CN101977936A - 蛋白酶激活受体1(par1)的拮抗剂抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供特异性识别和拮抗PAR1受体的抗体或抗原结合分子。在本发明中还提供编码这类分子的多核苷酸和载体及包含该多核苷酸或载体的宿主细胞。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求在2007年7月17日提交的美国临时专利申请号60/950,290的优先权。这一申请的全部公开在此以其整体和全部目的通过参考并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及蛋白酶激活受体-1(PAR1)的抗体和抗原结合分子拮抗剂。
蛋白酶激活受体-1(PAR1)是属于G蛋白偶联受体(GCPR)家族的凝血酶受体。PAR1在多种组织中表达，例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经元和人血小板。其涉及与止血、增殖和组织损伤有关的细胞应答。凝血酶介导的经由PAR1的血小板凝聚刺激是血管中血块形成和伤口愈合的重要步骤。凝血酶通过蛋白水解移去PAR1的细胞外N-末端结构域和暴露新的PAR1 N-末端来激活PAR1。然后新的PAR1 N-末端的头几个氨基酸(SFLLRN；SEQ ID NO：68)作为与该受体另一部分结合的系锁配体(tetheredligand)作用，通过结合的G-蛋白起始信号传导。PAR1也可以由参与血液凝固的其它丝氨酸蛋白酶激活。
PAR1介导的信号传导活动的调节有若干治疗应用。抑制PAR1有助于治疗血栓形成和血管增生的病症以及抑制癌症进展。见，例如，Darmoul等人，Mol Cancer Res(2004)2(9)：514-22和Salah等人，Mol Cancer Res(2007)5(3)：229-40。包括拮抗剂抗体或抗原结合分子的PAR1抑制剂在由PAR1细胞内信号传导介导的多种疾病的治疗中是有用的。例如，人们发现包括拮抗剂抗体或抗原结合分子的PAR1抑制剂在预防或抑制慢性肠炎(包括炎性肠病(IBD)、肠激惹综合症(IBS)和溃疡性结肠炎)和纤维变性病(包括肝纤维化和肺纤维化)中的用途。见，例如，Vergnolle等人，J ClinInvest(2004)114(10)：1444；Yoshida等人，Aliment Pharmacol Ther(2006)24(Suppl 4)：249；Mercer等人，Ann NY Acad Sci(2007)1096：86-88；Sokolova和Reiser，Pharmacol Ther(2007)PMID：17532472。人们还发现包括拮抗剂抗体或抗原结合分子的PAR1抑制剂在预防或抑制局部缺血再灌注损伤(包括心肌、肾、大脑和肠的局部缺血再灌注损伤)中有用。见，例如，Strande等人，Basic Res.Cardiol(2007)102(4)：350-8；Sevastos等人，Blood(2007)109(2)：577-583；Junge等人，Proc Natl AcadSci U S A.(2003)100(22)：13019-24和Tsuboi等人，Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol(2007)292(2)：G678-83。抑制PAR1细胞内信号传导也可以被用于抑制单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)对细胞的感染。见，Sutherland等人，J Thromb Haemost(2007)5(5)：1055-61。
发明概述
本发明提供针对蛋白酶激活受体-1(PAR1)的改良的拮抗剂抗体和其使用的方法。
因此，在一方面，本发明提供结合蛋白酶激活受体-1(PAR1)的抗体。在一些实施方案中，该抗体包含：
(a)重链可变区，包含人重链V-区段、重链互补决定区3(CDR3)、和重链构架区4(FR4)，和
(b)轻链可变区，包含人轻链V区段、轻链CDR3、和轻链FR4，其中
i)重链CDR3包含氨基酸序列DDX1X2SX3WX4FDV，其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是H、L、P、M、E、W、T、S、Q或A，X4是Y或F(SEQID NO：10)；
ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列FQGX5X6VPFT，其中X5是S、D、A或V，X6是H、R、T、S或K(SEQ ID NO：20)；
其中该抗体是PAR1拮抗剂。
在相关方面，本发明提供特异性结合PAR1的抗体。在一些实施方案中，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各自包含下列三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3；其中
i)重链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5的氨基酸序列；
ii)重链可变区的CDR 2包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQID NO：9的氨基酸序列；
iii)重链可变区的CDR 3包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列；
iv)轻链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
v)轻链可变区的CDR 2包含选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的氨基酸序列；
vi)轻链可变区的CDR 3包含选自SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是PAR1拮抗剂。
在一个实施方案中，重链V-区段与SEQ ID NO：41共有至少90％的序列同一性，轻链V区段与SEQ ID NO：46共有至少90％的序列同一性。
在一个实施方案中，重链V-区段与选自SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸共有至少90％的序列同一性，轻链V-区段与选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的氨基酸共有至少90％的序列同一性。
在抗体的一个实施方案中：
i)重链CDR3包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和
ii)轻链CDR3包含选自SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，重链FR4是人种系JH6(WGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：32)。在一些实施方案中，重链J-区段包含人种系JH6部分序列DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：66)。
在一些实施方案中，轻链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，轻链FR4是人种系Jk2(FGQGTKLEIK；SEQ ID NO：40)。在一些实施方案中，轻链J-区段包含人种系Jk2部分序列TFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：67)。
在一些实施方案中，重链V-区段和轻链V-区段各自包含互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
iii)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；和
iv)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。
在抗体的一些实施方案中：
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：4；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：8；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：11；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
v i)轻链CDR3包含SEQ ID NO：22。
在抗体的一些实施方案中：
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：4；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：8；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：12；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23。
在抗体的一些实施方案中：
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：5；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：9；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：13；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23。
在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO：51的可变区共有至少90％的氨基酸序列同一性，轻链可变区与SEQ ID NO：55的可变区共有至少90％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的可变区共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的可变区共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的，和轻链可变区与序列同一性。
在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的氨基酸序列，轻链可变区包含选自SEQ ID NO：57、SEQID NO：58和SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗体以少于1×10-8M的平衡解离常数(KD)结合于PAR1。
在一些实施方案中，该抗体是FAb’片段。在一些实施方案中，该抗体是IgG。在一些实施方案中，该抗体是单链抗体(scFv)。在一些实施方案中，该抗体包含人恒定区。
在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO：52的重链和包括SEQID NO：57的轻链。
在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO：53的重链和包括SEQID NO：58的轻链。
在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO：54的重链和包括SEQID NO：59的轻链。
在另一方面，本发明提供包含本发明的抗体的可药用组合物。实施方案如本文所述。
在另一方面，本发明提供改善通过PAR1的细胞内信号传导介导的疾病症状的方法，包括向有需要的受试者施用本发明的拮抗剂抗体。抗体的实施方案如这里所述。
在方法的一些实施方案中，由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是慢性肠炎。
在方法的一些实施方案中，由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是纤维变性病。
在方法的一些实施方案中，由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是过表达PAR1的癌症。
在方法的一些实施方案中，由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是局部缺血再灌注损伤。
定义
“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价的、可逆的并以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白片段的多肽。示例性的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体是由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)，通过二硫键相连。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次定义免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。各个链的N-末端定义主要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链这些区域。如在本申请中使用的，“抗体”包括具有特异地对例如PAR1的特定结合性的抗体和其片段的全部变体。因此，在这一概念范围之内的是全长的抗体、嵌合抗体、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab’和具有相同结合特异性的这些片段的多聚体的版本(例如，F(ab’)2)。
“互补性决定区”或“互补决定区”(“CDR”)可互换的指VL和VH的高变区。CDR是包含对这类靶标蛋白特异性的该抗体链的靶标蛋白结合位点。在每个人VL或VH中有三个CDR(CDR1-3，从N-末端顺序编号)，构成约15-20％的可变域。CDR是与靶标蛋白的表位结构互补，因此结合特异性的直接原因。VL或VH剩下的区段，即所谓的构架区，在氨基酸序列上显示较少的变异(Kuby，Immunology，第四版，第4章.W.H.Freeman & Co.，NewYork，2000)。
使用本技术领域多种众所周知的定义，例如Kabat，Chothia，国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(互联网址imgt.cines.fr/)，和AbM(见，例如，Johnson等人，Nucleic Acids Res.，29：205-206(2001)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature，342：877-883(1989)；Chothia等人，J.Mol.Biol.，227：799-817(1992)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.，273：927-748(1997))确定CDR和构架区的位置。抗原结合位点的定义也在以下文献中描述：Ruiz等人，Nucleic Acids Res.，28：219221(2000)；和Lefranc，M.P.，NucleicAcids Res.，29：207-209(2001)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.，262：732-745(1996)；和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9268 9272(1989)；Martin等人，Methods Enzymol.，203：121153(1991)；和Rees等人，In Sternberg M.J.E.(ed.)，Protein StructurePrediction，Oxford University Press，Oxford，141 172(1996)。
术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可交换的指确定抗体结合特异性所需的、互补决定区之内的最小的连续或非连续的氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多个CDR序列中。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇位于抗体重链和轻链的CDR3序列的部分或全长之内(即，由其单独的决定)。
这里使用的“抗体轻链”或“抗体重链”指各自包含VL或VH的多肽。内源性VL是由基因区段V(可变的)和J(连接)编码，内源性VH由V、D(多样性)和J编码。VL或VH各自包括CDR以及构架区。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链可以不时的共同被称为“抗体链”。这些术语包括含有本领域技术人员容易识别的、不破坏VL或VH基本结构的突变的抗体链。
抗体作为完整的免疫球蛋白存在、或作为用不同肽酶消化产生的多个公知特征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键下消化抗体产生F(ab)’2，即Fab’的二聚体，其自身是由二硫键连接于VH-CH1的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下被还原以打开在铰链区的二硫键连接，由此将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本是具有部分铰链区的Fab。Paul，Fundamental Immunology第3版(1993)。尽管在完整抗体的消化方式下定义多种抗体片段，技术人员将理解这类片段可以被化学的或通过使用重组DNA方法学从头合成。因此，如这里使用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法学从头合成的那些(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(见，例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))。
为了制备单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域公知的任何技术(见，例如，Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，pp.77-96.Alan R.Liss，Inc.1985)。产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可以修改以用于产生本发明的多肽的抗体。也可以使用转基因小鼠或其它生物体，例如其它哺乳动物，来表达人化抗体。或者，可以使用噬菌体展示技术鉴定特异性结合于选择的抗原的抗体和异数(heteromeric)Fab片段(见，例如，McCafferty等人，同上；Marks等人，Biotechnology，10：779-783，(1992))。
人源化或灵长化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化的抗体具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常涉及通常来自输入可变区(import variable domain)的输入残基(import residues)。人源化可以基本按照Winter和其合作者的方法进行(见，例如，Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应的序列。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上不完整的人可变区被非人物种的对应序列取代。在操作中，人源化抗体是典型的人抗体，其中一些互补决定区(“CDR”)残基、还可能有一些构架区(“FR”)残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，从而抗原结合位点(可变区)被连接于不同或改变类型、效应子功能和/或物种的恒定区，或赋予嵌合抗体新特征的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物)，或(b)可变区或其部分被改变、替代或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
术语“可变区”或“V-区”可交换的指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重链或轻链。见，图1。内源性可变区是由免疫球蛋白重链V-D-J基因或轻链V-J基因编码。V-区可以是天然存在、重组或合成的。
如这里使用的，术语“可变区段”或“V-区段”可交换的指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区的亚序列。见，图1。内源性V-区段是由免疫球蛋白V-基因编码。V-区段可以是天然存在、重组或合成的。
如这里使用的，术语“J-区段”指包含CDR3和FR4的C-末端部分的可变区的亚序列。内源性J-区段由免疫球蛋白J-基因编码。见，图1。J-区段可以是天然存在、重组或合成的。
“人源化”抗体是保留了非人抗体反应性而在人中较少免疫原性的抗体。这可以例如，通过保留非人CDR区和用其在人中的对应部分代替该抗体的剩余部分而实现。见，例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994).
