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CN101781635A - 具有动物型糖链加成功能的植物细胞 - Google Patents

具有动物型糖链加成功能的植物细胞 Download PDF

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CN101781635A
CN101781635A CN200910146674A CN200910146674A CN101781635A CN 101781635 A CN101781635 A CN 101781635A CN 200910146674 A CN200910146674 A CN 200910146674A CN 200910146674 A CN200910146674 A CN 200910146674A CN 101781635 A CN101781635 A CN 101781635A
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CN
China
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sugar chain
enzyme
plant
glycoprotein
animal
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CN200910146674A
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藤山和仁
关达治
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DFB Biotech Inc
Original Assignee
Dow Chemical Co
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Abstract

本发明提供一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的外源基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。

Description

具有动物型糖链加成功能的植物细胞
本申请是申请日为2002年3月6日，申请号为02805959.X，发明名称为“具有动物型糖链加成功能的植物细胞”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，一种从这类植物细胞再生的植物，一种生产这类植物细胞的方法，以及一种利用该植物细胞生产具有动物型糖链的糖蛋白的方法。
背景技术
除传统和常规的生殖方式以外，可利用基因工程技术对植物细胞进行改造，由此可将其它方法不可行的或有利的性状赋于植物细胞。例如至今为止，已产生并应用了具有抗病、抗除草剂、长寿等类似性能的植物。最近，传统上由动物细胞、酶母、大肠杆菌等产生的有用的蛋白质，已经可通过植物细胞或植物生产。
迄今为止，已报道的利用植物细胞或植物表达的简单蛋白质或糖蛋白包括以下的例子：
α-1-抗胰蛋白酶：Appl Microbiol Biotechnol 1999十月；52(4)：51，6-23 Terashima M，Murai Y，Kawamura M，Nakanishi S，Stoltz T，Chen L，Drohan W，Rodriguez RL，Katoh S；α-淀粉酶Biotechnology(NY)1992 Mar；10(3)：292-6 Pen J，Molendijk L，QuaxWJ，Sijmons PC，van Ooyen AJ，van den Elzen PJ，Rietveld K，Hoekema A；血红蛋白Nature 1997 Mar 6；386(6620)：29-30 DieryckW，Pagnier J，Poyart C，Marden MC，Gruber V，BouRNAt P，BaudinoS，Merot B；木聚糖酶Nat Biotechnol 1999五月；17(5)：466-9“在植物根的渗出物中生产重组蛋白质”Borisjuk NV，Borisjuk LG，Logendra S，Petersen F，GlebaY，Raskin I；抗体Eur J Biochem 1999六月；262(3)：810-6 Fischer R，Liao YC，Drossard J.Curr TopMicrobiol Immunol 1999；236：275-92 Ma jk，Vine ND，J ImmunolMethods 1998十一月1；220(1-2)：69-75 Verch T，Yusibov V，Koprowski H；肌醇六磷酸酶Biochem Biophys Res Commun 1999十月14；264(1)：201-6“在烟草叶中表达的重组真菌肌醇六磷酸酶(phyA)的描述”Ullah AH，Sethumadhavan K，Mullaney EJ，Ziegelhoffer T，Austin-Phillips S，Plant Physiol 1997七月；114(3)：1103-11“从大豆细胞培养悬液中分泌具活性的重组肌醇六磷酸酶”Li J，HegemanCE，Hahlon RW，Lacy GH，Denbow MD，Grabau EA；人血清白蛋白Biotechnology(NY)1990 Mar；8(3)：217-21“在转基因植物中生产正确加工的人血清白蛋白”Sijmons PC，Dekker BM，Schrammeijer B，Verwoerd TC，van den Elzen PJ，Hoekema A；人乳白蛋白J Biochem(Tokyo)1998 Mar；123(3)：440-4“在转基因烟草中表达人α-乳白蛋白”Takase K，Hagiwara K；人干扰素J Interferon Res 1992十二月；12(6)：449-53 Edelbaum O，Stein D，Holland N，Gafni Y，LivnehO，Novick D，Rubinstein M，Sela I；人艾杜糖醛酸苷酶Curr TopMicrobiol Immunol 1999；240：95-118“转基因植物用于治疗用蛋白质：连接上游与下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，Oishi KK；GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)CMAF 1995八月15；153(4)：427-9Robinson A；水蛭素P；ant Mol Biol 1995十二月；29(6)：1167-80“利用OLEOSIN分配在植物种子中生产生物活性水蛭素”Parmenter DL，Boothe JG，van Rooijen GJ，Yeung EC，Moloney MM；人乳铁蛋白Protein Expr Purif 1998六月；13(1)：127-35“在转基因烟草植物中生产人乳铁蛋白”Salmon V，Legrand D，Slomianny MC，EL YazidiI，Spik G，Gruver V，BouRNAt P，Olagnier B，Mison D，Theisen M，Merot B Plant Physiol 1994十一月；106(3)：977-81“在烟草细胞中表达人乳铁蛋白eDNA以生产抗细菌的蛋白质”Mitra A，Zhang Z；血管紧张素转移酶的肽掏抑制剂(西红柿和烟草)Biotechnology(NY)1993八月；11(8)：930-2Hamamoto H，Sugiyama Y，Nakagawa N，Hashida E，Matsunaga Y，Takemoto S，Watanabe Y，Okada Y；多聚羟基丁烯Nat Biotechnol 1999十月；17(10)：1011-6“ARABIDOPSIS和芸苔的新陈代谢工程用于生产多聚(3-羟基丁酸盐-CO-3-羟基戊酸盐)共聚物”Slater S，Mitsky TA，Houmiel KL，Hao M，ReiserSE，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，Rodriguez DJ，Stone DA，Padgette SR，Kishore G，Gruys KJ Planta 1999十月；209(4)：547-50“在芸苔NAPUS的油种白色体中生产多聚(β-羟基丁酸盐)”HoumielKL，Slater S，Broyles D，Casagrande L，Colburn S，Gonzalez K，Mitsky TA，Reiser SE，Shah D，Taylor NB，Tran M，Valentin HE，GruysKJ；葡糖脑苷脂酶，Ann NY Acad Sci 1996五月25；792：62-71“用转基因烟草进行人类酶的生物生产”Cramer CL，Weissenborn DL，Oishi KK，Grabau EA，Bennett S，Ponce E，Grabowski GA，Radin DNCurr Top Microbiol Immunol 1999；240：95-118“转基因植物用于治疗性蛋白质：连接上游与下游的策略”Cramer CL，Boothe JG，OishiKK；葡糖醛酸糖苷酶，Adv Exp Med Biol 1999；464：127-47“在转基因玉米中进行分子耕作生产工业用蛋白质”Hood EE，Kusnadi A，Nikolov Z，Howard JA Biotechnol Bioeng 1998十月5；60(1)：44-52，“转基因玉米种子的加工及其在重组β-葡糖醛酸糖苷酶复性中的作用”Kusnadi AR，Evangelista RL，Hood EE，Howard JA，Nikolov ZL；红细胞生成素，Plant Mol Biol 1995 Mar；27(6)：1163-72 MatsumotoS，Ikura K，Ueda M，Sasaki R Biosci Biotechnol Biochem 1993八月；57(8)：1249-52 Matsumoto S，Ishii A，Ikura K，Ueda M，SasakiR谷氨酸脱羧酶Nat Med 1997七月；3(7)：793-6 Ma SW，Zhao DL，YinZQ，Mukherjee R，Singh B，Qin HY，Stiller CR，Jevnikar AM AdvExp Med Biol 1999；464：179-94 Ma S，Jevnikar AM或其它。
应用植物细胞或植物生产有用蛋白质的优势是，植物细胞和植物可以在蛋白质上添加一个糖链。
常规用于生产重组蛋白的大肠杆菌不具有添加糖链的功能。酵母具有添加糖链的功能，但所添加的糖链与动物糖链的结构有差异。在动物中，添加糖链的结构在不同物种间各异。即使是在同一动物体中，也发现添加的糖链结构很大程度上随不同组织、不同发育和分化阶段或其它而各异。
总之，根据糖链与糖蛋白的连接方式，可以将糖蛋白中糖链的结构分为两类：一种糖链类型为氮-连接糖链，其中糖链与蛋白质中天冬酰胺残基连接；另一种是氧-连接糖链，其中糖链与蛋白质中丝氨酸或苏氨酸残基连接。对于氮-连接糖链，在动物、植物、昆虫、酵母等中有高甘露糖型糖链、复合型糖链以及杂合型糖链。
一种糖蛋白的糖链具有一种核心结构(核心糖链)。一种核心糖链首先是以在细胞内质网中含脂质体的复合物形式合成的，接着转移到蛋白质上(Annu Rev Biochem 1985；54：631-64 Kornfeld R，Kornfeld
S)。然后，含转移来的核心糖链的蛋白质由内质网输送至高尔基体，在这里将糖进一步添加到核心糖链上以延长糖链。在高尔基体中糖链的延伸被称为末端糖链合成，这种过程在不同物种中各异。
另外，岩藻糖残基与核心糖链还原末端部分的N-乙酰氨基葡糖残基的连接方式多种多样，连接方式取决于不同的物种(Biochem BiophysActa 1999十二月6；1473(1)：21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。
如上所述，植物具有同动物一样的糖链添加机制。植物是生产有用的糖蛋白的潜在宿主。然而，尽管所生产的蛋白质应该具有生理活性，某些该类蛋白质如果在翻译后没有成功地进行加工，不能像生理活性蛋白质一样呈现本身的活性(特别是在添加糖链后)。另外，植物所具备的糖链添加机制与动物，特别是人类的不同。因此，可能将一种与预想的动物型糖链结构不同的糖链添加到蛋白质上，所形成的蛋白质就可能对人具有抗原性(Glycobiology 1999四月；9(4)：365-72Cabanes-Macheteau M，Fitchette-Laine AC，Loutelier-Bourhis C，Lange C，Vine ND，Ma JK，Lerouge P，Faye L)。
