磷酸酶活性：Gli1表达速率。此外，由22∶1偶联物曲线直接估计多聚Shh-Ptc结合常数(见表1)。参数或者获自Shh文献，或者获自相似的配体-受体系统。在细胞体积或表面积内，对所有细胞速率常数求平均值，因为不知道这些常数会在细胞内在空间上变化。下面列出如图7所示的模拟结果的初始条件以及各个变量。了解每一术语在不同方程式中相对重要性的常规方式是比较表1中的无量纲浓度和参数。

表1.参数定义和数值范围。

也构建了引入HyA链位阻作为偶联物与Ptc的结合亲和力的简单减项的另一模型。在引入位阻的另一模型，称为“具有空间相互作用的模型”中，0.6∶1，3.5∶1，和7∶1偶联给料比的多聚Shh-Ptc结合常数k_on降低5.5倍，以匹配来自图4的0.6∶1曲线的实验数据。下面描述了BERKELEY MADONNA编码(code)，以模拟多价偶联物，其中f＝5(5∶1 Shh∶HyA偶联物)。在正文中，下述编码称为“无立体相互作用的模型”。如方法部分所述，对于“具有空间相互作用的模型”而言，只改变了一个参数。将多聚Shh-Ptc结合常数k_on降低5.5倍，以匹配图4中0.6∶1曲线的实验数据。

方法RK4

开始时间＝0

终止时间＝500

DT＝0.0000002

Shh＝S*Kshh

；---------------------------------------------------------------------

；由Lai等，Biophys J.2004定义促进和基础变量

；K1＝Gli1的平衡解离结合常数

；K2＝Gli3的平衡解离结合常数

；afr＝亲和比率＝K2/K1

；bc＝结合协同性

；tc＝转录协同性

；r＝抑制比

；

-----------------------------------------------------------------------

；来自Lai等，Biophys J.2004的Gli核心促进和基础表达式：

促进＝((afr*G1+G3)*(afr^2*bc^2*G1^2+3*tc^2+3*bc*tc*(G3+2*G3R*r*tc)+afr*bc*G1*(2*bc*G3+3*tc+3*bc*G3R*r*tc)+bc^2*(G3^2+3*G3*G3R*r*tc+3*G3R^2*r^2*tc^2)))/(1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R+3*bc*G3R^2+bc^2*G3R^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R)+3*G3*(1+bc*G3R)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R))^2)

基础＝((1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R*r+3*bc*G3R^2*r^2+bc^2*G3R^3*r^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R*r)+3*G3*(1+bc*G3R*r)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R*r))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R*r))^2))/(1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R+3*bc*G3R^2+bc^2*G3R^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R)+3*G3*(1+bc*G3R)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R))^2)

；-------------------------------------------------------------------

；定义Shh结合和运输方程的量纲常数

；-------------------------------------------------------------------------

koff＝0.1；Shh与Ptc的解离(min-1)

kdegc＝0.00198；Shh-Ptc复合物的降解速率常数(min-1)

kp＝0.03；EGF keR的洛芬博格(Lauffenburger)＝3e-2min-1(p95)

kq＝0.00036；EGF krec的洛芬博格＝5.8e-2min-1(p95)

kin＝0.021；EGF keC的洛芬博格＝0.03-0.3min-1(p95)

kout＝0.00181；输出至胞内Shh-Ptc复合物的表面(min-1)

kg＝0.09；Ptc的降解速率常数(.045-0.071min-1)

kon＝koff/Kshh；Shh与Ptc结合

vf＝0.2；组织的空隙分数

vff＝(1-vf)/vf；空隙分数因子＝胞内体积/胞外体积

Do＝2.0e-9；滑入(膜游离Ptc的摩尔数)/(胞外液体体积的升数)的初始游离Ptc浓度

Eo＝0.33e-9；滑入(内部Ptc的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)的初始内部Ptc浓度

