CN101766836B - 纳米银脊髓及外周神经损伤修复材料的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
一种纳米银脊髓及外周神经损伤修复材料的制备方法。本发明属于使用组织工程方法修复人体或动物脊髓及外周神经损伤。该修复材料使用胶原(I、III、IV型)与壳聚糖以及纳米银混合制成，改变注有纳米银、胶原及壳聚糖混合物硅胶管降入冷淋液中的速度和/或冷淋液温度使该脊髓、周围神经组织工程修复材料在内部结构上具有轴向微管矩阵排列且微管内表面均匀分布正电荷。使用组织工程化神经修复材料能够替代自体游离神经移植的材料，避免对供区造成医源性损害，加快外周神经再生轴索生长的速度，缩短神经修复的时间。可广泛应用于临床脊髓外伤及长阶段外周神经缺损的外科手术修复。
Description
技术领域
本发明属于使用组织工程方法修复人体或动物脊髓及外周神经损伤。主要涉及一种使用纳米银、胶原及壳聚糖制得的具有同损伤部位神经组织相同方向的微管结构支架的制备工艺。
背景技术
细胞外基质(extracellular matrix)成分如胶原等在细胞的粘附和移行过程中发挥重要的作用。胶原是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。胶原在各种动物中都有存在。脊椎动物中腱、软骨和骨中的胶原非常丰富，几乎占了蛋白总重的一半。
壳聚糖是甲壳质经脱乙酰反应后的产品。 壳聚糖的生物相容性良好，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛，可用作烧伤敷料及伤口愈合剂，包扎纱布用壳聚糖处理后，伤口愈合速度可提高75％。用壳聚糖制成的可吸收性手术缝线，机械强度高，可长期贮存，能用常规方法消毒，可染色，可掺入药剂，能被组织降解吸收，免除患者拆线的痛苦。
纳米银的安全性是国际医学界公认的，对人体细胞没有负面影响。美国毒物与疾病登记处(Toxicological Profile InformationSheet，ATSDR)和美国卫生及公共服务部(United States Departmentof Health and Human Services，HHS)对银的毒性进行调查，内容涉及银的吸收、分布、代谢、排泄以及其他对健康的影响，至今未发现银对人毒性反应或影响免疫系统、心血管系统、生殖系统的功能以及发育和遗传毒性的报道。其次，纳米银颗粒性质稳定，可以很容易以不同浓度加入支架材料中。由于其表面带有正二价电荷，颗粒之间因静电排斥作用而不易聚积，所以分布均匀。再其次，纳米银颗粒大小稳定，直径大小介于3-30纳米，不能被免疫系统识别，所以不会产生免疫排斥反应。可以随材料降解而缓慢释放，不易在体内蓄积。最后，纳米银的抗菌性已经为医学界所承认，那么使用纳米银颗粒制作的支架材料在损伤处可以起到很好的抗菌性。特别是在外伤后可以有效减少炎性细胞的浸润，对神经的再生可以起到进一步的促进作用。
发明内容
本发明的目的是使用组织工程方法制备一种具有轴向微管结构的组织工程化人工神经以修复脊髓及外周神经的缺损。
本发明采用的技术方案是：一种脊髓和周围神经修复材料的制备方法，该脊髓和周围神经修复材料使用I、III或IV型胶原与壳聚糖以及纳米银混合制成，在一定的低温条件下，改变注有纳米银、胶原及壳聚糖混合物的硅胶管降入冷淋液中的速度和/或冷淋液温度使脊髓、周围神经组织工程修复材料在内部结构上具有轴向微管矩阵排列且微管内表面均匀分布正电荷特性，其制备方法按以下步骤进行：
1)称取胶原蛋白150毫克和壳聚糖75毫克，溶于0.05摩尔/升醋酸溶液，在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分搅拌30分钟，制成胶原悬浊液；
2)将0.01-0.1毫克/升浓度纳米银溶液按照1∶8-1∶12体积比加入到胶原悬浊液，同样在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分钟搅拌30分钟，制成纳米银-胶原-壳聚糖悬浊液；
3)将纳米银-胶原-壳聚糖悬浊液注入内径2毫米-15毫米的硅胶管中，密封两端，按2×10-5米/秒速度顺轴向浸入冷凝剂中；
4)将悬浊液与硅胶管冰冻物按照应用切成相应长度，在-40摄氏度，100毫托冰冻干燥机中冻干48小时；
5)取出干燥的纳米银-胶原-壳聚糖支架，浸入浓度为5-15克/升京尼平溶液中交联48小时后，在-40摄氏度，100毫托冰冻干燥机中冻干24小时。
该方法中，本脊髓和周围神经修复材料的制备主要使用I、III或IV型胶原与壳聚糖以及纳米银为主要原料，纳米银-胶原-壳聚糖支架在体内为神经再生提供仿生临时结构，且可自然降解，无免疫排斥及体内蓄积毒性。
该方法中，支架内部微管具有轴向矩阵排列的结构特征，微管直径在20微米～300微米，有利于再生轴突定向生长，也使移植的种子细胞能够顺微管壁轴向排列、迁移，从而最大限度的使损伤的神经获得有效的修复再生，材料的外表面为致密结构，能够有效阻止体内纤维结缔组织的长入，在生物体内长期保持一定外形，4个月后仍能保持较好的空间结构，该材料既能够直接植入桥接神经缺损，也能够作为种子细胞种植的载体。
该方法中，支架微管内表面均匀分布大量纳米银颗粒，由于纳米银颗粒遇水电离出正二价银离子的特点使得支架微管内表面在生物体内均匀且大量分布着正二价电荷，均匀分布正电荷的内表面能够直接和神经细胞表面的分子带负电的基团相互作用，与细胞膜发生非特异性吸附，有助于神经的再生。
该方法中，使用植物提取成分京尼平作为交联剂，能够增强支架材料机械强度，且无细胞毒性。
该方法中，使用纳米银颗粒制备的支架材料在损伤处具有良好抗菌性。
具体实施方式
实施例1：按照本发明技术方案，以I型胶原蛋白、纳米银和壳聚糖为例，其制作方法按以下步骤进行：
1.称取I型胶原蛋白150毫克和壳聚糖75毫克，溶于0.05摩尔/升醋酸溶液。在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分钟搅拌30分钟，制成胶原悬浊液；
2.量取0.01毫克/升浓度纳米银溶液，按1/8体积比加入胶原悬浊液。同样在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分钟搅拌30分钟，制成纳米银、胶原及壳聚糖悬浊液；
3.将纳米银、胶原及壳聚糖悬浊液注入内径2-15毫米的硅胶管中，密封两端，按2×10-5米/秒速度顺轴向浸入冷凝剂中；
4.将悬浊液与硅胶管冰冻物按照应用切成相应长度，冰冻干燥机中(-40摄氏度，100毫托)冻干48小时；
5.取出干燥的纳米银、胶原及壳聚糖支架，浸入浓度为5-15克/升京尼平(Genipin)溶液中交联48小时后，冰冻干燥机中(-40摄氏度，100毫托)冻干24小时。
本发明所制备的脊髓、周围神经修复材料具有以下特点：
1.本脊髓、周围神经修复材料的制备主要使用纳米银、胶原及壳聚糖为主要原料，支架材料在体内可为神经再生提供仿生临时结构，且可自然降解。无免疫排斥及体内蓄积毒性。
2.支架内部微管具有轴向矩阵排列的结构特征，微管直径可控制在20微米～300微米，有利于再生轴突定向生长，也使移植的种子细胞可顺微管壁轴向排列、迁移，从而最大限度的使损伤的神经获得有效的修复再生。材料的外表面为致密结构，可有效阻止体内纤维结缔组织的长入。在生物体内可长期保持一定外形，4个月后仍能保持较好的空间结构，该材料既可直接植入桥接神经缺损，也可作为种子细胞种植的载体。
3.支架微管内表面均匀分布大量纳米银颗粒。由于纳米银颗粒遇水电离出正二价银离子的特点使得支架微管内表面在生物体内均匀且大量分布着正二价电荷。均匀分布正电荷的内表面可以直接和神经细胞表面的分子带负电的基团相互作用，与细胞膜发生非特异性吸附，有助于神经的再生。
4.使用植物提取成分京尼平(Genipin)作为交联剂，可增强支架材料机械强度，且无细胞毒性。
5.支架材料中的纳米银颗粒在损伤处可以起到很好的抗菌性。以下实例2～12。
实施例2：采用I型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.01毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例3：采用I型胶原蛋白、纳米银溶液(1/8体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例4：采用I型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例5：采用III型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.01毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例6：采用III型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例7：采用III型胶原蛋白、纳米银溶液(1/8体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