CN101732728B - 抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备与应用。所述抗炎药物组合物包括该抗炎药物-多糖偶联物和慢作用抗风湿药物。该抗炎药物-多糖偶联物通过亚烷基二胺为连接臂，在多糖骨架上引入疏水性含羧基的非甾体抗炎药物，使其具有两亲性质，在水中自组装形成纳米胶束，从而能够物理包裹抗风湿药物，并结合化学偶联的非甾体抗炎药物，达到联合治疗类风湿性关节炎的效果。该偶联物及其药物组合物安全性高、治疗效果好，可用于注射、口服或外用给药。

Description

抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种具有良好抗炎活性和生物可降解性的抗炎药物-多糖偶联物作为联合治疗药物载体，本发明还涉及该偶联物的制备方法及其药物组合物的应用。

背景技术

类风湿性关节炎是一种病因未明的自身免疫性疾病。治疗方法包括药物治疗、外科治疗和心理治疗等，一般以药物治疗为主。抗风湿药可分为四大类：非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药、糖皮质激素和植物药。

研究表明，任何单一用药都无法既缓解症状又改善病情，也都不能长期单独使用。例如布洛芬、消炎痛等非甾体抗炎药，具有良好的止痛、抗炎作用，但它们既不能长期应用，也不能改变病程和预防关节破坏。又如，甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶等改善病情的抗风湿药具有改善和延缓病情进展等作用，但它们不具备即刻止痛和抗炎作用，对症状改善帮助不大，且发挥作用慢，用药后临床症状改善约需4～8周，故而称为慢作用药。再如，泼尼松、强的松龙等糖皮质激素具有改善关节肿胀、疼痛等作用，也有助于减轻炎症，但一般只能作为起效前的“桥梁”用药，或应用非甾体抗炎药疗效不满意时的短期措施，不能长期使用。雷公藤等植物药制剂在单独使用时剂量偏大，可引起性腺抑制或(和)骨髓抑制等严重不良反应，不可单独使用。

近年，大量临床观察与研究表明，早期联合应用抗风湿药，不仅可以尽快缓解病情，还可延缓病情进展。然而，现有抗风湿药多为水难溶性药物，难于制备适宜的制剂，往往需要采取各种增加溶解度的方法，如将药物制备成盐、加入潜溶剂、加入助溶剂以及加入表面活性剂增溶。但成盐常需要强酸或强碱条件，对许多药物不适用；生理安全的潜溶媒又很少，且用量有所限制；通过药物形成络合物而增加药物溶解度的助溶剂，其安全性不易保证。此外，目前联合用药常采用多种制剂分别给药，方式繁琐，患者顺应性不好。

药物-高分子偶联物应运而生，即将小分子疏水性抗炎药物接入水溶性大分子载体，从而达到增加药物可溶性、被动靶向和缓控释作用、避免被肾脏快速清除延长药物半衰期等目的。作为生命有机体的重要组分的多糖，在控制细胞分裂、调节细胞生长以及维持生命有机体正常代谢等方面有重要作用。同时，多糖具有优良的生物相容性并能够在生物体中酶解成易被活体吸收、无毒副作用的小分子物质，此外，多糖的主链结构还有大量的氨基和羧基，易于化学修饰(如酰化、硫酸酯化、接枝与交联等)而改善其理化性质。故以多糖作为抗炎药物-高分子偶联物的水溶性部分，具有其他高分子材料无以比拟的优势。现已有部分多糖-药物偶联物处于研究阶段，但这些偶联物仅仅以药物-多糖偶联物形式给药，仍无法通过一种制剂达到联合治疗的目的，并且药物释放行为单一，难以满足类风湿性关节炎的治疗要求。此外，还存在以下缺陷：高分子化学反应本身固有的困难，使得合成条件较为苛刻，产率较低；当不能通过羟基、氨基等官能团直接进行缩合时，所使用的连接臂较为复杂，如氨基酸或多肽；疏水性药物的接枝率较低，载药量不高，导致难以达到给药剂量，影响治疗效果等。

