CN101522636A - 用作蛋白激酶抑制剂的3-氨基-吡唑-4-酰胺衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的游离形式或盐形式的式(I)的杂环化合物，其中所有变量如说明书中所定义的，本发明还涉及它们的制备、它们作为药物的用途以及包含它们的药物。

Description

用作蛋白激酶抑制剂的3-氨基-吡唑-4-酰胺衍生物

本发明涉及3-氨基-吡唑-4-羧酸衍生物，它们在治疗蛋白激酶调节响应的疾病中的用途或它们在制备用于治疗所述疾病的药物制剂中的用途，本发明还涉及药物制剂，其特别用于对抗所述疾病，该药物制剂包含所述化合物和可药用载体，所述化合物用于治疗动物或人体，特别是对抗所述疾病，本发明还涉及通过给动物或人施用所述化合物治疗动物或人体的方法，以及制备所述化合物的方法，其中在每种情况中，当提及化合物时，它们可以以本身存在和/或以(优选可药用)盐形式存在。

对于术语“蛋白激酶”，所定义的一类酶活性蛋白质，可以分为受体型激酶和非受体型激酶，还可以分为酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶。关于它们的定位，可以分为核、胞质和膜相关的激酶。很多膜相关的酪氨酸激酶同时是生长因子的受体。

关于它们的催化活性，蛋白激酶(PK)是酶，其催化细胞蛋白质中的特别的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化。底物蛋白质的翻译后修饰通常用作分子开关，表示调节细胞增殖、活化和/或分化的步骤。异常或过度，或更常见的是不适当的PK活性已经在多种疾病状态、包括良性和恶性增殖障碍中观察到。在很多情况中，在体外和体内通过应用PK抑制剂来治疗疾病、例如增殖障碍是可能的。

在过去的数年中，已经了解了Eph受体酪氨酸激酶和它们配体(ephrin)的基本作用。多种不同的Eph受体被分类并且基于它们对配体的亲和力被分为EphA或EphB亚类。至少已经鉴定出八种ephrin，它们是膜蛋白，或是甘油磷脂酰肌醇(GPI)-连接型(ephrinA)，或是跨膜型(ephrinB)。Eph受体和它们配体间的信号传导表现出受制于直接的细胞间接触的位点。接触的结果是诱导细胞间的交互双向事件。ephrin和它们的受体在某些部位的表达被认为对组织图式发育和组织空间非常受限的细胞部位具有影响。特别的作用包括细胞迁移、粘附和体节形成的修饰。

EphB4(也称为HTK)及其配体ephrinB2(HTKL)在建立和确定血管网络中发挥重要作用。在静脉上皮细胞上，EphB4是特异性表达的，而在血管发生的早期，ephrinB2特异性地并且相反地表达在动脉内皮细胞上。功能障碍的基因导致小鼠胚胎致死性，并且在缺陷ephrinB2和EphB4的情况中，胚胎在形成毛细管连接中表现出相同的缺陷。在胚胎发生过程中两者都表达在血细胞生成和血管发生的第一位点。对于适合的造血、内皮、成血管细胞和原始中胚层发生，已经建立了必需的作用。EphB4缺陷导致胚胎干细胞的中胚层分化结果的改变。乳房组织中EphB4的异位表达导致构造障碍、组织功能异常，并且是恶性肿瘤的诱因(参见，例如N.Munarini等人，J.Cell.Sci.115，25-37(2002))。从这些以及其它数据，可以得出以下结论：不适当的EphB4表达可能涉及恶性肿瘤的形成，因此抑制EphB4可以被期望成为战胜恶性肿瘤、例如癌症等的工具。

细胞中发现的酪氨酸激酶c-Src的组成性表达的病毒形式c-Src(来自劳斯肉瘤病毒，一种逆转录病毒)是Src蛋白酪氨酸激酶的不适当表达如何导致基于转化细胞的恶性肿瘤的实例。抑制Src蛋白酪氨酸激酶可以引起转化肿瘤细胞失调生长的抑制，例如在结缔组织肿瘤中。因此，在本文中抑制c-Src或其修饰或突变形式还被期望在治疗增殖疾病中显示出有益的作用。

已知VEGFR(血管内皮生长因子受体)参与控制血管发生的开始。特别是实体瘤取决于良好的血液供给，因此，在治疗此类肿瘤中，抑制VEGFR和血管发生正在进行临床研究，显示出有前景的结果。VEGF还是白血病和淋巴瘤中主要的参与者，并且在多种实体恶性肿瘤中高表达，与恶性疾病进程具有良好的相关性。伴有VEGFR-2(KDR)表达的肿瘤疾病的实例是肺癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、恶性胸膜间皮瘤和黑素瘤。除了它的血管发生活性之外，VEGFR的配体(VEGF)通过肿瘤细胞中的直接促存活作用促进肿瘤生长。多种其它疾病与失调的血管发生有关，例如以下提及的。

在患有慢性粒细胞白血病(CML)的患者中观察到abl原癌基因转化为癌基因。染色体异位将染色体22上的bcr基因连接到染色体9的abl基因上，从而产生费城染色体。产生的融合蛋白具有Bcr蛋白的氨基末端，其结合Abl酪氨酸蛋白激酶的羧基末端。因此，Abl激酶结构域变得不适当的活性，引起骨髓中造血细胞克隆的过度增殖。通过Gleevec^TM或

(Novartis的商标)的活性成分(该融合蛋白的抑制剂)抑制该酪氨酸激酶在治疗CML中显示出高活性。因此，可以证实如下一个普通概念：Abl酪氨酸激酶的不适当的表达可以治疗恶性肿瘤，特别是白血病。

