CN101706497A - 人tff3的elisa检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的人TFF3的ELISA检测试剂盒，其关键技术之处主要在于，用基因工程方法制备特异性的抗TFF3的抗体，并将此抗体包被的酶标板作为试剂盒的重要组成，然后与TFF3的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、TFF3标准品、TFF3阳性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装为人TFF3的ELISA检测试剂盒；使用双抗夹心法ELISA，建立了敏感快捷地捕获人血清或细胞、组织培养物中TFF3浓度的测定方法，具有高特异性，高稳定性。试剂盒主要供一般性实验室或胃肠道病理的临床研究使用。
Description
技术领域
本发明涉及多种生物制剂——人TFF3蛋白质、抗TFF3的特异性多抗、单抗，和一种用于人源TFF3含量检测的ELISA检测试剂盒，适用于人组织、细胞培养物或血清中TFF3的定量检测。
背景技术
TFFs(The trefoil factor families)即三叶因子家族，是一类产粘蛋白的上皮细胞表面的一种分泌型多肽，因为其蛋白质均包含一个或多个由38至39个氨基酸残基通过内部6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键而构成的三叶型结构而得名。
TFFs的基因位于21q22.3染色体上，家族中所有三个蛋白质的基因所占区域共55kb。TFFs在人体内多个组织里表达，但在胃肠道中表达量最大。
肠道炎症和前列腺癌症患者血清中，TFFs含量明显上升(Vestergaard EM，et al.Plasmalevels of trefoil factors are increased in patients with advanced prostate cancer.Clin Cancer Res.，2006；12：807-12)。TFFs被认为是维护黏膜表面健康的关键因子，后者炎症时TFFs含量显著上升，其作用机理被解释为通过与粘蛋白的相互作用增强细胞的迁移从而提高黏膜表层的保护能力。虽然也有研究指出TFFs在多种癌症病例中含量升高，但是这些蛋白质实现功能的机理还有待深入研究。
该家族有3个成员：TFF1、TFF2和TFF3。TFF1含60个氨基酸残基，与乳腺癌相关；TFF2含106个氨基酸残基，具解痉挛功能；TFF3含73个氨基酸残基。其中，TFF1和TFF3包含一个、TFF2包含两个三叶构型的结构域，且TFF1和TFF3可以通过位于羧基端的半胱氨酸残基形成同源二聚体。
TFF3，亦称为肠三叶因子(intestinal trefoil factor)，由于其紧密的三叶草结构，故而对蛋白酶、酸、热稳定。TFF3单体分子量约8kDa，二聚体约15.6kDa。TFF3主要定位在胃上，也大量表达在小肠和大肠的黏膜细胞内。肠细胞中TFF3的生理效应被认为有利于癌细胞的生长、增殖和转移。TFF3在健康捐赠者血清中的浓度为0.7ng/mL至2ng/mL(Vestergaard EM，et al.Development and Evaluation of an ELISA for Human Trefoil Factor 3.Clin.Chem.，2002；48：1689-1695)。临床数据显示TFF3的表达可与胃癌的不良预后呈现关联(Yamachika T et al.Intestinal Trefoil Factor A Marker of Poor Prognosis in Gastric Carcinoma.Clin.Cancer Res.，2002；8：1092)。此外，通过与粘蛋白的相互作用，TFF3可以使肠表层细胞避开众多有害因子的影响。鼠的体内研究显示，口服TFF3可使其避免胃黏膜伤害，抵御非类固醇类药物诱发的损伤，而TFF3基因敲除鼠的黏膜修复功能明显受损，当它们肠道受损时，死于伤口无法愈合，TFF3的作用机制包括维护上皮细胞，使其免于凋亡，或者诱使边缘细胞(bordering cell)迁移并覆盖伤口，或者阻止经伤口进入上皮细胞的血清补体系统成分的沉积(Mashimo H，et al.ImpairedDefense of Intestinal Mucosa in Mice Lacking Intestinal Trefoil Factor[J].Science，1996；274：262-265.)。