一种植物糖链的特征性结构是其中岩藻糖残基与核心糖链中还原末端部分N-乙酰氨基葡糖连接的方式。已报道这种连接方式随物种不同而不同(Biochem Biophys Acta 1999十二月6；1473(1)：21，6-36，Staudacher E，Altmann F，Wilson IB，Marz L)。对于植物，已报道了一种α1，3-连接(Biosci Biotechnol Biochem1999一月；63(1)：35-9 Palacpac NQ，Kimura Y，Fujiyama K，YoshidaT，Seki T；Biosci Biotechnol Biochem 1997十一月；61(11)：1866-71Kimura Y，Ohno A，Takagi S；Eur J Biochem 1991七月1；199(1)：169-79 Sturm A)。对于人和大鼠这样的哺乳动物，已报道了一种α1，6-连接(Glycobiology 1991九月；1(4)：337-46 TakeuchiM，Kobata A)。在图9中，显示了一种植物和一种动物的复合型糖链结构。对于昆虫细胞，α1，3-连接和α1，6-连接均已发现(GlycoconjJ 1998十一月；15(11)：1055-70 Wilson IB，Altmann F；Eur J Biochem1991八月1；199(3)：745-51 Staudacher E，Altmann F，Glossl J，Marz L，Scheachter H，Kamerling JP，Hard K，Vliegenthart JF)。
从植物和昆虫中获得的有α1，3-糖蛋白连接的糖链部分一般来讲对人具有抗原性(Glycoconj J 1998十一月；15(11)：1055-70 WilsonIB，Altmann F；Int Arch Allergy Immunol 1999二月-四月；118(2-4)：4113 Petersen A，Grobe K，Schramm G，Vieths S，AltmannF，Schlaak M，Becker WM；Int Arch Allergy Immunol 1999九月；120(1)：30-42 Fotisch K，Altmann F，Haustein D，Vieths S)。
负责在一个N-乙酰氨基葡糖残基上添加一种岩藻糖残基的酶的基因，即α1，3-岩藻糖基转移酶的cDNA，已从一种植物即绿豆中克隆到(J Biol Chem 1999七月30；274(31)：21830-9 Leiter H，Mucha J，Staudacher E，Grimm R，Glossl J，Altmann F)。对于哺乳动物，已从人和猪中克隆到α1，6-岩藻糖基转移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)：626-32 Yanagidani S，Uozumi N，IharaY，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)：27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，IharaY，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，Fujii S，Shiba T，Taniguchi N)。
N-乙酰氨基葡糖转移酶I基因的突变体己从拟南芥中获得。在这种突变体中，糖链的加工停滞于N-乙酰氨基葡糖转移酶I后(PlantPhysiol 1993八月；102(4)：1109-18 von Schaewen A，Sturm A，O’Neill J，Chrispeels MJ)。当将从人获得的N-乙酰氨基葡糖转移酶I的cDNA导入到这种突变体中，N-乙酰氨基葡糖转移酶的活性得到恢复(Proc Natl Acad Sci USA 1994三月1；91(5)：1829-33 GomezL，Chrispeels MJ)。相反，当将从拟南芥获得的N-乙酰氨基葡糖转移酶I的cDNA导入到没有N-乙酰氨基葡糖转移酶活性的CHO细胞的变种Lecl中，CHO细胞的N-乙酰氨基葡糖转移酶活性得到恢复(BiochemBiophys Res Commun 1999八月11；261(3)：829-32Bakker H，LommenA，Jordi W，Stiekema W，Bosch D)。
另外，发现除与一种固定氮的细菌-根瘤菌属NGR234中的一种结节因子的生物合成相关的基因之外，nodZ基因可以编码岩藻糖基转移酶(J Bacteriol 1997八月；179(16)：5087-93 Quesada-Vincens D，Fellay R，Nasim T，Viprey V，Burger U，Prome JC，Broughton WJ，Jabbouri S)。
Olsthoorn等报道在百脉根根瘤菌NZP2213中，α1，3-岩藻糖基转移酶参与结节因子的生物合成(Biochemistry 1998六月23；37(25)：9024-32 Olsthoorn MMA，Lopez-Lara IM，Petersen BO，BockK，Haverkamp J，Spaink HP，Thomas-Oates JE)。从百脉根根瘤菌中获得的一种nodZ蛋白，可以将GDP-β-岩藻糖中的岩藻糖残基转移到一种几丁质寡糖还原末端N-乙酰氨基葡糖残基的C6位上(ProcNatl Acad Sci USA 1997四月29；94(9)：4336-41 Quinto C，WijfjesAHM，Bloemberg GV，Blok-Tip L，Lopez-Lara IM，Lugtenberg BJ，Thomas-Oates JE，Spaink HP)。这种nodZ蛋白与从动物中获得的α1，6-岩藻糖基转移酶具有类似的酶活性，但实质上在氨基酸序列水平上没有同源性(Glycobiology 1991十二月；1(6)：577-84 Macher BA，Holmes EH，Swiedler SJ，Stults CL，Srnka CA；Histochem J 1992十一月；24(11)：761-70 de Vries T，van den Eijnden DH)。
进一步，当将从百脉根根瘤菌中获得的具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的nodZ蛋白显微注射到斑马鱼的受精卵中，胚胎发育中其身体和尾鳍变形(Proc Natl Acad Sci USA 1997七月22；94(15)：7982-6Bakkers J，Semino CE，Stroband H，Kijne JW，Robbins PW，SpainkHP；Ann N Y Acad Sci 1998四月15；842：49-54 Semino CE，AllendeML，Bakkers J，Spaink HP，Robbins PP)。
当将从人获得的β1，4-半乳糖转移酶基因cDNA导入到培养的烟草细胞中，在这种植物细胞中获得了具有转移的半乳糖残基的糖链结构。随着来源于人的糖转移酶基因的导入，植物细胞中糖链的加工途径可被改造(Proc Natl Acad Sci USA 1999四月13；96(8)：4692-7Palacpac NQ，Yoshi da S，Sakai H，Kimura Y，Fujiyama K，YoshidaT，Seki T)。
另外，Steinkellner已证实，利用从烟草中克隆的N-乙酰氨基葡糖转移酶IcDNA，可采用反义基因抑制法或转录后基因沉默法抑制N-乙酰氨基葡糖转移酶基因的表达，或减少其表达量(国际分子操作会议，伦敦，安大略省，加拿大，八月.29九月1，1999，Abstract Book，W79，p.46，Steinkellner H)。
发明人辛勤地研究了以上描述的由不同生物体中不同的糖链加成功能所造成的问题，并完成了本发明。本发明是用来通过在植物细胞中导入岩藻糖基转移酶基因解决以上描述的传统问题，而这种基因最初并不存在于植物细胞中。本发明的目的是提供一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，一种从这种植物细胞再生的植物，一种生产该植物细胞的方法，以及一种利用该植物细胞生产动物型糖蛋白的方法。
发明内容
本发明涉及一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞。这种植物细胞含有一个编码动物来源的酶的导入基因，这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白中糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
优选的，这种来源于动物的酶是α1，6-岩藻糖基转移酶。
一方面，本发明涉及一种从该植物细胞再生的植物。
另一方面，本发明涉及一种生产具有动物型糖链加成功能的植物细胞的方法。该方法包括在植物细胞中导入一种来源于动物的编码酶的基因的步骤，其中这种酶可以将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链中的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
在另一方面，本发明涉及一种生产具动物型糖链的糖蛋白的方法。该方法包括以下步骤：通过在植物细胞中导入一种编码来源于动物的酶的基因，以及一种编码外源性糖蛋白的基因来转化植物细胞，其中的酶可将一个岩藻糖残基转移到糖蛋白的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上，并且培养获得的转化的植物细胞。
本发明也涉及用上述方法所生产的一种糖蛋白。这种糖蛋白具有一个动物型糖链。
附图说明
图1显示用于生产本发明中植物细胞的载体pBI221-FT的构建图。pBI221-FT载体特有的SacI位点被更换为SalI位点。在该位点中插入一个α1，6-FT基因。
图2显示用于生产本发明中植物细胞的载体pGPTV-HPT-FT的构建图。
图3是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2-13制备并通过PCR进行扩增的。
图4A、B是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是从转化株BY2-FT 2，3，4和6制备的RNA中通过RT-PCR扩增所获得的。
图5是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。
图6是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。
图7是显示高效液相色谱(HPLC)分析一个结果的图。
图8是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本发明中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。
图9是显示一种植物和一种动物的复合型糖链结构的示意图。在复合型糖链结构的核心部分，植物型糖链包含一个木糖残基，而动物型糖链也包含一个木糖残基。另外，一个岩藻糖残基以α1，6方式与动物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接，一个岩藻糖残基以α1，3方式与植物型糖链最内部的N-乙酰氨基葡糖残基连接。
图10是一个显示用于测量α1，6-FT以及一种活性测量体系中底物糖链结构的示意图。
图11是转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白HPLC分析的色谱图。
图12显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(高甘露糖型糖链)的分析结果图。
图13显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(复合型糖链)的分析结果图。
图14显示从转化体BY2-FT3培养细胞所产生的糖蛋白的一种糖链结构(α1，6-岩藻糖连接糖链)的分析结果图。
图15是一张电泳后显色的胶的照片，染色体DNA是通过PCR扩增从转化的植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FG3中制备的。
图16是电泳胶印迹PVDF膜显色后的照片，显示本发明中应用植物凝血素的植物细胞产生的糖蛋白的分析结果。
具体实施方式
以下将详细描述本发明。
本行业中已知的分离和分析蛋白质的方法，以及免疫分析法，除特别提到的以外，可用于本发明中。这些技术可通过市场提供的试剂盒、抗体、标记物以及其它实施。本发明中所使用的技术将在以下的材料与方法部分中进行描述。
根据本发明的方法是针对一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，这里所用的术语“动物型糖链”是指这样一种糖链，即其中岩藻糖残基与糖蛋白的核心糖链中的还原末端部分存在的N-乙酰氨基葡糖残基以α1，6方式连接。优选的，岩藻糖残基是与存在于核心糖链的最核心部分的N-乙酰氨基葡糖残基连接的，而这种核心糖链是与蛋白质的天冬酰胺残基连接的。
植物细胞可以是任何植物细胞。植物细胞可以是培养的细胞、培养的组织、培养的器官或一种植物。优选的，植物细胞应是培养的细胞、培养的组织、或培养的器官，最优选的是培养的细胞。应用于本发明生产方法中的植物类型可以是可用于基因导入的任何类型的植物。可用于本发明中生产方法的植物类型的例子包括，茄科、poaeae、芸苔科、蔷薇科、豆科、瓜科(curcurbitaceae)、唇形科、百合科、藜科、伞形科家族的植物。
茄科家族植物的例子包括烟草属、茄属、曼陀罗属、番茄属、牵牛花属的植物。特别的例子包括烟草、茄子、土豆、西红柿、红辣椒和牵牛花。
POAEAE家族植物的例子包括稻属、大麦属、黑麦属、甘蔗属、稻田稗属和玉蜀黍属。特别的例子包括大麦、黑麦、稗、高粱和玉米。