但是，到目前为止用作蛋白激酶抑制剂的很多化合物表现出缺乏特异性、不希望的副作用(特别是由对多于一种类型的蛋白激酶的不利抑制性质引起的副作用)、由于太高的特异性而缺乏功效、仅对某些疾病的功效、在施用过程中抗性的发生和/或相当的不希望的性质。

这导致了本发明的问题：特别是在了解多种增殖和其它蛋白激酶相关疾病以及对某些治疗抗性的发生，仍然需要提供新的化合物，其用作蛋白激酶抑制剂，并且因此用于治疗这些蛋白酪氨酸激酶-(例如丝氨酸/苏氨酸和/或优选蛋白酪氨酸激酶-(PTK-))相关疾病。所需的是新型药物有利的蛋白激酶、特别是PTK抑制化合物，特别是具有有利的性质，例如对有限的组或甚至单独的蛋白激酶的高亲和力和/或选择性、活性(其中已经发生对不同类型化合物的抗性)、对某些组的激酶的有用的亲和特性等。需要新型蛋白激酶抑制剂，其能满足提及的或其它问题。

发明概述

目前令人惊讶地发现很多蛋白激酶，其参与营养因子介导的信号转导和疾病现象，其涉及蛋白激酶活性，例如增殖(例如肿瘤)生长，蛋白酪氨酸激酶的特别的代表性实例是来自src激酶家族的激酶(特别是c-src激酶)、VEGF-受体激酶(例如KDR和Flt-1)、RET-受体激酶和/或Ephrin受体激酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相关激酶)、进一步的abl激酶(特别是v-abl或c-abl激酶)、b-raf(V599E)、EGF受体激酶或EGF家族的其它激酶(例如HER-1或c-erbB2激酶(HER-2))、Flt-3、Ick、fyn、c-erbB3激酶、c-erbB4激酶、PDGF-受体酪氨酸蛋白激酶家族成员(例如PDGF-受体激酶)、CSF-1受体激酶、Kit-受体激酶(c-Kit)、FGF-受体激酶(例如FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3、FGF-R4)、c-Raf、酪蛋白激酶(CK-1、CK-2、G-CK)、Pak、ALK、ZAP70、Jak1、Jak2、Axl、Cdk1、cdk4、cdk5、Met、FAK、Pyk2、Syk、Tie-2、胰岛素受体激酶(Ins-R)、胰岛素样生长因子受体激酶(IGF-1激酶)、和/或进一步的丝氨酸/苏氨酸激酶，例如蛋白激酶C(PK-C)、PK-B、EK-B或cdc激酶，例如CDK1，可以被本发明的3-氨基-吡唑化合物抑制，以及，例如组成性活化任何一种或多种这些激酶的突变形式(例如Bcr-Abl、RET/MEN2A、RET/MEN2B、RET/PTC1-9或b-raf(V599E))。所有这些和其它蛋白激酶在哺乳动物细胞(包括人细胞)的生长调节和转化中发挥作用。特别是可以发现对细胞Eph4B激酶具有很高的功效。

考虑到这些活性，本发明化合物可以例如用于治疗蛋白激酶调节响应的疾病，例如特别是与此类激酶的异常(未调节或失调或组成性的等)或过度活性相关的疾病，特别是提及的那些并且最特别是作为优选提及的那些。

发明详述

本发明涉及游离形式或盐形式的下式的3-氨基-吡唑-4-羧酸衍生物

其中

R₁是C_1-7烷基或者被C_1-7烷氧基或C_1-7烷基之一取代的苯基；

R₂是-NH-CO-苯基，其中苯基环被一个或两个选自卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代，或者

是-CO-NH-苯基，其中苯基环被一个或两个选自卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代；并且

R₃是C_1-7烷基或卤素。

本发明还涉及式I化合物或其可药用盐在治疗蛋白激酶调节响应的疾病中的用途，特别是在动物或优选人中，所述的疾病特别是对“发明概述”中提及的一种或多种蛋白酪氨酸激酶(PTK)，更特别的是一种或多种选自下列的PTK的抑制响应的疾病：src激酶家族(特别是c-src激酶)、VEGF-受体激酶(例如KDR和Flt-1)、RET-受体激酶或Ephrin受体激酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相关激酶)或者它们的突变(例如组成性活化的或其它局部或整体失调的)形式。

本发明还涉及式I化合物或其(优选可药用)盐在制备用于治疗所述疾病的药物制剂中的用途、包含式I化合物或其可药用盐以及至少一种可药用载体特别用于对抗所述疾病的药物制剂、用于治疗动物或人体(特别是对抗前一段落中提及的疾病)的式I化合物或其可药用盐、治疗动物或人体的方法(该方法包括给动物或人、特别是需要该治疗的患者施用有效治疗所述疾病的量的式I化合物或其可药用盐)以及制备式I化合物或其(优选可药用)盐的方法。

在式I中，独立地、共同地或以任何组合或亚-组合来优选以下含义。

除非另外说明，在本公开内容的上下文中，上下文所用的通用术语或符号优选具有以下含义。

术语“C_1-7烷基”定义为具有至多并且包括7个、特别是至多并且包括4个碳原子的基团，所述的基团是具有一个或多个分支的支链的或者是直链的。低级或C_1-7烷基例如是正戊基、正己基或正庚基或者优选C_1-4烷基，特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选甲基。

