CN101936906B - 载体和试剂盒以及表面增强拉曼光谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种载体，其中，所述载体包括支撑体(11)和至少一个分析单元，每个分析单元包括除液结构、多孔基质层(12)和增强层(14)，多孔基质层(12)和增强层(14)位于除液结构之上，所述除液结构位于所述支撑体(11)中或位于所述支撑体(11)表面上，所述增强层(14)位于所述多孔基质层(12)表面上，所述除液结构用于接收来自多孔基质层(12)的液体，所述增强层(14)用于增强拉曼散射强度。本发明还提供了含有所述载体的试剂盒以及使用所述载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。本发明提供的载体能够使拉曼散射信号得到明显增强，从而灵敏度很高，而且还可以通过加入内标物或外标物进行定量分析。

Description

载体和试剂盒以及表面增强拉曼光谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种载体以及包括所述载体的试剂盒，另外，本发明还涉及使用所述载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法以及所述载体的用途。

背景技术

任何物质都是由一个或更多的化学成分组成。化学分析是分析单一或复杂的化合物化学结构、组成和数量的方法和过程。因此化学分析在农业、制造业、商业贸易、医疗保健和公共卫生以及人们的日常生活具有重要意义。因此，关于化学分析方面的研究进行得如火如荼。

拉曼光谱(RS)和红外光谱(IR)同属分子振动光谱，但它们的机理不同：红外光谱是分子对红外光的特征吸收，而拉曼光谱则是分子对光的散射(即拉曼散射)。拉曼散射是光子的非弹性散射。当光被原子或分子散射，其中大部分光子被弹性散射(瑞利散射)，这种散射的光子与入射光的光子具有相同的能量(频率)和波长。然而，一小部分散射光的光子与入射光的光子具有不同的频率，而且通常低于或高于入射光光子的频率。由于拉曼散射光的频率位移对应于分子中电子的能态改变，因此拉曼光谱技术便成为人们研究分子结构的新手段之一。20世纪40年代，由于当时的仪器技术水平所限，也由于红外光谱技术的迅速发展，拉曼光谱一度处于低潮阶段。20世纪60年代初，激光器的出现为拉曼光谱提供了理想的光源，再加上计算机的发展，使激光拉曼光谱逐步成为分子光谱学中的一个活跃分支。

表面增强拉曼光谱(SERS)是拉曼光谱分析技术的一种变体，是一种对金属表面敏感的技术。如果分子在位置上接近于特定金属表面，由于分子和金属的表面电子之间的附加能量传递，拉曼信号的强度能够被极大地增加，增强因子可高达10¹⁴至10¹⁵，这使得该技术可用于探测单个分子。为了进行SERS，所述分析物分子被吸附在纳米级的粗糙金属表面上，以检测到增强的拉曼散射。金和银是典型的用于表面拉曼光谱增强的金属，因为它们的等离子体共振频率位于可见光和近红外辐射频率范围。金属铜、镍、铂、铁和铝也可用于表面增强拉曼散射。

相比红外光谱和荧光技术，表面增强拉曼光谱(SERS)可以提供丰富的分子结构信息；相比质谱，SERS相对便宜、体积小。目前公知的使用表面增强拉曼光谱进行化学分析的方法有两种。第一种方法是以没有液体吸收或不透水性的固体物质如金属、陶瓷或玻璃作为载体，将含有待测样品和金属纳米颗粒的混合液置于该载体的表面上，然后用激光拉曼光谱仪进行检测。此方法测量结果误差较大，很难操作。第二种方法同样以没有液体吸收或不透水性的固体物质如金属、陶瓷或玻璃作为载体，不同的是首先将金属纳米材料固定在该载体的表面上，然后将待测样品的溶液置于有金属纳米颗粒的载体的表面上，并用拉曼光谱仪进行分析。然而，此方法存在拉曼信号弱、灵敏度低的缺点。而且，在上述两种方法中检测样品在检测过程是液体，且不能浓缩，从而导致拉曼信号较弱、灵敏度较低，因此不能用于定量分析。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的表面增强拉曼光谱方法存在拉曼信号不稳定、灵敏度低、操作困难和不能用于定量分析的缺陷，提供一种能够使表面增强拉曼光谱分析拉曼信号稳定、灵敏度高、操作便利且可进行定量分析的载体。

本发明的另一目的是提供包括上述载体的试剂盒以及使用上述载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

本发明提供了一种载体，其中，所述载体包括支撑体和至少一个分析单元，每个分析单元包括除液结构、多孔基质层和增强层，多孔基质层和增强层位于除液结构之上，所述除液结构位于所述支撑体中或位于所述支撑体表面上，所述增强层位于所述多孔基质层材质表面上，所述除液结构用于接收来自多孔基质层的液体，所述增强层用于增强拉曼散射强度。

本发明还提供了一种试剂盒，其中，该方法包括将待测样品的溶液负载到载体上，然后测定待测样品的拉曼光谱，其中，所述载体为本发明提供的载体，负载到载体上的方法为将待测样品的溶液加到所述载体的增强层上。

本发明的发明人研究发现，虽然现有技术的第一种方法由于金属纳米颗粒的加入而在一定程度上能够增强拉曼散射信号，但是当用拉曼光谱仪分析待测样品时，由于混合液中的金属纳米颗粒下沉，使得金属纳米颗粒偏离拉曼光谱分析的激光焦平面，因而拉曼信号不稳定，且灵敏度很低。第二种方法虽然克服了由于金属纳米颗粒下沉而偏离激光焦平面的缺陷，但是在该方法中由于待测样品处在溶液状态和表面金属纳米颗粒不能有效地混合，因而增强效应较低，导致拉曼信号的灵敏度低。

本发明提供的载体结构简单、操作方便且灵敏度高。使用本发明提供的载体进行化学分析时，将样品以溶液的形式滴在所述载体的多孔基质层上后，由于存在除液结构，因而溶液中的溶剂能够迅速被吸干，待测样品中的待测成分均匀附着在增强层的增强剂表面上，具有浓缩和变液体样品为固体样品的特征，从而可以直接用于分析，因而操作非常方便。通过使待测样品中的待测成分均匀附着在增强层的增强剂表面上，一方面避免了金属纳米颗粒下沉而导致偏离激光焦平面和拉曼信号不稳定的问题，另一方面还解决了现有技术存在的待测样品浓度低导致难于测试和拉曼信号很弱而无法进行定量分析的问题。而且，使用本发明提供的载体，可以通过除液结构使大容量的液体样品附着到小面积固体表面上，并形成固体样品层，再对该样品层进行拉曼光谱分析便可显著提高检测的灵敏度。另外，根据本发明提供的优选实施方式，通过加入内标物和外标物可以对待测样品进行精确的定量分析。

附图说明

图1表示本发明提供的载体的除液结构为吸液层时的纵截面示意图；

图2表示本发明提供的载体的除液结构为孔道时的纵截面示意图；

图3表示本发明提供的载体的除液结构为吸液层且所述载体还包括壳层的纵截面示意图；

图4表示本发明提供的载体的除液结构为孔道且所述载体还包括壳层的纵截面示意图；

图5表示本发明提供的载体包括壳层时的俯视图；

图6表示本发明提供的载体还包括滤膜的纵截面示意图；

图7表示拉曼光谱仪结构示意图；

图8表示实施例1中检测得到的拉曼光谱图；

图9表示实施例2中检测得到的拉曼光谱图；

图10表示对比例1中检测得到的拉曼光谱图；

图11表示实施例3的中药剂未煎煮前、煎煮15分钟、煎煮30分钟、煎煮60分钟、煎煮90分钟和煎煮120分钟的测试结果图。

图12表示根据实施例4的外标物待测样品的拉曼光谱图中在686cm^-1处的散射峰强度制定的标准曲线图；

图13表示根据实施例5的测试样品C1-C6的拉曼光谱中686cm^-1处的散射峰强度与730cm^-1处的散射峰的强度的比值制定的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合图1-6对本发明提供的载体作详细地说明。

如图1-6所示，本发明提供的载体支撑体11和至少一个分析单元，每个分析单元包括除液结构、多孔基质层12和增强层14，多孔基质层12和增强层14位于除液结构之上，所述除液结构位于所述支撑体11中或位于所述支撑体11表面上，所述增强层14位于所述多孔基质层12材质表面上，所述除液结构用于接收来自多孔基质层12的液体，所述增强层14用于增强拉曼散射强度。

所述支撑体11的材质可以是各种不影响测试的固体材料，例如可以是金属、塑料、玻璃或它们的复合材料。在本发明中，所述支撑体11的形状和大小没有特别的限定、只要能够放入拉曼散射仪中进行测试即可，例如，所述支撑体11可以为矩形薄片或圆形薄片。所述支撑体11的面积可以为1-1000平方厘米，优选为10-100平方厘米。所述支撑体11的厚度可以为0.5-50毫米，优选为1-5毫米。

在优选情况下，所述分析单元为多个，相邻的2个分析单元互相间隔开，多个分析单元可以共用一个除液结构，各个分析单元也可以具有单独的除液结构，即相邻的2个分析单元的除液结构互相间隔开。在使用过程中，每个分析单元可以分别用于测量一个样品，因此分析单元的个数越多，能测量的样品的个数也越多。进一步优选情况下，所述载体包括两排平行分布的分析单元，同一排分析单元的中心在同一条直线上，两排相邻的四个分析单元的中心连线形成矩形或正方形。为了减少样品之间的干扰，相邻两个分析单元的多孔基质层12最小距离为1-100毫米，所述最小距离是指相邻两个分析单元的边缘的最小距离。

在本发明的一种实施方式中，所述除液结构为吸液层13a，所述吸液层13a位于支撑体11的表面。所述吸液层13a的吸液量优选为1-1000微升，进一步优选为1-100微升。所述吸液层13a的材质为海绵、吸液性树脂、纤维素纸、玻璃纤维或它们的结合。所述吸液层的厚度为0.1-10毫米，优选为0.5-5毫米。所述吸液层的吸液率为0.1-50，优选为0.5-10，所述吸液率是指单位重量的吸液层能够吸收液体的最大重量值。所述吸液层13a可以完全覆盖所述支撑体11，也可以局部覆盖所述支撑体11。具体地，在所述吸液层局部覆盖所述支撑体11的情况下，当本发明的载体包括一个分析单元时，所述吸液层13a为一个面积远小于支撑体的块状物；当本发明的载体包括两个以上的分析单元时，所述吸液层13b为两个以上的不连续的块状物，所述不连续的块状物可以具有相同或不同的尺寸和形状，优选具有相同的尺寸和形状。

在本发明的另一种实施方式中，所述除液结构为位于支撑体11中的孔道13b。所述孔道13b包括入口13b1和出口13b2，所述入口13b1位于多孔基质层12的下方，来自多孔基质层12的液体通过所述入口13b1导入孔道13b中，并通过所述出口13b2导出支撑体11。当本发明提供的载体具有多个分析单元时，所述孔道13b包括多个入口13b1，且每个入口各自连接一个分析单元。另外，所述入口13b1的横截面积为其对应的分析单元的多孔基质层12面积的0.1-99％。另外，所述孔道13b与每个分析单元连接的入口的个数可以为多个，当设置在每个分析单元正下方的入口数为多个时，各个入口的横截面积之和与管道的截面积均符合上述比例。

在本发明的载体中，所述多孔基质层12用于聚集增强剂以形成增强层，并保证液体能够通过。所述多孔基质层12的上表面尺寸可以为10微米-10毫米，优选为0.5-5毫米，所述多孔基质层12的上表面可以为各种规则的形状如圆形或正方形，当所述多孔基质层12的上表面为圆形时，则所述上表面的尺寸是指圆形的直径尺寸；当所述多孔基质层12的上表面为长方形或正方形时，则所述上表面的尺寸是指正方形的对角线的尺寸。所述多孔基质层12可以由各种多孔材料形成，所述多孔材料可以是有机聚合物、无机材料或者它们的复合材料，例如可以是玻璃纤维、纤维素、尼龙、多孔硅、多孔玻璃、多孔金属、多孔金属氧化物和硅纳米结构材料中的一种或几种。所述多孔金属可以是贵金属如金、银，所述多孔金属氧化物可以是氧化铝。

所述多孔基质层12的厚度为0.05-5毫米，优选为0.1-0.5毫米。所述多孔基质层12的孔径为10纳米-10微米，优选为25-500纳米，进一步优选为50-250纳米，从而所述多孔基质层12能够截留颗粒大小大于该孔径的固体颗粒。在上述优选的孔径范围内，一方面能够避免因孔径太大而导致增强剂如金属纳米颗粒通过孔隙而难以形成增强层，并能够防止待测样品中的待测成分通过孔隙而流失，另一方面还能使待测样品中的溶剂如牛奶中的水分快速通过孔隙进入除液结构中，使待测成分和增强剂迅速附着到多孔基质层12上，形成待测样品层。所述多孔基质层12的孔隙率为1-99％，优选为10-90％。在本发明中，所述孔隙率是指孔隙的体积占整个多孔基质层总体积的百分比。

所述多孔基质层12可以为连续分布也可以为不连续分布。当所述载体的除液结构为吸液层13a且所述吸液层13a完全覆盖所述支撑体11时，所述多孔基质层12可以完全覆盖所述吸液层13a，也可以局部覆盖所述吸液层13a；另外，在所述载体包括多个分析单元且所述吸液层13a为不连续分布的情况下，所述多孔基质层12优选为不连续分布并且与所述吸液层13a对应。当所述载体的除液结构为孔道13b，并且所述载体包括多个分析单元时，所述多孔基质层12优选为不连续分布并且与所述孔道的位置对应。在所述多孔基质为不连续分布时，一方面可以节约多孔基质的用量，另一方面也能减轻整个载体的重量，从而更便于携带。

在本发明中，所述增强层14用于增强拉曼散射强度，所述增强层14的厚度为0.1-1000微米，优选为1-500微米。所述增强层14的厚度为从增强剂陷入多孔基质层12内最深处至增强层14上表面最高点的高度。在所述增强层14中，起主要的增强效果的部分是所述增强层14的上表面。所述增强层14可以通过各种常规的方法形成，例如，通过将含有增强剂的溶液加到所述多孔基质层12上，所述多孔基质层12使所述溶液的液体通过并截留固体颗粒，从而形成所述增强层14。所述增强剂包括金属纳米颗粒或者金属纳米颗粒和能够使金属纳米颗粒凝聚的物质的混合物。在形成增强层以前，所述金属纳米颗粒和能够使金属纳米颗粒凝聚的物质独立保存。其中，至少50重量％的所述金属纳米颗粒的粒径为5-500纳米，由于金属纳米颗粒的粒径小，表面能高，因而在溶液中即使没有所述能够使金属纳米颗粒凝聚的物质也能发生团聚，形成更大的颗粒，从而截留在多孔基质层12上而形成增强层。所述金属可以为金、银、镍、铂、铜、铁和铝中的一种或几种；所述能够使金属纳米颗粒凝聚的物质可以为盐、酸和碱中的一种或几种，所述酸、碱和盐为能够通过改变金属纳米颗粒形成的金属胶体微粒的Zeta电位(电子云的内外电位差)，从而实现金属纳米颗粒的凝聚的盐、酸和碱中的一种或几种。所述盐可以为氯化物(如氯化钠、氯化铵和氯化锂中的一种或几种)、硝酸盐(如硝酸铵、硝酸钠和硝酸钾中的一种或几种)、硫酸盐(如硫酸钠)或磷酸盐(如磷酸氢二钾)中的一种或几种，所述酸可以为盐酸、醋酸、柠檬酸中的一种或几种，所述碱可以为氢氧化钠或氢氧化氨。为了尽可能地防止测试样品的拉曼光谱信号被干扰，所述能够使金属纳米颗粒凝聚的物质优选为氯化钠和/或氯化锂。在本发明中，当所述增强剂为金属纳米颗粒和能够使金属纳米颗粒凝聚的物质的混合物时，所述增强层14为在多孔层基质层12之上由金属纳米颗粒和能够使金属纳米颗粒凝聚的物质形成的聚集物，形成聚集物的方法如下：(1)制备所述金属纳米颗粒，所述金属纳米颗粒通常以其液体或胶体形式使用。所述金属纳米颗粒液体通常是通过用已知的方法还原相应的含金属离子溶液中的金属离子得到的金属纳米颗粒胶体溶液，形成的金属纳米颗粒液体可以不经浓缩或稀释而直接使用。含金属离子溶液中的金属离子浓度通常是在0.01-10毫摩尔/升(mM)，优选为0.1-2毫摩尔/升。用于还原的还原剂可以为本领域技术人员公知的各种还原剂。(2)把所述能够使金属纳米颗粒凝聚的物质添加到金属纳米颗粒液体中，得到混合物液体，所述能够使金属纳米颗粒凝聚的物质的加入量使其在所述混合物液体中的最终浓度为1毫摩尔/升至5摩尔/升；(3)把所述混合物液体添加到样品孔中以形成增强层14。在所述金属纳米颗粒液体中，在不存在稀释、浓缩及溶剂挥发的情况下，金属原子的浓度可由金属离子的浓度表示，所述金属离子的浓度是指原来的金属离子溶液与还原剂溶液混合后但还原反应并未开始时的金属离子的浓度。然而，由于金属纳米颗粒通常是由许多金属原子聚集得到的，而金属纳米颗粒的大小与溶液中金属纳米颗粒的浓度有关，在其它条件相同的情况下，溶液中金属纳米颗粒的浓度越高，所得的金属纳米颗粒的粒径越大，溶液中金属纳米颗粒的浓度越低，所得的金属纳米颗粒的粒径越小；而在金属原子的总量一定的情况下，金属纳米颗粒的粒径越大，金属纳米颗粒的个数就越少，也即金属纳米颗粒的浓度越低。由于金属纳米颗粒的数目和浓度测量不便，而在金属原子的总量一定的情况下，金属纳米颗粒的浓度又与金属纳米颗粒的粒径有关，因此，一般不对金属纳米颗粒的数目或浓度进行测量，而是通过金属纳米颗粒的粒径来体现。本发明的发明人发现，相对于每1平方毫米样品孔的截面积，使用约20-35微升的至少50％的所述金属纳米颗粒的粒径为5-500纳米的金属纳米颗粒液体即可有效实现本发明的目的。因此，优选情况下，相对于每1平方毫米样品孔的截面积，使用约20-35微升的至少50％的所述金属纳米颗粒的粒径为5-500纳米的金属纳米颗粒液体，例如，对于样品孔直径在0.5毫米(约0.2平方毫米)的圆形样品孔，使用4-7微升上述金属纳米颗粒液体。上述过程可在载体使用前完成或提前完成并存放备用。

在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供的载体还包括壳层15，所述壳层15固定在支撑体11上，所述壳层15与支撑体11的一个表面形成空间，分析单元位于该空间内；所述壳层15包括开口16，至少一个所述开口的对应于所述分析单元的位置。该开口16和位于该开口下的分析单元即构成用于承载拉曼分析样品的样品孔。所述壳层15可用于将多孔基质层12以及吸液层13a固定在支撑体11上，并用于形成该载体的样品孔。特别是当所述载体包括上述多个分析单元时，所述壳层15能够将不连续的增强层14、多孔基质层12以及吸液层13a固定在支撑体11上，形成多个分析单元。通过壳层15的固定作用，所述载体的各个部件之间无需粘合剂即可实现有效贴合。所述壳层15的材质可以是各种柔性材质，例如可以是塑料片材或金属箔如铝箔、铜箔或金箔，所述壳层15的厚度可以为1-500微米。

当所述载体包括一个或多个分析单元时，所述分析单元位于所述开口16的正下方，分析单元的大小不小于所述开口16的大小。

在本发明中，所述壳层的开口16的形状和分析单元的截面的形状可以相配也可以不相配。优选情况下，所述壳层的开口16和分析单元的截面(也即多孔基质层的截面)的形状均为圆形，所述开口16的大小为1微米-10毫米，进一步优选为0.1-5毫米，所述多孔基质层的截面积优选为所述开口16截面积的1.01-50倍，这样即可保证待测样品能够全部位于多孔基质层12上，还能够使待测样品充分浓缩。为了便于定量分析和进行多次检测，所述壳层的开口16和分析单元的个数各自优选为2-12个。

进一步优选情况下，所述载体还包括滤膜17，所述滤膜17覆盖在所述壳层14的开口16上，所述滤膜用于截留大分子如蛋白质，所述滤膜的截留分子量为10000以上。所述截留分子量是指能被滤膜截留住的溶质中最小溶质的分子量。所述滤膜17的材质可以为再生纤维素、硝化纤维素或改性聚丙烯中空纤维，其厚度可以为1微米至0.2毫米。所述滤膜17的尺寸大于所述壳层14的开口16的尺寸。

本发明提供的载体的制作方法没有特别的限定，只要能将增强层14、多孔基质层12、吸液结构和支撑体11组合形成能够用于盛放拉曼光谱分析用样品的结构即可。例如，当所述载体的除液结构为不连续的吸液层13a时，在支撑体11的一个表面上形成不连续的吸液层13a，并相应在每个吸液层13a上附着多孔基质层12，然后将含有增强剂的混合液分别加到所述多孔基质层12上，所述混合液中的液体通过所述多孔基质层12，从而形成增强层14，再将具有开口且开口的形状和位置与所述多孔基质层12相匹配的壳层15按照多孔基质层12和吸液层13a的外形贴合附着到多孔基质层12或吸液层13a上，并固定在支撑体11上。当所述载体的除液结构为孔道13b时，在支撑体11的支撑面上形成一个或多个纵向的孔穴，孔穴的深度不贯穿支撑体11的厚度，然后通过横向的孔穴与所述一个或多个纵向的孔穴连通，且所述横向的孔穴连通至支撑体11的外部，从而形成连通的孔道13b，然后将多孔基质层12附着在纵向孔穴的入口上，然后将含有增强剂的混合液分别加到所述多孔基质层12上，所述混合液中的液体通过所述多孔基质层12，从而形成增强层14，再将具有开口且开口的形状和位置与所述多孔基质层12相匹配的壳层15按照多孔基质层12的外形贴合附着到多孔基质层12上，并固定在支撑体11上。

本发明提供的载体在使用过程中可以使液体样品浓缩成固体样品以进行拉曼光谱分析。所述载体在闲置的过程中(即使用之前)通常储存在密闭环境中，所述密闭环境通常为真空或填充惰性气体如氮气或氩气，所述密闭环境由材质为玻璃、塑料、金属等的材料形成。在使用时，只需将样品直接置于增强层14上即可，因此，操作非常便利。

本发明还提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明提供的载体。本发明提供的所述试剂盒可用于各种常规的化学分析如拉曼光谱分析。

本发明提供的载体和试剂盒可以用于固体样品分析，也可以用于液体样品的分析，但由于如上所述，在分析液体样品时特别是分析液体样品中的微量或痕量成分的含量时更能体现本发明的优点，因此本发明以液体样品的表面增强拉曼光谱分析方法为例说明本发明的载体和使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

本发明还提供了一种表面增强拉曼光谱分析方法，该方法包括将待测样品的溶液负载到载体上，然后测定待测样品的拉曼光谱，其中，所述载体为本发明提供的载体，将待测样品的溶液负载到载体上的方法包括将待测样品的溶液加到所述载体的增强层上。

为了更有效地提高拉曼光谱的灵敏度，优选向待测样品中加入能够使金属纳米颗粒凝聚的物质，然后将含有能够使金属纳米颗粒凝聚的物质的待测样品加到所述载体的增强层上。

当所述载体还包括滤膜时，将待测样品的溶液负载到载体上的方法包括待测样品的溶液加到所述载体的滤膜上，大分子物质截留在滤膜上，而小分子待测样品和溶剂则通过滤膜，溶剂通过增强层后继续通过多孔基质层和除液结构而排出载体外，待测样品则附着在增强层上。

在每一个直径在0.5毫米(约0.2平方毫米)的圆形样品孔分析单元中，所述含待测样品的溶液的用量一般为1-100微升，优选为10-20微升。

根据本发明的一种优选实施方式，在所述混合液中还含有含量已知的内标物，所述内标物为本身能产生拉曼光谱且该拉曼光谱不与待测物的拉曼光谱部分重叠或全部重叠的物质。对于不同的待测样品，内标物的种类可能不同。通过该优选方式，可以实现定量分析。具体地，通过以含量已知的内标物的拉曼光谱信号为参照标准，将待测样品的拉曼光谱信号与参照标准进行比较，分析待测样品的拉曼光谱特征峰强度(纵坐标)与参照标准的拉曼光谱特征峰强度的比例或高度差，来判断待测样品的浓度(或含量)是高于还是低于内标物的浓度(或含量)，甚至大致的浓度差(或含量差)。

相对于每升的含待测样品的混合液，内标物的用量一般为1微克-1克，优选为10微克-100毫克。每个待测样品内待测成分的绝对量可以在飞克(fg)至纳克(ng)的范围内，甚至可以为单分子水平。也就是说，只要待测样品中含有该待测成分，即便该待测成分的含量为单个分子、飞克(fg)或者纳克(ng)，采用本发明的方法也能测出。

另外，为了实现定量分析，也可以包括将含量已知的外标物负载到所述载体上，然后测定外标物的增强拉曼光谱，并将该外标物的拉曼光谱特征峰与待测样品的拉曼光谱特征峰进行比较，所述外标物与待测样品具有相同或相似拉曼光谱特征峰。上述使用外标物的方法也可以称为“外标法”。当使用外标法进行定量分析时，优选使用本发明提供的包括两排样品孔的载体。

对于不同的待测样品，外标物的种类可以不同。内标物和外标物可以相同，也可以不同。

采用拉曼光谱仪进行分析的方法为本领域技术人员公知的方法，例如，如图7所示，将承载有待测样品的载体放置在工作台21上，通过激光器24发出激光，经过光学过滤器23并通过物镜22形成聚焦光束，光束照射到待测样品上产生拉曼散射，拉曼散射产生的光信号通过光学信号检测器25进行检测，检测到的光信号通过计算机26进行读取和分析。