术语“对应的人种系序列”指这样的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列编码的全部其它所评价的可变区氨基酸序列相比较，该核酸序列编码的人可变区氨基酸序列或亚序列与参考可变区氨基酸序列或亚序列共有最高的测定的氨基酸序列同一性。对应的人种系序列也可以指这样的人可变区氨基酸序列或亚序列，与全部其它所评价的可变区氨基酸序列比较，其与参考可变区氨基酸序列或亚序列共有最高的氨基酸序列同一性。对应的人种系序列可以是仅构架区、仅互补决定区、构架区和互补决定区、可变区段(如上定义)、或包含可变区的序列或亚序列的其它组合。可以使用这里所述的方法确定序列同一性，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域公知的另一比对算法比对两条序列。对应的人种系核酸或氨基酸序列可以与参考的可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、92％、94％、96％、98％、99％的序列同一性。对应的人种系序列可以例如通过公共可获得的国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(互联网址imgt.cines.fr/)和V-base(互联网址vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)来确定。
短语“特异性(或选择性)结合”，当在描述抗原(例如，蛋白)与抗体或抗体衍生的结合物质之间相互作用的情况下，指在蛋白质和其它生物的异源群体中由抗原的存在决定的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质以至少两倍于背景结合于特定抗原，且基本不以显著的量结合样品中存在的其它抗原。在这样条件下特异性结合抗体或结合物质可能需要抗体或物质已针对特定蛋白质的特异性经过选择。可以通过除去与例如，来自其它物种(例如，小鼠)的PAR1分子或其它PAR亚型(例如，PAR2、PAR3、PAR4)交叉反应的抗体而实现选择。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质有特异性免疫反应的抗体。例如，可以常规的使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质有特异性免疫反应的抗体(见，例如，Harlow & Lane，Using Antibodies，ALaboratory Manual(1998)，描述可以用于测定特异免疫反应性的免疫形式和条件)。通常特异性或选择性的结合反应将产生高于背景至少两倍的信号，更通常的高于背景至少10至100倍的信号。
术语“平衡解离常数(KD，M)”指解离速率常数(kd，时间-1)除以结合速率常数(ka，时间-1，M-1)。可以使用本领域任何公知的方法测量平衡解离常数。本发明的抗体通常具有少于约10-8M，例如，少于约10-9M或10-10M，在一些实施方案中少于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
如这里使用的，术语“抗原结合区”指负责在分子和PAR1之间特异性结合的本发明的PAR1-结合分子的结构域。抗原结合区包括至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体轻链可变区。在本发明的各个PAR1-结合分子中存在至少一个这类抗原结合区，各个抗原结合区可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，本发明的PAR1-结合分子的至少一个抗原结合区作为PAR1的拮抗剂作用。
如这里使用的，术语“拮抗剂”指能够特异性结合和抑制通过受体的信号传导来完全阻断或可检测的抑制由受体介导的应答的物质。例如，PAR1的拮抗剂特异性结合于受体并全部或部分抑制PAR1-介导的信号传导。在一些情况下，可以通过其结合PAR1的能力、抑制继来自PAR1的细胞内信号传导之后的凝血酶诱导的钙流出或凝血酶诱导的IL-8产生(例如，在FlipR测定中测量或通过ELISA测量)来鉴定PAR1拮抗剂。另外的测定由Kawabata等人，J Pharmacol Exp Ther.(1999)288(1)：358-70描述。当与来自未暴露于拮抗剂的对照PAR1的细胞内信号传导相比，来自暴露于本发明拮抗剂的PAR1细胞内信号传导(例如通过钙流量或IL-8产生来测量)至少减少约10％，例如，至少减少约25％、50％、75％，或完全被抑制时，抑制发生。对照PAR1可以暴露于非抗体或抗原结合分子、特异性结合另一抗原的抗体或抗原结合分子、或已知不作为拮抗剂起作用的抗-PAR1抗体或抗原结合分子。“抗体拮抗剂”指其中该拮抗剂是抑制性抗体的情况。
术语“蛋白酶激活的受体-1”、“蛋白水解酶激活的受体-1”或“PAR1”可交换的指由凝血酶切割激活藉此暴露N-末端系锁配体的G蛋白偶联受体。PAR1也称为“凝血酶受体”和“凝结因子II受体前体”。见，例如，Vu等人，Cell(1991) 64(6)：1057-68；Coughlin等人，J Clin Invest(1992)89(2)：351-55；和基因文库(GenBank)登录号NM_001992。系锁配体与PAR1的细胞外结构域的分子内结合引起细胞内信号传导和钙流出。见，例如，Traynelis和Trejo，Curr Opin Hematol(2007)14(3)：230-5；和Hollenberg等人，Can J Physiol Pharmacol.(1997)75(7)：832-41。PAR1的核苷酸和氨基酸序列是本领域公知的。见，例如，Vu等人，Cell(1991)64(6)：1057-68；Coughlin等人，J Clin Invest(1992)89(2)：351-55；和基因库登录号NM_001992。人PAR1核酸序列被公布为基因文库登录号NM_001992(又见，M62424.1和gi4503636)。人PAR1的氨基酸序列被公布为NP_001983和AAA36743。如这里使用的，PAR1多肽是功能上的G蛋白偶联受体，由凝血酶激活，结合N-末端系锁配体时引起细胞内信号传导和钙流出。结构上，PAR1氨基酸序列与基因文库登录号NP_001983、AAA36743或M62424.1的氨基酸共有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。结构上，PAR1核酸序列与基因文库登录号NM_001992或M62424.1的氨基酸共有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特别限制，术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述天然核苷酸与参考核酸具有相似的结合特性并与天然存在的核苷酸以相似方式代谢。除非另外指出，特定的核酸序列无疑也涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源体(ortholog)、SNP、和互补序列以及明确指出的序列。具体的，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列获得简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可以交换的使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和正-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即，结合于氢的α-碳、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的普通化学结构不同的结构，但是与天然存在的氨基酸以相似方式起作用的化学的化合物。
“保守修饰的变体”同时应用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指其核酸编码与基本相同的序列相同或基本相同的氨基酸序列或其中该核酸不编码氨基酸序列的那些。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何特定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定为丙氨酸的每个位置，该密码子可以被改变为任意的所述对应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变体是“沉默变体”，其为保守修饰的变体的一种。这里编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的各个可能的沉默变体。技术人员应该认识到在核酸中的各个密码子(除了AUG，其一般为甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其一般为色氨酸的唯一密码子)可以被修饰产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变体是在各个所述序列中暗含的。
至于氨基酸序列，技术人员应该意识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个的替代、缺失或加入(其在编码序列中改变、加入或缺失单个的氨基酸或小百分比的氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中该改变的结果是用化学相似的氨基酸替代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替代表是本技术领域众所周知的。这样的保守修饰的变体还加上且不排除本发明的多态变异体、种间同系物和等位基因。
下列八组各自含有彼此为保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如，Creighton，Proteins(1984)).