术语“C_1-7烷氧基”定义为具有至多并且包括7个、特别是至多并且包括4个碳原子的基团，例如甲氧基或乙氧基，优选甲氧基。

卤素优选氟、氯、溴或碘，最优选氟、氯或溴。

盐特别是式I化合物的可药用盐。它们可以在盐形成基团、例如碱性或酸性基团存在下形成，它们例如在pH范围为4至10的水性环境中可以以至少部分解离的形式存在，或者特别是以固体形式分离，或者它们可以在带电基团(例如季铵)存在下形成，在后者情况中，酰化的盐是与有机或无机酸(例如如下一个段落定义的)的阴离子形成的。

此类盐由具有碱性氮原子的式I化合物优选与有机或无机酸形成的，例如形成为酸加成盐，特别是可药用盐。适合的无机酸是例如氢卤酸(例如盐酸)、硫酸或磷酸。适合的有机酸是例如羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、氨基酸(例如谷氨酸或天冬氨酸)、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、苯甲酸、甲磺酸或乙磺酸、乙-1，2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1，5-萘-二磺酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸，或其它有机质子酸，例如抗坏血酸。

在负电荷基团(例如羧基或磺基)的存在下，还可以与碱形成盐，例如金属或铵盐，例如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾、镁或钙盐，或与氨或适合的有机胺的铵盐，例如叔单胺，例如三乙胺或三(2-羟基乙基)胺，或杂环碱，例如N-乙基-哌啶或N，N’-二甲基哌嗪。

当碱性基团和酸性疾病存在于同一个分子中时，式I化合物还可以形成内盐。

对于分离或纯化目的，也是可能应用不可药用盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途，仅应用可药用盐或游离化合物(其可应用于包含在药物制剂中)，并且因此优选这些。

考虑到游离形式的化合物与它们的盐(包括那些可以用作中间体的盐，例如在纯化或鉴定化合物或其盐中)形式之间的紧密关系，上下文中任何涉及“化合物”(还包括原料和“中间体”)特别是涉及式I化合物的被理解为还涉及其一种或多种盐或者游离化合物与其一种或多种盐的混合物，其每个旨在还包括任何溶剂化物、代谢前体(例如式I化合物的酯或酰胺)或任何一种或多种这些物质的盐，正如适当的和有利的并且如果没有另外明确提及。不同的晶体形式和溶剂化物是可获得的，然后也包括在内。

当复数形式用于化合物、盐、药物制剂、疾病、障碍等时，其旨在表示还包括单个化合物、盐、药物制剂、疾病、障碍等，当应用“一个”、

“一种”等时，指的是不定的或优选“一个”、“一种”等。

在某些情况中，本发明化合物在取代基中可以包含一个或多个手性中心或者显示其它不对称性(导致对映异构体)或者另外可以以多于一种立体异构体的形式存在，例如由于多于一个手性中心或多于一个其它类型的不对称性或由于能提供Z/E(或顺式-反式)异构体现象(非对映异构体)的环或双键。本发明包括两种或多种此类异构体的混合物，例如对映异构体的混合物，特别是外消旋体，以及优选纯化的异构体，特别是纯化的对映异构体或对映异构体富集的混合物。

式I化合物具有有价值的药理学性质并且用于治疗蛋白激酶、特别是蛋白酪氨酸激酶(特别是在以上“发明概述”中提及的一种或多种蛋白激酶，最特别是c-src激酶、VEGF-受体激酶(例如KDR和Flt-1)、RET-受体激酶和/或Ephrin受体激酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相关激酶))调节响应的疾病，其中调节优选表示抑制，并且响应表示疾病和/或其症状的进程被缓解、停止或者甚至反转成至多并且包括完全或至少暂时治愈。术语“治疗”特别是包括预防，包括例如在患者中的预防性治疗，其中说明他们将要或易于发生疾病的突变或变化已经发现，或者优选治疗性(包括但不限于缓解性、治愈性、症状缓解性、症状减轻性、疾病或症状抑制性、进程延缓性、激酶调节性和/或激酶抑制性)治疗所述疾病，特别是以下提及的任何一种或多种疾病。

本文所用的术语“治愈性”优选表示在治疗涉及(特别是失调的)受体酪氨酸激酶活性的进行性发作中的功效。

术语“预防性”优选表示预防涉及失调的受体酪氨酸激酶活性的疾病的发作或复发。

本文所用的术语“延缓进程”特别表示给处于所治疗疾病的前期或早期的患者施用活性化合物，其中患者，例如被诊断出相应疾病的预先形式，或者患者处于例如药物治疗的病症或者因意外引起的病症中，在这种情况中，发生相应疾病是可能的，或者例如转移会在没有治疗下预期发生。

动物优选是温血动物，更优选哺乳动物。人(其通常也归入通用术语“动物”)特别是患者或易于对以上或以下定义的疾病存在风险的人(例如由于某些突变或其它特征)。

当以下或以上提及术语“应用”或“用途”(作为动词或名词)(涉及式I化合物或其可药用盐的用途)时，其(如果上下文没有不同表示或不同建议)包括任何一个或多个本发明的以下实施方案，分别是(如果没有另外说明)：在治疗蛋白(特别是酪氨酸)激酶调节(特别是抑制)响应的疾病中的用途、在制备用于治疗蛋白激酶调节(特别是抑制)响应的疾病的药物组合物中的用途、在治疗蛋白激酶调节(特别是抑制)响应的疾病和/或增殖疾病中应用一种或多种式I化合物的方法、包含一种或多种式I化合物用于治疗所述的蛋白激酶调节(特别是抑制)响应的疾病的药物制剂以及在治疗所述的蛋白激酶调节(特别是抑制)响应的疾病中的一种或多种式I化合物，正如适当的并且有利的，如果没有另外说明。特别的是，所治疗的并且优选“应用”式I化合物的疾病选自以下提及的(特别是酪氨酸)蛋白激酶调节(特别是抑制)响应的(也表示“支持的”，不仅“依赖”，还包括疾病对调节、特别是抑制蛋白激酶响应的情况，即蛋白激酶活性支持或甚至引起疾病现象)疾病，特别是以下提及的增殖疾病。