因此，对TFF3的定量分析有助于揭示其在胃肠道中的作用。
此外，也有报道，TFF3在乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌症患者血清中异常上调(Gronbaek H，et al.Serum trefoil factors in patients with inflammatory bowel disease.Digestion，2006；74：33-39)。
鉴于TFF3在血清或组织和细胞中浓度的上升为胃肠道病变发生的先兆，同时也与乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌的病理发生和预后相关，因此，加强TFF3在血液、组织和细胞中的检测具有研究价值和临床意义。
目前，国际上几大ELISA试剂盒生产商只单一地生产TFF3蛋白或抗体，而尚未有生产TFF3的ELISA试剂盒的报道，且近年来针对TFF3蛋白的研究结果亦有不断创新，故而在本发明中，使用GenBank：AAH17859.1(BC017859)序列为模板，通过细胞表达TFF3蛋白质，根据同样的氨基酸序列，又通过化学合成或通过生物重组细胞表达多组不同长度的TFF3多肽，再制备TFF3对应的单抗和多抗，使用制备的抗体包被酶标板，以前面所得的TFF3多肽为标准品，组成ELISA试剂盒。
本发明采用双抗夹心法，以特异性抗体作为捕获TFF3的抗体，保证了检测结果的特异性，最大程度避免了假阳性；随后以特异性多抗作为检测抗体，进一步排除了假阳性；再加入酶标二抗，形成一个4组分的夹心形状的结合物，最后加入底物显色液，将以上得到的正确信号有效放大，对比同步平行进行的标准品和内参实验，进一步排除实验中的试剂或操作误差，最终得到可信赖的结论。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测生物样品中人源TFF3的酶联免疫吸附分析方法(EnzymeLinked-Immuno-Sorbent Assay，ELISA)，该方法包括：(1)将样品与本发明的抗TFF3的特异性抗体(antibodies)接触，形成TFF3::TFF3抗体复合物(complex)，(2)检测样品中TFF3分子与抗体的结合情况，(3)与对照样品比较，确定生物样品中TFF3的含量。
在某些实施方式中，所述生物样品包括人血清、组织或细胞样品抽提物或裂解液。在某些实施方式中，TFF3的含量因个体的健康状态，或者组织和细胞是否癌变而形成差异。
在某些实施方式中，抗TFF3的特异性抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段或以上一种或几种的混合物。在某些实施方式中，该抗体是经标记的，标记可为酶、放射性同位素或荧光基团。在某些实施方式中，抗体对除TFF3以外的多肽的结合亲和力低于约1×105Ka。
本发明还提供了分离的TFF3多肽，该多肽包含1个或2个选自下组的氨基酸序列：SEQ1或SEQ 2，见表1，其中，SEQ 1即为全长的TFF3。在某些实施方式中，该多肽的长度约为73或约为146个氨基酸的片段，或为两者的混合物。在某些实施方式中，该多肽或多肽混合物特异性地与抗TFF3抗体结合。
表1：分离的TFF3多肽
| SEQ No. | 氨基酸序列 |
| SEQ 1 | MLGLVLALLSSSSAEEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF |
| SEQ 2 | MLGLVLALLSSSSAEEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTFMLGLVLALLSSSSAEEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF |
本发明还提供了分离的TFF3抗体，其中该抗体识别对应于SEQ 3、SEQ 4、SEQ 5、SEQ6、SEQ 7、SEQ 8、SEQ 9、SEQ 10、SEQ 11、SEQ 12、SEQ 13或SEQ 14中至少一个TFF3序列区域。各人工合成多肽见表2。
表2：人工合成的TFF3多肽
| SEQ No. | 序列 | 长度 | 经定位的氨基酸序列位置 |