针对以上问题，本专利以天然多糖为骨架，在多糖的羧基或经衍生化形成的羧基上通过简单的亚烷基二胺为连接臂，引入含羧基疏水性非甾体抗炎药物，由于该抗炎药物-多糖偶联物含有亲水性多糖部分，和疏水性非甾体抗炎药物部分，使其具有了两亲性，故该偶联物可作为抗风湿药物载体，构建一种新型、能够通过一种制剂联合给药、治疗类风湿性关节炎的药物传递系统，兼具聚合物胶束的特征：1)在水溶液中可自组装形成纳米胶束，避免了有机溶剂、表面活性剂、交联剂或加热条件的使用；2)胶束的疏水内核通过物理包裹方式，增溶疏水性抗风湿药物，与化学偶联的非甾体抗炎药物协同发挥作用，达到联合治疗效果；3)由于增溶在偶联物内核的抗风湿药物是以非共价的方式与载体结合，使得运载的药物能够较为容易释放出来，与化学偶联的非甾体抗炎药物释放行为相互辅助，达到程序性释药效果，从而降低毒副作用，提高疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗炎活性并生物可降解的抗炎药物-多糖偶联物。该偶联物在水介质中可自组装形成纳米胶束，避免化学交联剂、大量有机溶剂、加热条件的使用，制备工艺简单；可通过疏水基团所形成的疏水内核物理包裹抗风湿药物，显著提高抗风湿药物的溶解性；此外，可通过化学偶联非甾体抗炎药物与物理包裹疏水性抗风湿药物，达到联合治疗类风湿性关节炎的效果。

本发明的另一个目的是提供包含上述抗炎药物-多糖偶联物的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供上述抗炎药物-多糖偶联物及包含上述偶联物药物组合物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物在制药中的应用。

为达到上述目的，本发明提供一种新型抗炎药物-多糖偶联物，该偶联物是在多糖分子的羧基或经过衍生化形成的羧基上，通过亚烷基二胺为连接臂，引入疏水基团——含羧基非甾体抗炎药物，使其具有两亲性性质，在水介质中可自组装为纳米胶束。由于疏水基团为非甾体抗炎药物，通过物理包裹增溶抗风湿药物，故能够达到联合用药治疗类风湿性关节炎的效果。

所述的抗炎药物-多糖偶联物，其中选用的多糖包括原本含有羧基的多糖未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、透明质酸、软骨素、多硫酸化软骨素、海藻酸和原本不具有羧基但引入羧基的多糖壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、琥珀酰壳聚糖、葡聚糖、真菌多糖。

所述的抗炎药物-多糖偶联物，其中疏水基团为含羧基的非甾体抗炎药物，包括疏水性含羧基的水杨酸类、苯丙酸类、苯乙酸类、吲哚类、灭酸类、烯醇酸类非甾体抗炎药，优选自阿司匹林、双氯芬酸、酮洛芬、布洛芬、芬布芬、甲芬那酸、甲氯芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿西美辛、苄达明、依托度酸、萘普生、异丁苯丙酸。

所述的抗炎药物-多糖偶联物的制备方法，包括下列步骤：

将含羧基非甾体抗炎药物溶于适当有机溶剂中，采用亚烷基二胺为连接臂，二环己基碳化二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的活性中间体；将含羧基或经衍生化成含羧基的多糖溶于反应溶剂中，与得到的活性中间体通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，进一步羧基和氨基缩合反应。

所述的制备方法，其中适当有机溶剂优选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜。

所述的制备方法，其中连接臂为碳原子数2～12的亚烷基二胺结构。

所述的制备方法，其中反应溶剂优选自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。

所述的抗炎药物组合物，包含本发明所述的抗炎药物-多糖偶联物和具有药学活性或药理活性分子。其中该药学活性或药理活性的分子选自慢作用抗风湿药：包括甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺吡啶、来氟米特。

所述的抗炎药物组合物，可以用作注射、口服或外用给药。其中注射给药优选注射剂、冻干粉针，口服给药优选片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂，外用给药优选贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂。

该抗炎药物-多糖偶联物的药物组合物，制备成载药纳米胶束的方法操作步骤如下：抗炎药物-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的慢作用抗风湿药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

具体方案如下：

在含羧基或经衍生化形成含羧基的多糖分子链上引入疏水基团(含羧基抗炎药物)，使其具有两亲性，在水介质中可自组装成纳米胶束，相对疏水的含羧基抗炎药物聚集成内核，多糖分子亲水链形成高度亲水性外壳，具有稳定胶束、有效躲避生物体网状内皮系统的捕捉的作用。因此这类抗炎药物-多糖偶联物可作为一类优良的药物载体，尤其对于难溶性抗风湿药物，从而能够达到联合治疗目的。该偶联物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，表面光滑，均匀度好，再分散性好，载药量和包封率高。该偶联物可用于注射、口服或外用给药。