当提及蛋白激酶时，其涉及任何类型的蛋白激酶，特别是以上“发明概述”中定义的那些之一，更特别是丝氨酸/苏氨酸和/或优选蛋白酪氨酸激酶，最优选一种或多种酪氨酸蛋白激酶，特别选自c-src激酶、VEGF-受体激酶(例如KDR和Flt-1)、RET-受体激酶和/或Ephrin受体激酶，例如EphB2激酶、EphB4激酶或相关激酶，包括任何一种或多种这些激酶的一种或多种改变的或突变的或等位形式(例如引起各自原癌基因转化为癌基因的那些，例如组成性活化的突变，例如Bcr-Abl)。特别的是包括异常高表达的、组成性活化的或正常的但是在患者的给定情况的其它调节机制中相对过度活化和/或突变的形式。

本发明化合物在调节蛋白激酶、特别是作为蛋白激酶抑制剂中的用途可以通过以下用于以上优选提及的蛋白激酶的试验体系来特别并且示例性证明：

在以下典型的示例性试验体系的描述中，下列缩略语具有以下含义：DMSO＝二甲亚砜；DTT＝二硫苏糖醇；EDTA＝乙二胺四乙酸盐；MOI＝多重感染；PMSF＝对-甲苯磺酰氟；Tris＝三(羟基甲基)氨基甲烷。如果没有另外说明，“抑制剂”是式I的试验化合物。

式I化合物作为抑制剂或Ephrin B4受体(EphB4)激酶的功效可以证明如下：

Bac-to-Bac^TM(Invitrogen Life Technologies，Basel，Switzerland)GST-融合表达载体的传代：将EphB-类的完整胞质编码区从分别来源于人胎盘或脑的cDNA文库通过PCR扩增。将重组的杆状病毒传代，其表达人EphB4受体的氨基酸区域566-987(SwissProt Database，Accession No.P54760)。将GST序列克隆至pFastBac1

载体(Invitrogen LifeTechnologies，Basel，Switzerland)中并且PCR扩增。将编码EphB4-受体域的cDNA在GST序列框架3’端分别克隆至该修饰的FastBac1载体中，以产生pBac-to-BacTM供体载体。将通过转化获得的单克隆接种并且过夜培养，用于小规模质粒制备。质粒DNA的限制酶分析显示几个克隆包含预期大小的插入片段。通过自动测序，插入片段和约50bp的侧翼载体序列在双链上得到验证。

病毒的制备：如果没有另外说明，根据GIBCO提供的方案制备用于每种激酶的病毒。简而言之，将包含激酶域的转移载体转染到DH10Bac细胞系(GIBCO)中并且涂到选择性琼脂板上。没有将融合序列插入到病毒基因组(通过细菌进行的)中的菌落是蓝色。挑选单个白色菌落，并且通过标准质粒纯化方法将病毒DNA(杆状病毒穿梭载体)从细菌中分离。然后根据方案应用Cellfectin试剂将Sf9细胞或Sf21细胞在25cm²烧瓶中用病毒DNA转染。

GST-标记激酶的纯化：将离心的细胞裂解液装入2mL谷胱甘肽-琼脂糖柱(Pharmacia)中并且用10mL的25mM Tris-HCl，pH 7.5、2mMEDTA、1mM DTT、200mM NaCl洗涤三次。然后，将GST-标记蛋白通过10份(每份1mL)25mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM还原型谷胱甘肽、100mM NaCl、1mM DTT、10％甘油洗脱，并且在-70℃下贮存。

蛋白激酶试验：蛋白激酶的活性是在抑制剂的存在或不存在下试验的，通过测量掺入到谷氨酸和酪氨酸聚合物(聚(Glu，Tyr))(作为底物)中的[γ³³P]ATP的³³P进行。纯化的GST-EphB(30ng)的激酶试验是在环境温度下、在包含20mM Tris·HCl，pH 7.5、10mM MgCl₂、3-50mM MnCl₂、0.01mM Na₃VO₄、1％DMSO、1mM DTT、3μg/mL聚(Glu，Tyr)4:1(Sigma；St.Louis，Mo.，USA)和2.0-3.0μM ATP(γ-[³³P]-ATP 0.1μCi)的终体积30μL中进行15-30分钟。通过加入20μL 125mM EDTA将试验终止。随后，将40μL反应混合物转移至预先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)上，用水冲洗，然后用0.5％H₃PO₄浸泡5分钟并且安装在切断真空源的真空装置上。点完所有样品后，连接真空并且将每孔用200μL 0.5％H₃PO₄冲洗。将膜移去并且在振荡器上用1.0％H₃PO₄洗涤4次，用乙醇洗涤1次。在环境温度下干燥后，将膜计数，安装在Packard TopCount96-孔框架中并且加入10μL/孔的Microscint^TM(Packard)。IC₅₀值是通过每种化合物在四种浓度(通常是0.01、0.1、1和10μM)下重复两次的抑制百分数的线性回归分析来计算的。蛋白激酶活性的一个单位定义为在37℃下每毫克蛋白每分钟由[γ³³P]ATP转移至底物蛋白的1nmol的³³P ATP。式I化合物显示EphB4抑制范围为0.005μM-10μM，优选IC₅₀值为0.05-10μM。