；------------------------------------------------------------------------

；定义无量纲常数

；时间单位1/kdeg，Gli1的降解速率常数(.009min-1)

；

--------------------------------------------------------------------------

θ_e＝kg/kdeg

α_off＝koff/kdeg

α_on＝kon*(Kgli3*vff)/kdeg

β_in＝kin/kdeg

γ_out＝kout/kdeg

θ_c＝kdegc/kdeg

α_p＝kcatp/(Kgli3*vff*kdeg)

β_p＝rbas/(Kgli3*vff*kdeg)

ε_out＝kq/kdeg

δ_in＝kp/kdeg

ζ＝Kgli3/Kptc

；*******************************************************************************

；定义无量纲Shh结合方程

；无量纲变量：

；A＝(Shh摩尔数)/(胞外液体体积的升数)/(Kgli3)/(vff)

；B＝(膜Ptc-Shh复合物的摩尔数)/(胞外液体体积的升数)/(Kgli3)/(vff)

；C＝(胞内Ptc-Shh复合物的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

；D＝(膜游离Ptc的摩尔数)/(胞外液体体积的升数)/(Kgli3)/(vff)

；E＝(胞内Ptc-Shh复合物的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

；来自Lauffenberger 1993；Perelson 1986的多聚模型

；Bcom[i]＝(膜Ptc-Shh[i]复合物的摩尔数)/(胞外液体体积的升数)/(Kgli3)/(vff)

；Ccom[i]＝(胞内Ptc-Shh[i]复合物的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

d/dt(A)＝0

d/dt (D)＝(α_p)*促进+(β_p)*基础+(ε_out)*E -(α_on)*A*D+k_x*Sum2-kx*Sum1*D-(δ_in)*D

d/dt(E)＝(δ_in)*D-(ε_out)*E-(θ_e)*E

sumlv[1..(f-1)]＝(f-i)*Bcom[i]

suml＝阵列求和(sumlv[*])

sum2v[1..f]＝(i)*Bcom[i]

sum2＝阵列求和(sum2v[*])

f＝5；最高价态

INIT Bcom[1..f]＝0

d/dt(Bcom[1])＝(α_on)*A*D-(α_off)*Bcom[1]-(f-1)*kx*Bcom[1]*D+2*k_x*Bcom[2]-(β_in)*Bcom[1]+(γ_out)*Ccom[1]

d/dt (Bcom[2..(f-1)])＝(f-i+1)*kx*Bcom[i-1]*D-i*k_x*Bcom[i]-(f-i)*kx*Bcom[i]*D+(i+1)*k_x*Bcom[i+1]-(β_in)*Bcom[i]+(γ_out)*Ccom[i]

d/dt(Bcom[f])＝kx*Bcom[i-1]*D -f*k_x*Bcom[i]-(β_in)*Bcom[i]+(γ_out)*Ccom[i]

INIT Ccom[1..f]＝0

d/dt(Ccom[1..f])＝(β_in)*Bcom[i]-(γ_out)*Ccom[i]-(θ_c)*Ccom[i]

INIT A＝Shh/(Kgli3*vff)

INIT D＝Do/(Kgli3*vff)

INIT E＝Eo/(Kgli3)

信号＝1/(1+ξ*D)；未结合Smo的分数，基于Ptc和Smo之间的斯卡查得检验(rxn)

kx因子＝12；多聚Shh的kon在初始结合后的加速

kx＝α_on*kx因子

k_x＝α_off

；定义胞内方程式

；无量纲变量：

；G1＝(Gli1摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

；G3＝(Gli3活化形式的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

；G3R＝(Gli3R阻抑蛋白形式的摩尔数)/(胞内液体体积的升数)/(Kgli3)

d_G1＝(α)*促进+(β)*基础-G1

d/dt(G1)＝(α)*促进+(β)*基础-G1

d/dt(G3)＝(γ)/(G1+常数)-G3*(1+(δ)/(Kg3rc+信号))