兼具抗炎活性和生物可降解的抗炎药物-多糖偶联物的合成及药物组合物制备方法详细说明如下：

一、抗炎药物-多糖偶联物的合成

1、活性中间体的的制备

a.将含羧基非甾体抗炎药物溶于适当有机溶剂中，以二环己基碳化二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂，控温反应至完全，抽滤除去沉淀，加入过量乙酸乙酯洗涤；对抽滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，除去溶剂，得到活化中间酯。

b.将亚烷基二胺和活化中间酯按适当比例分别溶于适当有机溶剂中，0～4℃将亚烷基二胺缓慢滴入活化中间酯的溶液中，监控反应至完全；对反应液进行萃取，合并有机溶剂层。

c.分离纯化上述产品，得到氨基化的药物，即活性中间体。

所述合成路线图解如下：

在上述活性中间体的制备方法中：步骤a所述有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜，更优选为N，N-二甲基甲酰胺；控温反应优选为先0～4℃反应10～150min，再升至室温反应到完全，更优选为0℃反应30min，再升至室温反应到完全；反应时间优选为4～36h，更优选为24h。

步骤b中所述亚烷基二胺和活化中间酯的比例优选为2～30∶1，更优选为3∶1；所述有机溶剂优选为二氯甲烷。

2、抗炎药物-多糖偶联物的合成

将含羧基或经衍生化成含羧基的多糖和活性中间体溶于适当反应溶剂中，在N2保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为活化剂，室温反应至完全；反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀；加水复溶沉淀，透析，冷冻干燥即得最终产物抗炎药物-多糖偶联物。

所述合成路线图解如下：

在上述抗炎药物-多糖偶联物的制备方法中：所述反应溶剂优选为水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，更优选为水与甲酰胺的混合溶剂；反应时间优选为4～48h，更优选为24h；透析时间优选为1～5d，更优选为3d。

二、抗炎药物-多糖偶联物胶束的制备方法

按每1ml水中溶解3～30mg的抗炎药物-多糖偶联物的比例，将制得的抗炎药物-多糖偶联物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的抗炎药物-多糖偶联物胶束。

三、以抗炎药物-多糖偶联物作为载体，制备含难溶性抗炎药物的药物组合物

抗炎药物-多糖偶联物溶于水，将难溶性抗风湿药物如甲氨蝶呤用适当溶剂溶解，与抗炎药物-多糖偶联物水溶液混合，经超声或高压均质处理，通过透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂及小分子，制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。所谓适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂。

四、采用抗炎药物-多糖偶联物作为载体制备药物组合物，可对抗炎药物有效负载

可使用该抗炎药物-多糖偶联物作为载体的药物有：甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺吡啶、来氟米特及青霉胺等，但并不局限于这些所列药物。

本发明的有益效果：

一、本发明以亚烷基二胺为连接臂与含羧基非甾体抗炎药物缩合，得到具有一端游离氨基的活性中间体，用一种简单经济和容易实现工业化生产的方法将该活性中间体与含羧基或能够衍生化形成含羧基的多糖反应，制备了一系列抗炎药物-多糖偶联物，条件温和、反应简单、产率高；

二、本发明提供的抗炎药物-多糖偶联物，可以在水中自发形成纳米胶束，不但可用于抗风湿药物的包载，还可以结合化学偶联的非甾体抗炎药物，达到联合治疗类风湿性关节炎的效果；

三、本发明提供了抗炎药物-多糖偶联物的新应用，获得一种新型抗炎药物组合物，治疗类风湿性关节炎效果好、安全性高；

四、本发明提供的抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物可用于注射、口服或外用给药。本药物组合物具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。

具体实施方案

下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

实施例1：酮洛芬-硫酸软骨素偶联物的合成

取10mmol酮洛芬、12mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、15mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在30mlN，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应30min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到酮洛芬活化中间酯。将3mmol酮洛芬活化中间酯溶于15ml二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入9mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即酮洛芬活性中间体。取30mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.2mmol硫酸软骨素的甲酰胺溶液中，室温反应20min，将含45mmol酮洛芬活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物酮洛芬-硫酸软骨素偶联物。