可选择的是，EphB4受体自磷酸化可以测量如下：EphB4受体自磷酸化的抑制可以用体外细胞试验来证实，例如将转染的A375人黑素瘤细胞(ATCC号：CRL-1619)(其稳定表达人EphB4(SwissProt AccNo P54760))接种在6-孔细胞培养板的完全培养基(具有10％胎牛血清＝FCS)中，并且在37℃和5％CO₂下培养，直至它们显示出90％融合。然后将试验化合物在培养基(没有FCS，具有0.1％牛血清白蛋白)中稀释并且加入至细胞中。(对照包含无试验化合物的培养基)。配体诱导的自磷酸化是通过加入1μg/mL可溶的ephrinB2-Fc(s-ephrinB2-Fc：R&D Biosystems，CatNr 496-EB)和0.1μM原钒酸盐来诱导的。在37℃下进一步培养20分钟后，将细胞用冰冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两次并且立即在200μL裂解缓冲液/孔中裂解。然后，将裂解液离心以除去细胞核，并且上清液的蛋白浓度是应用商购的蛋白试验(PIERCE)来确定的。然后，将裂解液立即应用或者如果需要，在-20℃下贮存。

夹心ELISA用于测量EphB4磷酸化：为了捕获磷酸化的EphB4蛋白，将100ng/孔的ephrinB2-Fc(s-ephrinB2-Fc：R&D Biosystems，CatNr496-EB)固定在MaxiSorb(Nunc)ELISA板中。然后，将板洗涤并且将剩余的游离蛋白结合位点用在含有吐温20

(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯，ICI/Uniquema)的磷酸盐缓冲液(PBST)中的3％TopBlock

(Juro，Cat.#TB232010)饱和。然后，将细胞裂解液(100μg蛋白/孔)在室温下在这些板中培养1小时。用PBS将孔洗涤三次后，加入偶联碱性磷酸酶的抗磷酸酪氨酸抗体(PY 20碱性磷酸盐结合的：ZYMED，Cat Nr03-7722)并且再培养1小时。将板再洗涤，然后证明抗磷酸酪氨酸抗体与捕获的磷酸化受体的结合，并且应用10mM D-硝基苯基磷酸盐(作为底物)进行定量并且在0.5-1小时后测量405nm处的OD。

阳性对照(用钒酸盐和s-ephrinB2-Fc刺激的)和阴性对照(没有刺激)的信号差异对应最大的EphB4磷酸化(＝100％)。试验物质的活性计算为最大EphB4磷酸化的抑制百分数，其中诱导一半最大抑制的物质的浓度定义为IC₅₀(用于50％抑制的抑制剂量)。对于式I化合物，可以发现IC₅₀值范围为0.005至10μM，优选0.005至5μM。

式I化合物还可以抑制其它酪氨酸蛋白激酶，例如特别是c-Src激酶，其与动物、特别是哺乳动物细胞，包括人细胞的生长调节和转化有关。适合的试验在Andrej auskas-Buchdunger等人，Cancer Res.52，5353-8(1992)中描述。应用该试验体系，式I化合物可以显示抑制c-Src的IC₅₀值范围为例如0.01至20μM，通常为0.01至10μM。

本发明化合物作为KDR蛋白-酪氨酸激酶活性抑制剂的活性可以证明如下：VEGF-诱导的受体自磷酸化的抑制可以在细胞中、例如转染的CHO细胞中证明，该细胞稳定表达人VEGF-R2受体(KDR)，并且将其接种在6-孔细胞培养板的完全培养基(具有10％胎牛血清＝FCS)中，并且在37℃、5％CO₂下培养，直至它们显示出约80％融合。然后，将试验化合物在培养基(没有FCS，具有0.1％牛血清白蛋白)中稀释并且加入至细胞中。对照包含无试验化合物的培养基。在37℃下培养2小时后，加入重组的VEGF；最终VEGF浓度是20ng/mL。在37℃下进一步培养5分钟后，将细胞用冰冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤两次并且立即在100μL裂解缓冲液/孔中裂解。然后，将裂解液离心以除去细胞核，并且上清液的蛋白浓度是应用商购的蛋白试验(BIORAD)来确定的。然后，将裂解液立即应用或者如果需要在-20℃下贮存。应用该方案，发现选择的式I化合物显示对KDR抑制的IC₅₀值优选比对c-Abl酪氨酸激酶高出至少1.5倍，更优选比对EphB4酪氨酸激酶高出大于2倍。在该试验体系中，对于式I化合物，发现IC₅₀值范围为0.01至20μM，更优选为0.01至10μM。

式I化合物还可以抑制其它蛋白激酶。

本发明化合物作为c-Abl蛋白酪氨酸激酶活性抑制剂的功效可以证明如下：

体外酶试验是在96孔板中进行的，如Geissler等人在Cancer Res.1992；52：4492-4498中描述的滤膜结合试验，进行如下修改。将c-Abl的His-标记激酶域克隆并且在杆状病毒/Sf9系统中表达，如Bhat等人在J.Biol.Chem.1997；272：16170-16175中描述的。将37kD的蛋白(c-Abl激酶)通过两步法纯化，经钴金属螯合柱后进行阴离子交换柱，产量为1-2mg/L的Sf9细胞(Bhat等人，引用的参考)。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色后判断c-Abl激酶的纯度>90％。该试验包含(总体积为30μL)：c-Abl激酶(50ng)、20mMTris·HCl，pH 7.5、10mM MgCl₂、10μM Na₃VO₄、1mM DTT和0.06μCi/试验[γ³³P]-ATP(5μM ATP)，应用30μg/mL聚-Ala，Glu，Lys，Tyr-6:2:5:1(Poly-AEKY，Sigma P1152)，在1％DMSO的存在下进行。通过加入10μL 250mM EDTA将反应终止并且将30μL反应混合物转移到预先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)上，用水冲洗，然后用0.5％H₃PO₄浸泡5分钟，并且安装在切断真空源的真空装置上。点完所有样品后，连接真空并且将每孔用200μL 0.5％H₃PO₄冲洗。将膜移去并且在振荡器上用0.5％H₃PO₄洗涤(4次)并且用乙醇洗涤1次。在环境温度下干燥后，将膜计数，安装在Packard TopCount96-孔框架中，并且加入10μL/孔的Microscint^TM(Packard)。应用该试验体系，式I化合物可以显示对c-Abl抑制的IC₅₀值的范围为例如0.02至10μM，通常为0.02至5μM。