d/dt(G3R)＝G3*(δ)/(Kg3rc+信号)-G3R

G3o＝5.81e-9

G3Ro＝61.2e-9

G1o＝1.63e-9

INIT G1＝G1o/Kgli3

INIT G3＝G3o/Kgli3

INIT G3R＝G3Ro/Kgli3

；---------------------------------------------------------------------------

；定义胞内方程式的量纲常数

；---------------------------------------------------------------------------

bas因子＝130

kcatg＝1.992732e-10；最高Gli合成速率(2.4e-10M/min)

rgbas＝2.74e-10/bas因子；基础Gli合成速率(vmax，g/100)

kcatp＝1.5e-10；最高Ptc合成速率(4.5e-10M/min)

rbas＝2.25e-9/bas因子；基础Ptc合成速率(vmax，P/100)

rg3b＝3.1e-19；基础gli3合成速率(1.6e-19M2/min)

Kshh＝8.3e-10；Shh-Ptc结合的解离常数

Kgli3＝8.3e-10；用于Kptc

kdeg＝0.009；Gli 1的降解速率常数(.009min-1)

kdegp＝0.09；Ptc的降解速率常数(.045-0.071min-1)

Kptc＝3.32e-11；抑制Smo信号转导的Ptc半数最大浓度

kg3r＝0.0117；Gli3转化为Gli3R的速率常数(0.012min-1)

Kg3rc＝0.12；转化成信号强度的灵敏度常数

bc＝1；结合协同性

tc＝0.5；转录效率

r＝0.2；转录抑制

afr＝0.5；亲和比率

S＝120

α＝kcatg/(Kgli3*kdeg)

β＝rgbas/(Kgli3*kdeg)

γ＝rg3b/(Kgli3*Kgli3*kdeg)

δ＝kg3r/kdeg

ε＝kcatp/(kdeg*Kgli3)

η＝rbas/(Kgli3*kdeg)

常数＝1e-30

结果

化学偶联

构建、表达、并通过固定的金属亲和层析纯化在C末端附近具有半胱氨酸残基的重组大鼠Shh变体。利用pAAc和HyA实现重组蛋白的高效偶联。使用凝胶电泳可明显看出，该反应导致单体Shh条带减少(图2)，并出现高分子量偶联物。就pAAc而言(图2A)(MW＝450,000)，这会产生贯穿凝胶的成片条带，其质量随Shh偶联摩尔给料比升高(从1∶1升高至30∶1)而增加。对HyA而言(MW＝106Da)，该高分子量偶联物不会深深穿入凝胶(图2B)。相反，将Shh与未处理的pAAc或HyA简单地混合不会改变Shh在凝胶中的迁移率。对以10∶1和30∶1摩尔给料比一式三份进行的纯化Shh∶HyA反应的蛋白质分析说明该反应可重现且效率高，效率约为70-75％(表2)。1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和30∶1的摩尔给料比产生的Shh∶HyA偶联物的摩尔取代比分别为0.6∶1、3.5∶1、7∶1、14∶1和22∶1。

表2：在30∶1和10∶1摩尔给料比的条件下测定的Shh∶HyA反应的偶联比和偶联效率

C3H10T1/2细胞生物学活性测定

通过使用鼠胚胎细胞系C3H10T1/2，Shh的偶联能显著改变利用溶液中实际Shh浓度评估的系链连接蛋白的活性(图4)。只有偶联HyA的Shh才可用此细胞系检测，因为pAAc能抑制可溶性Shh在该细胞系中诱导的分化。偶联比例低(如3.5∶1)时，该活性降低，同时估计溶液中Shh的EC₅₀提高10倍，估计是由于较大线性聚合物连接时引起的位阻作用所致。当偶联比例达到7∶1时，该活性提高到正常水平。超过这一比例后，系链连接的Shh的活性显著提高，与未连接的Shh相比22∶1构建物的预计EC₅₀值降低10倍。