“序列同一性的百分数”是通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列确定，其中为进行两条序列的最佳比对，在比较窗口中多核苷酸序列的部分可以与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比包含添加或缺失(即，空位(gap))。通过测定在两个序列中都存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数得到匹配的位置数，用匹配位置数除以在比较窗口中的总位置数，将结果乘以100产生序列同一性的百分数来计算百分数。
在两个或更多核酸或多肽序列的背景下，术语“同一”或百分比“同一性”指其为相同序列的两个或更多序列或亚序列。当在比较窗或指定区使用下列序列比对算法之一或通过人工比对和目测进行比较和比对最大对应时，如果两个序列具有特定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，在特定区域，或当未指明时，在参考序列的整个序列上有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，则两个序列是“基本相同的”。本发明提供多肽或多核苷酸，其分别与这里举例的多肽或多核苷酸(例如，在SEQ ID NO：2-23任一中举例的CDR)基本相同。任选的，在参考序列的长度至少约15、25或50个核苷酸的区域，或更优选在长度为100-500或1000或更多的区域，或在全长存在该同一性。关于氨基酸序列，可以在参考序列的长度为至少5、10、15或20个氨基酸，任选长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸，任选在长度为至少约150，200或250个氨基酸，或在全长的区域存在同一性或基本同一性。对于更短的氨基酸序列，例如，有20个或更少的氨基酸的氨基酸序列，根据这里定义的保守替换，当一个或两个氨基酸残基是保守替代时，则存在基本同一性。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果需要，指定亚序列坐标，并选定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定备选的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。
如这里使用的，“比较窗”包括参考任一数目的连续位置的区段，所述连续位置的数目选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个(其中在两个序列被最佳比对之后序列可以与相同数目连续位置的参考序列比较)。比对序列用于比较的方法是本领域众所周知的。可以进行序列的最佳比对来比较，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(1970)Adv.Appl.Math.2：482c，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(1970)J.Mol.Biol.48：443，通过Pearson和Lipman的搜索相似性的方法(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444，通过这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)的计算机化实现，或通过人工比对和目测(见，例如，Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology(1995 supplement))。
适合确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其被分别描述在Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。执行BLAST分析的软件是通过生物技术信息国家中心(National Centerfor Biotechnology Information)可公开获得的。这一算法涉及首先通过在查询序列中鉴定短字节的长度W鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字节的长度W当与数据库序列中相同长度字节比对时，其匹配或满足一些正评价的阈值评分T。T被称为邻字节评分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初邻字节被作为寻找含有其的更长HSP的最初搜索击中的种子。只要可以增加累计的比对评分，该字节击中被沿着各个序列的两个方向延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(对于错配残基的处罚评分；总是＜0)来计算累计评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计评分。当：累计比对评分从其最大获得值减少数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，该累计评分到达零或更低；或到达序列的任意端时，在各个方向的字节击中的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M＝5，N＝-4和两条链均进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，比较两条链。
BLAST算法也在两个序列之间执行相似性的统计分析(见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总概率(P(N))，其通过在两个核苷酸或氨基酸序列之间可能偶然发生的匹配提供概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，核酸被认为相似于参考序列。
两条核酸序列或多肽基本相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体有免疫交叉反应，如下所述。因此，例如，当两个肽仅保守取代不同时，多肽与第二多肽通常是基本相同的。两条核酸序列基本相同的另一指示是，如下所述，在严格条件下两个分子或其互补链彼此杂交。而两条核酸序列基本相同的另一指示是可以使用相同的引物扩增该序列。
当被使用在描述抗原结合区如何被连接在本发明的PAR1-结合分子内时，术语“连接”涵盖物理结合该区域的全部可能的方式。多数抗原结合区通常由化学键，例如共价建(例如，肽键或二硫键)或非共价键连接，其可以是直接的结合(即，在两个抗原结合区之间没有接头)或间接的结合(即，在两个或多个抗原结合区之间具有至少一个接头分子的辅助)。
术语“治疗可接受的量”指足以作用产生期望结果的量(即，靶标细胞的凋亡)。优选的，治疗可接受的量不产生不期望的副作用。可以通过先施用低剂量，然后渐增地增加剂量直至获得期望效果来确定治疗可接受的量。
附图简述
图1说明包含抗体V-区的结构单元的示意图。重链是由三个基因家族(重-V、D和J)编码，轻链是由两个基因家族(κ或λ的V和J)编码。这些基因的重组产生完整的V区。CDR3序列在重链情况下位于重V、D和J基因的重组位点，在轻链情况下在κ或λ的V和J基因的重组位点。
图2说明用人氨基酸序列替代参考抗体氨基酸序列的示意图。
图3说明与对应的人种系可变区(例如，Vh1-46(SEQ ID NO：42和32)；VKII A3(SEQ ID NO：56))比较，本发明的改良的可变区氨基酸序列(重链V-区，SEQ ID NO：52、53和54；轻链V-区，SEQ ID NO：57、58和59)的比对。互补决定区(CDR)是有下划线的。粗体碱基表示与人种系的差异和斜体残基表示在CDR3中的改变。
图4说明在ELISA测定中本发明的改良的抗体的高度结合特异性。改良的抗-PAR1抗体结合于PAR1，但是不结合于密切相关的蛋白质人PAR2或小鼠PAR1或小鼠PAR2。指示的抗体克隆被以1μg/ml的浓度加入。
图5说明改良的抗体与短尾猴(Cynomolgus)PAR1具有反应活性。在短尾猴(Cyno)和人抗体结合表位的序列是相同的(SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE；SEQ ID NO：1)。
图6A-C说明改良的抗-PAR1抗体以剂量依赖的方式抑制凝血酶介导的PAR1的激活。
图7说明对本发明的三个改良拮抗剂PAR1抗体的比较。
发明详述
总述
本发明的抗体特异性结合蛋白酶激活的受体-1(PAR1)。在这样做时，抗体可以阻断天然配体(例如，凝血酶)的结合，作为拮抗剂作用或作为激动剂作用。在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体作为PAR1受体的拮抗剂作用。PAR1抗体拮抗剂是特异性结合PAR1、并抑制或减少PAR1-介导的细胞内信号传导的抗体。抗-PAR1抗体任选的可以是多聚化的，根据本发明的方法使用。抗-PAR1抗体可以是全长的四聚体抗体(即，具有两个轻链和两个重链)、单链抗体(例如，ScFv)、或包含形成一个或多个抗原结合位点和赋予PAR1结合特异性的抗体片段(例如包含重链和轻链可变区(例如，Fab’或其它相似片段))的分子。
可以通过本领域公知的任何方式产生抗-PAR1抗体片段，包括但不限于，抗体四聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而可以通过，例如，杂交瘤或重组生产获得全长的单克隆抗体。重组表达可以是来自本领域公知的任何合适的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。当存在时，抗-PAR1抗体的恒定区可以是适当的任意类型或亚型，可以是选择来自通过当前方法处理的受试物种(例如，人、非人灵长类或其它哺乳动物，例如，农业哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼(camelid))、家养哺乳动物(例如，犬、猫)或啮齿类(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔子)。
本发明的抗-PAR1抗体或抗原结合分子也包括具有骆驼支架的单结构域抗原结合单元。骆驼家族的动物包括骆驼、骆马(llama)和羊驼。骆驼产生缺乏轻链的功能抗体。重链可变(VH)结构域自主折叠，作为抗原结合单元独立的作用。与经典抗原结合分子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比，其结合表面包括仅三个CDR。骆驼抗体能够获得与那些传统抗体可相比的结合亲和力。可以使用本领域众所周知的方法，例如，Dumoulin等人，Nature Struct.Biol.11：500 515，2002；Ghahroudi等人，FEBS Letters 414：521 526，1997；和Bond等人，J Mol Biol.332：643-55，2003，产生具有这里举例的小鼠抗-PAR1抗体的结合专一性的基于骆驼支架的抗-PAR1分子。
a.抗-PAR1抗体可变区
本发明的抗-PAR1抗体的可变区衍生自已知以高亲和力结合PAR1的参考单克隆抗体，并作为拮抗剂作用。通过减少对应于非人物种(例如，小鼠)的氨基酸序列区段和增加对应于人种系氨基酸序列的氨基酸序列区段来改良或优化抗体。以这一方式，能够在人宿主中诱导针对抗-PAR1抗体的免疫应答的可能序列被减少、最小化或消除。已经描述了基因工程设计人抗体的方法。见，例如，美国专利公开号2005/0255552和美国专利公开号2006/0134098，其二者的公开在此以其整体作为参考被并入用于全部目的。
本发明的改良的抗-PAR1抗体是基因工程设计的人抗体，其具有的V-区序列与人种系V-区序列有基本的氨基酸序列同一性，而保留了参考抗体的特异性和亲和力。见，美国专利公开号2005/0255552和美国专利公开号2006/0134098。该改良操作鉴定了为确定来自参考抗体可变区的抗原结合特异性所需的最小序列信息，并转移该信息至人部分V-区基因序列的文库以产生人抗体V-区的表位集中的文库。可以使用基于微生物的分泌系统表达文库成员如抗体Fab’片段，并例如使用菌落转移结合测定法(colony-lift binding assay)筛选文库的抗原结合Fab’。见，例如，美国专利公开号2007/0020685。阳性克隆可以进一步表征以鉴定具有最高亲和力的那些。产生的基因工程设计的人Fab’保留了亲本(参考抗-PAR1抗体)的结合特异性，通常具有与亲本抗体相比相当的或更高的对抗原的亲和力，并具有与人种系抗体V-区相比具有高度序列同一性的V-区。
为产生表位集中的文库所需的最小结合特异性决定簇(BSD)通常是由重链CDR3中的序列(“CDRH3”)和轻链CDR3中的序列(“CDRL3”)呈现。BSD可以包含CDR3的部分或全长。BSD可以由连续的或非连续的氨基酸残基组成。在一些情况下，从人V-区段序列构建表位集中的文库，所述人V-区段序列连接于来自含有BSD和人种系J-区段序列的参考抗体的独特CDR3-FR4区(见，图1和美国专利公开号2005/0255552)。或者，可以通过相继的表达盒替代产生人V-区段文库，其中仅部分的参考抗体V-区段一开始被人序列文库替代。在残留的参考抗体氨基酸序列的情况下支持结合的鉴定的人“表达盒”接着在第二次文库筛选中被重组以产生全人V-区段(见，美国专利公开号2006/0134098).