另外，式I化合物还可用于抑制b-raf(V599E)。B-Raf-V599E的活性是在抑制剂的存在或不存在下通过测量[γ³³P]ATP掺入到(His)-IκB中的³³P而试验的。将试验化合物溶于DMSO(10mM)中并且在-20℃下贮存。在DMSO中新鲜制备系列稀释液并且进一步用纯水稀释以得到在3％DMSO中的3倍浓缩试验溶液。终体积(30μL)的试验包含10μL试验溶液(1％DMSO)、10μL试验混合物(20mM Tris-HCl，pH 7.5、3mM MnCl₂、3mM MgCl₂、1nM DTT、3μg/mL(His)-IκB.1％DMSO和3.5μM ATP[γ³³P]-ATP 0.1μCi)和10μL酶稀释液(600ng的GST-B-Raf-V599E)。在96-孔形式中的移液步骤按程序设计在MultiPROBE Iix、MultiPROBEIILx或HamiltonSTAR自动机上进行。试验如文献(参见C.Garcia-Echeverria等人，Cancer Cel..5，231-9(2004))中描述的那样进行，通过加入20μL 125mM EDTA来终止。通过滤膜结合的方法来捕获磷酸化的肽进行如下：将40μL反应混合物转移到预先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜上，用水冲洗，然后用0.5％H₃PO₄浸泡5分钟并且安装在切断真空源的真空装置上。点完所有样品后，连接真空并且将每孔用200μL 0.5％H₃PO₄冲洗。将游离膜移去并且在振荡器上用1.0％H₃PO₄洗涤4次，用乙醇洗涤1次。在环境温度下干燥后将膜计数，安装在PackardTopCount96-孔框架中并且加入10μL/孔的Microscint^TM。最后，将板密封并且在微板闪烁计数器(TopCount NXT，TopCount NXT HTS)中计数。在闪板方法的情况中，激酶反应首先在基于聚苯乙烯的塑料板中进行，60分钟后通过加入20μL125mM EDTA来终止。为了捕获(60分钟，室温)，将生物素化的底物转移到镍包被的闪板中。将试验板用PBS洗涤三次并且在室温下干燥。然后，将板密封并且在微板闪烁计数器(TopCount NXT，TopCount NXT HTS)中计数。IC₅₀值通过化合物在四个浓度(通常是0.01、0.1、1和10μM)下重复两次的抑制百分数的线性回归分析来计算或者作为8个单点IC₅₀，起始在10μM，随后按1:3稀释。对于b-raf抑制，式I化合物可以显示IC₅₀值的范围为0.0005μM至20μM，例如范围为0.001至10μM。

结果表明式I化合物的有利的亲和特性。

还有试验证明式I化合物在体内的抗肿瘤活性。例如，为了试验式I化合物在体内是否抑制血管发生，在小鼠的生长因子移植模型中试验了其对血管发生因子(例如VEGF、bFGF、S-1P.PDGF或IGF-1)诱导的血管发生响应的作用：在多孔特氟隆室(体积0.5mL)中装入包含肝素的(20单位/mL)的0.8％w/v琼脂，将或不将生长因子(2μg/mL人VEGF)皮下植入到C57/C6小鼠的背侧胁腹。将小鼠用试验化合物(例如5、10、25、50或100mg/kg，口服每天一次)或载体处理，在植入室的当天开始并且此后连续4天。在处理结束后，将小鼠处死，并且将室取出。将生长在室周围的血管化的组织小心取出并且称重，血含量是通过测量组织的血红蛋白含量来估算的(Drabkins方法；Sigma，Deisenhofen，Germany)。Tie-2蛋白水平(作为内皮标志物的测量)通过特异的ELISA确定以将血管发生响应定量。以前已经显示这些生长因子诱导生长在室周围的组织(组织学表征包含成纤维细胞和小血管)的重量、血含量和Tie-2蛋白水平呈剂量-依赖性增加，并且该响应是通过中和抗体来封闭的，例如特异性中和VEGF(参见Wood JM等人，Cancer Res.60(8)，2178-2189，(2000)；和Schlaeppi等人，J.CancerRes.Clin.Oncol.125，336-342，(1999))。对于该模型，在以上给定的浓度的式I化合物的情况中可以表现出抑制。

在本发明优选的理解中，蛋白激酶调节响应的疾病是对用所治疗的单个有利方法来调节(特别是抑制)蛋白(优选酪氨酸)激酶活性响应的障碍，特别是具有以上优选特征的疾病(其中可以应用式I化合物)，其是一种或多种增殖疾病(表示其取决于(特别是不适当的)蛋白激酶活性)，包括过度增殖病症，例如一种或多种白血病、增生、纤维变性(特别是肺，但是还可以是其它类型的纤维变性，例如肾纤维变性)、血管发生、银屑病、动脉粥样硬化和血管平滑肌增生(例如血管成形术后的狭窄或再狭窄)。另外，式I化合物可以用于治疗血栓形成和/或硬皮病。