芸苔科家族植物的例子包括萝卜属、芸苔属、ARABIDOPSIS、WASABIA和荠属。特别的例子包括日本白萝卜、油菜籽、拟南芥、日本辣根和荠菜。
蔷薇科家族植物的例子包括orunus、苹果属(malus)、梨属(pynus)、草莓属和玫瑰属。特别的例子包括李子、桃、苹果、梨、荷兰草莓和玫瑰。
豆科家族植物的例子包括大豆属、豇豆属、菜豆属、碗豆、蚕豆属、花生属、红花草属、紫花苜蓿和苜蓿属。特别的例子包括大豆、小豆、菜豆、豌豆、蚕豆、花生、苜蓿和紫花苜蓿。
瓜科家族植物的例子包括丝瓜，黄瓜属和香瓜属。特别的例子包括南瓜、倭瓜、黄瓜和甜瓜。
唇形科家族植物的例子包括薰衣草属、薄荷属和紫苏属。特别的例子包括熏衣草，薄荷和白苏植物。
百合科家族植物的例子包括葱属、百合属、郁金香属。特别的例子包括洋葱、大蒜、百合和郁金香。
藜科家族植物的例子包括菠菜属，特别的例子是菠菜。
伞形科家族植物的例子包括当归属、胡萝卜属、鸭儿芹属和芹属。特别的例子包括日本土当归、胡萝卜、北柴胡和芹菜。
优选的，本发明的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、稻、玉米、萝卜、大豆、豌豆、紫花苜蓿或菠菜。更优选的，本发明的生产方法中所使用的植物应该是烟草、西红柿、土豆、玉米或大豆。
“能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶”是指植物细胞中糖蛋白的蛋白质部分合成以后，在糖链添加过程中可以将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶。这种酶的例子之一是α1，6-岩藻糖基转移酶。这个酶可使岩藻糖以α1，6的方式连接到糖蛋白离肽链最近处的N-端连接的糖链的N-乙酰氨基葡糖残基上，GDP-岩藻糖用作糖的供体。该酶可从任何动物细胞中获得，优选的是哺乳动物，更优选的是人。
优选的，这个酶定位于细胞的细胞器中。发明人相信，该酶存在于细胞的细胞器中(例如内质网和高尔基体)，并导致岩藻糖以α1，6的方式连接到植物细胞外源蛋白质的还原末端部分所存在的N-乙酰氨基葡糖残基上。尽管发明人并不拘泥于一种特定的理论。
“能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基的酶的基因”可以是利用编码该酶的核苷酸序列从任何动物细胞中分离到的基因，或是一种市售商品。这类酶可经修饰后适应于在植物中表达。对这种分离和修饰，有本行业熟练人员已知的方法。
例如对于哺乳动物，己从人和猪中克隆到α1，6-岩藻糖基转移酶的cDNA(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)：626-32 YanagidaniS，Uozxumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-84975，Japanese Laid-OpenPublication No.10-4959；J Biol Chem 1996十一月1；271(44)：27810-7 Uozumi N，Yanagidani S，Miyoshi E，Ihara Y，Sakuma T，Gao CX，Teshima T，Fujii S，Shiba T，Taniguchi N；Japanese Laid-Open Publication No.10-4969，Japanese Laid-OpenPublication No.9-201191)。已显示了cDNA的结构。
这里所用的术语“基因”是指结构基因部分。可将操纵序列如启动子、操纵子和终止子连接到这段基因上，以便在植物中正确表达该基因。
术语“外源性糖蛋白”是指在植物中以基因工程方法表达所得到的糖蛋白。这类外源性糖蛋白的例子包括酶、激素、细胞因子、抗体、疫苗、受体和血清蛋白。酶的例子包括辣根过氧化物酶、激酶、葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(TPa)和HMG-CoA还原酶。激素和细胞因子的例子包括内啡肽、α-干扰素、GM-CSF、G-CSF、绒毛膜刺激激素、白介素-2、β-干扰素、γ-干扰素、红细胞生成素、血管内皮细胞生长因子、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体(生成)激素(LH)、甲状腺刺激激素(TSH)、催乳素和卵巢刺激激素。抗体的例子包括免疫球蛋白G(IgG)和单链抗体可变区基因片段(ScFv)。疫苗的例子包括乙型肝炎表面抗原、轮状病毒抗原、大肠杆菌肠毒素、疟疾抗原、狂犬病毒G蛋白和艾滋病毒糖蛋白(如gp120)。受体和基质蛋白的例子包括EGF受体、纤维结合素、α1-抗胰蛋白酶和凝集因子III。血清蛋白质的例子包括白蛋白、补体蛋白、纤溶酶原、类皮质酮结合球蛋白、甲状腺素-结合球蛋白和蛋白质C。
术语“外源性糖蛋白基因”是指从任何动物细胞中分离的基因，可应用核苷酸序列编码该基因，或市场提供的基因。这类基因可通过修饰以适应在植物细胞中表达。
能将岩藻糖残基转移到还原末端的N-乙酰氨基葡糖残基的酶的基因，以及外源性糖蛋白的基因均可通过本行业中已知的方法导入到植物细胞中。这些基因可分别或同时导入到植物细胞。将基因导入到植物细胞的方法的例子包括土壤杆菌属法、电穿孔法和粒子轰击法。
转移植物细胞的合适的方法包括显微注射(Crossway等人，BioTechniques 4：320-334(1986))、电穿孔(Riggs等人，Proc NatlAcad Sci USA 83：5602-5606(1986))、土壤杆菌属介导的转化(Hinchee等人，Biotechnology 6：915-921(1988)；也见Ishida等人，Nature Biotechnology14：745-750(六月1996)的玉米转化)、直接基因转移(Paszkowski等人，EMBO J 3：2717-2722(1984)；Hayashimoto等人，Plant Physiol 93：857-863(1990)(水稻))，以及利用以下公司出售的仪器进行弹道粒子加速法：Agracetus公司，Madison，Wis以及Dupont公司，Wilmington，Del(见，例如，Sanford等人，美国专利号4945050；以及McCabe等人，Biotechnology6：923-926(1998))，也见于Weissinger等人，Annual Rev Genet22：421-477(1988)；Sanford等人，Particulate Science andTechnology 5：27-37 91987(洋葱)；Svab等人，Proc Natl Acad SciUSA 87：8526-8530(1990)(烟草叶绿粒)；Christou等人，PlantPhysiol 87：671-674(1988)(大豆)；McCabe等人，Bio/Technology6.923-926(1988)(大豆)；Klein等人，Proc Natl Sci USA85：4305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，Bio/Technology 6.559-563(1988)(玉米)；Klein等人，Plant Physiol 91：440-444(1988)(玉米)；Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990)；和Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603-618(1990)(玉米)；Koziel等人，Biotechnology11：194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，Nature 338：274-277(1989)(水稻)；Christou等人，Biotechnology 9：957-962(1991)(水稻)；Datta等人，Bio/Technology 3：736-740(1980)(水稻)；欧洲专利申请EP 0332581(果园草和其它POOIDEAE)；Vasil等人，Biotechnology 11：1553-1558(1993)(小麦)；Weeks等人，PlantPhysiol 102：1077-1084(1983)(小麦)；Wan等人，Plant Physiol104：37-48(1984)(大麦)；Jahne等人，Theor Appl Genet 89：525-533(1994)(大麦)；Umbeck等人，Bio/Technology 5：263-266(1987)(棉花)；Casas等人，Proc Natl Sci USA 90：11212-11216(1983年12月)(高粱)；Somers等人，Bio/Technology 10：1589-1594(1982年12月)(橡胶)；Torbert等人，Plant Cell Reports 14：635-640(1995)(橡胶)；Weeks等人，Plant Physiol 102：1077-1084(1983)(小麦)；Chang等人，WO 94/13822(小麦)和Nehra等人，The Plant Journal 5：285-297(1994)(小麦)。一套特别优选的通过显微注射轰击将重组DNA分子导入玉米的实施方案可见于Koziel等人，Tiotechnology 11：194-200(1993)，Hill等人，Euphytica 85：119-123(1995)和Koziel等人，纽约科学院年鉴792：164-171(1996)。另一种优选的实施方案是在欧洲专利0292435中披露的玉米的原生质体转化法。植物转化可以用单一种类的DNA或多种类DNA进行(例如联合转移)，这些技术均适用于过氧化物酶编码的序列。
导入植物细胞中基因的表达可用本行业中任何已知的方法观察。这类方法的例子包括银染或加强法、免疫印迹法、RNA印迹杂交和酶活性检测法。表达导入基因的细胞即转化细胞。
可以表达能将岩藻糖残基转移到还原末端的N-乙酰氨基葡糖残基的酶以及外源性的糖蛋白的转化细胞表达具有动物型糖链的外源性糖蛋白。也就是说，转化的细胞具有动物型糖链加成功能。通过培养这类转化细胞，可大量生产具有动物型糖链的糖蛋白。动物型糖蛋白包含核心糖链和外部糖链。核心糖链由一个甘露糖和一个或一个以上的乙酰氨基葡糖所组成。这类糖蛋白的外部糖链包含非还原末端糖链部分。外源糖链可具有一个直链结构或一个支链结构。优选的，外部糖链可具有一个支链结构。支链糖链部分有一、二、三或四级结构。用这类转化细胞生产的糖蛋白优选的包含以α1，6-方式连接到离糖蛋白肽链最近的N端糖链的N-乙酰氨基葡糖上的任何岩藻糖残基。
这些转化的植物细胞可以是培养的细胞或分化成特异组织或器官的形式。替代地，这些细胞也可以再生为植物。在这种情况下，转化的植物细胞可以分布于整个植物中或存在于植物特定的部位，例如种子、果实、果核、叶子、根、干或植物的花。
对于培养来讲，转化的植物细胞的分化和再生均使用本行业已知的方法和培养基。培养基的例子包括MURASHIGE-SKOOG(MS)培养基、GAMBORG B5(B)培养基、WHITE培养基和NITSCH&NITSCH(NITSCH)培养基，然而，本发明并不仅限于此。这类培养基一般在添加合适量的植物生长调节物(例如植物激素)及同类物以后使用。
这些体系在不同植物株的应用取决于该植物株从原生质体再生的能力。已有描述谷类由原生质体再生的示范性方法(Fujimura等人，Plant Tissue Culture Letters，2：74，1985；Toriyama等人，TheorAppl Genet，73：16，1986；Yamada等人，Plant Cell Rep，4：85，1986；Abdullah等人，Biotechnology，4：1087，1986)。
对于不能由原生质体成功转化的植物株，可利用其它将DNA导入完整细胞或组织的方法。例如，谷类可按描述的方法由不成熟的胚胎或外植体有效再生(Vasil，Biotechnology，6：397，1988)。
土壤杆菌介导的转化也是在植物细胞中导入基因所广泛应用的体系，这是由于DNA可导入到整个植物组织中，从而越过了从原生质体到完整植物的再生的需要。应用土壤杆菌介导的植物整个载体向植物细胞中导入DNA是本行业中熟知的方法。例如，本方法在以上已进行了描述。
由转化植物细胞生产的具动物型糖链的糖蛋白可从植物细胞中分离或萃取。分离糖蛋白的方法可以是本行业已知的任何方法。本发明中的糖蛋白可应用于食品中，而糖蛋白仍存留于转化的细胞中。本发明中植物细胞生产的糖蛋白由于添加了动物型糖链，可以在动物、特别是人身上注射而没有抗原性。
(实施例)
实施例中使用的材料、试剂以及操作步骤将在以下的材料与方法部分进行描述。
(实施例1：在培养的烟草细胞中导入α1，6-岩藻糖基转移酶基因(此后指α1，6-FT))
应用可以感染植物细胞的土壤杆菌在培养的烟草细胞中导入α1，6-岩藻糖基转移酶基因。土壤杆菌农杆根瘤菌经常用于转化双子叶植物。最近的研究显示，Ti质粒上的vir区编码的一组基因参与了肿瘤的形成。当感染植物时，土壤杆菌接受由双子叶植物分泌的作为感染信号的酚，然后激活vir基因组的转录。结果，vir基因编码的几个蛋白通过切割、转移，掺入T-DNA基因。单个的T-DNA和vir基因不具备肿瘤形成的能力。即使当T-DNA和vir基因存在于同一土壤杆菌细胞但在不同复制子时，T-DNA和vir基因可以共同致癌。利用一个双载体导入外源性基因的方法利用了这种特性。