在各个情况下，使用含有来自参考抗体特异性决定簇的成对重链和轻链CDR3区段、CDR3-FR4区段或J-区段来限制结合特异性，从而从文库获得的抗原结合子保留了参考抗体的表位特异性。在文库构建期间在各个链的CDR3区中可以引入额外的成熟改变以鉴定具有最佳结合动力学的抗体。产生的基因工程设计的人抗体具有衍生自人种系文库的V-区段序列，保留了来自CDR3区内的短BSD序列并具有人种系骨架4(FR4)区。
因此，在一些实施方案中，抗-PAR1抗体含有衍生自原始单克隆抗体的重链和轻链的CDR3之中的最小结合序列决定簇(BSD)。重链和轻链可变区的保留序列(CDR和FR)，例如，V-区段和J-区段，是来自对应的人种系氨基酸序列。V-区段可以选自人V-区段文库。可以通过亲和力成熟实现进一步的序列改进。
在另一实施方案中，抗-PAR1抗体的重链和轻链含有来自对应的人种系序列的人V-区段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，例如，选自人V-区段文库，和来自原始单克隆抗体的CDR3-FR4序列区段。可以通过用相应的人种系序列替代序列区段和/或通过亲和力成熟进一步改进CDR3-FR4序列区段。例如，在BSD周围的FR4和/或CDR3序列可以用对应人种系序列替代，而来自原始单克隆抗体CDR3的BSD被保留。
在一些实施方案中，重链V-区段的对应人种系序列是Vh1-46。在一些实施方案中，重链J-区段的人种系序列是JH6。在一些实施方案中，重链J-区段包含人种系JH6部分序列DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：66)。来自人种系JH6的全长J-区段是YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。可变区基因参考免疫球蛋白可变区基因标准命名法提及。当前免疫球蛋白基因信息可以通过互联网获得，例如，在ImMunoGeneTics(IMGT)、V-base和PubMed数据库，又见，Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18(2)：100-16；Lefranc，Exp Clin Immunogenet.2001；18(3)：161-74；Exp Clin Immunogenet.2001；18(4)：242-54；和Giudicelli等人，Nucleic Acids Res.2005 Jan1；33(Database issue)：D256-61。
在一些实施方案中，轻链V-区段的对应人种系序列是VKII A3。在一些实施方案中，轻链J-区段的对应人种系序列是Jk2。在一些实施方案中，轻链J-区段包含人种系Jk2部分序列TFGQGTKLEIK。来自人种系Jk2的全长J-区段是YTFGQGTKLEIK。
在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列(Q/E)VQLVQSGAEVKKPG(A/S)SVKVSCK(A/V)SG(Y/G)TF(N/S)(N/S)Y(Y/V)(M/F)(N/H)WVRQAPGQGLEWMG(V/I)I(N/D)P(S/H)GG(R/S)T(R/S)Y(A/N)QKFKGRVTMT(T/R)DTSTST(V/A)YMELSSL(R/T)S(D/E)DTAVYYCAR(SEQ ID NO：41)共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，轻链V-区段与氨基酸序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLH(R/S)NG(Y/N)NYL(D/E)WYLQKPGQSPQLLIY(K/L)(G/I)SNR(A/F)SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ IDNO：46)共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，重链V-区段与选自以下的氨基酸序列共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：42)、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPHGGRTRYNQKFKGRVTMTTDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：43)、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPHGGRTRYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO：44)和EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKVSGGTFSNYVFNWVRQAPGQGLEWMGVINPHSGRTRYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO：45)。
在一些实施方案中，轻链V-区段与选自以下的氨基酸序列共有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：47)、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：48)、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：49)和DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：50)。
在一些实施方案中：
i)重链CDR3包含氨基酸序列基序DDX1X2SX3WX4FDV，其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是H、L、P、M、E、W、T、S、Q或A，X4是Y或F(SEQID NO：10)，
ii)轻链CDR3包含氨基酸序列基序FQGX5X6VPFT，其中X5是S、D、A或V，X6是H、R、T、S或K(SEQ ID NO：20)。
在一些实施方案中：
i)重链CDR3包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自DDGPSMWYFDV(SEQ ID NO：11)、DDGPSLWYFDV(SEQ ID NO：12)和DDGPSHWYFDV(SEQ IDNO：13)；和
ii)轻链CDR3包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自MQALQTP(SEQ ID NO：21)、FQGSSVPFT(SEQ ID NO：22)和FQGSHVPFT(SEQ ID NO：23)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含的重链可变区包含含有氨基酸序列S/N)Y(Y/V)(M/F)(N/H)(SEQ ID NO：2)的CDR1；含有氨基酸序列(I/V)I(N/D)P(S/H)(S/G)G(R/S)T(R/S)Y(A/N)QKF(K/Q)G(SEQ ID NO：6)的CDR2；和含有氨基酸序列DDX1X2SX3WX4FDV的CDR3，其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是H、L、P、M、E、W、T、S、Q或A，X4是Y或F(SEQ ID NO：10)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含的轻链可变区包含含有氨基酸序列RSSQSLLH(R/S)NG(Y/N)NYL(D/E)(SEQ ID NO：14)的CDR1；含有氨基酸序列(L/K)(G/I)SNR(A/F)S(SEQ ID NO：17)的CDR2；和含有氨基酸序列FQGX5X6VPFT的CDR3，其中X5是S、D、A或V，X6是H、R、T、S或K(SEQID NO：20)。
在一些实施方案中，重链可变区包含含有氨基酸序列(E/Q)VQLVQSGAEVKKPG(S/A)SVKVSCK(V/A)SG(G/Y)TF(S/N)(SEQ ID NO：24)的FR1；含有氨基酸序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO：27)的FR2；含有氨基酸序列RVTMT(R/T)DTSTST(V/A)YMEL(S/R)SL(R/T)S(E/D)DTAVYYCAR(SEQ ID NO：28)的FR3；和含有氨基酸序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：32)的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守取代的氨基酸。
在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO：33)的FR1；含有氨基酸序列WYLQKPGQSP(Q/R)LLIY(SEQ ID NO：34)的FR2；含有氨基酸序列GVPDRFSGSG(S/A)GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO：37)的FR3；和含有氨基酸序列FGQGTKLEIK(SEQ ID NO：40)的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如，来自亲和力成熟)或一个或两个保守取代的氨基酸。
在全长范围，本发明的抗-PAR1抗体的可变区通常具有总的可变区(例如，FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)与对应人种系可变区氨基酸序列共有至少约90％，例如，至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。例如，抗-PAR1抗体的重链与人种系可变区Vh1-46/JH6共有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。抗-PAR1抗体的轻链与人种系可变区VKIIA3/Jk2共有至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体包含具有与SEQ ID NO：51的重链可变区至少有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含具有与SEQ ID NO：55的轻链可变区至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体包含重链可变区，其与选自SEQ ID NOS：52、53和54的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性，并包含轻链可变区，其与选自SEQ ID NOS：56、57、58和59的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体包含与SEQ ID NO：52的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，并包含与SEQ ID NO：57(即，克隆LDW653)的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体包含与SEQ ID NO：53的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO：58(即，克隆LDS 900)的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体包含与SEQ ID NO：54的重链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的重链可变区，和包含与SEQ ID NO：59(即，克隆LDS 896)的轻链可变区具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的轻链可变区。
为了长度小于20个氨基酸的鉴定的氨基酸序列，可以容忍一个或两个保守氨基酸残基取代，而仍然保留期望的特异性结合和/或拮抗剂活性。
本发明的抗-PAR1抗体通常以小于约10-8M或10-9M，例如，小于约10-10M或10-11M，在一些实施方案中小于约10-12M或10-13M的平衡解离常数(KD)结合PAR1。
b.PAR1抗体拮抗剂和筛选方法
可以根据本发明的方法使用任何类型的抗-PAR1抗体拮抗剂。通常，使用的抗体是单克隆抗体，其可以通过本领域公知的任一方法(例如，杂交瘤和重组表达)产生。在一些实施方案中，使用包含重链和轻链可变区的抗体片段而不是全长抗体来构建本发明的PAR1-结合分子。
在一些实施方案中，PAR1-结合分子的抗原结合区是单链抗体(ScFv)。产生ScFv和抗体的有用的技术是本领域公知的，描述在例如，美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology203：46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995-7999(1993)；和Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)。
可以使用本领域众所周知的技术鉴定特异性结合于PAR1的抗-PAR1抗体，例如，ELISA、表面等离子共振、干涉量度法(例如，使用ForteBio Octet生物传感器系统)。可以通过检测抗体抑制或减少PAR1-介导的事件的能力，例如，在表达PAR1的细胞中的钙流出、凝血酶诱导的IL-8分泌的抑制等，来鉴定PAR1抗体拮抗剂。可以使用多种本领域公知的测定检测对PAR1介导的事件的存在和抑制的诱导。
可以使用PAR1-依赖的钙流出测定筛选功能性PAR1拮抗剂抗体。已知凝血酶切割PAR1的N-末端结构域，除去约15个氨基酸。保留的N-末端结构域称为系锁配体，负责起始PAR1介导的信号传导。由凝血酶对PAR-1的这一切割产生细胞中快速和瞬时的钙流出，其可以使用可商购的试剂(例如，可从Molecular Devices商购)测量。具体的，可以使用表达PAR1的细胞，例如，HT-29、HCT-116或DU145细胞，评估抗体在凝血酶处理之后抑制钙流出的能力。可以使用本领域公知的任何方法测定钙流出。在一个实例中，在FlipR染料(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中的细胞用抗体预孵育(例如，约1小时)，用不同浓度的凝血酶诱导Ca2+流出。在检测PAR1拮抗剂活性之前可以使用本领域公知的任何方法纯化抗体。对照细胞未用抗体预孵育，或用对PAR1之外的抗原特异的抗体预孵育，或用已知不作为拮抗剂作用的抗-PAR1抗体预孵育。与在对照细胞中凝血酶-诱导的钙流出相比，在用本发明的PAR1拮抗剂抗体预孵育的细胞中，凝血酶-诱导的钙流出可检测的被抑制或减少。例如，与对照细胞相比，暴露于PAR1拮抗剂抗体的细胞中，凝血酶-诱导的钙流出减少至少约10％，例如，至少30％、50％或80％，或完全被抑制。
也可以通过测量候选抗-PAR1拮抗剂抗体对来自合适靶标细胞(例如，HUVEC)的凝血酶介导的IL-8分泌的抑制来测定抗体的PAR1拮抗剂活性。可以使用本领域任何公知的方法测量来自靶标细胞的凝血酶-介导的IL-8分泌。在一个实例中，细胞被暴露于凝血酶过夜，产生分泌进入培养基的IL-8的升高。在检测样品中，在先于凝血酶处理之前约1小时加入抗体。可以通过ELISA测量培养基中的IL-8。与对照细胞相比，抗-PAR1拮抗剂抗体抑制用凝血酶处理的靶标细胞的IL-8分泌的增加。对照细胞未用抗体预孵育，或用对PAR1之外的抗原特异的抗体预孵育，或用已知不作为拮抗剂作用的抗-PAR1抗体预孵育。与来自对照细胞的凝血酶诱导的IL-8分泌相比，在用本发明的PAR1拮抗剂抗体预孵育的细胞中，凝血酶-诱导的IL-8分泌可检测的被抑制或降低。例如，与对照细胞相比，在暴露于PAR1拮抗剂抗体的细胞中，凝血酶-诱导的IL-8分泌被减少至少约10％，例如，至少30％、50％或80％，或完全被抑制。
c.产生抗-PAR1抗体的多核苷酸、载体和宿主细胞
本发明提供多核苷酸(DNA或RNA)，其编码的多肽包含以上所述抗-PAR1抗体链或抗原结合分子的区段或结构域。在一些实施方案中，多核苷酸是基本纯化或分离的。本发明的一些多核苷酸包含编码重链可变区的多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：51、52、53和54，和编码轻链可变区的多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：55、56、57、58和59。本发明的一些多核苷酸包含重链可变区的核苷酸序列，其由选自SEQ ID NO：60、61和62的多核苷酸序列编码，和轻链可变区的核苷酸序列，其由选自SEQ IDNO：63、64和65的多核苷酸序列编码。本发明的一些其它的多核苷酸包含的核苷酸序列，其与在SEQ ID NO：60-65所述核苷酸序列之一是基本相同的(例如，至少70％、80％、95％、96％、97％、98％或99％)。当从合适的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示抗原结合能力。
在本发明中还提供多核苷酸，其编码在以下实施例中所述小鼠抗-PAR1抗体的重链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区。一些其它的多核苷酸编码小鼠抗-PAR1抗体的重链和/或轻链的全部或基本全部可变区序列。例如，这些多核苷酸中的一些编码与在SEQ ID NO：51、52、53或54中所示重链可变区具有至少约90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或与在SEQ ID NO：55、56、57、58和59中所示轻链可变区具有至少约90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。因为密码子简并性，许多核酸序列编码各个免疫球蛋白氨基酸序列。