| SEQ 3 | GLVLALL | 7-mer | 3-9 |
| SEQ 4 | LGLVLAL | 7-mer | 2-8 |
| SEQ 5 | LGLVLALL | 8-mer | 2-9 |
| SEQ 6 | AVPAKDRVDCG | 11-mer | 26-36 |
| SEQ 7 | AVPAKDRVDC | 10-mer | 26-35 |
| SEQ 8 | AVPAKDRVD | 9-mer | 26-34 |
| SEQ 9 | GYPHVTPKECN | 11-mer | 36-46 |
| SEQ 10 | GYPHVTPKEC | 10-mer | 36-45 |
| SEQ 11 | GYPHVTPKE | 9-mer | 36-44 |
| SEQ 12 | CFKPLQEAECT | 11-mer | 62-72 |
| SEQ 13 | CFKPLQEAEC | 10-mer | 62-71 |
| SEQ 14 | CFKPLQEAE | 9-mer | 62-70 |
在某些实施方式中，该抗体通过以下方法产生：
(1)在噬菌体上合成一个TFF3的抗体库；
(2)通过将该噬菌体与组合物混合来对样品进行抗体库的筛选，该组合物包含对应于SEQ3、SEQ 4、SEQ 5、SEQ 6、SEQ 7、SEQ 8、SEQ 9、SEQ 10、SEQ 11、SEQ 12、SEQ13或SEQ 14中的至少一个；
(3)淘洗(panning)分离与组合物结合的噬菌体，其中该抗体的特征是，具有与对应于SEQ3、SEQ 4、SEQ 5、SEQ 6、SEQ 7、SEQ 8、SEQ 9、SEQ 10、SEQ 11、SEQ 12、SEQ13或SEQ 14中的至少一个TFF3序列区域相结合的能力，其结合亲和力至少为108I/；
(4)分析所得噬菌体，并确定该噬菌体结合有对应于SEQ 3、SEQ 4、SEQ 5、SEQ 6、SEQ7、SEQ 8、SEQ 9、SEQ 10、SEQ 11、SEQ 12、SEQ 13或SEQ 14中的至少一个TFF3序列区域的氨基酸编码序列。
在某些实施方式中，该抗体通过重组宿主细胞产生，该重组细胞选自中国仓鼠卵巢细胞。
在某些实施方式中，该抗体通过杂交瘤产生，该杂交瘤由TFF3多肽作为抗原免疫后的分泌特异性抗体的小鼠淋巴B细胞和鼠骨髓瘤细胞融合后所得。
本发明还提供了一些多肽片段SEQ 15、SEQ 16、SEQ 17、SEQ 18，这些片段长约23至25个氨基酸，至少包含SEQ 5、SEQ 6、SEQ 9、SEQ 12之中的一个序列，见表3。在某些实施方式中，该片段由人工化学合成；在某些实施方式中，该片段在重组宿主细胞中产生，这些重组细胞选自：中国仓鼠卵巢细胞或细菌宿主细胞。在某些实施方式中，这些多肽片段用于小鼠和/或兔的动物免疫，在某些实施方式中，这些多肽片段用于试剂盒标准品的组成成分。
表3：分离的TFF3多肽片段
| SEQNo. | 序列 | 长度 | 经定位的氨基酸序列位置 |
| SEQ 15 | MLGLVLALLSSSSAEEYVGLSANQC | 25-mer | 1-25 |
| SEQ 16 | VGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHV | 23-mer | 18-40 |
| SEQ 17 | DCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIP | 24-mer | 34-57 |
| SEQ 18 | CCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF | 24-mer | 50-73 |
具体实施方式
本发明提供了TFF3标准品、抗体以及使用这些试剂检测TFF3浓度的方法。TFF3在许多组织和细胞系如与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠癌相关的组织和细胞中差异表达。
本文所述“差异表达”通常是指TFF3蛋白质以较高或较低水平表达，如与正常组织或细胞中的含量相比，癌变组织或细胞中表达量更高或更低至少约50％、1倍、5倍、10倍或者更多.TFF3是一种在结肠、乳腺、前列腺和其它癌症中已呈现出差异表达的基因.这些比较可在两个个体或同一个体的两种组织间进行，亦可在来源于同一组织的细胞间进行.