在这个实施例中，来源于人α1，6-FT(序列鉴定号2)的cDNA(序列鉴定号1)，例如糖转移酶(α1，6-FT亚克隆所得到的pBluescript-FT由大阪大学医学系的Naoyuki Taniguchi惠赠)插入到T-DNA区域以构建双载体pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT。这种双载体的构建方案以图1和图2表示。
最初，利用pBluescript-FT为模板，通过PCR扩增所获得的α1，6-FT基因片段用限制性内切酶进行消化。同样，将该基因片段插入到PBI221载体(CLONTECH LABORATRIES INC)，通过PCR对其限制性酶切位点进行修饰以获得一个pBI221-FT载体(图1)。引物参照Yanagidani等人的报告而产生(J Biochem(Tokyo)1997三月；121(3)：626-32 Yanagidani S，Uozumi N，Ihara Y，Miyoshi E，Yamaguchi N，Taniguchi N；J Biol Chem 1996十一月1；271(44))。
另外，Xba I-EcoR I片段含有一个CALIFLOWER花叶病毒35S启动子基因，α1，6-FT，并从pBI221-FT载体中切掉一个胭脂碱合成酶终止子基因。Xba I-EcoR I片段掺入到三个植物转化双载体pGPTV-HPT(例如从美国典型培养物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockbill，Maryland USA 20852)获得的ATCC77390)、pGPTV-DHFR(例如，ATCC77390从ATCC获得)pGPTV-BAR(例如，ATCC77391从ATCC获得)(图2)。这三种双载体在其T-DNA区域具有不同的抗药性基因，因此可以使用不同的药物筛选转化的植物细胞。
制备三种不同抗药性表达基因(即pGPTV-HPT-FT、pGPTV-DHFR-FT和pGPTV-BAR-FT)的原因是，用于筛选转化细胞的药物和导入的糖转移酶对细胞具有不可知的影响。尚未发现一种可以确定应用于该情况的筛选的药物。因此，提前构建了三种α1，6-FT的表达载体。构建这三种载体主要是源于这样的观点，即当将来将多个外源基因导入到同一克隆中时，含具备不同作用机制的筛选标记的载体是有用的。
在制备的表达载体中，pGPTV-HPT-FT在这个实施例中用来转化一种烟草BY2的培养细胞。
土壤杆菌是用Bevan等人的三亲株交配法转化的(Bevan M，Nucleic Acid Res，12，8711，1984)。含有pGPTV型质粒(Plant MolBiol 1992十二月；20(6)：1195-7 Becker D，Kemper E，Schell J，Masterson R)的大肠杆菌DH5α(suE44，ΔlacU169，(Φ801azΔM15)，hsdR17)(Bethesda Research Laboratories Inc：Focus8(2)，9(1986))，以及含有辅助质粒pRK2103(Bevan M，Nucleic AcidRes，12，8711，1984)的大肠杆菌HB101分别在含12.5mg/l四环素、50mg/l卡那霉素的2×YT培养基中37℃过夜培养。土壤杆菌农杆根瘤菌EHA101(Elizanbeth EH，J Biacteriol，168，1291，1986)在含50mg/l卡那霉素、25mg/l氯霉素的2×YT培养基中28℃培养两晚。然后，每种培养液取1.5ml到Eppendorf管中。收集到每种菌株的细胞后，用LB培养液将细胞洗三遍。以这种方式获得的细胞接着用100μl 2×YT培养液悬浮，与三种细菌混合，涂布到2×YT琼脂培养基上，在28℃培养，然后pGPTV型质粒从大肠杆菌结合转移到土壤杆菌。两天后，将出现在2×YT琼脂培养基上的某些菌落用白金环转移到含50mg/l卡那霉素、12.5mg/l四环素和25mg/l氯霉素的LB琼脂培养皿中。将内容物在28℃培养2天后，可筛选到单菌落。
培养的烟草细胞的转化是用An G.，Plant Mol Bio Mannual A3，1所描述的方法。首先，将100μl含pGPTV型质粒的土壤杆菌EHA101在含12.5mg/l四环素的LB培养基中，于28℃培养48小时，在培养的第四天，将4ml培养的烟草细胞烟草属烟草L.cv.亮黄2的悬液(菌株号BY2是从Tsukuba生命科学研究中心基因库的植物细胞发展组，用分类号RPC1获得的)在一个培养皿中充分混匀，并在暗处于25℃放置。两天后，从培养皿中取出部分溶液，通过离心(1000rpm，5分钟)分离上清。细胞沉淀加入到新的培养基中并再次离心。将细胞接种到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧苄青霉素的加强LS琼脂皿中，在暗处于25℃放置。两至三星期后，将生长到胼胝期的细胞转移到新的培养皿中，并挑选生长的菌落。再过两到三星期后，传代后将菌落转移到30ml含潮霉素和羧苄青霉素的加强型LS琼脂皿中。由于筛选中用了潮霉素，获得一个转化的胼胝的时间(约5星期)是平常的两倍。对于所得到的转化的胼胝，用含潮霉素的选择性培养基再重复筛选约一个月。从这种方法所获得的抗性菌株中随机选择12个抗性菌株(BY2-FT 2至13)，用于DNA水平的分析。
(BY2-FT细胞DNA水平的分析)
所获得的转化菌株BY2-FT 2至13的研究如下：利用其胼胝，根据以下材料和方法部分第10节所描述的方法，制备基因组DNA，α1，6-FT基因的掺入用PCR检测(见材料和方法部分12)。对于PCR，引用以下的引物：FT-Xba：5’-TGGTTCCTGGCGTTGGATTA(序列鉴定号3)，和FT-Sal：5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC(序列鉴定号4)。PCR扩增产物用材料和方法部分第8节所描述的方法进行电泳，结果表示于图3。
如图3所显示，11个菌株即BY2-FT2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和13在1700bp附近显示条带，被认为是α1，6-FT基因区的扩增片段。相对照，从培养的野生型烟草细胞中制备的基因组DNA用于模板时，未发现条带(在图3的右边用WT指示的电泳道)。因此，确定α1，6-FT基因掺入到BY2-FT细胞的染色体中。
(BY2-FT细胞RNA水平的分析)
在PCR分析证实导入的α1，6-FT基因是基因组DNA的转化子中，研究了具有高生长率的4株菌株BY2-FT2、3、4和6。其中的RNA是根据下面材料与方法第11节中所描述的方法制备的，进行了RT-PCR(见下面材料与方法第13节)。结果显示于图4中。RT-PCR中所使用的引物与以上描述的一致，扩增产物用以上DNA分析中描述的相同条件进行电泳。如图4中所显示的结果，观察到所有4株菌株在1700bp附近显示条带，被认为是α1，6-FT基因区的扩增片段。野生型BY2株中未发现扩增条带(图4中WT所指示的泳道)。进一步，用根据一种CaWV 35S启动子序列所设计的引物(CaWV引物)(序列鉴定号5)和FT-Sal引物进行RT-PCR，结果没有条带(图4中第A道)。CaWV引物：5‘-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT(序列鉴定号5)。
在这些实验中，用制备RNA标本的试剂盒所制备的RNA液有可能被基因组DNA污染。在RT-PCR之前，所有制备的RNA标本均经过了DNA酶的处理。在使用经DNA酶处理的RNA标本作模板进行PCR的情况中，未发现扩增条带(图4的B道)。因此，证实上述的条带不是从DNA扩增的片段。
(α1，6-FT酶活性的观察)
在这些实验中所使用的检测α1，6-FT活性的一种α1，6-FT活性检测试剂盒中，一种具有图10上端所显示的结构的荧光素标记糖链是一种底物糖链。荧光素标记糖链是在Toyobo Co公司制备的，参照以下Yazawa等人和Seko等人的报告(Glycoconj J 1998九月；15(9)：863-71 Yazawa S，Kochibe N，Nishimura T，Shima C，TakaiI，Adachi M，Asao T，Hada T，Enoki Y，Juneja LR；Biochim BiophysActa 1997四月17；1335(1-2)：23-32 Seko A，Koketsu M，NishizonoM，Enoki Y，Ibrahim HR，Juneja LR，Kim M，Yamamoto T)。具有一个连接的天冬酰胺残基的糖链是从卵黄中制备的(Gn和Gn-bi-Asn)。一种荧光底物(4-氟-7-硝基苯呋咱(NBD-F，Dojin KagakuKenkyujo))贴附于天冬酰胺残基(Gn，Gn-bi-Asn-NBD)。传统上，还原末端是由2-氨基吡啶进行荧光标记的PA糖链是用于检测糖转移酶的活性的。然而，在这种PA糖链中，还原末端的N-乙酰氨基葡糖有一个开-环结构。因此，PA糖链不能作为α1，6-FT的底物糖链。因此，尝试了用于检测α1，6-FT活性的多种受体糖链和方法。
反应产物在材料和方法第18.3节中所描述的条件下进行了HPLC分析。未反应的底物在约9.5分钟洗脱(在图5的上部)，而一种α1，6-岩藻糖化的糖链标准品在约15分钟洗脱(图5的底部)。mRNA的表达在RNA水平分析时观察到的BY2-FT2、3、4和6的研究如下。根据材料和方法第14或18.1节制备了一种酶的粗提液。这种酶的粗提液与α1，6-FT活性检测试剂盒进行反应。反应液进行HPLC分析。结果在洗脱至约15分钟时，BY2-FT 3、4和6的酶粗提液的反应液显示一个峰组合(在图6的中和下部，以及图7的上部)。这个洗脱时间与α1，6-岩藻糖化糖链标准品的洗脱时间一致。
进一步，对含培养的烟草细胞的植物中存在的α1，3-岩藻糖基转移酶(α1，3-FT)，Studacher等人(GlycoconjJ 1995十二月；12(6)：780-6 Staudacher E，Dalik T，Wawra P，Altmann F，Marz L；Glycoconj J 1998一月；15(1)：89-91 Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)已报道，从Mung绿豆中所获得的α1，3-FT绝对需要如Mn2+和Zn2+这样的二价阳离子，并且在没有这样的阳离子时无活性。在该实施例中，在α1，6-FT活性检测试剂盒和α1，3-FT酶粗提液中没有添加二价阳离子。有鉴于此，建议在HPLC分析中洗脱至15分钟时所发现的峰不是α1，3-岩藻糖化糖链。事实上，野生型BY2样品HPLC图中，在洗脱15分钟的位置，未发现对应的洗脱峰(图7下部)。
(α1，6-岩藻糖基转移酶特异活性的检测)
检测了从BY2-FT3、4和6中所获得的蛋白粗提液的α1，6-岩藻糖基转移酶的特异活性。这种特异活性是根掘以下的材料和方法中第18.4节所描述的HPLC层析谱评价的。结果，未转化的BY2菌株(图1中用WT指示)的特异活性低于检测极限，而BY2-FT6株显示6.03U/mg蛋白质的最高特异活性(表1)，其中1U是指每分钟转化1pmol底物所需的酶量。
表1
BY2-FT的酶粗提物中α1，6-FT的特异活性
  克隆号   特异活性(U/mg蛋白质)
  BY2-FT3BY2-FT4BY2-FT6WT   2.572.536.03＜0.03
1U：1pmol/min
(实施例2：α1，6-FT对培养的烟草细胞中糖蛋白的影响)
BY2-FT细胞中导入的α1，6-FT对糖蛋白的影响是采用豌豆凝集素(PSA)进行研究的，豌豆凝集素的天冬酰胺连接型糖链的还原末端存在的N-乙酰氨基葡糖残基以α1，6方式与一个岩藻糖残基紧密连接。首先，根据材料与方法第14节所描述的方法，从BY2-FT细胞中制备蛋白粗提物，粗提蛋白的大约浓度是通过测量A280吸光度值得到的(材料与方法第15节)。根据以下材料与方法第16和17节，对蛋白粗提物进行SDS-PAGE。然后，进行凝集素染色。
图18中的结果显示：转化细胞中的糖蛋白糖链在约23KDa处有对应的染色，通过与未转化的BY2菌株比较，表明与凝集素有反应(图8右边用WT所指示的泳道)。该结果提示在BY2-FT2、3和4细胞的糖蛋白中，存在一个α1，6-岩藻糖残基。未转化的BY2(WT)细胞有轻微的染色。考虑原因是PSA与所存在的植物复合型糖链上的其它岩藻糖残基有亲和力(包括α1，3-岩藻糖残基)。应该注意，图8中用A所指的泳道是电泳的胶使用甲状球蛋白作阳性对照作印迹所获得的，显示与凝集素的反应是阳性的。
(实施例3：转化的培养烟草细胞所产生的糖蛋白的分析)
选择了3株具有最高生长率的BY2-FT菌株。分析了具有导入的α1，6-FT基因的转化细胞所产生的糖蛋白的糖链结构。
1.由菌株BY2-FT3生产的糖蛋白的制备
将BY2-FT3(培养的烟草细胞)的培养细胞(湿重约3kg)用一个玻璃匀浆器进行研磨，从而获得细胞的裂解物。这些细胞裂解物在4℃、12000rpm离心20分钟，从而得到含糖蛋白的的上清液。上清液用去离子水进行透析(1.5×104倍稀释)，然后冷冻干燥，从而获得干粉标本。
2.N-连接糖链的制备
然后，将这些干粉标本在100℃肼解10小时，从而从糖蛋白中切掉糖链。在肼解产物中加入过量的丙酮，再于4℃、8000rpm离心20分钟以沉淀糖链。在得到的沉淀中加入饱和的碳酸钠溶液和N-乙酸酐以使糖链乙酰化。然后，将得到的反应产物用Dowex 50×2(MuromachiKagaku Kogyo)进行脱盐。进一步，将得到的溶液应用到0.1N氨水平衡过的TSK gel YOYO PERAL HW-40(TOSOH)凝胶过滤柱(2.5×30cm)，以使N-连接的糖链复性。