本发明的多核苷酸能够仅编码抗-PAR1抗体的可变区序列。它们也可以编码抗体的可变区和恒定区。一些本发明核酸的多核苷酸序列编码成熟的重链可变区序列，其与在SEQ ID NO：5或7所示成熟重链可变区序列是基本相同的(例如，至少80％、90％或99％)。一些其它的多核苷酸序列编码成熟的轻链可变区，其与在SEQ ID NO：6或8所示成熟轻链可变区序列是基本相同的。一些多核苷酸序列编码多肽，该多肽包含示例小鼠抗-PAR1抗体之一的重链和轻链的可变区。一些其它的多核苷酸编码两个多肽区段，其分别与小鼠抗体之一的重链和轻链的可变区基本相同。
可以通过从头固相DNA合成或通过对编码抗-PAR1抗体或其结合片段的现存序列(例如，在以下实施例中所述序列)的PCR诱变产生多核苷酸序列。可以通过本领域公知的方法实现核酸的直接化学合成，例如Narang等人的磷酸三酯法，Meth.Enzymol.68：90，1979；Brown等人的磷酸二酯法，Meth.Enzymol.68：109，1979；Beaucage等人的二乙基磷酰胺酸法，Tetra.Lett.，22：1859，1981；和美国专利号4,458,066的固相支持法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以按照在例如，PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，H.A.Erlich(编)，Freeman Press，NY，NY，1992；PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Innis等人(编)，Academic Press，San Diego，CA，1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967，1991；和Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17，1991中所述执行。
本发明还提供产生上述抗-PAR1抗体的表达载体和宿主细胞。可以使用多种表达载体表达编码抗-PAR1抗体链或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病毒的和非病毒的表达载体在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(通常具有表达蛋白质或RNA的表达盒)，和人工人类染色体(见，例如，Harrington等人，Nat Genet 15：345，1997)。例如，对于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达抗-PAR1多核苷酸和多肽有用的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(Invitrogen，San Diego，CA)、MPSV载体和本领域公知的表达其它蛋白质的多种其它的载体。有用的病毒载体包括基于反转录病毒的载体、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒，基于SV40的载体、乳头瘤病毒、HBP非洲淋巴细胞瘤病毒、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒(SFV)。见，Brent等人，如上；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807，1995；和Rosenfeld等人，Cell 68：143，1992。
表达载体的选择依赖于载体待表达的预期宿主细胞。通常，表达载体含有能够被有效连接于编码抗-PAR1抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子阻止在除诱导条件下之外插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩增转化生物体的培养物而不使种群偏向编码序列，编码序列的表达产物被宿主细胞更好地耐受。除了启动子，也可能需要或期望其它调节元件以有效表达抗-PAR1抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其它序列。此外，可以通过包含对使用的细胞系统合适的增强子来提高表达效率(见，例如，Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125，1994；和Bittner等人，Meth.Enzymol.，153：516，1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子在哺乳动物宿主细胞中增加表达。
表达载体也可能提供分泌信号序列位置以与由插入的抗-PAR1抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更多情况下，插入的抗-PAR1抗体序列在被包含在载体之前即连接于信号序列。用来接受编码抗-PAR1抗体轻链和重链可变域序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这类载体使可变区能够与恒定区作为融合蛋白表达，藉此致使产生完整的抗体或其片段。通常，这类恒定区是人的。
包含和表达抗-PAR1抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是对于克隆和表达本发明的多核苷酸有用的一个原核宿主。适合使用的其它微生物宿主包括杆菌，例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，和其它肠杆菌，例如，沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)，和多种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，人们也可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞兼容的控制序列(例如，复制起始点)。此外，会存在任意数目的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选通过操纵基因序列进行，并具有用于起始和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。也可以使用其它微生物，例如，酵母，来表达本发明的抗-PAR1多肽。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一些优选的实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞表达和产生本发明的抗-PAR1多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，在实施例中所述骨髓瘤杂交瘤克隆)或含有外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常必死的或正常或非正常永生的动物或人细胞。例如，已经发展了能够分泌完整免疫球蛋白的多种合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。表达多肽的哺乳动物组织细胞培养物的使用被广泛讨论在，例如，Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如，复制起始点、启动子和增强子(见，例如，Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68，1986)，和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可能是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括，但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导的CMV启动子(例如，人即刻早期CMV启动子)、组成型CMV启动子、和本领域公知的启动子-增强子组合。
引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法依赖于细胞宿主类型而改变。例如，氯化钙转染是通常用于原核细胞的方法，而磷酸钙处理或电穿孔可以被用于其它细胞宿主(通常见Sambrook等人，supra)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物弹法、病毒体、免疫脂质体、多聚阳离子、核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、融合于疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliot和O’Hare，Cell 88：223，1997)、试剂增强的DNA摄取和离体转导。为了长期、高产率的生产重组蛋白，通常希望稳定的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达抗-PAR1抗体链或结合片段的细胞系，所述本发明的表达载体含有病毒复制起始点或内源表达元件和可选择的标记基因。在引入载体之后，可使细胞在转入选择培养基之前在富集培养基中生长1-2天。可选择标记的目的是赋予选择抗性，其存在使成功表达引入序列的细胞在选择培养基中能够生长。使用适合细胞类型的组织培养技术可以增殖有抗性的、稳定转染的细胞。
抗-PAR1抗体或抗原结合分子的特性
一旦从宿主细胞中的表达载体或在杂交瘤中内源性合成或表达上述抗-PAR1抗体或抗原结合分子，它们可以从，例如，培养基和宿主细胞容易的被纯化。通常，抗体链表达时具有信号序列，因此释放至培养基。然而，如果抗体链不是由宿主细胞天然的分泌，可以通过用温和去污剂处理来释放抗体链。然后可以通过常规方法纯化抗体链，包括硫酸铵沉淀、对固定靶标的亲和色谱法、柱色谱法、凝胶电泳等。这些方法均是本领域众所周知和常规操作的，例如Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，NY，1982；和Harlow & Lane，同上。
例如，表达本发明的抗-PAR1抗体的选择的杂交瘤可以在转瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可以过滤上清液并用蛋白质A-琼脂糖或蛋白质G-琼脂糖柱通过亲和色谱法浓缩。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查从柱洗脱的IgG分子以保证纯度。缓冲液可以被交换为PBS，可以通过OD280读数确定浓度。单克隆抗体可以等分试样和贮存在-80℃。
无论其制备方法，本发明的抗-PAR1抗体或抗原结合分子特异性结合于PAR1或其抗原片段。当抗体结合PAR1或其抗原片段的解离常数≤1μM，优选≤100nM，和最优选≤1nM时，存在特异性结合。可以通过直接标记目标抗体检测抗体结合于PAR1的能力，或者抗体可以是未标记的，使用多种夹心式测定法间接的检测结合。见，例如，Harlow & Lane，如上。具有这类结合特异性的抗体更可能享有由在以下实施例中讨论的小鼠或嵌合抗-PAR1抗体呈现的有利的特性。通常，本发明的抗-PAR1抗体或抗原结合分子以至少1×107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1的平衡缔合常数(KA)结合于PAR1多肽或抗原片段。此外，它们还具有约1×10-3s-1、1×10-4s-1、1×10-5s-1或更低的动力学解离常数(kd)，和以至少大于其结合非特异性抗原(例如，BSA)亲和力两倍的亲和力结合人PAR1(hPAR1)。
在一些实施方案中，本发明的抗体相对来自其它哺乳动物物种，例如，来自啮齿动物物种，包括小鼠、大鼠、兔和仓鼠的PAR1，优选的结合人PAR1。在一些实施方案中，本发明的抗体相对于其它PAR亚型，例如，PAR2、PAR3或PAR4，优选的结合于PAR1。
在一些实施方案中，本发明的抗-PAR1抗体或抗原结合分子阻断或与参考抗-PAR1抗体竞争结合PAR1多肽。参考抗-PAR1抗体能够特异性结合具有包含SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE(SEQ ID NO：1)氨基酸序列或其片段(例如，至少8、9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸的片段)的PAR1表位。这些可以上述的全人抗-PAR1抗体。它们也可以是与参考抗体结合相同表位的其它小鼠、嵌合或人源化的抗-PAR1抗体。阻断或与参考抗体竞争结合PAR1的能力表明所测试的抗-PAR1抗体或抗原结合分子结合于由参考抗体定义的相同或相似表位，或与参考抗-PAR1抗体结合的表位足够接近的表位。这类抗体尤其可能具有鉴定的参考抗体的有利特性。阻断或与参考抗体竞争的能力可以通过，例如，竞争结合测定来确定。使用竞争结合测定，在测试中检查该抗体抑制参考抗体特异性结合共同抗原(例如，PAR1多肽)或抗原上的表位的能力。如果过量的检测抗体基本抑制参考抗体的结合，则检测抗体与参考抗体竞争对抗原或表位的特异性结合。基本抑制意指检测抗体通常以10％、25％、50％、75％或90％减少参考抗体的特异性结合。
有多种公知的竞争结合测定可以被用于评估检测抗-PAR1抗体或抗原结合分子与参考抗-PAR1抗体对结合人PAR1(hPAR1)的竞争。这些包括，例如，固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(见Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253，1983)；固相直接生物素-亲和素EIA(见Kirkland等人，J.Immunol.137：3614-3619，1986)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(见Harlow& Lane，如上)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15，1988)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，Virology 176：546-552，1990)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82，1990)。通常，这类测定涉及使用结合于固体表面的纯化的抗原或带有抗原的细胞、未标记的测试抗-PAR1抗体和标记的参考抗体。通过在测试抗体存在下测定结合固体表面或细胞的标记的量测量竞争抑制。通常测试抗体是过量存在的。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合于相同表位的抗体、和结合于与参考抗体结合的表位足够接近而发生位阻的邻近表位的抗体。
为了确定是否测试抗-PAR1抗体或抗原结合分子和参考抗体结合唯一表位，可以使用可商购试剂(例如，来自Pierce，Rockford，IL的试剂)对各个抗体生物素化标记。使用PAR1多肽包被的ELISA平板可以进行用未标记单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。可以用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb的结合。为了确定纯化的抗-PAR1抗体的同种型，可以执行同种型ELISA。例如，可以用1μg/ml的抗人IgG包被微孔板的孔，在4℃过夜。在用1％ BSA封闭之后，用1μg/ml或更少的单克隆抗-PAR1抗体或纯化的同种型对照与平板在室温反应1至2小时。然后可以将孔与人IgG1或人IgM-特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。然后显影平板和分析，从而可以测定纯化抗体的同种型。
为了证明单克隆抗-PAR1抗体或抗原结合分子对表达PAR1多肽的活细胞的结合，可以使用流式细胞计数仪。简言之，可以将表达PAR1的细胞系(在标准生长条件下生长)与多种浓度的抗-PAR1抗体在含有0.1％ BSA和10％胎牛血清的PBS中混合，和在37℃孵育1小时。洗涤之后，在与一级抗体染色相同的条件下，细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。可以通过流式细胞计分析样品，使用光和侧散射特性门控单个细胞。可以使用荧光显微镜作为(另外或代替)流式细胞计数测定的备选测定。如上对细胞染色和通过荧光显微镜检测。
还可以通过免疫印迹检测本发明的抗-PAR1抗体与PAR1多肽或抗原片段的反应性。简言之，可以制备纯化的PAR1多肽或融合蛋白质，或来自表达PAR1细胞的细胞提取物，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清封闭，和用待检测的单克隆抗体作为探针检测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶和用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)显影来检测人IgG结合。
治疗应用和药物组合物
通过抑制PAR1信号传导活动，这里所述抗-hPAR1抗体或抗原结合分子可以用在许多治疗或预防应用。在治疗应用中，将包含抗-hPAR1拮抗剂抗体或抗原结合分子的组合物施用于已经患有由PAR1信号传导介导、引起或有关疾病或病症的受试者。该组合物含有足以抑制、部分阻碍或可检测的降低病情及其并发症发展的量的抗体或抗原结合分子。