CAM血管新生模型

CAM结果表明，偶联的Shh∶HyA功效提高。照片分析和定量分析(分别参见图5和6)揭示出，在植入物附近(0.1mm)，与阴性对照相比，加载Shh的样品周围的血管发生统计学显著性增加。以14∶1比例偶联的Shh∶HyA不仅在0.1cm处产生超过阴性对照和未偶联Shh的平均血管数量，还在0.25cm厘米处产生超过阴性对照的远程持续增加效果。虽然可溶性Shh在此距离上也产生超过阴性对照的平均血管数量，但这一观察结果没有统计学显著性。

多价Shh生物学活性的数值模型

开发了HyA∶Shh偶联物结合、运输和下游信号激活的简单动力学模型。为了专注于偶联物多价性的影响，在简化模型中设定了许多假设：Ptc受体聚集不影响信号转导；配体内化不受价态的影响；无论分化水平如何碱性磷酸酶活性与细胞中的Gli1水平线性相关；和偶联物结合只有两种速率-偶联物初始结合速率以及来自该偶联物的所有其他Shh部分与其他Ptc受体的较高结合速率(模型方程式参见方法部分，参数参见表1)。在这些假设条件下，开发了两类模型，一类引入HyA链的位阻作为作为偶联物与Ptc的结合亲和力的简单减项，一类忽略任何位阻影响。这两种模型分别称为“具有空间相互作用的模型”和“无空间相互作用的模型”。在这些假设条件下，建模结果表明，在生物学活性测定中提高Shh与其HyA载体的偶联比例应导致细胞信号转导持续增加和EC₅₀下降(图7)。以测试的偶联比例和上述假设条件使用两类动力学模型时，估计得到的EC₅₀值与实验数据良好匹配(在无空间相互作用的模型中R²＝0.7；在具有空间相互作用的模型中R²＝0.8)。在无空间相互作用的模型中，在高偶联比例条件下EC₅₀值与实验结果良好匹配，但是在偶联比例为7∶1或更低时，建模结果过高估计了EC₅₀值(图7)。具有空间相互作用的模型的结果可校正这种偏差(图7)。

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虽然参照具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。

Claims

1.一种下式偶联物：

X-(Y)_n-Z，

其中X是生物活性多肽；

Y是任选的接头部分，其中n为0或1到约10的整数；和

Z是包含约50-100,000个亚基的生物相容性聚合物，

其中所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比为至少约5∶1。

2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述聚合物是包含选自下组的多个亚基的直链聚合物：透明质酸、丙烯酸、乙二醇、甲基丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、阿拉伯糖、牛磺酸、甜菜碱、改性纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、改性淀粉、疏水改性淀粉、羟乙基淀粉、羟丙基淀粉、直链淀粉、支链淀粉、氧化淀粉和它们的共聚物。

3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽是受体、受体的配体、生长因子、血管新生因子、诱导细胞分化的多肽、抗体或抑制细胞增殖的多肽。

4.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述聚合物是直链聚(丙烯酸)。

5.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述聚合物是透明质酸。

6.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比为约5∶1至约10∶1。

7.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比为约10∶1至约25∶1。

8.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽与所述聚合物的摩尔比为约25∶1至约50∶1。

9.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽的分子量为约2kDa至100kDa。

10.一种药物组合物，其包含：

a)权利要求1所述的偶联物；和

b)药学上可接受的赋形剂。

11.一种可植入装置，其包含权利要求1所述的偶联物。

12.如权利要求11所述的可植入装置，其特征在于，所述可植入装置是支架、分流器、人造阀、导线、人造关节、移植物或电极。

13.一种可植入药物递送装置，其包含权利要求1所述的偶联物。

14.一种治疗方法，其包括给予需要的个体有效量的权利要求10所述药物组合物、权利要求11所述可植入装置或权利要求13所述可植入药物递送装置。