3.吡啶基氨基(PA)糖链的制备
复性后的N-连接糖链用2氨基吡啶转换为PA糖链。PA糖链通过用0.1N氨水平衡过的TSK凝胶YOY0 PERAL HW-40(TOSOH)凝胶过滤柱(2.5×30cm)进行纯化。
4.用HPLC对PA糖链进行分级和分析
PA糖链的结构用反相(RP)HPLC和体积分级(SF)HPLC进行分析，用外源性糖蛋白酶消化进行双向糖链描图，并进行MALDI-TOF MS分析。
HPLC分析采用的是装有日立公司FL检测器L-7480的日立HPLC系统，其中荧光的密度是在310纳米的激发波长和380纳米的荧光波长检测的。RP-HPLC分析采用的是Cosmosil5C18-P柱(6×250mm；Nacalai Tesque)，PA糖链的洗脱是通过以1.2ml/min的流速，在40分钟内将0.02％ TFA水溶液中乙腈的浓度从0％增加到6％。SF-HPLC分析是采用Asahipak NH2P-50柱(4.6×250mm；Showa Denko)，PA糖链的洗脱是通过以0.7ml/min的流速，在25分钟内将去离子水-乙腈混合液中乙腈的浓度从26％增加到50％。
PA糖链的结构是用双向糖链描图评价的，其中洗脱时间是用反相(RP)HPLC和体积分级(SF)HPLC进行比较的。
5.用外源性糖蛋白酶消化分析PA糖链
利用N-乙酰氨基葡糖酶(肺炎双球菌；Roche)进行酶消化的研究如下：每种PA糖链在含3mU N-乙酰氨基葡糖酶的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.45)中于37℃反应2天。α-L-岩藻糖酶的酶反应是在含10mMα-L-岩藻糖酶的0.1M醋酸盐缓冲液(pH5.45)中于37℃反应2天。每种酶的消化反应是通过100℃煮沸3分钟来终止，然后在12000rpm离心5分钟。上清进行HPLC分析。糖链标本的洗脱时间与已知糖链的洗脱时间进行比较。
6.MALDI-TOF MS分析
MALDI-TOF MS分析是采用PerSeptive生物系统Voyager DE RP工作平台进行的。
7.由菌株BY2-FT3获得的PA糖链的结构
从约3公斤BY2-FT3所制备的PA糖链用RP-HPLC和SF-HPLC进行纯化。特别的，由RP-HPLC所得到的成分(1至10)(见图11A所示的层析谱)进行复性，再进行SF-HPLC。由SF-HPLC所得到的1-9的峰再进一步进行SF-HPLC分析，共得到55个峰(部分数据表示于图11B)。其中的部分峰含有多个PA糖链。在这种情况时，这些峰再做一次SF-HPLC，从而可完全纯化糖链。
对应于55个峰的组分中，组分4D-V、5A-III、5C-III、5D-II、6B、6F-I和7E可由岩藻糖苷酶切割，分解的产物在完整产物之前用RP-HPLC进行洗脱(未显示数据)。这种情况提示这些糖链包含α1，6-岩藻糖(Glycoconj J 1998一月；15(1)：89-91用于检测Fuc与天冬酰胺连接的GlcNAc岩藻糖基转移酶的HPLC方法。Roitinger A，Leiter H，Staudacher E，Altmann F)。
每个糖链的结构用双向糖链描图法分析，外源性糖蛋白酶消化，或MALDI-TOF MS分析。结果，糖链结构表示于图12至14。
组分4D-V、5C-III和5D-II的PA糖链有与M3FFX(1413.33)基本相同的m/z(1413.59)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与M3FX匹配，而且也有与M3FFX(1267.19)基本相同的m/z(1267.36)。
组分6B和5A-III的PA糖链有与M2FFX(1251.19)基本相同的m/z(1251.57)(图14)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链有与M2FX(1105.05)基本相同的m/z(1105.79)。
组分6F-I的PA糖链有与Gn1M3FFX(1616.52)基本相同的m/z(1616.14)(图14)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与Gn1M3FX匹配，而且也有与Gn1M3FX(1470.38)基本相同的m/z(1470.35)。
组分7E的PA糖链有与M5F(1459.36)基本相同的m/z(1459.33)(图14)。用岩藻糖苷酶处理的PA糖链在双向糖链描图与M5A匹配，而且也有与M5A(1313.22)基本相同的m/z(1313.43)。
组分5C II 3II和5D I 2II的PA糖链与M5A在双向糖链描图匹配，与M5A(1313.22)有基本相同的m/z(1313.14)。
组分4F的PA糖链与M6B在双向糖链描图匹配，与M6B(1475.36)有基本相同的m/z(1475.82)。
组分3B的PA糖链与M7B在双向糖链描图匹配，与M7B(1637.50)有基本相同的m/z(1638.35)。
组分2C的PA糖链与M7A在双向糖链描图匹配，与M7A(1637.50)有基本相同的m/z(1638.33)。
组分2D中1E峰的PA糖链与M8A在双向糖链描图匹配，与M8A(1475.36)有基本相同的m/z(1800.44)。
进一步，组分1AIII和2A中的PA糖链与M3FX在双向糖链描图匹配，组分5CIII的PA糖链与M3X在双向糖链描图匹配。当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分7C中PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAc1。片段与M3X在双向描图匹配，与GnM3X(1324.24)有基本相同的m/z(1324.83)。因此，组分7C的PA糖链被认为是Gn1M3X(见图13中每种糖链的结构)。
当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分5C II 2和5D I 1中的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAc1。每个片段与M3X在双向糖链描图匹配，与GnM3X(1324.24)有相同的m/z(1324.61)。因此，组分5C II 2和5D I 1的PA糖链被认为是Gn1M3X。这些PA糖链的洗脱位置与RP-HPLC分析中组分7C的PA糖链不同。因此，认为这些PA糖链是结构变异体。
当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分4E I中的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAc1。片段与M3FX在双向糖链描图匹配，与GnM3FX(1470.38)有相同的m/z(1471.21)。因此，组分4E I的PA糖链被认为是Gn1M3FX。
当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分2B II的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于一个GlcNAc1。片段与M3FX在双向描图中匹配，其m/z为1471.29，与GnM3FX(1470.38)基本相同。因此，组分2B II的PA糖链被认为是Gn1M3FX。这个PA糖链的洗脱位置与RP-HPLC分析中组分4E I的PA糖链不同。因此，认为组分2BII的PA糖链是结构变异体。
组分3A的PA糖链有与Gn2M3FX(1673.57)基本相同的m/z(11674.56)。当用N-乙酰氨基葡糖苷酶切割组分3A中的PA糖链时，在SF-HPLC分析中，片段的洗脱位置移动的数量对应于GlcNAc1的2倍数量。片段与M3FX在双向糖链描图匹配，因此，组分3A的PA糖链被认为是Gn2M3FX。
对于数据，如m/z数值和双向糖链描图结果，其它糖链与任何N-连接糖链不匹配。可以判断其它糖链并不是N-连接糖链。
如上所述分析的结果，N-连接糖链的比例以百分比表示。高甘露糖型糖链占10.8％，复合型糖链占28.1％，α1，6-岩藻糖连接糖链占61.1％。α1，6-岩藻糖连接于由α1，6-岩藻糖苷酶基因转化的BY2-FT3中61.1％的糖链。
如上所述，α1，6-岩藻糖连接于由α1，6-岩藻糖苷酶基因转化的BY2-FT3中61.1％的糖链。然而，α1，3-岩藻糖或β1，2-木糖也连接于α1，6-岩藻糖连接糖链。有报道指出，α1，3-岩藻糖或β1，2-木糖有可能对动物具有抗原性。为使这种糖链的结构不可能对动物造成抗原性，有必要灭活α1，3-岩藻糖基转移酶或β1，2-木糖转移酶。这是通过筛选或生产一种植物宿主的变种来实现的，其中不含α1，3-岩藻糖基转移酶活性或β1，2-木糖转移酶活性，或通过一种酶基因来抑制基因的表达。
抑制基因表达是通过反义技术实现的(Wenderoth I，von SchaewnA“植物N-乙酰氨基葡糖转移酶I的分离和鉴定”，“拟南芥cgl突变体和反义植物中的功能分析”Plant Physiol 2000七月；(3)：1097-1108)，利用嵌合DNA-RNA寡糖产生一种位点特异性突变(Beetham PR，Kipp PB，Sawycky XI，Arntzen CJ，May GD“一种用于功能性植物基因组的工具：嵌合DNA-RNA寡核苷酸在体内导致基因特异性突变”，Proc Natl Acad Sci USA 1999七月；96(15)：8774-8778)，用一种植物病毒实现基因沉默(Covey SN，Al-Kaff NS.“植物DNA病毒与基因沉默”Plant Mol Biol 2000六月；43(2-3)：307-322)。这些技术在本行业中已知。
(实施例4：从转化的烟草细胞再生而产生植物以及由该植物所产生的糖蛋白的分析)
1.灭菌的烟草植物的产生
将1粒烟草种子(Nicotiana tabacum SR1(从日本烟草公司的烟草叶实验室所获得，700 Higashihara，Toyoda-cho，Iwata-gun，Shizuoka))放入1.5ml微量离心管中，在管中加入70％乙醇。将离心管摇动3分钟以对种子进行灭菌，然后，弃乙醇溶液。用1ml灭菌水洗种子。接着在试管中加入1ml安替佛民(antiformin)溶液(市售次氯酸盐溶液的10倍稀释液)，放置15分钟，并间隔摇晃。然后，去掉安替佛民溶液，并用灭菌水将种子洗3遍。
另一方面，在一个培养皿中将奥古佩宁(由Meiji Seika Kaisha公司生产)稀释至终浓度为160mg/l。将1张灭菌滤纸浸入到培养皿中，烟草种子在滤纸上发芽。将发芽的种子转移至MS培养基，并在一个明亮的环境中培养。将长成的烟草SR1株植物在芽的顶端4厘米处用刀切，切下来的植物种植于新的MS培养基中生根，并进一步培养于明亮的环境中。
2.烟草植物的转化
根据An等人描述的方法(An，G，Ebert PR，Mitra A and Ha SB(1988)Binary vectors.In Plant Molecular Biology Manual A3，1-19，Academic Dordrecht)转化烟草植物。
简言之，从罐中的植物上切掉一片无菌的烟草叶，叶子在一个培养皿中切成1cm×1cm2(叶片)。将叶片移到另一个灭菌的培养皿中。将已在2×YT培养基中于28℃培养了2天的5ml土壤杆菌培养液(含pGPTV-HPT-FT的土壤杆菌EHA101)加入培养皿中并充分混匀，然后静置3分钟。将叶片取出，并用一个KIM毛巾吸去粘着的多余菌液。接着，将叶片放于MS-NB培养液中(4.0g Murashige-Skoog植物盐混合物，30g蔗糖，10ml 5％ MES-KOH(Ph 5.7)，3g结冷胶，0.1mg NAA，1.0mg BAP，10mg盐酸硫胺，1mg烟酸，1mg盐酸吡哆辛(pyridoxin)/ml水)，并在明亮处于25℃培养。
2天后，将叶片转移到一个装有灭菌水的50ml圆锥管中，通过充分振荡清洗。在用KIM毛巾将叶片上的水擦干后，将叶片放入灭菌过的培养液中，于25℃培养一周。然后，将叶片移入含潮霉素B(终浓度20mg/L)和羧苄青霉素(终浓度250mg/L)的MS-NB培养液中(芽形成培养液)。长大的胼胝以无菌方式移入含芽形成培养液的玻璃罐中。1个月以后，将植物上含新生蒂的芽和叶子切下，以无菌方式植入含潮霉素B(终浓度20mg/L)和羧苄青霉素(终浓度250mg/L)的MS-NB培养液中(根形成培养液)(注意该培养液与上述的除BAP和NAA之外的基础培养基MS-NB一样)，在明亮处于25℃培养直到芽长成根。将罐中长大的植物移入盘中继续生长，这样就得到了含FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的转化植物。
3.从烟草植物中制备染色体DNA
将分别从转化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3中得到的约100g植物标本冻于液氮中。将这些冻存的标本研磨碎之后，用微型Daeasy植物试剂盒(QIAGEN)按照其中的操作说明制备染色体DNA。
然后，按照与实施例1中描述的从BY2-FG细胞中扩增基因组DNA相似的条件，对每种染色体DNA进行PCR。实验证实α1，6-FT基因已掺入到转化植物的染色体中。采用的引物是，CaMV引物(5’-CGTCTTCAAAGCAAGTGGAT)和FT-Sal(5’-GGATATGTGGGGTACTTGAC).