例8：采用III型胶原蛋白、纳米银溶液(1/8体积比，0.01毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例9：采用IV型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.01毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例10：采用IV型胶原蛋白、纳米银溶液(1/12体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例11：采用IV型胶原蛋白、纳米银溶液(1/8体积比，0.1毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
实施例12：采用IV型胶原蛋白、纳米银溶液(1/8体积比，0.01毫克/升浓度)和壳聚糖作为原始材料制备，其实施过程同实施例1。
以上所述仅是本发明优选的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限与此，任何熟悉该技术的人在本发明所公开的技术范围内，可轻易想到进行类似的变化和替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种脊髓和周围神经修复材料的制备方法，该脊髓和周围神经修复材料使用I、III或IV型胶原与壳聚糖以及纳米银混合制成，在一定的低温条件下，改变注有纳米银、胶原及壳聚糖混合物的硅胶管降入冷淋液中的速度和/或冷淋液温度使脊髓、周围神经组织工程修复材料在内部结构上具有轴向微管矩阵排列且微管内表面均匀分布正电荷特性，其制备方法按以下步骤进行：
1)称取胶原蛋白150毫克和壳聚糖75毫克，溶于0.05摩尔/升醋酸溶液，在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分搅拌30分钟，制成胶原悬浊液；
2)将0.01-0.1毫克/升浓度纳米银溶液按照1∶8-1∶12体积比加入到胶原悬浊液，同样在4摄氏度恒温环境中，以1000转/分钟搅拌30分钟，制成纳米银-胶原-壳聚糖悬浊液；
3)将纳米银-胶原-壳聚糖悬浊液注入内径2毫米-15毫米的硅胶管中，密封两端，按2×10-5米/秒速度顺轴向浸入冷凝剂中；
4)将悬浊液与硅胶管冰冻物按照应用切成相应长度，在-40摄氏度，100毫托冰冻干燥机中冻干48小时；
5)取出干燥的纳米银-胶原-壳聚糖支架，浸入浓度为5-15克/升京尼平溶液中交联48小时后，在-40摄氏度，100毫托冰冻干燥机中冻干24小时。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，本脊髓和周围神经修复材料的制备主要使用I、III或IV型胶原与壳聚糖以及纳米银为主要原料，纳米银-胶原-壳聚糖支架在体内为神经再生提供仿生临时结构，且可自然降解，无免疫排斥及体内蓄积毒性。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，支架内部微管具有轴向矩阵排列的结构特征，微管直径在20微米～300微米，有利于再生轴突定向生长，也使移植的种子细胞能够顺微管壁轴向排列、迁移，从而最大限度的使损伤的神经获得有效的修复再生，材料的外表面为致密结构，能够有效阻止体内纤维结缔组织的长入，在生物体内长期保持一定外形，4个月后仍能保持较好的空间结构，该材料既能够直接植入桥接神经缺损，也能够作为种子细胞种植的载体。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，支架微管内表面均匀分布大量纳米银颗粒，由于纳米银颗粒遇水电离出正二价银离子的特点使得支架微管内表面在生物体内均匀且大量分布着正二价电荷，均匀分布正电荷的内表面能够直接和神经细胞表面的分子带负电的基团相互作用，与细胞膜发生非特异性吸附，有助于神经的再生。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用植物提取成分京尼平作为交联剂，能够增强支架材料机械强度，且无细胞毒性。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用纳米银颗粒制备的支架材料在损伤处具有良好抗菌性。
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