在预防应用中，将含有抗-hPAR1抗体或抗原结合分子的组合物施用于尚未患有PAR1-信号传导相关病症的患者。而将它们施用于具有发展这类病征风险或倾向的受试者。这类应用使受试者能够增加患者的抗性或者延缓由PAR1信号传导介导的病征的进程。
多种疾病是由异常或反常地高的PAR1-介导的细胞内信号传导介导。异常高的PAR1-介导的细胞内信号传导可以是由，例如，受体暴露于异常高浓度的激活蛋白酶(例如，凝血酶)或异常高的细胞表面PAR1表达水平而引起。抑制PAR1对于治疗血栓形成和血管增生的病症以及抑制癌症(cancer)进程是有用的，所述癌症，例如，癌(carcinomas)或上皮癌，包括例如皮肤癌(包括黑色素瘤)、胃肠癌(包括结肠癌)、肺癌和乳腺癌(包括乳房和导管癌)、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、腺癌等。见，例如，Darmoul等人，Mol Cancer Res(2004)2(9)：514-22和Salah，等人，Mol Cancer Res(2007)5(3)：229-40。抑制PAR1还发现用于预防或抑制慢性肠炎，包括炎性肠病(IBD)、肠易激惹综合征(IBS)和溃疡性结肠炎；和纤维变性病，包括肝纤维化和肺纤维化。见，例如，Vergnolle等人，J Clin Invest(2004) 114(10)：1444；Yoshida，等人，AlimentPharmacol Ther(2006)24(Suppl 4)：249；Mercer等人，Ann NY Acad Sci(2007)1096：86-88；Sokolova和Reiser，Pharmacol Ther(2007)PMID：17532472。
能够通过本发明的抗-PAR1抗体抑制或预防的癌症包括，不限于，上皮癌包括癌(carcinomas)；神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、多发骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、和非霍奇金淋巴瘤(对于另外的癌症，见，CANCER：PRINCIPLES ANDPRACTICE(DeVita，V.T.等人编辑1997))。
抑制PAR1还发现用于预防或抑制可能是或不是由异常或反常地高的PAR1表达或细胞内信号传导介导的疾病。例如，抑制PAR1对于预防或抑制局部缺血再灌注损伤(包括心肌、肾脏、大脑和肠内的局部缺血再灌注损伤)是有用的。见，例如，Strande等人，Basic Res.Cardiol(2007)102(4)：350-8；Sevastos等人，Blood(2007)109(2)：577-583；Junge等人，Proc Natl Acad Sci U S A.(2003)100(22)：13019-24和Tsuboi等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol(2007)292(2)：G678-83。也可以将抑制PAR1细胞内信号传导用于抑制单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)对细胞的感染。见，Sutherland等人，J Thromb Haemost(2007)5(5)：1055-61。
本发明提供药物组合物，其包含与可药用载体一起配制的抗-hPAR1抗体或抗原结合分子。该组合物可以另外含有适合治疗或预防特定病征的其它治疗物质。制药载体提高或稳定该组合物，或有利于组合物的制备。可药用载体包括生理可兼容的溶剂、分散剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
可以通过本领域公知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和/或方式可以根据期望效果而改变。优选施用是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下的，或施用于靶标位点附近。可药用载体应该适合静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮的施用(例如，通过注射或灌输)。由施用途径决定，可以将有活性化合物(即，抗体、双特异性和多特异性分子)包被在材料中，以保护化合物免受可能灭活该化合物的酸和其它天然条件作用。
在一些实施方案中，组合物是无菌和液体的。可以例如，通过使用包衣例如卵磷脂，通过维持分散情况下所需颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质，例如，单硬脂酸铝或明胶带来可注射组合物的长效吸收。
可以根据本领域众所周知的方法和常规操作制备本发明的药物组合物。见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，MackPublishing Co.，20版，2000；和Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems，J.R.Robinson，编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，在本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的抗-hPAR1抗体。通过本领域技术人员公知的常规方法将抗-hPAR1抗体配制成为可药用剂型。调整给药方案以提供最佳期望应答(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个团注，可以在一段时间内施用数次分份剂量，或可以按照治疗情况紧急程度指示成比例的减少或增加剂量。以剂量单元形式配制胃肠道外的组合物对于容易的施用和均匀剂量是特别有利的。这里使用的剂量单元指对于要治疗的受试者适合作为单元剂量的物理分离的单元；各个单元含有结合了需要的治疗载体的、计算出的产生期望治疗效果的活性化合物的预定的量。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得对于特定患者、组合物和施用方式有效实现所期望治疗应答，而对患者没有毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物、或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，所治疗患者的年龄、性别、体重、状态、整体健康和先前病史，等等因素。
医生或兽医可以在药物组合物中以低于获得期望治疗效果所需水平开始使用本发明的抗体的剂量，逐渐增加剂量直至获得期望效果。通常，本发明组合物的有效剂量依据许多不同因素而改变，包括要治疗的特定疾病或病征、施用方式、靶标位点、患者的生理学状态、患者是人或动物、施用的其它药物、和治疗是预防还是治疗的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。对于抗体施用，剂量范围从宿主体重的约0.0001至100mg/kg，和更通常从0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围之内。示例性的治疗方案要求施用每两周一次或每月一次或每3至6个月一次。
在其中该物质是核酸的实施方案中，典型剂量范围可以从约0.1mg/kg体重达并包括约100mg/kg体重，优选在约1mg/kg体重至约50mg/kg体重之间。更优选约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50mg/kg体重。
通常以多次施用抗体。在单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中抗-hPAR1抗体的血液水平所示，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂量以获得血浆抗体浓度为1-1000μg/ml和在一些方法中25-300μg/ml。或者，可以将抗体作为持续释放制剂施用，此种情况下需要施用的频率较少。依据在患者中抗体的半衰期改变剂量和频率。通常，人源化抗体显示比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施用的剂量和频率可以依据治疗是预防性或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间以相对不频繁间隔施用相对低剂量。一些患者在余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要相对短时间间隔、相对高剂量直至减少或终止该疾病进展，优选直至患者显示疾病症状的部分或全部的改善。此后，患者可以被施用预防性方案。
实施例
提供下列实施例以说明，而非限定要求的发明。
实施例1：下列实施例提供对在人中具有最小化免疫原性的抗-Par-1
抗体的构建和筛选。
方法
鼠V-区的亚克隆
从鼠单克隆4E7.J14亚克隆鼠V-区。使用PCR扩增V-重链和V-κ区的V-基因和掺入适合克隆进入表达载体的限制性内切酶位点。在pBR322载体系统中，V-区被克隆为带有人IgG1恒定区的Fab’片段。在大肠杆菌中从pTAC启动子表达Fab’。在ELISA测定中，纯化的Fab’蛋白(克隆PR15-5)显示结合Par-1抗原。
Fab’和Fab纯化
使用表达载体通过从大肠杆菌分泌表达Fab’和Fab片段。细胞在2xYT培养基中生长至在600nm波长测量光密度(OD600)为0.6。在33℃使用异丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)诱导表达3小时。从胞质部分获得装配的Fab’或Fab和根据标准方法使用链球菌蛋白质G通过亲和色谱法(HiTrap蛋白质GHP柱；GE Healthcare)纯化。在pH 2.0缓冲液中洗脱Fab’和Fab，立即调节至pH 7.0和对PBS pH7.4透析(PBS是没有钙和镁的)。
ELISA
通常，通过在4℃孵育过夜，50ng/孔的Par-1抗原结合于96孔微孔板。用在含有0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液(“PBST”)中5％牛奶的溶液在33℃封闭平板1小时。在PBS中稀释Fab或参考Fab’(PR15-5)和每孔加入50μl。在33℃孵育1小时之后，用PBST洗平板3次。每孔加入50μl的抗-人-κ链辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Sigma；在PBST中稀释至0.1ng/ml)和在33℃孵育平板40分钟。用PBST洗平板3次和用PBS洗一次。每孔加入100μl的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma)和在室温孵育～5分钟。为了终止反应，每孔加入100μl的0.2N H2SO4。在分光光度计于450nm读取平板。
筛选
对Fab片段文库的筛选按照在美国专利公开号2005/0255552和2006/0134098中所述使用重组Par-1抗原包被的硝化纤维素滤器进行。这些专利出版物的全部公开在此通过其整体参考被并入用于全部目的。
亲和力测量
使用ForteBio Octet生物传感器分析Fab’和Fab片段的结合动力学。根据厂商方法使用EZ-link生物素化作用试剂盒(Pierce)生物素化重组抗原。然后将抗原偶联于中和亲和素(neutravidin)包被的传感器(ForteBio)。使用生物涂层干涉量度法分析和由厂商提供的软件实时监测Fab’和Fab结合。从测定的结合和解离常数计算亲和力。
结果
V-区的克隆和表达
ForteBio Octet检测证实亚克隆的V-区的Par-1抗原结合活性。
对鼠V-区克隆、测序和表达。V-区被克隆为带有人IgG1恒定区的Fab’片段和在大肠杆菌中表达。在Par-1抗原结合的ForteBio Octet检测中，克隆的Fab’PR15-5产生依赖于抗体浓度的结合曲线。见，表1。
表1
| PR15-5 | PR15-5 | |
| 摩尔浓度[M] | 5E-8 | 2.5E-8 |
| K解离[1/s] | 2.43E-4 | 2.61E-4 |
| K结合[1/Ms] | 2.97E5 | 2.97E5 |
| KD[M] | 8.19E-10 | 8.77E-10 |
文库构建和V-区表达盒
从连接于参考Fab’PR15-5的独特CDR3区的人V-区段序列文库构建表位集中(Epitope-focused)的文库；FR4区分别是重链和轻链的人种系JH6和Jk2。这些“全长”文库被用作其中仅部分鼠V-区段是由人序列文库一开始替代的“表达盒”文库的构建基础。使用构架2(FR2)区内重叠的共有序列通过桥式PCR制备V-重链和V-κ链的表达盒(cassettes)。以这一方法构建人V-重链1和V-κIII亚类的“前-末端”和“中间”的人表达盒文库。通过菌落转移结合测定鉴定支持结合Par-1-抗原的人表达盒和根据在ELISA和ForteBio Octet生物传感器分析中的亲和力排序。然后在二级文库筛选中重组最高亲和力表达盒的集合以产生全人V-区段。以这一方式完成的表达盒筛选鉴定具有Par-1抗原结合活性的多种人V-轻链和人V-重链“前-末端”表达盒。
在备选方法中，构建诱变文库，其中在此CDR2内的各个残基被突变为鼠序列或来自单个人种系序列的对应残基(VH1-46是对于鉴定的“前-末端”表达盒最接近的人种系序列)(见，图3)。这一诱变文库被偶联于选择的“前-末端”和已知支持抗原结合的人构架3(FR3)序列。这一文库的全部成员具有PR15-5参考Fab’的共同CDR3序列，连同人种系FR4序列。因此，通过菌落转移结合测定建立、筛选基因工程构建的人“中间”表达盒文库，通过ELISA和ForteBio Octet选择和进一步分析抗原结合克隆。以此方式，鉴定支持Par-1抗原结合的多种CDR序列接近人种系氨基酸序列(见图3)。
在鉴定接近人种系序列的高亲和力Fab集合之后，建立亲和力成熟文库。使用退化性PCR引物突变一组最佳Fab克隆的共有CDR3序列以产生文库。使用菌落转移结合测定筛选诱变文库。使用ELISA和ForteBio分析，对选择的Fab亲和力排序。鉴定当与PR15-5参考Fab’相比时支持对抗原等同的或提高的亲和力的突变。见，表2。
使用Forte Octet分析Fab’和Fab对人Par-1抗原的亲和力
通过与参考Fab’PR15-5的动力学比较，进一步表征由菌落转移结合测定和ELI SA从表达盒和诱变文库筛选分离的完全优化的Fab。使用ForteBio Octet系统的蛋白质-蛋白质相互作用的实时无标记监测分析结合动力学。计算的结合和解离和总亲和力常数显示于表2。
表2
| 实验1 | 实验1 | 实验2 | 实验2 | 实验2 | ||
| PR15-5 | LDS896 | PR15-5 | LDS900 | LDW653 | ||
| 摩尔浓度[M] | 1E-8 | 1E-8 | 5E-8 | 2.5E-8 | 2.5E-8 | |
| k解离[1/s] | 3.08E-4 | 3.11E-4 | 3.50E-4 | 2.89E-4 | 2.93E-4 | |
| K结合[1/Ms] | 3.95E5 | 2.65E5 | 3.29E5 | 1.96E5 | 2.59E5 | |
| KD[M] | 7.79E-10 | 1.18E-9 | 1.06E-9 | 1.47E-9 | 1.13E-9 |
表2显示使用ForteBio Octet生物传感器技术通过生物涂层干涉量度法对Fab’和Fab结合于重组Par-1抗原的分析，显示结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和计算的亲和力(KD)。改良的Fab克隆LDS-896、LDS900和LDW653和参考Fab’克隆PR15-5的动力学分析证明全部具有对Par-1抗原的高亲和力。
图3显示与人种系序列相比，优化的Fab LDS-896、LDS900和LDW653的V-区序列的氨基酸序列比对。参考和优化的V-区序列对于相应人种系氨基酸序列的百分数氨基酸序列同一性被显示在表3。
表3
| 抗体 | Vh同一性，对于Vh1-46/JH6 | Vk同一性，对于VkII A3/Jk2 |
| 4E7.J14 | 64％ | 80％ |
| LDS896 | 81％ | 92％ |
| LDS900 | 88％ | 92％ |
| LDW653 | 92％ | 92％ |
在表3中的全部百分数序列同一性代表对于除了CDR3BSD序列之外跨V-区的单个人种系序列的同一性。可见全部三个改良的Fab的大部分V-区极度接近于相应人种系序列，具有约90％的百分数氨基酸序列同一性。
尽管通过目的为清楚理解的图解和示例已经对上述发明进行了详细描述，对于本领域普通技术人员显而易见的是在本发明的指导下可以对其进行某些改变和修饰而不背离所附权利要求书的精神和范围。
在本说明书中引用的全部出版物、数据库、基因文库序列、专利和专利申请在此通过参考被并入，如同其各自被明确和个别的表示为通过参考被并入。
序列表
<110>IRM责任有限公司
<120>蛋白酶激活受体1(PAR1)的拮抗剂抗体
<130>P1311PC00
<140>
<141>
<150>60/950,290
<151>2007-07-17
<160>70
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>1
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe Trp Glu
1 5 10 15
Asp Glu Glu Lys Asn Glu Ser Gly Leu Thr Glu
20 25
<210>2
<211>5
<212>PRT
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<220>
<221>来源
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<220>
<221>变体
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<220>
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<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
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<211>5
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<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
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<221>来源
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<221>变体
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<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(3)
<223>替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(4)
<223>替换＝″Tyr″
<220>
<221>变体
<222>(6)
<223>替换＝″Leu″或″Pro″或″Met″或″Glu″或″Trp″或″Thr″或″Ser″或″Gln″或″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(8)
<223>替换＝″Phe″
<400>10
Asp Asp Gly Pro Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>11
Asp Asp Gly Pro Ser Met Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>12
Asp Asp Gly Pro Ser Leu Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>13
Asp Asp Gly Pro Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(9)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(12)
<223>替换＝″Asn″
<220>
<221>变体
<222>(16)
<223>替换＝″Glu″
<400>14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>16
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(1)
<223>替换＝″Lys″
<220>
<221>变体
<222>(2)
<223>替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(6)
<223>替换＝″Phe″
<400>17
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser
1 5
<210>19
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>19
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(4)
<223>替换＝″Asp″或″Ala″或″Val″
<220>
<221>变体
<222>(5)
<223>替换＝″Arg″或″Thr″或″Ser″或″Lys″
<400>20
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210>21
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro
1 5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>22
Phe Gln Gly Ser Ser Val Pro Phe Thr
1 5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>23
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr
1 5
<210>24
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(1)
<223>替换＝″Gln″
<220>
<221>变体
<222>(16)
<223>替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(24)
<223>替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(27)
<223>替换＝″Tyr″
<220>
<221>变体
<222>(30)
<223>替换＝″Asn″
<400>24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
<210>25
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn
20 25 30
<210>26
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
<210>27
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>27
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210>28
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(6)
<223>替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(13)
<223>替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(18)
<223>替换＝″Arg″
<220>
<221>变体
<222>(21)
<223>替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(23)
<223>替换＝″Asp″
<400>28
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>29
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>30
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>30
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>31
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>31
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>33
<211>23
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210>34
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(11)
<223>替换＝″Arg″
<400>34
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210>35
<211>15
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210>36
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>36
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210>37
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(11)
<223>替换＝″Ala″
<400>37
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>38
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>39
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>39
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210>41
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：Synthetic polypeptide″
<220>
<221>变体
<222>(1)
<223>替换＝″Glu″
<220>
<221>变体
<222>(16)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(24)
<223>替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(27)
<223>替换＝″Gly″
<220>
<221>变体
<222>(30)..(31)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(33)
<223>替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(34)
<223>替换＝″Phe″
<220>
<221>变体
<222>(35)
<223>替换＝″His″
<220>
<221>变体
<222>(50)
<223>替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(52)
<223>替换＝″Asp″
<220>
<221>变体
<222>(54)
<223>替换＝″His″
<220>
<221>变体
<222>(57)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(59)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(61)
<223>替换＝″Asn″
<220>
<221>变体
<222>(72)
<223>替换＝″Arg″
<220>
<221>变体
<222>(79)
<223>替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(87)
<223>替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(89)
<223>替换＝″Glu″
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>42
<211>98
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>43
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro His Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>44
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Hi s Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>45
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Phe Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro His Ser Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210>46
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(32)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(35)
<223>替换＝″Asn″
<220>
<221>变体
<222>(39)
<223>替换＝″Glu″
<220>
<221>变体
<222>(55)
<223>替换＝″Leu″
<220>
<221>变体
<222>(56)
<223>替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(60)
<223>替换＝″Phe″
<400>46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90
<210>47
<211>93
<212>PRT
<213>智人
<400>47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90
<210>48
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90
<210>49
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>49
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90
<210>50
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90
<210>51
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>变体
<222>(1)
<223>替换＝″Glu″
<220>
<221>变体
<222>(16)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(24)
<223>替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(27)
<223>替换＝″Gly″
<220>
<221>变体
<222>(30)..(31)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(33)
<223>替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(34)
<223>替换＝″Phe″
<220>
<221>变体
<222>(35)
<223>替换＝″His″
<220>
<221>变体
<222>(50)
<223>替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(52)
<223>替换＝″Asp″
<220>
<221>变体
<222>(54)
<223>替换＝″His″
<220>
<221>变体
<222>(57)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(59)
<223>替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(61)
<223>替换＝″Asn″
<220>
<221>变体
<222>(72)
<223>替换＝″Arg″
<220>
<221>变体
<222>(79)
<223>替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(87)
<223>替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(89)
<223>替换＝″Glu″
<220>
<221>变体
<222>(104)
<223>替换＝″Leu″或″His″
<400>51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 l5
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Pro Ser Met Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>52
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro His Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Pro Ser Met Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro His Gly Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Pro Ser Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成肽
<400>54
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Phe Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro His Ser Gly Arg Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Pro Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
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115 120
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<220>
<221>变体
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<223>替换＝″His″
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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100 105 110
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<213>智人
<400>56
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212>PRT
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
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Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser Ser Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<400>58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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<221>来源
<223>人工序列说明：合成多核苷酸
<400>60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcaac agctactata tgaactgggt gcgacaggcc 120
ccgggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcgatcctc atggtggtcg tactcgttac 180
aatcagaagt tcaagggcag agtcacgatg accacagaca catccacgag cacagtctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaagac acagccgtgt actactgcgc acgcgatgat 300
ggtccgagca tgtggtactt cgatgtgtgg ggtcagggta ccaccgtgac cgtgagctcc 360
<210>61
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列说明：合成多核苷酸
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tcctgcaagg catctggata caccttcaac agctactata tgaactgggt gcgacaggcc 120
ccgggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcgatcctc atggtggtcg tactcgttac 180
aatcagaagt tcaagggcag agtcacgatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgac atctgacgac acagccgtgt actactgcgc acgcgatgat 300
ggtccgagcc tgtggtactt cgatgtgtgg ggtcagggta ccaccgtgac cgtgagctcc 360
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<400>62
gaggtccagc tggtgcagtc tggggctgaa gtgaagaagc cggggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg tctctggagg caccttcagc aactatgtct tcaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagtt atcaatcctc atagtggtcg tactcgttac 180
aatcagaagt tcaagggcag agtcacgatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggagcctgac atctgacgac acggctgtgt actactgcgc acgcgatgat 300
ggtccgagcc actggtactt cgatgtgtgg ggtcagggta ccaccgtgac cgtgagctcc 360
<210>63
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成多核苷酸
<400>63
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg cataggaatg gaaacaacta tttggaatgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgttggggtt tactactgct ttcaaggttc ttcggttccg 300
ttcacatttg gccaaggtac gaaactggaa attaaa 336
<210>64
<211>336
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成多核苷酸
<400>64
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg cataggaatg gaaacaacta tttggaatgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgttggagtt tactactgct ttcaaggttc tcatgttccg 300
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>来源
<223>人工序列说明：合成多核苷酸
<400>65
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg cataggaatg gaaacaacta tttggaatgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180
tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aagctgagga tgtcggagtt tactactgct ttcaaggttc tcatgttccg 300
ttcacgtttg gccaaggtac gaaactggaa attaaa 336
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<212>PRT
<213>智人
<400>66
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210>67
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>67
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211>6
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<223>人工序列说明：合成肽
<400>68
Ser Phe Leu Leu Arg Asn
1 5
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<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>69
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>70
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
Claims (33)
1.结合蛋白酶激活受体-1(PAR1)的抗体，其中该抗体包含
(a)重链可变区，其包含人重链V-区段、重链互补决定区3(CDR3)、和重链构架区4(FR4)，和
(b)轻链可变区，其包含人轻链V-区段、轻链CDR3、和轻链FR4，其中
i)重链CDR3包含氨基酸序列DDX1X2SX3WX4FDV，其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是H、L、P、M、E、W、T、S、Q或A，X4是Y或F(SEQ ID NO：10)；
ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列FQGX5X6VPFT，其中X5是S、D、A或V，X6是H、R、T、S或K(SEQ ID NO：20)；
其中该抗体是PAR1拮抗剂。
2.权利要求1的抗体，其中重链V-区段与SEQ ID NO：41共有至少90％序列同一性，其中轻链V-区段与SEQ ID NO：46共有至少90％序列同一性。
3.权利要求1的抗体，其中重链V-区段与选自SEQ ID NO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸共有至少90％序列同一性，其中轻链V-区段与选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的氨基酸共有至少90％序列同一性.
4.权利要求1的抗体，其中：
i)重链CDR 3包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列；和
ii)轻链CDR3包含选自SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
5.权利要求1的抗体，其中重链FR4是人种系FR4。
6.权利要求5的抗体，其中重链FR4是人种系JH6(WGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：32)。
7.权利要求5的抗体，其中重链J-区段包含人种系JH6部分序列DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：66)。
8.权利要求1的抗体，其中轻链FR4是人种系FR4。
9.权利要求8的抗体，其中轻链FR4是人种系Jk2(FGQGTKLEIK；SEQID NO：40)。
10.权利要求8的抗体，其中轻链J-区段包含人种系Jk2部分序列TFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：67)。
11.权利要求1的抗体，其中重链V-区段和轻链V-区段各自包含互补决定区1(CDR1)和互补决定区2(CDR2)；其中：
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
iii)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；和
iv)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列.
12.权利要求11的抗体，其中
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：4；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：8；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：11；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：22。
13.权利要求11的抗体，其中
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：4；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：8；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：12；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23。
14.权利要求11的抗体，其中
i)重链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：5；
ii)重链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：9；
iii)重链CDR3包含SEQ ID NO：13；
iv)轻链V-区段的CDR1包含SEQ ID NO：16；
v)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO：19；和
vi)轻链CDR3包含SEQ ID NO：23。
15.权利要求1的抗体，其中重链可变区与SEQ ID NO：51的可变区共有至少90％氨基酸序列同一性，轻链可变区与SEQ ID NO：55的可变区共有至少90％氨基酸序列同一性。
16.权利要求1的抗体，其中重链可变区与选自SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53和SEQ ID NO：54的可变区共有至少90％氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的可变区共有至少90％氨基酸序列同一性。
17.权利要求1的抗体，其中重链可变区与选自SEQ ID NO：52、SEQ I DNO：53和SEQ ID NO：54的可变区共有至少95％氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的可变区共有至少95％氨基酸序列同一性。
18.权利要求1的抗体，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO：52、SEQID NO：53和SEQ ID NO：54的氨基酸序列，轻链可变区包含选自SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
19.权利要求1的抗体，其中该抗体以小于1x10-8M的平衡解离常数(KD)结合于PAR1。
20.权利要求1的抗体，其中该抗体是FAb’片段。
21.权利要求1的抗体，其中该抗体是IgG。
22.权利要求1的抗体，其中该抗体是单链抗体(scFv)。
23.权利要求1的抗体，其中该抗体包含人恒定区。
24.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO：52的重链和包含SEQ ID NO：57的轻链。
25.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO：53的重链和包含SEQ ID NO：58的轻链。
26.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO：54的重链和包含SEQ ID NO：59的轻链。
27.可药用组合物，其包含权利要求1-26的任一项的抗体和生理相容的赋形剂。
28.改善由通过PAR1的细胞内信号传导介导的疾病症状的方法，包括向有需要的患者施用权利要求1-26的任一项的抗体，其中该抗体是PAR1的拮抗剂。
29.权利要求28的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是慢性肠炎。
30.权利要求28的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是纤维变性病。
31.权利要求28的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是过表达PAR1的癌症。
32.权利要求28的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号传导介导的疾病是局部缺血再灌注损伤。
33.特异性结合PAR1的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各自包含下列三个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3；其中：
i)重链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5的氨基酸序列；
ii)重链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：9的氨基酸序列；
iii)重链可变区的CDR3包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的氨基酸序列；
iv)轻链可变区的CDR1包含选自SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的氨基酸序列；
v)轻链可变区的CDR2包含选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19的氨基酸序列；
vi)轻链可变区的CDR 3包含选自SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
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