本文所用术语“约”是指某一数值的+/-10％。
TFF3多肽
本文所述“TFF3”或“TFF3多肽”是指与人三叶因子3(GenBank：AAH17859.1)同源的蛋白质(多肽)或其片段，包括上述序列中的任一种序列或虽然基因的核苷酸序列不同，但由于遗传密码的简并性而所得的多肽片段与TFF3的氨基酸序列仍然基本一致的变体。在某些优化的实施方式中，TFF3包含SEQ 1、SEQ 2、SEQ 3、SEQ 4、SEQ 5、SEQ 6、SEQ 7、SEQ 8、SEQ 9、SEQ 10、SEQ 11、SEQ 12、SEQ 13或SEQ 14。
本文所述术语“多肽”和“蛋白质”可互相替代使用，均可指任何长度的氨基酸聚合形式，可以由人工化学合成，亦可以由重组的细菌或真核细胞表达；这些氨基酸聚合体可经如糖基化修饰或不经过化学或生物修饰；其末端含有或不含有N末端甲硫氨酸残基。
“TFF3多肽”还指与SEQ 1的氨基酸序列同一性至少约在90％以上的各种氨基酸聚合形式，其来源可以为天然表达或人工合成的。序列同一性是用BLAST算法(algorithm)利用例如默认参数(default parameter)进行测定的。
“TFF3多肽”也指一些长度至少为20个氨基酸以上的多肽变体，这些变体包含TFF3蛋白特有区域或表位的片段，尤其是生物学活性片段或与功能结构域相对应的片段。
抗体
本文术语“抗体”使用其广泛的含义，涵盖了完全装配的多克隆抗体和单克隆抗体，以及能结合抗原的抗体片段(如，Fab，、F′(ab)2)。
本文所述“多克隆抗体”，简称“多抗”，指通过多次皮下(sc)、腹腔内(ip)或肌内(im)注射相应抗原和助剂，在动物中产生的离散抗体的混合物。本文所用的术语“单克隆抗体”，简称“单抗”，指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，而非离散抗体的混合物。
本文所述抗体片段，通常由完整抗体的蛋白水解消化衍生而来的(参见Morimoto K，et al.Single-step purification of F(ab′)2fragments of mouse monoclonal antibodies(immunoglobulinsG1)by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using TSKgelPhenyl-5PW[J].J.Biochem.and Biophys.Meth.，1992；24：107-117.)。同时，这些片段也可由重组宿主细胞直接产生，例如，该抗体片段可从上文所述的抗体噬菌体库中分离得到；F(ab′)2片段可以先从大肠杆菌(E.coli)中直接回收Fab′-SH片段，再经过化学偶联形成(参见Carter P，et al.High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanizedantibody fragment[J].Bio/Technology，1992；10：163～167.)。本行业熟练的技术人员是清晰地理解和准确地运用抗体片段的生成技术的。
抗体与抗原的结合被称为“特异性结合”，这意味着：(1)抗原抗体之间显示出结合活性的阈水平，(2)抗原或抗体不与已知的相关多肽分子发生显著的交叉反应。本领域的普通技术人员可以很方便地使用某种技术测定抗体的结合亲合力，如通过Scatchard分析(ScatchardG.The attractions of protein for small molecules and ions[J].Ann.N Y Acad.Sci.，1949；51：660-672.).本发明的抗体与TFF3的结合高于其它TFF3相关蛋白至少1000倍.在某些实施方式中，本发明的抗体不与已知的相关的多肽分子特异性结合，例如，使用标准的Westemblotting分析，它们与TFF3多肽结合的同时不与已知的相关多肽结合.其它本领域众所周知的分析的典型例子包括：放射性免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附分析(ELISA)、点杂交或抑制或竞争分析和三明治分析法.
宿主细胞
可以将编码TFF3的表达构建体导入宿主细胞内，这些宿主细胞可以是任何合适的原核或真核细胞。
细菌中的表达系统包括Goeddel DV，et al.Direct expression in Escherichia coli of a DNAsequence coding for human growth hormone[J].Nature，1979；281：544-548，和Siebenlist U，et al.E.coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters.Cell，1980；20：269-281中描述的系统。
酵母中的表达系统包括Kelly JM，et al.Transformation of AspergiIlus niger by the amdSgene of Aspergillus nidulans.EMBO J，1985；4：475479，和Yelton MM，et al.Transformation ofAspergillus nidulans by using a trpC plasmid[J].Proc Natl Acad Sci，1984；81：1470-1474，与Gaillardin，C，et al.Integrative transformation of the yeast Yarrowia lipolytica.Curr.Genet.，1985；10：49-58，以及Van den Berg JA，et al.Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression：expression and secretion of prochymosin[J].Biotechnology，1990；8：135-9中所描述的系统。
昆虫宿主细胞中的表达系统包括《杆状病毒的分子生物学》(THE MOLECULARBIOLOGY OF BACULOVIRUSES，W.Doerfler编)中，和《杆状病毒基因表达的调控》(TheRegulation of Baculovirus Gene Expression，Friesen编)中，以及Smith GE，et al.Modification andsecretion of human interleukin 2 produced in insect cells by a baculovirus expression vector[J].Proc Natl Acad Sci.，1985；82：8404-8408中所描述的系统。
哺乳动物细胞中的表达系统包括Dijkema，R，et al.Cloning and expression of thechromosomal immune interferon gene ofthe rat.EMBO J.，1985；4：761-767，和Boshart M，et al.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.Cell，1985；41：521-530，与Barnes D，et al.Methods for growth of cultured cells in serum-freemedium[J].Anal Biochem.，1980；102：255-270中所描述的系统。
将编码TFF3的表达构建体导入宿主细胞，构建表达TFF3的重组细胞，所使用的技术包括病毒感染、脂质体介导的细胞融合、磷酸钙介导的转染、电穿孔、原生质体融合、阳离子化学聚合物介导的DNA转移和基因枪。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明.应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，也不代表以下的实验是所进行的全部或仅有的实验.下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，《分子克隆实验指南》(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，《细胞实验指南》所建议的条件.我们努力确保数据的准确性(例如，数量、温度等等)，但是需要说明可能有一些实验误差和偏差.除非另外说明，分数是指质量分数，分子量是平均分子质量，温度的单位为℃，压力则为大气压或接近大气压.
实施例1：大肠杆菌中TFF3蛋白的表达
(1)8kDaTFF3蛋白片段的原核表达：以BC017859DNA(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物(引物1：TTTT GAATTC ATG CTG GGG CTGGTC CTG GCC；引物2：TTTT CTCGAG TCA GAA GGT GCA TTC TGC TTC)，PCR扩增TFF3 DNA片段，将所得片段克隆于载体pET28a(购自德国Merck公司)，转化BL21(DE3)(购自Merck)感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明TFF3 cDNA片段正确克隆至pET28a，为一个具有219bp的完整开放式阅读框，与GenBank中人源TFF3基因100％同源，推算其表达的蛋白质分子量为8kDa。
(2)8kDaTFF3蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在8kDa附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与TFF3的抗体发生强阳性反应，说明该8kDa的TFF3蛋白具有较强的免疫原性。
(3)8kDa的TFF3蛋白片段的制备与纯化：经大量培养、IPTG诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱(购自Pharmacia)纯化带有6×His标记的TFF3蛋白，得到大量8kDa TFF3蛋白片段。
实施例2：单克隆抗体的制备
以实施例1中获得的TFF3为例，以TFF3为抗原免疫小鼠，获取分泌特异性单抗的淋巴B细胞，后者与鼠骨髓瘤细胞融合得杂交瘤细胞，细胞培养后直接从上清中分离抗TFF3的单抗，或将杂交瘤细胞直接接种至小鼠腹腔获取单抗。后者的过程举例如下：
(4)TFF3蛋白的动物免疫：将约8kDa的TFF3蛋白片段与完全福氏佐剂混合并经充分乳化后，免疫鼠龄在8～12周的BALB/c健康小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)3至4只，皮下注射，每次免疫间隔为2周，第二次及其后免疫改为非完全福氏佐剂与TFF3皮下注射，直至血清效价高于20000∶1。
(5)杂交瘤细胞的制备：在末次免疫后4天，分离鼠脾细胞，在PEG存在条件下与对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞株(购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC)以4∶1的比例融合，饲养细胞来自小鼠腹腔细胞。融合后的细胞以含HAT的培养基筛选，经有限稀释后选出高抗体分泌孔，将孔内细胞克隆，进行抗原特异的ELISA测定，挑选高分泌性细胞株扩大培养或冻存。
(6)单抗制备：将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株进行小鼠腹腔接种，待产生明显腹水后收集腹水，用葡萄球菌A蛋白交联的亲和层析柱(购自Pharmacia公司)纯化单抗。抗体存于含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/L、pH7.4的PBS之中。
实施例3：多克隆的制备
(1)动物免疫：麻醉3-4月龄、体重在1.7Kg以上的健康日本大耳白兔(购自湖北省实验动物研究中心)3至4只，在第O天和第28天使用编码人TFF3的DNA表达载体进行免疫，表达载体参见前文“宿主细胞”中的“哺乳动物细胞中的表达系统”.具体地，对于第1次和第2次免疫，对每只兔肌肉内注射0.6mg的DNA表达载体，并对注射部位短暂地施用温和的电流以刺激该部位内肌肉细胞摄取DNA.然后，每月给兔肌肉内注射重组人TFF3蛋白如SEQ 1以加强免疫，重组蛋白在不完全福氏佐剂中充分乳化。
(2)血清获取：每次免疫14天后从兔中耳动脉采集血样，静置30分钟后离心，3000rpm、5分钟，上清即为血清。用ELISA试验测定兔血清以确定对重组人TFF3蛋白产生的抗体反应的效价，直至血清效价高于20000∶1。
(3)多抗的纯化：采用层析的方法通过蛋白A柱分离血清组分，得到总IgG组分，再用预先交联了全长的TFF3蛋白的亲和层析柱(购自Pharmacia)纯化，得到抗TFF3的多抗。纯化后的抗体保存于含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞的0.01mol/L、pH7.4的PBS之中，多抗的终浓度为1mg/mL。
实施例4：ELISA试剂盒的组成与配制
试剂盒包括：TFF3标准品、TFF3阳性对照样品、TFF3多抗、生物样品稀释液、洗涤液、酶标二抗(HRP标记的羊抗兔多抗)、底物显色液、终止液、酶标板。具体说明如下：
(1)TFF3标准品
全长73个氨基酸的TFF3蛋白(如SEQ 1)的0.01mol/L PBS溶液，pH7.4，含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞，TFF3终浓度为240μg/mL，使用时用生物样品稀释液稀释至2400、1200、600、300、150、75pg/mL六个梯度。
(2)TFF3阳性对照样品
全长的TFF3蛋白的0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液，含50％甘油、10％人血清、0.5％BSA、0.1％BHA和0.01％硫柳汞，TFF3的终浓度为5μg/mL，使用时用生物样品稀释液作1∶10000稀释。
(3)TFF3多抗
为多抗的PBS溶液，含55％甘油、0.1％BHA和0.01％硫柳汞，pH7.4，多抗的终浓度为1mg/mL，使用时用标本稀释液作1∶5000稀释。
(4)生物样品稀释液
为含8％小牛血清、1％Trito X-100、0.01％硫柳汞和1％人IgG的pH7.4的0.01mol/L PBS。
(5)洗涤液
为pH7.4、浓度0.01mol/L的PBST：NaCl 8.0g，NaH2PO4·2H2O 0.3g，Na2HPO4·12H2O2.9g，Tween 200.5g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000mL，调pH至7.4。
(6)酶标二抗
为HRP标记的羊抗兔多抗，购自美国R＆D systems，使用时用生物样品稀释液作1∶10000稀释。
(7)底物显色液
为TMB系统，购自美国SIGMA。
(8)终止液
为2mol/L H2SO4溶液。
(9)酶标板
为预先抗体包埋和血清封闭好的酶标板，在超净工作台上风干后真空密封包装，使用时从密封袋内取出，剩余的酶标条放回密封袋内于4℃保存。
实施5：生物材料的来源
生物样品可以来源于人血或组织、细胞培养物的裂解液或抽提液。下面具体以PC3(人前列腺癌细胞)的裂解液制备为例来加以说明。
(1)1640培养基添加10％FBS于T75塑料瓶中培养PC3，细胞覆盖培养表面85％以上时，收集细胞，离心后以预冷的PBS洗涤细胞2次；
(2)加入细胞抽提缓冲液(Cell Extraction Buffer)，细胞抽提缓冲液加入量依据细胞的量而定，两者比例关系为1×106个细胞加入1mL的细胞抽提缓冲液；
(3)间或上下混均，冰浴30分钟后，转移至微量离心管内，13000rpm，4℃离心10分钟，取上清即为细胞裂解液或细胞的蛋白质抽提液。细胞裂解液可存于-80℃，同时，在使用时应避免多次冻融循环。
细胞抽提缓冲液组成：10mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM NaF，20mM Na4P2O7，2mM Na3VO4，1％Triton X-100，10％glycerol，0.1％SDS，0.5％deoxycholate，1mM PMSF，蛋白酶抑制剂混合物(购自Sigma)。需要注意的是，PMSF和蛋白酶抑制剂使用前加入，其它成分可预先配制成溶液，置于4℃可存放15天，-20℃可存放6个月。
实施例6：人血清中TFF3含量的测定
在选用1000克离心力、离心15分钟的条件对血液样品离心处理前30分钟，可以允许其凝块。所得到的血清样品立即分析；若不能马上使用，样品可在2-8℃保藏7天，在-20℃保藏4星期。应该注意，所有血液组分应作为潜在的危险物来处理，同时避免对试剂瓶内样品的污染。ELISA检测步骤如下：
(1)将待检血清样品、标准样、阳性对照样品放置在室温预先温度平衡后，用生物样品稀释液将血清样品作二分之一、四分之一和八分之一稀释；标准品稀释至2400、1200、600、300、150、75pg/mL六个梯度；阳性对照稀释液作1∶10000稀释；同时，直接选用生物样品稀释液为阴性对照；
(2)将以上各样依次加入酶标板微孔中，每个样2个重复实验，37℃孵育1小时，TFF3将与固相载体表面的捕获抗体——预先包被在孔内的抗体相结合。
(3)经过3次PBST洗涤，再将稀释了5000倍抗TFF3的多抗加入微孔内，第二次孵育，37℃孵育1小时，多抗扮演检测抗体，并与第一次孵育中被捕获的TFF3结合。
(4)洗去多余的多抗，加入酶标二抗，37℃孵育40分钟，在第三次孵育中，酶标二抗与上一步中的多抗——检测抗体相结合，形成一个4组分的夹心形状的结合物。
(5)洗去未结合的酶标二抗，加入酶的底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)，孔内液体在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，加入终止液，转化成黄色。
(6)颜色的深浅和样品中TFF3的含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值)，制作以标准品浓度的对数为X轴、吸光值为Y轴的标准曲线。
(7)计算样品中TFF3浓度：如果阳性对照样品的测定值和标示值(5μg/mL)相比较，其变异系数小于15％，说明测定过程可靠，可依据上一步骤所得的标准曲线计算所测样品中TFF3浓度。
尽管本发明是参照以上具体的实施方式加以描述的，本领域的技术人员应当理解的是可以在不背离本发明精神实质和范围的前提下对其做出很多改动，也可以用等价物加以替换，以适应特定的情形、材料、物质组成、过程、程序步骤或各步骤，所有这样的修改都在所附权利要求的范围之内.
Claims (7)
1.人TFF3的ELISA检测试剂盒在TFF3含量检测中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，使用双抗夹心法进行TFF3含量的ELISA检测。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，ELISA检测试剂盒的试剂组成包括TFF3多肽、抗TFF3的特异性单抗和多抗、酶标二抗、生物样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液。
4.如权利要求1和2中任一项所述的用途，其特征在于，所检测对象为人血液、血浆、血清、组织和细胞。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，酶标板上起捕获生物样品中TFF3的分子为抗TFF3的特异性抗体，包括单抗和多抗。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所用标准品为TFF3多肽，对应于SEQ 1、SEQ 15、SEQ 16、SEQ 17和SEQ 18中任何一个序列。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测包括将所得标准品曲线与阳性对照样进行比较后，再将生物样品的结果与标准品曲线进行比较。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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