优选的是式I化合物在治疗(包括预防)增殖障碍(特别是其对调节(特别是抑制)蛋白(优选酪氨酸)激酶(特别是本文优选提及的)活性响应)中的用途，所述的增殖障碍选自肿瘤或癌症疾病，特别是对抗优选良性或特别是恶性肿瘤或癌症疾病，更优选实体瘤，例如脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌(特别是胃肿瘤)、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(例如小或大细胞肺癌)、阴道癌、甲状腺癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤或胃肠癌，特别是结肠癌或结肠直肠腺瘤，或颈与头的肿瘤，例如头与颈的鳞状癌，包括瘤形成，特别是上皮特征的，例如在乳房癌的情况中；表皮过度增殖(非癌症)，特别是银屑病；前列腺增生；或白血病。

式I化合物或其用途使其可能引起肿瘤消退和/或预防肿瘤转移的形成和(微)转移的生长。

将式I化合物用于治疗涉及与几个或特别是单个蛋白(优选酪氨酸)激酶(特别是优选提及的那些)相关的免疫系统疾病也是可能的；另外，式I化合物还可以用于治疗中枢或外周神经系统疾病，所述的疾病涉及由至少一种蛋白(优选酪氨酸)激酶(特别是优选提及的那些蛋白酪氨酸激酶)引起的信号转导。

在慢性粒细胞白血病(CML)中，造血干细胞(HSC)中的相互平衡的染色体易位产生BCR-ABL杂交基因。后者编码致癌的Bcr-Abl融合蛋白。但是，ABL编码紧密调节的蛋白酪氨酸激酶，其在调节细胞增殖、粘附和凋亡中发挥重要作用，BCR-ABL融合基因编码组成性的活化的激酶，其转化HSC以产生显示失调的克隆的增殖、对骨髓间质粘附的能力降低以及对突变刺激的凋亡响应降低的表型，这使得其进行性地累积更多恶性转化。产生的粒细胞未能发育成成熟淋巴细胞并且被释放进入循环系统，导致成熟细胞的缺乏和感染易感性的增加。已经描述了Bcr-Abl(或相当的突变形式)的ATP-竞争性抑制剂阻止激酶活化促有丝分裂和抗凋亡途径(例如P-3激酶和STAT5)，导致BCR-ABL表型细胞死亡并且因此提供了对CML有效的治疗。因此，本发明应用的式I的3-氨基-吡唑化合物作为Bcr-Abl抑制剂特别适用于治疗与其过表达相关的疾病，特别是白血病，例如白血病，例如CML或ALL。

血管发生被认为是那些生长超过最大直径约1-2mm的肿瘤的绝对先决条件；达到这个极限，氧和营养素是可能通过扩散来提供给肿瘤细胞。因此，每种肿瘤(无论是原发的还是继发的)在其达到一定大小后其生长取决于血管发生。三个主要机制在对抗肿瘤的血管发生抑制剂的活性中发挥重要作用：1)抑制血管(特别是毛细管)生长进入无血管的休眠肿瘤，结果是由于在凋亡和增殖之间获得了平衡，没有净肿瘤生长；2)由于缺乏血流进出肿瘤而防止肿瘤细胞迁移；和3)抑制内皮细胞增殖，从而避免通过内皮细胞正常连接血管而施加在外周组织上的旁分泌生长刺激作用。

式I化合物，考虑到它们抑制KDR并且特别是Ephrin受体激酶以及可能抑制其它蛋白激酶并且因此调节血管发生的能力，其特别适合用于对抗与相应受体、优选酪氨酸激酶的不适当活性、特别是其过表达有关的疾病或障碍。在这些疾病中，以下是特别重要的：特别是例如局部缺血、视网膜病变(例如年龄相关的)、黄斑变性、银屑病、肥胖症、血管母细胞瘤、血管瘤、炎性疾病例如类风湿或风湿炎性疾病，特别是关节炎，例如类风湿性关节炎或其它慢性炎性障碍例如慢性哮喘、动脉或移植后动脉粥样硬化、子宫内膜异位症并且特别是肿瘤疾病，例如所谓的实体瘤，特别是胃肠道癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、脑癌、黑素瘤、卡波西肉瘤、头与颈的鳞状细胞癌、恶性胸膜间皮瘤(mesotherioma)、淋巴瘤或多发性骨髓瘤，和进一步的液体肿瘤，例如白血病。

式I化合物特别用于预防或治疗由持续血管发生触发的疾病，例如再狭窄，例如支架诱导的再狭窄；克隆病；霍奇金病；眼疾病，例如糖尿病性视网膜病变和新生血管性青光眼；肾疾病，例如肾小球肾炎；糖尿病肾病；炎性肠病；恶性肾硬化；血栓性微血管病综合征；(例如慢性)移植排斥反应和肾小球病；纤维变性疾病，例如肝硬化；肾小球膜细胞增殖疾病；神经组织损伤；以及用于抑制气囊导管治疗后血管再闭塞，用于血管修复或插入维持血管畅通的机械装置(例如支架)后，作为免疫抑制剂，作为无疤痕伤口愈合的辅助剂，以及用于治疗老年斑和接触性皮炎。

优选的是，本发明涉及式I化合物或其可药用盐在治疗本文提及的实体瘤和/或本文提及的液体肿瘤、例如白血病中的用途。

制备方法

式I化合物是应用类似于本领域基本上已知的用于其它化合物的方法来制备的，以便对于新的式I化合物，方法是新的类似的方法，优选通过在式IV或式V的原料与式VI的原料或其活性衍生物之间形成酰胺键