实施例2：布洛芬-肝素偶联物的合成

取10mmol布洛芬、16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在20mlN，N-二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应45min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到布洛芬活化中间酯。将2mmol环丙沙星活化中间酯溶于10ml二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入5mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即布洛芬活性中间体。取36mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol肝素的甲酰胺溶液中，室温反应20min，将含26mmol布洛芬活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物布洛芬-肝素偶联物。

实施例3：双氯芬酸-透明质酸偶联物的合成

取10mmol双氯芬酸、15mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、15mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25ml二甲基亚砜中，避光、氮气保护下，冰浴反应40min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到双氯芬酸活化中间酯。将3mmol双氯芬酸活化中间酯溶于25ml二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入5mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即双氯芬酸活性中间体。取30mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol透明质酸的水溶液中，室温反应30min，将含30mmol双氯芬酸活性中间体的二甲基亚砜的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应20h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥即得最终产物双氯芬酸-透明质酸偶联物。

实施例4：吲哚美辛-羧甲基壳聚糖偶联物的合成

取10mmol吲哚美辛、16mmol二环己基碳化二亚胺(DCC)、16mmol羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解在25ml四氢呋喃中，避光、氮气保护下，冰浴反应30min，然后升至室温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到吲哚美辛活化中间酯。将5mmol吲哚美辛活化中间酯溶于40ml二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入20mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所得产物，即吲哚美辛活性中间体。取30mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入含0.1mmol的羧甲基壳聚糖水溶液中，室温反应30min，将含25mmol吲哚美辛活性中间体的N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析2d，冷冻干燥即得最终产物吲哚美辛-羧甲基壳聚糖偶联物。

实施例5：抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束的制备和表征

1、抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束的制备

实施例1～4抗炎药物-多糖偶联物48mg溶解在8ml水中于室温搅拌1h，然后冰浴下超声或高压均质后，0.45μm滤膜过滤，即得。

2、粒径

将1制备得到抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(MalvernInstruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表1。

3、临界胶束浓度(CMC)

采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度增加，放射光谱中振动精细结构(the vibrational fine structure of theemission spectra)发生变化，激光光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I₁/I₃比(在固定的激发波长下扫描，I₁、I₃分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中I₃₃₈/I₃₃₃比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲性分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。

表1抗炎药物-多糖偶联物胶束的表征

实施例6：包含甲氨蝶呤的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征

1、制备工艺

抗炎药物-多糖偶联物20mg，溶解在3ml水中搅拌1h。甲氨蝶呤8mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺(二甲基亚砜)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中甲氨蝶呤含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为乙睛：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH＝4.85)＝10∶90(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为313nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表2。

表2实施例1～4载有甲氨蝶呤的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束

实施例7：包含柳氮磺吡啶的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征

1、制备工艺

抗炎药物-多糖偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌1h。柳氮磺吡啶9mg溶解在二甲基亚砜(N，N-二甲基甲酰胺)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中柳氮磺吡啶含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶乙腈∶水＝35∶35∶30(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为0.9mL/min，检测波长为365nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表3。

表3实施例1～4载有柳氮磺吡啶的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束

实施例8：包含来氟米特的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征

1、制备工艺

抗炎药物-多糖偶联物20mg，溶解在3ml水中搅拌1h。来氟米特10mg溶解在乙酸乙酯中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.45μm滤膜过滤，冷冻干燥。

2、抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束中来氟米特含量的测定

用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为0.01mol/L四丁基溴化铵(用醋酸调pH为3.0)∶乙腈∶甲醇＝30∶20∶50(v/v)，色谱柱为Lichrospher C₁₈(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0mL/min，检测波长为260nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为25℃，注射样品体积为20μl。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表4。

表4实施例1～4载有来氟米特的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束

实施例9：包含抗风湿药物的抗炎药物-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物用于治疗类风湿性关节炎