本发明提供的表面增强拉曼光谱分析方法可用于对取自人体、动物、植物、微生物、食物、药物和环境等的样品进行检测。

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的载体以及使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

(1)制作载体

将吸液层13a放置在支撑体11上，然后将多孔基质层12放置在所述吸液层13a上，其中所述支撑体11为75毫米(长)×25毫米(宽)×2毫米(厚)的玻璃板，吸液层13a的材质为厚度为0.5毫米的纤维素纸(吸液率为5)，多孔基质层12的材质为孔径为200纳米、孔隙率为50％和厚度为0.5毫米的玻璃纤维膜。通过碾压使它们相互紧密贴在一起，然后在所述多孔基质层12上形成增强层14，所述增强层14通过将由5微升的银纳米颗粒和5微升的浓度为5摩尔/升的氯化锂组成的增强剂溶液滴加到玻璃纤维膜上而形成，厚度为1微米。上述银纳米颗粒的颗粒直径为40-80纳米，具体的制备方法为向20毫升的沸腾的浓度为1.0毫摩尔/升的AgNO₃的溶液中加入2毫升的1重量％的柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液，并在磁力搅拌下维持回流沸腾10分钟，即得22毫升的银纳米颗粒胶体(即银纳米颗粒)。

(2)检测与分析

使10微升的浓度为10ppm的三聚氰胺的水溶液加到所述载体上，在液体快速滤干并形成固体层之后进行拉曼光谱检测，得到如图8所示的拉曼光谱图。在图8中，在686cm^-1处的散射峰(686cm^-1处散射峰为三聚氰胺的特征峰)的拉曼强度为28365。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的载体以及使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

(1)制作载体

以与实施例1相同的方法制作所述载体，不同的是，所述增强层14通过将由5微升的银纳米颗粒(银纳米颗粒的粒子直径为40-80纳米，制备方法同实施例1)和2.5微升的浓度为5摩尔/升的氯化锂组成的增强剂溶液滴加到玻璃纤维膜上而形成，厚度为0.5微米。

(2)检测与分析

取10微升浓度为10ppm的三聚氰胺的水溶液与2.5微升氯化锂(5摩尔/升)混合，并加到所述载体上，在液体快速滤干并形成固体层之后进行拉曼光谱检测，得到如图9所示的拉曼光谱图。在图9中，在686cm^-1处的散射峰(686cm^-1处散射峰为三聚氰胺的特征峰)的拉曼强度为62370。以与实施例1不相同的是，氯化锂(使能够与金属纳米颗粒凝聚的物质)分两批加入。

对比例1

使10微升的浓度为10ppm的三聚氰胺的水溶液与5微升氯化锂(5摩尔/升)和5微升的银纳米颗粒(银纳米颗粒的粒子直径为40-80纳米，制备方法同实施例1)混合液体，然后吸取10微升所述混合液体，并直接采用拉曼光谱仪对其进行拉曼光谱检测以获得如图10所示的拉曼光谱图。在图10中，在686cm^-1处的散射峰(686cm^-1处散射峰为三聚氰胺的特征峰)的拉曼强度为2463。

通过将实施例1和2与对比例1的检测结果进行对比说明，采用本发明提供的载体可以使表面增强拉曼光谱灵敏度增强10倍以上。特别是当使能够与金属纳米颗粒凝聚的物质(如氯化锂)分批加到所述载体上时，表面拉曼光谱灵敏度增强更加显著，可以高达20倍以上。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的载体以及使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法和在中医药研究的应用。

(1)制作如图3所示的载体

支撑体11为75毫米(长)×25毫米(宽)×2毫米(厚)的玻璃板，吸液层13a的材质为厚度为0.5毫米的纤维素纸(吸液率为5)，多孔基质层12的材质为孔径为200纳米、孔隙率为50％和厚度为0.5毫米的玻璃纤维膜，增强层14通过将由5微升的银纳米颗粒(银纳米颗粒的粒子直径为40-80纳米，制备方法同实施例1)和5微升的浓度为5摩尔/升的氯化钠组成的增强剂溶液滴加到玻璃纤维膜上而形成，厚度为1微米，壳层15的材质为厚度为0.1毫米的铝箔，样品孔共12个(也即多孔基质和吸液层形成的分析单元的个数为12)，沿该玻璃板长度方向排列成平行的两排，两排多孔基质层12之间的最小距离为1毫米，相邻两个样品孔的距离为9毫米，样品孔为直径为0.5毫米的圆形孔。

(2)待测样品的制备

对由5克枸杞、5克黄芪、10克党参、3克当归、7克首乌、10克淮山、8克茯苓、3克杜仲和5克山茱萸组成的中药药方进行煎煮，分别取煎煮0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟时的煎煮所得的1毫升液体作为待测样品1、2、3、4、5和6。

(3)拉曼光谱检测

将上述待测样品1-6各自重复一次，并分别取10微升，并各自相应地加到上述(1)所得的载体的12个样品孔中。在各个样品孔中的液体快速滤干并在增强层上快速形成黑色固体层之后，依次进行拉曼光谱检测，待测样品1-6的每个样品中其一检测结果示于图11中。

(4)结果分析

如图11所示，内标物在720cm^-1处的位置出现散射峰，该峰的强度最强，1320cm^-1位置处的散射单峰随着煎煮时间而逐渐减弱，并且在煎煮30分钟时该单峰在1300cm^-1处衍生一肩峰，1600-1650cm^-1位置处的散射双峰在煎煮30分钟时出现并达到最强，而煎煮90分钟时该峰的强度大大减弱。由此可见，上述中药药方煎煮后得到的药汁的化学成分会随着煎煮时间的变化而改变，且由于在煎煮30-60分钟时测得的拉曼光谱信息最多，表明所述中药药方在煎煮30-60分钟时所得药汁中的化学成分信息最丰富。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的载体以及使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

(1)制作如图6所示的载体

支撑体11为80毫米(长)×30毫米(宽)×5毫米(厚)的塑料板，孔道13b的孔径为1.0毫米，多孔基质层12的材质为孔径为1微米、孔隙率为20％和厚度为3毫米的玻璃纤维膜，增强层14通过将由5微升0.1摩尔的盐酸溶液和5微升金纳米颗粒(金纳米颗粒的颗粒直径为40-80纳米，具体的制备方法包括向20毫升的沸腾的浓度为1.0毫摩尔/升的HAuCl₄的溶液中加入2毫升的1重量％的柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液，并在磁力搅拌下维持回流沸腾10分钟，即得22毫升金纳米颗粒胶体(即金纳米颗粒)，并使用所需的量进行测试)组成的增强剂溶液滴加到玻璃纤维膜上而形成，厚度为1微米，壳层15的材质为厚度为0.15毫米的层压塑料片材，样品孔共12个(也即多孔基质形成的分析单元的个数为12)，沿该塑料板长度方向排列成平行的两排，两排之间的间距为20毫米，同一排的相邻两个样品孔的间距为10毫米，样品孔为直径为1毫米的圆形孔。样品孔顶部放有直径为3毫米、厚度为10微米的再生纤维素膜(截留分子量为10000以上)。

(2)外标物测试样品的制备

分别将0微克、5微克、20微克、50微克、100微克和200微克的三聚氰胺加到10克(10毫升)的不含三聚氰胺的氨基酸营养液(由厦门集仁生物科技有限公司生产)中，制得0ppm、0.5ppm、2ppm、5ppm、10ppm和20ppm的三聚氰胺外标物测试样品，将如此制得的样品作为外标物测试样品。

(3)待测样品的制备

取三聚氰胺的含量未知的两种氨基酸营养液待测样品(A和B)，使用不含三聚氰胺的氨基酸营养液样品将待测样品的浓度各自稀释至1/2、1/10和1/100；从而得到6个样品A1、A2、A3、B1、B2和B3，如下表1所示，

表1

样品	稀释程度
		A1	1/2
A2	1/10
		A3	1/100
B1	1/2
		B2	1/10
B3	1/100

(4)拉曼光谱检测

将上述6个外标物测试样品和6个待测样品分别取10微升，加到上述载体的12个样品孔中，在真空吸力下，各个样品孔中的液体快速滤干并在增强层上快速形成固体层之后，依次进行拉曼光谱检测。

(5)结果分析

在外标物测试样品和待测样品的拉曼光谱图中，在686cm^-1的位置均出现不同强度的增强散射峰(686cm^-1处散射峰为三聚氰胺的特征峰)。根据外标物待测样品的拉曼光谱图中在686cm^-1处的散射峰强度制得如图12所示的标准曲线图，其中具体数据如下表2所示。待测样品A1-A3和B1-B3的测试结果和分析结果如下表3所示。

表2

三聚氰胺含量(ppm)	686cm-1处散射峰的强度
		0	10
0.5	500
		2	2000
5	5000
		10	9000
20	13000

表3

由于A2值在标准曲线的中间(A1和A3在标准曲线高端和低端)，因此样品A中三聚氰胺的含量确定为100ppm。由于B1、B2和B3的值均在500下，因此样品B中三聚氰胺的含量确定为小于1ppm。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的载体以及使用该载体进行表面增强拉曼光谱分析的方法。

(1)制作如图3所示的载体

以与实施例3相同的方法制作所述载体。

(2)含有内标物的测试样品的制备

取三聚氰胺的含量未知的两种待测样品(A和B)，用不含三聚氰胺的牛奶分别将上述两种待测样品(A和B)的浓度稀释至1/2、1/5、和1/10，共制得6个待测样品(A1、A2、A3、B1、B2和B3)。

将不含三聚氰胺的牛奶作为C组，分成6个样品(C1、C2、C3、C4、C5和C6)，分别向其中加入已知量的三聚氰胺，使其中三聚氰胺的含量分别为0.2ppm、0.5ppm、1ppm、2ppm、10ppm和20ppm。

另外，用腺嘌呤作为内标物，分别加到上述12个样品中，使其中腺嘌呤的含量均为5ppm。

分别使这些含有三聚氰胺和腺嘌呤的牛奶在12000转/分钟下离心分离5分钟，通过直径为10毫米、厚度为50微米的再生纤维素膜(截留分子量为10000以上)，得到滤清液。各自取10微升滤清液与5微升5摩尔的氯化锂混合，然后与5微升银纳米颗粒混合(银纳米颗粒的粒子直径为40-80纳米，制备方法同实施例1)，制得12个测试样品。

(4)拉曼光谱检测

将上述含有内标物的测试样品各取20微升并分别加到上述载体的12个样品孔中，在各个样品孔中的液体快速滤干并在增强层上快速形成固体层之后，依次进行拉曼光谱检测。

(5)结果分析

在测试样品的拉曼光谱图中，三聚氰胺增强散射峰在686cm^-1处，腺嘌呤增强散射峰在730cm^-1处，并分别计算C1-C6的拉曼光谱中686cm^-1处的散射峰强度与730cm^-1处的散射峰的强度的比值，其结果示于下表4中，并制定标准曲线如图13所示。

表4

三聚氰胺(ppm)	比值(686cm-1/730cm-1)
		0.2	0.1
1	0.25
		2	0.5
5	1.25
		10	2
20	2.5

通过计算测试样品A1、A2、A3、B1、B2和B3中686cm^-1/730cm^-1比值(686cm^-1处的散射峰强度与730cm^-1处的散射峰的强度的比值)，得到A3中686cm^-1/730cm^-1比值为2.2(A1和A2中686cm^-1/730cm^-1比值均大于3)，B1中686cm^-1/730cm^-1比值为0.2(B2和B3中686cm^-1/730cm^-1比值均小于0.1)。因此，分别将A3的686cm^-1/730cm^-1比值(2.2)和B1的686cm^-1/730cm^-1比值(0.2)作为纵坐标在图13中找到相应的横坐标的值(三聚氰胺的含量)，其中，A3对应的横坐标的值为15ppm，B1对应的横坐标的值为0.8ppm。另外，由于A3被稀释至1/10，B1被稀释至1/2，因此，可以相应计算出样品A中三聚氰胺的含量为150ppm，样品B中三聚氰胺的含量为1.6ppm。

由此可见，采用本发明提供的载体和表面增强拉曼光谱分析的方法可以进行定量分析。

Claims (16)

1.一种载体，其特征在于，所述载体包括支撑体(11)和至少一个分析单元，每个分析单元包括除液结构、多孔基质层(12)和增强层(14)，多孔基质层(12)和增强层(14)位于除液结构之上，所述除液结构位于所述支撑体(11)中或位于所述支撑体(11)表面上，所述增强层(14)位于所述多孔基质层(12)表面上，所述除液结构用于接收来自多孔基质层(12)的液体，所述增强层(14)用于增强拉曼散射强度。

2.根据权利要求1所述的载体，其中，所述分析单元为多个，相邻的2个分析单元的增强层(14)和多孔基质层(12)互相间隔开，多个分析单元共用一个除液结构或各个分析单元具有单独的除液结构。

3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述除液结构为吸液层(13a)，所述吸液层(13a)位于支撑体(11)的表面。

4.根据权利要求3所述的载体，其中，所述吸液层(13a)的吸液量为1-1000微升，所述吸液层(13a)的厚度为0.1-10毫米，所述吸液层(13a)的吸液率为0.1-10。

5.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述除液结构为位于支撑体(11)中的孔道(13b)。

6.根据权利要求5所述的载体，其中，所述孔道(13b)包括入口(13b1)和出口(13b2)，所述入口(13b1)位于多孔基质层(12)的下方，来自多孔基质层(12)的液体通过所述入口(13b1)导入孔道(13b)中，并通过所述出口(13b2)导出支撑体(11)。

7.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述增强层(14)的厚度为0.1-1000微米。

8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述增强层(14)由增强剂形成。

9.根据权利要求8所述的载体，其中，所述增强剂包括金属纳米颗粒或者独立保存的金属纳米颗粒和能够使金属纳米颗粒凝聚的物质。

10.根据权利要求9所述的载体，其中，至少50重量％的所述金属纳米颗粒的粒径为5-500纳米，所述金属为金、银、铜、镍、铂、铁和铝中的一种或几种；所述能够使金属纳米颗粒凝集的物质为酸、碱和盐中的一种或几种。

11.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述载体还包括壳层(15)，所述壳层(15)固定在支撑体(11)上，所述壳层(15)与支撑体(11)的一个表面形成空间，分析单元位于该空间内；所述壳层(15)包括开口(16)，至少一个所述开口对应于所述分析单元的位置。

12.根据权利要求11所述的载体，其中，所述载体还包括滤膜(17)，所述滤膜(17)覆盖在所述壳层(15)的开口(16)上，所述滤膜的截留分子量为10000以上。

13.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-12中任意一项所述的载体。

14.一种表面增强拉曼光谱分析方法，该方法包括将待测样品的溶液负载到载体上，然后测定待测样品的拉曼光谱，其特征在于，所述载体为权利要求1-12中任意一项所述的载体，负载到载体上的方法为将含有待测样品的溶液加到所述载体的增强层上。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述混合液中还含有含量已知的内标物，所述内标物为本身能产生拉曼光谱且该拉曼光谱不与待测物的拉曼光谱部分重叠或全部重叠的物质。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括将含量已知的外标物负载到所述载体上，然后测定外标物的拉曼光谱，并将该外标物的拉曼光谱与待测样品的拉曼光谱进行比较，所述外标物与待测样品具有相同或相似拉曼光谱特征峰。

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