CN101935687B - 用IL-12p40 siRNA促进肝再生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及IL-12p40基因、IL-12p40蛋白或其拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的用途。本发明还涉及基于所述IL-12p40基因或蛋白而筛选用于促进肝再生的物质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及肝再生领域。具体而言，本发明涉及用IL-12p40 siRNA促进肝再生。
背景技术
人类和哺乳动物的肝脏在物理、化学、感染或缺血性损伤后具有很强的再生能力。在某些条件下(如外科因肿瘤或移植手术切除部分肝脏或肝叶；移植一个小的供体肝脏到一个大的受体；因化学药物、病毒等引起肝细胞破坏等)，肝脏的体积发生变化，触动肝脏再生。自20世纪以来，肝脏疾病的发病率的逐渐攀升成为严重威胁人类健康的疾病之一。我国各型肝病患者正在呈上升趋势，每年有近40万人死于肝脏疾病。目前，肝脏切除手术已被许多医院广泛应用于治疗多种肝脏疾病。当部分肝脏切除后，肝脏面临着剩余肝脏功能的代偿问题。剩余肝脏功能若能代偿，则会引起肝再生而逐渐康复。反之，则会走向急性肝功能衰竭，导致患者死亡。研究表明对肝再生的人为诱导可能会提高肝切除导致的急性肝衰竭患者的生存率和缩短其康复时间。如何有效地提高及促进肝脏再生、肝功能恢复成为目前亟待解决的问题。
研究肝再生最常用的动物模型是小鼠或大鼠的部分肝切除(约70％肝脏切除)模型。在肝脏切除后的短短几分钟之内，肝细胞活化即被触动。在这一过程中，多种细胞因子、生长因子等参与调节激酶的活化和转录因子的激活。评价肝再生的指标有：肝脏重量的变化、肝细胞有丝分裂指数等。到目前为止，诱导和促进肝脏再生的研究大多局限于动物研究阶段，临床应用非常有限。
因此，本领域仍需要对于肝再生有调节作用的药物靶点以及针对该靶点的药物。
发明内容
本发明一方面涉及IL-12 p40基因或IL-12 p40蛋白在制备促进肝再生用的物质中的用途。
在一优选实施例中，所述物质为所述IL-12 p40蛋白的特异性抗体。
在另一优选实施例中，所述物质为IL-12 p40基因的拮抗剂。
在一优选实施例中，所述拮抗剂为特异性干扰IL-12p40基因表达的siRNA。
在一更优选实施例中，所述siRNA的正义链序列为CCAAGAACUUGCAGAUGAATT；反义链的序列为UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC。
在另一优选实施方式中，所述siRNA的正义链序列为GGAAUUUGGUCCACUGAAATT；反义链的序列为UUUCAGUGGACCAAAUUCCAT。
在一优选实施例中，所述siRNA存在于表达盒中。
在一优选实施例中，所述制备包括针对所述IL-12 p40基因或IL-12 p40蛋白筛选其拮抗剂。
在一优选实施例中，所述制备包括以下步骤：
(1)将所述候选物质与表达IL-12 p40蛋白的体系接触；和
(2)检测候选物质对IL-12 p40蛋白的表达的影响；
其中，若候选物质可抑制IL-12 p40蛋白的表达、活性或分泌，则表明该物质是可作为促进肝再生的所述物质。
本发明另一方面涉及IL-12 p40基因的拮抗剂或IL-12 p40蛋白的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的用途。
在一优选实施例中，所述IL-12 p40基因的拮抗剂是siRNA。
在一优选实施例中，所述siRNA的正义链序列为CCAAGAACUUGCAGAUGAATT；反义链的序列为UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC。
在一优选实施例中，所述siRNA存在于表达盒中。
本发明又一方面涉及一种表达盒，该表达盒含有抑制IL-12p40基因表达的siRNA。
在一优选实施例中，所述siRNA的正义链序列为CCAAGAACUUGCAGAUGAATT；反义链的序列为UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC。
在另一优选实施方式中，所述siRNA的正义链序列为GGAAUUUGGUCCACUGAAATT；反义链的序列为UUUCAGUGGACCAAAUUCCAT。
本发明另一方面涉及一种筛选用于促进肝再生用的潜在物质的方法，所述的方法包括：
(1)将候选物质与表达IL-12p40蛋白的体系接触；
(2)检测候选物质对IL-12p40蛋白的表达的影响；
其中，若所述候选物质可抑制IL-12p40蛋白的表达、活性或分泌，则表明该候选物质是可作为促进肝再生的潜在物质。
在一个优选实施例中，所述步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达IL-12p40蛋白的体系中；和/或所述步骤(2)包括：检测测试组的体系中IL-12p40蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达IL-12p40蛋白的体系；如果测试组中IL-12p40蛋白的表达、活性或分泌在统计学上低于对照组，就表明该候选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。
在一优选实施例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选实施例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进肝再生有用的组合物。
附图说明
图1显示肝切后的不同时间点，IL-12p40在肝脏中的表达情况。C57BL/6小鼠(每个时间点3-4只)，在第0天进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，以触动剩余肝脏再生。在肝切后的第0小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时和72小时，处死小鼠，取出小鼠的肝脏抽取总蛋白。通过Westernblot的方法检测IL-12p40的表达水平。所示数据代表3次试验的结果。
图2显示肝切后，IL-12p40-/-小鼠肝脏再生明显增加。对照组(C57BL/6)和实验组(IL-12p40-/-)，每组9-10只小鼠，通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，触动剩余肝脏再生。在肝切后的第24小时、48小时和72小时，称量小鼠体重后，处死小鼠，取出小鼠的肝脏并称其重量。根据小鼠肝脏重量/小鼠的体重×100计算每只小鼠的肝脏与体重比率。所示数据代表3次试验的结果。
图3显示肝切后，IL-12p40-/-小鼠肝细胞增殖明显增强。对照组(野生型)和实验组(IL-12p40-/-)，每组9-10只小鼠，通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，触动剩余肝脏再生。在肝切后的第24小时、48小时和72小时，处死小鼠，取出小鼠的肝脏。通过BrdU染色方法检测肝切后剩余肝脏中肝细胞的增殖情况。所示数据代表3次试验的结果。图示为放大100倍的图。
图4显示通过RNAi技术干扰IL-12p40表达后，小鼠肝脏再生明显上升。对照组和实验组(IL-12p40siRNA)，每组3-4只小鼠，在第0天，给小鼠尾静脉注射2ml的阴性对照siRNA或IL-12p40siRNA。48小时后，切除小鼠肝脏的70％，触动小鼠肝再生。肝切后48小时，处死小鼠，按照图2所述的方法计算每只小鼠的肝脏与体重比率。
图5显示，显示通过RNAi技术干扰IL-12p40表达后，小鼠肝脏再生明显上升。对照组和实验组(IL-12p40siRNA)，每组3-4只小鼠，在第0天，给小鼠尾静脉注射2ml的阴性对照siRNA或IL-12p40siRNA。48小时后，切除小鼠肝脏的70％，触动小鼠肝再生。肝切后48小时，处死小鼠，按照图2所述的方法计算每只小鼠的肝脏与体重比率。
具体实施方式
本发明利用肝再生的动物模型，证明了IL-12p40亚基在肝切后不同时间点的表达发生变化。利用IL-12p40基因缺陷小鼠，首次发现IL-12p40缺失后小鼠肝再生能力明显增强。BrdU染色显示，与对照小鼠相比，IL-12p40基因缺陷小鼠在肝切后不同时间点，其肝细胞的增殖明显增加，以上研究证实，IL-12p40在肝再生中发挥重要作用。进一步的研究显示，利用RNAi技术干扰小鼠肝脏中IL-12p40表达后，小鼠肝再生能力明显升高。
因此，IL-12p40作为肝再生的调节因子，通过干扰其表达可以有效地促进肝脏再生、提高肝脏疾病治愈率。
以下将结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。应理解，虽然本文以具体实施例的方式描述本发明，但是各具体实施例中所包含的各具体技术特征的任意组合所构成的技术方案也在本发明范围之内。
1.IL-12p40多肽及其编码序列
IL-12p40是炎性细胞因子IL-12和IL-23共有的亚基，其通过与IL-12p35亚基相结合形成具有生物活性的IL-12或者与IL-23p19亚基结合成为IL-23。IL-12p40基因序列如Genebank NM_008352.2所示，其氨基酸序列如GenebankNP_032378.1所示。所形成的两种细胞因子在多种炎症性疾病和自身免疫病中发挥重要作用。此外，IL-12p40亚基作为有独立功能的细胞因子，通过单体或同源二聚体的形式发挥它对IL-12和IL-23受体介导免疫反应的负向调节作用。除了它的负向调节作用，IL-12p40可以作为激动剂促进巨噬细胞、树突状细胞的迁移和趋化，调节免疫反应。
本发明包括如编码Genebank NP_032378.1所示多肽的IL-12p40，以及编码在Genebank NP_032378.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有IL-12p40的活性的由Genebank NP_032378.1衍生的蛋白质的基因。
本发明包括任何形式的IL-12p40多肽，例如，包括其全长序列或生物活性片段。经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且保留了IL-12p40的生物活性的IL-12p40氨基酸序列也包括在本发明中。IL-12p40或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。这些替代可发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的替代将不会对生物活性有重要影响。例如，本发明的IL-12p40可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。
本领域技术人员根据本发明将理解，氨基酸序列与GenebankNP_032378.1所示的IL-12p40的氨基酸序列接近或基本相同(如相同性大于70％，较佳的相同性大于80％；更佳的相同性大于85％；最佳的相同性大于90％、95％或99％)、且保留该IL-12p40生物活性(如本文所述的作为肝再生的调节因子)的蛋白及其编码序列也可作为调节肝再生的药物靶点。
“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它们的序列信息，计算两条排列的序列间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，从而可得到相同性百分数。
在相同性分析中可辅助使用易于获得的计算机程序，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它适用于Smith和Waterman分析肽用的局部相同性算法(Advances inAppl.Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence AnalysisPackage(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列相同性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。使用制造者建议的和上述WisconsinSequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可使用Smith和Warerman的相同性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的相同性百分数。
本发明建立相同性百分数的另一方法是使用版权属于爱丁堡大学、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列相同性”。计算序列间的相同性百分数或相似性百分数的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的，例如，另一种排列程序是BLAST，使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGHSCORE；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http://www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。
2.IL-12p40基因和蛋白的拮抗剂及其用途
如本文所用，所述的IL-12p40基因或蛋白的拮抗剂包括抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
所述的IL-12p40基因或蛋白的拮抗剂是指任何可降低IL-12p40蛋白的活性、降低IL-12p40基因或蛋白的稳定性、下调IL-12p40蛋白的表达、减少IL-12p40蛋白有效作用时间、或抑制IL-12p40基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调IL-12p40基因或蛋白有用的物质，可用于促进肝再生。例如，所述的拮抗剂包括但不限于：特异性干扰IL-12p40基因表达的小干扰RNA分子或其反义核苷酸；或特异性与IL-12p40多肽结合的抗体或配体。本发明也包括其它可抑制IL-12分泌的物质，比如IL-10、TGF-β、PGE2等。
作为本发明的一种优选方式，所述的IL-12p40多肽的拮抗剂是一种特异性与IL-12p40多肽结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用IL-12p40多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达IL-12p40多肽或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
作为本发明的一种优选方式，所述的IL-12p40基因的拮抗剂是一种IL-12p40基因特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。
小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可特异性地干扰IL-12p40基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的相同性；并且经验证，其具有良好的干扰IL-12p40基因表达的效果。在一个优选实施例中，所述的小干扰RNA分子为如下的siRNA序列(5’端至3’端)：
正义链：CCAAGAACUUGCAGAUGAATT SEQ ID NO：1)
反义链：UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC(SEQ ID NO：2)
在另一实施例中，适用于本发明的s iRNA的序列如下(5’端至3’端)：
正义链：GGAAUUUGGUCCACUGAAATT(SEQ ID NO：3)
反义链：UUUCAGUGGACCAAAUUCCAT(SEQ ID NO：4)
本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了IL-12p40基因与肝再生的相关性以后，可以以各种途径方便地制备出所述的小干扰RNA或经过一定修饰的小干扰RNA(比如连接脂质体/阳离子脂质体、肽/聚合物或抗体，或者进行适当碱基、核糖修饰或siRNA骨架修饰等)，从而用于促进肝再生。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到体内(如肝脏部位)，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到体内。
此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
在知晓本发明的机理之后，本领域技术人员可采用本领域常规技术制备特异性地干扰IL-12p40基因的表达的其它siRNA。
将外源DNA转染入哺乳动物细胞的方法是本领域周知的，大致可分为两大类，即生物方法和物理化学方法。物理化学方法中常用的有磷酸钙法、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染，以及最近出现的以高分子聚合物为载体的基因传递技术。生物方法则主要是以病毒作为载体，通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中，其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。
磷酸钙在良好的转染条件下，可以在293T等细胞的转染达到较高的转染效率。此外，转染方法还包括阳离子脂质体法，具体为带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。适用于阳离子脂质体法的阳离子脂质体是本领域周知的，并且可从各种商业途径购得。
3.药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的IL-12p40基因或多肽的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于促进肝再生。任何前述的IL-12p40基因或多肽的拮抗剂均可用于组合物的制备。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述IL-12p40基因或多肽的拮抗剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的拮抗剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将IL-1 2p40基因或多肽的拮抗剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带IL-12p40基因的拮抗剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的IL-12p40基因的拮抗剂，具体情况需视所述的拮抗剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的IL-12p40基因或多肽的拮抗剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的IL-12p40基因或多肽的拮抗剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的IL-12p40基因或多肽的拮抗剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
4.药物筛选
在得知了IL-12p40基因或多肽与肝再生的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制IL-12p40基因或多肽的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于促进肝再生真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选促进肝再生的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达IL-12p40基因或多肽的体系；和检测所述体系中IL-12p40基因或多肽的表达或活性；若所述候选物质可抑制IL-12p40基因或多肽的表达或活性，则表明该候选物质是促进肝再生的潜在物质。所述的表达IL-12p40基因或多肽的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达IL-12p40基因或多肽的细胞；或可以是重组表达IL-12p40基因或多肽的细胞。所述的表达IL-12p40基因或多肽的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到IL-12p40基因或多肽的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达IL-12p40基因或多肽的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于促进肝再生真正有用的物质。
本发明对于IL-12p40多肽的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的促进肝再生的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制IL-12p40基因或多肽的表达和活性，进而对促进肝再生有用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的实施除非另外说明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础免疫学》(FundamentalVirology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structures andMolecular properties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
实施例中实验所用材料及试剂：
1.动物：C57BL/6小鼠、IL-12p40-/-小鼠(来源于Jackson Laboratory)。
2.试剂：IL-12p40 Ab购自ebioscience；BrdU Ab购自Sigma；β-肌动蛋白抗体购于Sigma；ECL购自Cell signaling technology，生物素连接的羊抗鼠的IgG购自eBioscience；IL-12p40 siRNA合成于上海吉玛制药技术有限公司。
3.测试方法：Western blot、BrdU染色；
1)Western blot：
①将收集好的肝组织，加入一定量的RIPA裂解液，吹打混匀后，冰上放置20分钟，期间震荡3-4次；然后高速12,000rpm，低温离心30分钟；将上清液转移到无菌离心管中，测量蛋白浓度，待用；
②配制12％分离胶，每孔上样50μg蛋白，以200v电压跑胶35分钟；
③将蛋白转移至PVDF膜上，电转100v 60分钟；
④将膜与稀释好的抗IL-12p40的抗体或抗β-肌动蛋白的抗体4℃孵育过夜；充分洗涤后，再加入稀释好的HRP标记二抗，室温孵育反应1小时；
⑤加ECL显色液避光作用，适时终止反应，进行胶片的曝光、冲片。
2)BrdU染色：
①处死小鼠后，取出小鼠肝脏，浸泡于4％多聚甲醛。组织经过脱水、透明等处理后，进行石蜡包埋。将包埋好的组织块切成5μm厚的薄片，已备BrdU染色。
②切片经过预处理后，以6％H2O2甲醇浸泡5分钟以抑制内源性过氧化物酶；将切片浸泡于2N HCl中30分钟使DNA变性；经过胰蛋白酶处理20分钟后，在标本上加抗-BrdU抗体，于37℃孵育2小时；用PBS充分浸泡后，加生物素标记的羊抗鼠的IgG孵育1小时；PBS充分浸泡后，加链霉亲和素标记的HRP孵育1小时；PBS充分浸泡后，加DAB显色。
4.实验步骤：
1)IL-12p40-/-小鼠部分肝切除实验
小鼠经过2％戊巴比妥钠麻醉后，放于手术板上，去毛后，切开皮肤，剪开腹膜，充分暴露腹腔，用沾湿的棉签轻轻分离出肝的右上叶、左上叶及左下叶(总共约占小鼠肝脏体积的70％)，分别以5号线接扎后，切掉结扎的肝脏，缝合腹膜及皮肤，并给予小鼠背部注射4ml 0.9％生理盐水。1-2小时后，小鼠苏醒。在肝切后的24小时、48小时和72小时，称取小鼠体重和剩余肝脏的重量，计算剩余肝脏的重量/小鼠体重。
2)siRNA干扰肝脏中IL-12p40表达
将5OD的siRNA溶于2ml的0.9％生理盐水中，在4-10秒内通过i.v注射快速打入小鼠体内。48小时以后，给予小鼠实施部分肝切手术.小鼠苏醒48小时后，称取小鼠体重和剩余肝脏的重量，计算剩余肝脏的重量/小鼠体重，以评价干扰IL-12p40在肝脏中的表达后对肝再生的影响。
5.结果
(1)C57BL/6小鼠，按照时间点分为7组，每组3-4只。在第0天按前述部分肝切除实验进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，以触动剩余肝脏再生。在肝切后的第0小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时和72小时，处死小鼠，取出小鼠的肝脏抽取总蛋白。通过Western blot的方法检测IL-12p40的表达水平。如图1所示，肝切后的不同时间点，IL-12p40在肝脏中的表达发生明显变化。所示数据代表3次试验的结果。
(2)选取对照组(野生型)小鼠(9-10只)和IL-12p40基因缺陷小鼠(9-10只)进行实验。通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，触动剩余肝脏再生。在肝切后的第24小时、48小时和72小时，称量小鼠体重后，处死小鼠，取出小鼠的肝脏并称其重量。根据小鼠肝脏重量/小鼠的体重×100计算每只小鼠的肝脏与体重比率。所得结果显示在图2中。图2显示，肝切后，IL-12p40-/-小鼠肝脏再生明显增加。所示数据代表3次试验的结果。
(3)对照组(野生型，WT)和实验组(IL-12p40-/-)，每组9-10只小鼠，通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70％肝脏切除)，触动剩余肝脏再生。在肝切后的第24小时、48小时和72小时，处死小鼠，取出小鼠的肝脏。通过BrdU染色方法检测肝切后剩余肝脏中肝细胞的增殖情况。所得结果显示在图3中。图中显示，肝切后，IL-12p40-/-小鼠肝细胞增殖明显增强。所示数据代表3次试验的结果。图中放大倍数为100倍。
(4)对照组和实验组(IL-12p40siRNA)，每组3-4只小鼠，在第0天，给小鼠尾静脉注射2ml的阴性对照siRNA或IL-12p40siRNA。所使用的siRNA序列分别如下(5’端至3’端)：正义链：CCAAGAACUUGCAGAUGAATT，反义链：UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC〔结果见图4〕；和正义链：GGAAUUUGGUCCACUGAAATT，反义链：UUUCAGUGGACCAAAUUCCAT〔结果见图5〕。
48小时后，切除小鼠肝脏的70％，触动小鼠肝再生。肝切后48小时，处死小鼠，按照前述第(2)个实验所述的方法计算每只小鼠的肝脏与体重比率。结果分别显示在图4和5中。图中显示，通过RNAi技术干扰IL-12p40表达后，小鼠肝脏再生明显上升。
实施例2：药物筛选
1.细胞水平筛选
取正常小鼠的肝脏细胞(该细胞可内源性表达IL-12p40蛋白)、可以诱导表达IL-12p40的细胞或可以表达IL-12p40的细胞系，将所述细胞培养于CM培养基中。将该种细胞作为用于筛选促进哺乳动物肝再生的物质的细胞模型。
测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；
对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。
在处理后适当时间，采用常规方法测定所述细胞的IL-12p40蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的IL-12p40蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的促进哺乳动物肝再生的物质。
2.动物水平筛选
以正常小鼠作为动物模型。
测试组：用候选物质腹腔注射给予(还可通过灌胃、静脉注射、肌肉注射、皮下注射的方式给予)小鼠；
对照组：不用候选物质给予小鼠。
在处理后适当时间，采用常规方法测定小鼠肝脏中IL-12p40蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况。如果与对照组相比，测试组中的IL-12p40蛋白的表达、活性、存在量或分泌显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的促进哺乳动物肝再生的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>用IL-12p40siRNA促进肝再生
<130>091488
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA的正义链
<220>
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uuucagugga ccaaauucca n 21
Claims (1)
1.IL-12 p40基因的拮抗剂在制备促进肝再生用的药物中的用途，所述IL-12 p40基因的拮抗剂是特异性干扰IL-12p40基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链的序列为CCAAGAACUUGCAGAUGAATT，反义链的序列为UUCAUCUGCAAGUUCUUGGGC；或者其正义链的序列为GGAAUUUGGUCCACUGAAATT，反义链的序列为UUUCAGUGGACCAAAUUCCAT。
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