以实施例6～8为例，观察其对佐剂性关节炎大鼠的影响

1、方法：将SD雄性大鼠70只按体重随机分为14组，每组5只，设为空白对照组(ig生理盐水10ml/kg)、模型组(ig生理盐水10ml/kg)、包含甲氨蝶呤酮洛芬-硫酸软骨素组(ig甲氨蝶呤5mg/kg)、包含甲氨蝶呤布洛芬-肝素组(ig甲氨蝶呤5mg/kg)、包含甲氨蝶呤双氯芬酸-透明质酸组(ig甲氨蝶呤5mg/kg)、包含甲氨蝶呤吲哚美辛-羧甲基壳聚糖组(ig甲氨蝶呤5mg/kg)、包含柳氮磺吡啶酮洛芬-硫酸软骨素组(ig柳氮磺吡啶20mg/kg)、包含柳氮磺吡啶布洛芬-肝素组(ig柳氮磺吡啶20mg/kg)、包含柳氮磺吡啶双氯芬酸-透明质酸组(ig柳氮磺吡啶20mg/kg)、包含柳氮磺吡啶吲哚美辛-羧甲基壳聚糖组(ig柳氮磺吡啶20mg/kg)、包含来氟米特酮洛芬-硫酸软骨素组(ig来氟米特40mg/kg)、包含来氟米特布洛芬-肝素组(ig来氟米特40mg/kg)、包含来氟米特双氯芬酸-透明质酸组(ig来氟米特40mg/kg)、包含来氟米特吲哚美辛-羧甲基壳聚糖组(ig来氟米特40mg/kg)。其中除空白组以外其余各组均按0.1ml/只弗氏完全佐剂注射于大鼠左后足跖内。

观察指标：A：体重观察：从实验第一天起，以后每周称重一次；B：肿胀率测定：采用游标卡尺测定大鼠踝关节下约0.5cm处的足趾中心厚度代表足趾肿胀度，于致炎前及至炎后连续测定21天；C：关节炎指数(AI)计算：致炎后第12天开始观察并记录全身关节病变程度，1次/3d。全身病变按5级评分法评价。根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累计积分，计算出AI。无红肿为0分；小趾关节红肿为1分；趾关节和足跖肿胀为2分；踝关节以下的足爪肿胀为3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀为4分。把各个关节的累计起来，即为每只大鼠的AI。

2、结果：与模型对照组比较，各个载药胶束组合物组大鼠左右足趾肿胀值在12-21天内均有明显降低，表明载药胶束组合物对佐剂性关节炎大鼠关节病变有较好的预防和治疗作用；与模型对照组比较，各个载药胶束组合物组大鼠的体重增长在3周时有显著差异，表明载药胶束组合物组队佐剂性关节炎大鼠体重增长缓慢有明显的改善；与模型对照组比较，各个载药胶束组合物组在第12天时大鼠关节炎指数(AI)比较差异不显著(p＞0.05)，此后模型组大鼠AI逐渐升高，第21天达峰，表明载药胶束组合物组均能抑制佐剂性关节炎大鼠的关节病变。

Claims (6)

1.一种抗炎药物-多糖偶联物，其特征在于该偶联物是在多糖的羧基或经衍生化形成的羧基上，通过亚烷基二胺为连接臂引入疏水性羧酸类非甾体抗炎药物，使其具有两亲性质，在水介质中可自组装为纳米胶束；所述多糖选自硫酸软骨素，肝素，透明质酸，羧甲基壳聚糖；所述抗炎药物选自酮洛芬，布洛芬，双氯芬酸，吲哚美辛；所述连接臂为碳原子数2～12的亚烷基二胺结构。

2.根据权利要求1所述的抗炎药物-多糖偶联物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：将含羧基非甾体抗炎药物溶于适当有机溶剂中，采用亚烷基二胺为连接臂，二环己基碳化二亚胺、羟基琥珀酰亚胺为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的活性中间体；将含羧基或经衍生化成含羧基的多糖溶于反应溶剂中，与得到的活性中间体通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为活化剂，进一步羧基和氨基缩合反应；所得多糖偶联物即具有良好两亲性，在水介质中可自发形成纳米胶束。

3.一种抗炎药物组合物，其特征在于该组合物包含权利要求1所述的抗炎药物-多糖偶联物和具有药学活性或药理活性的分子，所述的药学或药理活性分子为选自甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、来氟米特的慢作用抗风湿药，该组合物的制备方法包括如下步骤：抗炎药物-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的慢作用抗风湿药物用药学上可接受溶剂溶解，与所述抗炎药物-多糖偶联物纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，冻干制得粒径为10～1000nm的纳米胶束。

4.根据权利要求3所述的抗炎药物组合物，其特征在于该组合物可以用于联合用药治疗类风湿性关节炎。

5.根据权利要求4所述的抗炎药物组合物，其特征在于该组合物可以用于注射、口服或外用给药。

6.根据权利要求5所述的抗炎药物组合物在制药中的应用，其特征在于所述口服给药选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂，外用给药选自贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂。