CN101899101B - 一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽，该合成多肽的序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。本发明多肽合成过程简单快速，而且所得到的多肽偶联抗原就有较广泛的保护作用。对于亚单位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽。
背景技术
流行性感冒病毒称流感病毒，是一类具有高度传染性的呼吸道病毒，也是被列入生物恐怖武器的其中一种。。目前，接种流感病毒疫苗被认为是预防流感发生与控制病毒传播的最佳方法，但由于流感病毒变异速度非常快，致使WHO每年都需要公布当前流行性病毒疫苗，给疫苗的研制和生产造成诸多不便。因此研制一种具有广泛保护作用的疫苗对于控制流感病毒流行具有极其重要的意义。
而且，目前的流感亚单位疫苗主要是通过PCR的方法扩增基因，再通过质粒转化大肠该菌，获得工程菌，最终获得重组蛋白。操作过程繁琐，且耗时。本发明多肽采用化学合成的方法，简单快速，且有良好的抗原性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽。
为实现上述目的，本发明合成多肽的序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
上述合成多肽的筛选方法为：
(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用以知DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；
(2)对候选肽段通过抗体的筛选，最终得到针对新型H1N1、H3N2和H1N1三种流感病毒具有保护作用的合成多肽，该多肽为498-520AA的氨基酸，其序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
进一步，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。
上述步骤(2)具体为：
以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清；
利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选，其中，
包被液：称取Na2CO3 0.15g，NaHCO3 0.293g，蒸馏水稀释至100ml，得到0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存；
洗涤液(稀释液)：称取NaCl 8g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液，4℃，保存；
封闭液：5％脱脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；
终止液：2mol/L的硫酸溶液；
然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，即：
1)包被抗原：用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3)加封闭液200ul，37℃放置1h；
4)洗涤同2)；
5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔加100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6)洗涤同2)；
7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀释)，反应板每孔100ul，37℃放置1h；
8)洗涤同2)；
9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；
10)加终止液：反应板每孔50ul；
11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
本发明多肽合成过程简单快速，而且所得到的多肽偶联抗原就有较广泛的保护作用。对于亚单位疫苗的研制，控制流感病毒的蔓延具有积极的意义。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细说明。
本发明合成多肽的筛选方法包括如下步骤：
(1)肽抗原表位的生物信息学选择与合成、修饰
从NCBI数据库中搜索流感病毒的HA氨基酸序列，用已知DNA-STAR和antheprot 5.0分析显示，330-350之间部分无论在抗原性、亲水性还是易溶性分析都是很好的候选片段；在400位下游存在大量的α螺旋结果，且主要位于疏水性片段，而且该区段变异度很低，序列稳定，因此判断为可能的穿膜部分，该区域放弃。但该区域(500-520)之后有较短的变异较大的区域，且该部分抗原性和亲水性均很强。同时，流感病毒的各亚型的表位线性肽的序列如表2和表3所示。故在330-350和500-520区域中，选择不同亚型的差异性片段合成十条备选多肽，见表1。
表1
表2
表3
(2)抗体的制备
以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清，各多肽的免疫血清抗体效价达到1∶100000时的P/N值见表4。
表4
| 免疫血清编号 | 对应多肽名称 | 位点 | 基因型别 | 1∶100000时PN值 |
| KLH-H5N1-1 | 1# | 320-338 | H5N1 | 82.1 |
| KLH-H1N1-1 | 2# | 321-339 | H1N1 | 9.09 |
| KLH-H3N2-1 | 3# | 238-256 | H3N2 | 48.0 |
| KLH-H2N2-1 | 4# | 318-336 | H2N2 | 6.02 |
| KLH-H5N1-2 | ZS-5 | 498-520 | H5N1 | 41.2 |
| KLH-H1N1-2 | ZS-6 | 495-517 | H1N1 | 24.9 |
| KLH-H3N2-2 | ZS-7 | 497-519 | H3N2 | 34.6 |
| KLH-H2N2-2 | ZS-8 | 492-514 | H2N2 | 27.9 |
| KLH-NH1N1-2 | X1 | 496-518 | 新H1N1 | 18.6 |
| KLH-NH1N1-1 | X2 | 322-340 | 新H1N1 | 31.2 |
(3)合成多肽免疫血清中抗体的筛选
ELISA实验的建立
利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选。
1.实验材料与试剂
H1N1、H3N2、新甲型H1N1流感病毒疫苗株来自长春生物制品所。
酶标羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司
96孔酶标板购自欣经科公司
牛血清白蛋白(BSA)购自Roch公司
Tween20购自Sigma公司。
包被液：称取Na2CO30.15g，NaHCO30.293g，蒸馏水稀释至100ml，即为0.05mol/L pH9.6(包被液)碳酸缓冲液，4℃，保存；
洗涤液(稀释液)：称取NaCl 8g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液(稀释液)，4℃，保存；
封闭液：5％脱脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；
终止液：2mol/L的硫酸溶液。
2.ELISA步骤
1)包被抗原：用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3)加封闭液200ul，37℃放置1h；
4)洗涤同2)；
5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6)洗涤同2)；
7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀释)，每孔100ul，37℃放置1h；
8)洗涤同2)；
9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；
10)加终止液：每孔50ul；
11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
3.ELISA实验结果见表5
表5
ELISA结果判读：P/N值＞2.1，判为阳性；P/N＜2.1，判为阴性。
从表5的结果可以看出，免疫血清KLH-H5N1-2与三种流感病毒(H1N1、新型H1N1和H3N2)反应，得到的P/N值均大于2.1，可以判读为阳性。进而可以说明由合成多肽ZS-5偶联KLH得到的抗原刺激产生的免疫血清具有一定范围的保护作用，能够为流感病毒亚单位疫苗的研究提供一定的佐证。
Claims (3)
1.一种用于流感病毒亚单位疫苗研究的合成多肽，其特征在于，所述合成多肽的序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
2.一种权利要求1所述合成多肽的筛选方法，其特征在于，具体如下：
(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用以知DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；
(2)对候选肽段通过抗体的筛选，最终得到针对新型H1N1、H3N2和H1N1三种流感病毒具有保护作用的合成多肽，该多肽为498-520AA的氨基酸，其序列为：CVKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清；
利用全病毒：H3N2、H1N1、新型H1N1作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选，其中，
按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，即：
1)包被抗原：用包被液将全病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；
2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；
3)加封闭液200ul，37℃放置1h；
4)洗涤同2)；
5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔加100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；
6)洗涤同2)；
7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，1∶1000倍稀释，反应板每孔100ul，37℃放置1h；
8)洗涤同2)；
9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；
10)加终止液：反应板每孔50ul；
11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数；
其中，包被液：称取Na2CO3 0.15g，NaHCO3 0.293g，蒸馏水稀释至100ml，得到0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存；
洗涤液及稀释液：称取NaCl 8g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液，4℃，保存；
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