类似实施例1，所得到的PCR产物进行电泳。结果显示于图14中。如图14所示，FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3在1700bp附近有扩增带，被认为是α1，6-FT基因区域的扩增片段。另一方面，当以野生型SR1为模板制备基因组DNA时，在1700bp附近没有发现扩增带。因此，在转化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3的染色体中掺入了α1，6-FT基因。
4.α1，6-FT转化植物所产生的糖蛋白的分析：植物凝集素染色
与实施例2相似，α1，6-FT-介导的转化体所产生的糖蛋白用豌豆凝集素(PSA)进行分析，PSA与天冬酰胺连接型糖链的还原末端存在的N-乙酰氨基葡糖残基以α1，6方式与一个岩藻糖残基紧密连接(Yamamoto K，Tsuji T，Osawa T，(1982)Carbohydrate Res，110，283-289，Debray  H，Montreuil J，(1989)Carbohydrate Res，185，15-26)。
结果示于图15中。如图15所示，转化植物FT(1)、FT(2)、FT1、FT2和FT3有染色，提示与SR1植物比较，凝集素与糖蛋白的糖链有反应。因此，转化植物的糖蛋白中存在α1，6-岩藻糖残基。
应当指出的是，尽管SR1植物的凝集素反应水平微弱，但在培养的用α1，6-FT基因转化的烟草细胞中也观察到了这种反应，阳性克隆用凝集素进行了筛选。认为可能的原因是PSA凝集素与其它岩藻糖残基，包括植物混合型糖链中存在的α1，3-岩藻糖残基。
以下将对在上述实施例中所采用的材料与方法进行简要描述。
材料与方法
1.植物，菌株，质粒
(1.1植物)
作为植物转化体，使用了一种烟草BY2培养细胞(烟草属烟草L.cv.亮黄2)。
(1.2菌株)
所使用的植物列于表2中。
表2菌株
  菌株   基因型和特性
  大肠杆菌
  JM109   RecA1，endA1，gryA96，thi，hsdR17，supE44，relA1，Δ(lac proAB)/F[traD36，proAB+，laclq，lacZΔM15]
  DH5α   SupE44，ΔlacU169(Φ80lacZΔM15)，hsdR17，recAl，endA1，gyrA96，thi-1，relA1
  土壤杆菌农杆根瘤菌
  EHA101   卡那霉素抗性携带反向作用毒力功能，是促进双载体T-DHA区向植物转移所必需的
  LBA4404   利福平抗性，链霉素抗性
(1.3质粒)所用的质粒示于表3中
表3质粒
  基因型和特性
  PUC19   Ampr，lacZ
  PBI221   AmprCaMV 35S启动子，GUS基因，以及克隆至PUC19的胭脂碱合成酶终止子
  PGPTV-HPT   Kmτ.HmΓ
  PGPTV-DHFR   Kmr，甲氨喋呤Γ
  PGPTV-BAR   Kmr，双丙胺磷r
2.培养基
(2.1培养细菌的培养基)
2×YT培养基：使用的是细菌-胰蛋白胨16g/l，酵母提取物10g/l，氯化钠5g/l。对于平皿培养基，加入12g/l纯化的琼脂粉。选择性地加入氨苄青霉素(Meiji Seika Kaisha，Ltd)，卡那霉素(Meiji SeikaKaisha，Ltd)，潮霉素(Wako Chemicals)，氯霉素(Wako Chemicals)，利福平(Wako Chemicals)，链霉素(Wako Chemicals)，使终浓度分别为50mg/l，50mg/l，20mg/l，25mg/l，50mg/l，和20mg/l。
(2.2培养烟草细胞的培养基)
表4
加强的LS培养基(mg/l，)
NH4NO3            1650         CaCl2.2H2O      440
KNO3              1900         MgSO4.7H2O      370
KH2PO4            370          Na2.DETA        37.3
H3BO4             6.2          FeSO4.7H2O      27.8
MnSO4.4H2O        22.3         氢氯硫胺        10
ZnSO4.7H2O        8.6          烟酸            1
KI                0.83         氢氯吡哆辛      1
Na2MoO4.2H2O      0.25         内消旋肌醇      100
CuSO4.5H2O        0.025        蔗糖            30000
CoCl2.2H2O        0.025
用氢氧化钾调pH至5.8
进一步，用Murashige-Skoog培养基中的混合盐制备以上的组合物。
加强型LS琼脂培养基：
加强型LS琼脂培养基中KH2PO4的含量为170mg/l，pH用KOH调为5.8，再在培养基中加入3g/l  结冷胶(Wako Chemicals)。选择性地加入卡那霉素、羧苄青霉素(Wako Chemicals)、潮霉素、氨甲蝶呤(Wako Chemicals)，和双丙胺磷(Meiji Seika Kaisha公司)，使终浓度分别为150mg/l，250mg/l，20mg/l，0.1mg/l，和10mg/l。
3.试剂和酶
除非特别指出，所使用的试剂是从Wako Chemicals和NacaliTesque得到的。限制酶和修饰酶是从Toyobo有限公司、Takara Shuzo有限公司、Nippon Gene，Sigma和NEB公司购得的，使用方法按照其中的说明。
4.大肠杆菌的转化
(4.1感受态细胞的制备)
宿主大肠杆菌接种到2ml 2×YT培养基中，并过夜培养。将培养基接种到含200ml 2×YT培养基的sakaguchi烧瓶中。烧瓶在37℃振荡直到浊度在600nm是0.6，然后进行离心(5000rpm，10分钟，0℃)。去掉上清，用5ml 50mM的CaCl2和15％的甘油悬浮细菌。然后，将悬浮液分装于Eppendorf管中，在-80℃保存作为感受态细胞。
(4.2大肠杆菌的转化)
将感受态细胞在冰上融化，然后，将1-15微升DNA溶液加入到感受态细胞中，并在冰上放置30分钟。接着，将溶液在42℃放90秒，然后放于冰上。将1ml 2×YT培养基加入到溶液中，将感受态细胞在37℃培养1小时，加入到含适量抗生素的琼脂培养基上，于37℃过夜培养。
5.土壤杆菌的转化
土壤杆菌的转化采用Bevan等人的三亲体杂交方法。简言之，将含PGPTV型质粒的大肠杆菌和含辅助质粒PRK2013的大肠杆菌于37℃在含抗生素的培养基中分别过夜培养。将土壤杆菌EHA101或LBA4044于28℃在含抗生素的培养基中培养两夜。
将每种培养液1.5ml倒入到Eppendorf管中，然后离心收集细菌。收集的细菌用2×YT培养基洗两次，然后再悬于1ml 2×YT培养基中。将三种菌株混合并加入到2×YT培养基中，培养于28℃，以使质粒从大肠杆菌中通过结合转化到土壤杆菌中。两天后，将2×YT培养基上出现的部分菌落用白金环转移到含抗生素的2×YT琼脂培养基上。在28℃培养两天后，挑选一个单菌落。
6.培养的烟草细胞的转化
(6.1培养的烟草细胞的传代)
将95ml加强型LS培养基倒入一个300ml Mayer烧瓶中，在暗处于25℃-27℃、120rpm进行振荡培养。将2ml到达静止期的培养细胞每7天进行传代。当第7天没有得到足够量的细胞时，将加倍(4ml)的细胞进行传代培养。
(6.2培养的烟草细胞的转化)
将100微升在含抗生素的2×YT培养基中于28℃培养了两天的土壤杆菌培养液(含pGPTV型质粒的土壤杆菌EHA101和LBA4044)，在一个培养皿中与4ml培养到第四天的培养烟草细胞悬液混匀，然后将混合液在25℃于暗处静置。两天后，将培养皿中的悬液移到一个离心管中，离心(1000rpm，5分钟)去除上清。在得到的沉淀中加入含250mg/l羧苄青霉素的新培养基，再离心以清洗细胞，这种清洗共重复三次以去除土壤杆菌。将不含土壤杆菌的培养烟草细胞加入到含20mg/l潮霉素和250mg/l羧苄青霉素的潮霉素和250mg/l羧苄青霉素潮霉素和250mg/l羧苄青霉素琼脂培养基上，在暗处于25℃进行培养。两至三周后，将长到胼胝阶段的细胞转移到新的加强型LS琼脂培养基上以筛选生长的菌落。再过两到三周后，将长到直径为1厘米的菌落转移到30ml含潮霉素和羧苄青霉素的加强型LS液体培养基中，并进行传代培养。
7.小量质粒DNA的制备
小量质粒是以Birnboin和Doly’s碱性提取方法从大肠杆菌和土壤杆菌中得到的。将细菌在含抗生素的2×YT培养基中过夜培养(土壤杆菌培养两夜)。将培养基转移到一个Eppendorf管进行离心(12000rpm，5分钟，室温)收集细菌。所获得的细菌用100微升溶液I悬浮(对土壤杆菌，含5mg/ml的溶菌酶(Sigma))，并在室温静置5分钟。然后，在悬液中加入200微升溶液II并进行充分振荡。所得到的混合物在冰上放置5分钟，接着，在混合物中加入150微升溶液III并进行充分振荡，所得到的混合物在冰上放置5分钟。离心后(12000rpm，5分钟，室温)，将上清转移到另一个管中。上清用RNA酶处理(37℃，5分钟)，经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀后，将获得的沉淀物用适量的TE缓冲液溶解。
[表5]
TBE缓冲液：12.1g/l Tris
           6.18g/l硼酸盐
           0.7g/l EDTA
凝胶-上样缓冲液：0.25％溴酚兰
                 0.25％二甲苯腈蓝
                 40％(w/v)蔗糖
8.DNA电泳
用TBE缓冲液配制1.0-1.5％(w/v)的琼脂糖。在5份样品中加入1份凝胶上样缓冲液，将样品加入到凝胶的槽中。所使用的电泳仪是Mupid-2(Cosmobio)。电泳是在1×TBE中用100伏的常压下进行的。电泳完后，将凝胶在0.5μg/ml溴化乙锭水溶液中浸泡20分钟。将染色后的凝胶置于穿透性照明灯下观察。
9.电泳凝胶中DNA片段的复原
DNA片段从琼脂糖凝胶中的复原使用的是一种基因清除II试剂盒(Funakoshi)。将含有目的片段的凝胶移到一个Eppendorf管中。在1份琼脂糖凝胶中加入1/2份的TBE加强液和4.5份的NaI，将混合物在55℃孵育以使凝胶完全溶解。将5μl基质加入到混合物中并完全混匀，然后，将混合物在冰上放置10分钟。短促离心后弃上清，用200μl的清洗缓冲液将沉淀物洗三次，再将溶液于55℃洗脱5-10分钟，进行离心，可获得含有DNA的上清液。
10.从烟草中制备染色体DNA
(10.1从培养的烟草细胞中制备染色体DNA)
从培养的烟草细胞中制备染色体DNA使用的是ISOPLANT(NipponGene)。将300μl溶液I加入到大约0.1g培养的烟草细胞中，并完全搅拌。再加入150μl溶液II并用振荡器完全搅拌。将细胞于50℃孵育15分钟。再在细胞中加入150μl溶液III，振荡，并放置15分钟。离心后(12000rpm，15分钟，4℃)，将上清用乙醇沉淀两次，将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，并用1μl RNA酶A处理30分钟。
(10.2从烟草胼胝中制备染色体DNA)
用DNeasy Plant Mini Prep Kit(QIAGEN)从胼胝中制备染色体DNA。当胼胝长到直径大约为1厘米后，将其于液氮中冷冻，用研磨器将胼胝研磨成粉，用这种粉(100mg)作标本按照试剂盒的说明制备DNA。
11.从烟草培养的细胞胼胝中制备总RNA
胼胝的总RNA的制备采用RNeasy Mini Prep Kit(QIAGEN)。在这种情况下，用0.05％二甲基焦碳酸盐处理研磨器、乳钵和灭菌水，然后高压消毒(120℃，30分钟)。当胼胝长到直径大约为1厘米后，将其于液氮中冷冻，用研磨器和乳钵将胼胝研磨成粉，用这种粉(100mg)作标本按照试剂盒的说明制备RNA。
12.PCR
(12.1反应体系)
将1μl染色体DNA、5μl 10×PCR缓冲液(由Takara Shuzo有限公司生产的Takara Ex Taq所附带)，4μl dNTP(由Takara Shuzo有限公司生产的Takara Ex Taq所附带2.5mM)，引物(每种20pmol)，0.5μl Takara Ex Taq(5U/μl，Takara Shuzo有限公司)，以及灭菌水混合并使总体积至50μl.
(12.2反应条件)
反应以以下的条件进行。所使用的热循环仪是PCR系统9700(PEBiosystems)。
[表6]
第一阶段：1个循环  变性(94℃)5分钟
                   退火(60℃ 2分钟)
                   延伸(72℃ 3分钟)
第二阶段：30个循环 变性(94℃)1分钟
                   退火(60℃ 2分钟)
                   延伸(72℃ 3分钟)
第三阶段：1个循环  变性(94℃)1分钟
                   退火(60℃ 2分钟)
                   延伸(72℃ 3分钟)
退火温度根据引物的Tm值而改变。
13.RT-PCR    
(13.1反转录反应)
反转录反应采用的是RNA PCR试剂盒2.1(Takara Shuzo有限公司)。将5μl MgCl2(5mM)，2μl 10×RNA PCR缓冲液，8.5μl无RNA酶的水，2μl dNTP(1mM)，0.5μl RNA酶抑制剂(1U/μl)，1μl反转录酶(0.25U/μl)以及1μl试剂盒中所附的连接Oligo dT的引物(0.125μM)，1μl按上述第11节中所制备的RNA样本混合，按以下所述的程序进行反应。所采用的热循环仪是PCR系统9700(PEBiosystems)，循环数是1，1个循环包括50℃ 30分钟，99℃ 5分钟，以及5℃ 5分钟。
(13.2反转录反应后的PCR)
将6μl MgCl2(2.5mM)，8μl 10×RNA PCR缓冲液，63.5μl灭菌的蒸馏水，0.5μl TaKaRa Taq酶(2.5U/100μl)，以及引物混匀并加入到上述第13.1节已制备的反转录反应物中。用一个小离心机离心10秒后，将管子按以下条件进行反应，第1阶段：1个循环；94℃2分钟；第2阶段：45个循环；94℃ 30秒，60℃ 30秒，以及72℃ 1.5分钟。
14.从培养的烟草细胞中制备蛋白质粗提溶液
通过离心收集传代后第7天的烟草细胞(3000rpm，15分钟，4℃)，然后，通过轻轻地将管子上下颠倒，将所得到的细胞用等量的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行清洗，将这一过程重复三次，然后离心(3000rpm，15分钟，4℃)。将所收集的细胞转到一个手持匀桨器中(20ml IKEMOTO)进行研磨。接着将细胞研磨液转移到一个50ml的离心管中并离心(12000rpm，20分钟，4℃)，所获得的上清即蛋白质粗提液。在每50ml提取液中选择性地加入一颗蛋白酶抑制剂药片(BOEHRINGERMANNHEIM)。进一步，如果需要粗蛋白的浓缩液，在粗蛋白中选择性加入硫酸铵(Wako Chemicals)到70％的饱和度，在冰上放置4-5小时，然后离心(12000rpm，20分钟，4℃)。将所得到的蛋白质悬浮于500μl灭菌水中，用于以下的分析。
15.蛋白质定量
用DC蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad)进行蛋白质定量。该试剂盒基于Lowly-Folin方法，根据其中的说明，将反应液混匀并于室温放置15分钟。然后，测量750nm的吸光度。用小牛白蛋白作标准在0.05-0.4mg/ml的范围内作标准曲线。以标准曲线作参考，测定蛋白质的量。
16.蛋白质电泳
(16.1 Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是根据Laemmli方法进行的。用于电泳的凝胶，分离胶用的是12.5％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶用的是2.5％的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺＝30∶0.8)，电泳缓冲液采用的是Tris-甘氨酸缓冲液。将12μl样品在加样缓冲液中于100℃变性3分钟，电泳中使用的电压是100伏恒压。
(16.2分子量标记)
[表7]
分子量标记品用的是蛋白质分子量标记品“第一”(DaiichiKagaku Yakuhin)
磷酸化酶                        97400
小牛白蛋白                      66270
醛缩酶                      42200
碳酸酐酶                    30000
大豆蛋白酶抑制剂            20100
溶菌酶                      14000
或者，预先染色的SDS-PAGE标准(Bio-Rad)
磷酸化酶B                   106000
小牛白蛋白                  80000
卵白蛋白                    49500
碳酸酐酶                    32500
大豆蛋白酶抑制剂            27500
溶菌酶                      18500
(16.3蛋白质染色)
进行了考马斯兰染色和银染。对考马斯兰染色，将凝胶浸入到染色液中30分钟(0.1％考马斯亮兰R-250，甲醇∶乙酸盐∶水＝5∶5∶2(v/v)混合物)，然后浸于脱色液(甲醇∶乙酸盐∶水＝2∶1∶7(v/v)混合物)并振荡过夜。银染是用银染试剂盒(Wako chemicals)，根据其中所描述的说明进行的。
17.凝集素染色
SDS-PAGE电泳后，将凝胶在印迹缓冲液中平衡15分钟，然后将凝胶中的蛋白质转印到PVDF膜(Bio-Rad，用于蛋白质印迹的免疫印迹PVDF膜，0.2mm)，使用的是半干式转印仪(半干式转移仪BE-310Biocraft)于1mA/cm2的恒流进行60-70分钟。转印后，将PVDF膜浸于0.6％ H2O2/甲醇(V/v)溶液，以阻断培养烟草细胞中的内源性过氧化物酶。阻断后，用冲洗缓冲液(10分钟，三次)洗PVDF膜，然后将膜浸于含5％脱脂奶的洗液中，在室温温和反应两小时。同样，将PVDF膜用洗液进行清洗。然后，将PVDF膜浸于用冲洗缓冲液1000倍稀释的氧化物酶标记的PSA凝集素(1mg/ml，EY LABORATORIES，INC)中，于室温反应90分钟。反应后，用上述类似的方法冲洗膜。然后用POD免疫染色盒进行染色(Wako chemicals)。上述冲洗缓冲液的配方是10Mm Tris-HCl(pH 7.4)，0.15M NaCl，0.05％吐温20。
18.α1，6-岩藻糖基转移酶活性的测定
(18.1粗酶液的制备)
通过离心(3000rpm，20分钟，4℃)收集培养至第7天的转化培养烟草细胞，然后用类似于上面第14节中的抽提缓冲液冲洗并收集细胞。接着用一个手持式匀浆器研磨细胞，并离心(12000rpm，20分钟，4℃)。上清被用作粗酶溶液。以上抽提缓冲液的配方是：20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.175％ CHAPS。
(18.2α1，6-岩藻糖基转移酶的酶反应)
α1，6的活性总是在暗处测定的。使用了一种由Toyobo有限公司提供的底物溶液(15μl)来测量α1，6-岩藻糖基转移酶的活性。将以上第19.1节中制备的粗酶溶液5μl加入到一个含底物溶液的管子中，于37℃反应三小时，通过煮沸1分钟来终止酶反应，然后立即将管子移到冰上放置1分钟，再将管上的冰水去掉。在管中加入80μl去离子水并离心(12000rpm，20分钟，4℃)。将30μl获得的上清液进行HPLC分析。每15μl测量α1，6-岩藻糖基转移酶活性的底物溶液包括：8μl 0.5M MES/NaOH缓冲液(pH7.5)，1nmole/μl Gn，1μl Gn-bi-Asn-NBD，2μl 5nmole/ml GDP-岩藻糖(Wako chemicals)，以4μl超纯水。使用的HPLC体系(HITACHI生产)包括接口(L-7000)，荧光检测仪(LsChrom L-7480)，泵(LaChrom L-7100)以及柱加热炉(LaChrom L-7300)。
(18.3酶活性的有或无)
酶活性的有或无是用HPLC分析测定的。柱子用的是反相Mightysil RP-18 GPl50-4.6(5μm)(Kanto Kagaku 4.6×150mm)。用于测量α1，6-FT活性的底物糖链进行了荧光标记以使底物糖链可以用荧光检测仪(Ex；470nm，Em；530nm)特异地进行检测。进一步，用以下方法制备了α1，6-岩藻糖链的标准品。将5μl α1，6-岩藻糖基转移酶(40mU/ml，Toyobo有限公司)加入到底物混合液中，以测量α1，6-岩藻糖基转移酶的活性，并按上面第1.18节中的方法与37℃反应15分钟。
(18.4活性的测定)
计算了按以下条件进行的HPLC分析中底物的峰面积与反应产物的峰面积的比值，活性的计算是按每分钟于每毫克粗酶溶液蛋白质中转化岩藻糖的量。粗酶溶液中总蛋白的量是以上述第15节中描述的方法定量的。
[表8]
缓冲液A：20mM  乙酸氨  pH4.0
缓冲液B：20mM  乙酸氨  pH4.0-80％乙腈
缓冲液比率：B＝5％
模式：恒溶剂
流速：1ml/分钟
柱温度：55℃
Ex：470mm
Em：530mm
工业实用性
本发明提供一种具动物型糖链加成功能的植物细胞，一种从植物细胞再生的植物，一种生产该植物细胞的方法，一种应用植物细胞生产动物型糖蛋白的方法。本发明中用植物细胞生产的糖蛋白具动物型糖链，以使糖蛋白对动物特别是人无抗原性。因此，本发明中的糖蛋白适应于给动物，包括人进行注射。
序列表
<110>藤山和仁
     关达治
<120>具有动物型糖链加成功能的植物细胞
<130>62734A(J1-00356138)
<140>PCT/JP02/02091
<141>2002-03-06
<150>JP 2001-062704
<151>2001-03-06
<160>5
<170>Microsoft Word 97 SR-2
<210>1
<211>1759
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>17..1744
<400>
aaaatctctc tagaaa atg cgg cca tgg act ggt tcc tgg cgt tgg att atg 52
                  Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met
                    1               5                  10
ctc att ctt ttt gcc tgg ggg acc ttg ctg ttt tat ata ggt ggt cac  100
Leu Ile Leu Phe Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His
         15                  20                  25
ttg gta cga gat aat gac cat cct gat cac tct agc cga gaa ctg tcc  148
Leu Val Arg Asp Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser
     30                  35                  40
aag att ctg gca aag ctt gaa cgc tta aaa cag cag aat gaa gac ttg  196
Lys Ile Leu Ala Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu
 45                  50                  55                  60
agg cga atg gcc gaa tct ctc cgg ata cca gaa ggc cct att gat cag  244
Arg Arg Met Ala Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln
                 65                  70                  75
ggg cca gct ata gga aga gta cgc gtt tta gaa gag cag ctt gtt aag  292
Gly Pro Ala Ile Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys
             80                  85                  90
gcc aaa gaa cag att gaa aat tac aag aaa cag acc aga aat ggt ctg  340
Ala Lys Glu Gln Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu
         95                 100                 105
ggg aag gat cat gaa ate ctg agg agg agg att gaa aat gga gct aaa  388
Gly Lys Asp His Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys
    110                 115                 120
gag ctc tgg ttt ttc cta cag agt gaa ttg aag aaa tta aag aac tta  436
Glu Leu Trp Phe Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu
125                 130                 135                 140
gaa gga aat gaa ctc caa aga cat gca gat gaa ttt ctt ttg gat tta  484
Glu Gly Asn Glu Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu
                145                 150                 155
gga cat cat gaa agg tct ata atg acg gat cta tac tac ctc agt cag  532
Gly His His Glu Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln
            160                 165                 170
aca gat gga gca ggt gat tgg cgg gaa aaa gag gcc aaa gat ctg aca  580
Thr Asp Gly Ala Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr
        175                 180                 185
gaa ctg gtt cag cgg aga ata aca tat ctt cag aat ccc aag gac tgc  628
Glu Leu Val Gln Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys
    190                 195                 200
agc aaa gcc aaa aag ctg gtg tgt aat atc aac aaa ggc tgt ggc tat    676
Ser Lys Ala Lys Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr
205                 210                 215                 220
ggc tgt cag ctc cat cat gtg gtc tac tgc ttc atg att gca tat ggc    724
Gly Cys Gln Leu His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly
                225                 230                 235
acc cag cga aca ctc atc ttg gaa tct cag aat tgg cgc tat gct act    772
Thr Gln Arg Thr Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr
            240                 245                 250
ggt gga tgg gag act gta ttt agg cct gta agt gag aca tgc aca gac    820
Gly Gly Trp Glu Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp
        255                 260                 265
aga tct ggc atc tcc act gga cac tgg tca ggt gaa gtg aag gac aaa    868
Arg Ser Gly Ile Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys
    270                 275                 280
aat gtt caa gtg gtc gag ctt ccc att gta gac agt ctt cat ccc cgt    916
Asn Val Gln Val Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg
285                 290                 295                 300
cct cca tat tta ccc ttg gct gta cca gaa gac ctc gca gat cga ctt    964
Pro Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu
                305                 310                 315
gta cga gtg cat ggt gac cct gca gtg tgg tgg gtg tct cag ttt gtc    1012
Val Arg Val His Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val
            320                 325                 330
aaa tac ttg atc cgc cca cag cct tgg cta gaa aaa gaa ata gaa gaa    1060
Lys Tyr Leu Ile Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu
        335                 340                 345
gcc acc aag aag ctt ggc ttc aaa cat cca gtt att gga gtc cat gtc    1108
Ala Thr Lys Lys Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val
    350                 355                 360
aga cgc aca gac aaa gtg gga aca gaa gct gcc ttc cat ccc att gaa    1156
Arg Arg Thr Asp Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu
365                 370                 375                 380
gag tac atg gtg cat gtt gaa gaa cat ttt cag ctt ctt gca cgc aga    1204
Glu Tyr Met Val His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg
                385                 390                 395
atg caa gtg gac aaa aaa aga gtg tat ttg gcc aca gat gac cct tct    1252
Met Gln Val Asp Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser
            400                 405                 410
tta tta aag gag gca aaa aca aag tac ccc aat tat gaa ttt att agt    1300
Leu Leu Lys Glu Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser
        415                 420                 425
gat aac tct att tcc tgg tca gct gga ctg cac aat cga tac aca gaa    1348
Asp Asn Ser Ile Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu
    430                 435                 440
aat tca ctt cgt gga gtg atc ctg gat ata cat ttt ctc tct cag gca    1396
Asn Ser Leu Arg Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala
445                 450                 455                 460
gac ttc cta gtg tgt act ttt tca tcc cag gtc tgt cga gtt gct tat    1444
Asp Phe Leu Val Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr
                465                 470                 475
gaa att atg caa aca cta cat cct gat gcc tct gca aac ttc cat tct    1492
Glu Ile Met Gln Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser
            480                 485                 490
tta gat gac atc tac tat ttt ggg ggc cag aat gcc cac aat caa att    1540
Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile
        495                 500                 505
gcc att tat gct cac caa ccc cga act gca gat gaa att ccc atg gaa    1588
Ala Ile Tyr Ala His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu
    510                 515                 520
cct gga gat atc att ggt gtg gct gga aat cat tgg gat ggc tat tct    1636
Pro Gly Asp Ile Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser
525                 530                 535                 540
aaa ggt gtc aac agg aaa ttg gga agg acg ggc cta tat ccc tcc tac    1684
Lys Gly Val Asn Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr
                545                 550                 555
aaa gtt cga gag aag ata gaa acg gtc aag tac ccc aca tat cct gag    1732
Lys Val Arg Glu Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu
            560                 565                 570
gct gag aaa taa agtcgactca gatgg                                   1759
Ala Glu Lys
        575
<210>2
<211>575
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Arg Pro Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe
  1               5                  10                  15
Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp
             20                  25                  30
Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala
         35                  40                  45
Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala
     50                  55                  60
Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Pro Ala Ile
 65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln
                 85                  90                  95
Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Thr Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His
            100                 105                 110
Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe
        115                 120                 125
Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Asn Leu Glu Gly Asn Glu
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Phe Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln
            180                 185                 190
Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Lys
        195                 200                 205
Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu
    210                 215                 220
His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr
225                 230                 235                 240
Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu
                245                 250                 255
Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Ash Val Gln Val
        275                 280                 285
Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Val Arg Val His
305                 310                 315                 320
Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile
                325                 330                 335
Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys
            340                 345                 350
Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp
        355                 360                 365
Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile 6lu Glu Tyr Met Val
    370                 375                 380
His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp
385                 390                 395                 400
Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu
                405                 410                 415
Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile
            420                 425                 430
Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg
        435                 440                 445
Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val
    450                 455                 460
Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln
465                 470                 475                 480
Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala ASh Phe His Ser Leu Asp Asp Ile
                485                 490                 495
Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Ile Tyr Ala
            500                 505                 510
His Gln Pro Arg Thr Ala Asp Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile
        515                 520                 525
Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn
    530                 535                 540
Arg Lys Leu Gly Arg Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu
545                 550                 555                 560
Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys
                565                 570                 575
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Claims (17)

1.一种具有动物型糖链加成功能的植物细胞，其中的植物细胞中导入了编码动物来源的酶的基因，这种酶可以将一种岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
2.根据权利要求1所述的植物细胞，其中来源于动物的酶是α1，6-岩藻糖基转移酶。
3.一种从根据权利要求1或2所述的植物细胞中再生的植物。
4.一种生产具有动物型糖链加成功能的植物细胞的方法，包括在植物细胞中导入编码动物来源酶的基因的步骤，其中的酶可以将一种岩藻糖残基转移到糖蛋白糖链还原末端的乙酰氨基葡糖残基上。
5.一种生产具有动物型糖链的糖蛋白的方法，包括以下步骤：
通过在植物细胞中导入一种编码动物来源的酶的基因和编码外源性糖蛋白的基因转化植物细胞，其中的酶可以将岩藻糖残基转移到糖蛋白的还原末端的乙酰氨基葡糖残基上，并且
培养所获得的转化的植物细胞。
6.一种生产具有动物型糖链的糖蛋白的方法，包括以下步骤：
通过在植物细胞中导入一种编码能将岩藻糖残基转移到还原末端的乙酰氨基葡糖残基上的酶的基因和编码外源性糖蛋白的酶的基因来转化植物细胞，并且
在细胞器中表达该酶。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述糖蛋白从植物中表达后被分离。
8.一种用权利要求6所述的方法生产的具有动物型糖链的糖蛋白。
9.根据权利要求1所述的植物细胞，其中所述动物来源的酶是哺乳动物α1，6-岩藻糖基转移酶。
10.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中所述动物来源的酶是哺乳动物α1，6-岩藻糖基转移酶。
11.根据权利要求1所述的植物细胞，其还包含外源性糖蛋白。
12.根据权利要求11所述的植物细胞，其中所述外源性糖蛋白是酶、激素、细胞因子、抗体、疫苗、受体或血清蛋白。
13.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述外源性糖蛋白是酶、激素、细胞因子、抗体、疫苗、受体或血清蛋白。
14.根据权利要求12所述的植物细胞，其中所述抗体是IgG或scFv。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体是IgG或scFv。
16.根据权利要求1所述的植物细胞，其中的内源性植物α1，3-岩藻糖基转移酶和/或β1，2木糖转移酶被灭活。
17.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其中还包括将内源性植物α1，3-岩藻糖基转移酶和/或β1，2木糖转移酶灭活的步骤。
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