如果需要，将式I化合物转化为不同的式I化合物，将可获得的式I化合物的盐转化为游离化合物或不同的盐，将可获得的游离的式I化合物转化为其盐，和/或将可获得的式I化合物的异构体混合物分离为单个异构体。

与式VI的酸或其活性衍生物的缩合反应优选与活性酸衍生物(其可以以本身应用)，例如与对称或混合酸酐、活性酯或酰卤(例如酰氯)形式的活性酸衍生物，例如在叔氮碱(例如三-低级烷基胺或吡啶)的存在下进行，或者活性酸衍生物可以例如在原位形成活性酯的试剂的存在下通过缩合反应原位形成。该反应例如通过将原料溶于适合的溶剂例如卤代烃，例如二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮或者两种或多种此类溶剂的混合物中，并且通过加入适合的碱例如三乙胺、二异丙基乙基胺(DIEA)或N-甲基吗啉来进行，并且如果活性酸衍生物是原位形成的，原位形成活性酸衍生物的适合的偶联剂，例如二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCC/HOBT)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次磷酰氯(BOPCl)、O-(1，2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TPTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、(苯并三唑-1-基氧基)-三吡咯烷子基鏻-六氟磷酸盐(PyBOP)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑(EDC/HOBT或EDC/HOAt)或单独的HOAt，或与(1-氯-2-甲基-丙烯基)-二甲基胺一起。对于某些其它可能的偶联剂，参见例如Klauser；Bodansky，Synthesis 1972，453-463。优选将反应混合物在温度为约-20至50℃、特别是0℃至30℃、例如室温下搅拌。

任选的反应和转化

可以将式I化合物转化为不同的式I化合物。

可以将具有至少一个盐形成基团的式I化合物的盐以自身已知的方法制备。例如，具有酸性基团的式I化合物的盐可以通过将化合物用金属化合物(例如适合的有机羧酸的碱金属盐，例如2-乙基己酸的钠盐)、无机碱金属或碱土金属化合物(例如相应的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，例如氢氧化钠或氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾或者碳酸氢钠或碳酸氢钾)、相应的钙化合物或者氨或适合的有机胺处理而形成，优选应用化学计算量或仅少量过量的盐形成试剂。式I化合物的酸加成盐可以以常规方法、例如通过将式I化合物用酸或适合的离子交换试剂处理而获得。具有酸性和碱性盐形成基团(例如羧基和氨基)的式I化合物的内盐可以例如通过例如用弱碱将盐(例如酸加成盐)中和到等电点或者通过用离子交换剂处理而形成。可以将式I化合物的盐以常规方法转化为游离化合物、金属或铵盐，例如，通过用适合的酸和酸加成盐处理，例如，通过用适合的碱性试剂处理。在两种情况中，可以应用适合的离子交换剂。

通过适合的分离方法可以将立体异构体混合物(例如非对映异构体混合物)以本身已知的方法分离为它们相应的异构体。通过分级结晶、色谱法、溶剂分配和类似的方法可以将非对映异构体混合物分离为它们各自的非对映异构体。该分离可以在起始化合物之一的水平或在式I化合物本身中进行。对映异构体可以通过形成非对映异构体盐进行分离，例如通过与对映异构纯的手性酸形成盐或通过色谱法，例如通过HPLC，应用具有手性配体的色谱底物进行。

中间体和终产物可以根据标准方法处理和/或纯化，例如应用色谱方法、分配方法、(重)结晶等。

原料

原料或者是本领域已知的(它们中的某些甚至可以是可商购获得的)，或者它们可以根据本领域已知的方法制备。保护基(即使没有特别提及)可以在适当的时候引入和除去，以保护官能团，官能团的反应在相应的反应步骤中是不希望的。保护基和它们引入和除去的方法例如在提及的参考文献中描述。本领域技术人员将容易地决定是否以及哪种保护基是有用的或需要的。

除了式IV、V或VI那些之外，原料例如优选以下这些(除非另外说明，原料式中的变量如式I中定义的)：

式II的原料

其中R₄是卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基，n是1或2，并且Halo是卤素，例如氯、氟、碘或溴，优选氯。

式II’的原料

其中R₃是C_1-7烷基或卤素；以及

式III的原料

其中R₃是C_1-7烷基或卤素，R₄是卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基，并且n是1或2。

式III的原料可以例如通过在式II的原料与式II’的原料之间形成酰胺键而获得，例如在二氯甲烷中、在室温下应用三乙胺。

式IV的原料(其中R₃是C_1-7烷基或卤素，R₄是卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基，并且n是1或2)可以例如通过将相应的式III的原料例如用Raney-Nickel在甲醇中在室温下氢化而获得。

式V的原料(其中R₃是C_1-7烷基或卤素，R₄是卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基，并且n是1或2)可以例如以制备式IV的原料中描述的类似的方法应用相应的原料而获得。

式IV和V的原料具有以下通式

其中R₂和R₃如式I中定义的。

在式VI的原料中

R₁如式I中定义的。

通用处理条件

以下通常应用于上下文提及的所有处理，但是优选上下文特别提及的反应条件：

在任何反应中，当适当或需要时，即使没有特别提及，可以将保护基用于保护不需要参与给定反应的保护官能团，并且在适当或需要的阶段可以将它们引入和/或除去。因此，包括应用保护基的反应还尽可能包括在本申请中描述的没有特别提及保护和/或脱保护的反应的情况中。

在本公开的范围内，除非上下文另外说明，仅将容易除去的基团(其不是特别需要的式I终产物的组成)指定为“保护基”。功能团通过此类保护基的保护、保护基本身以及它们的除去在例如标准参考著作中描述，例如J.F.W.McOmie，“Protective Groups in Organic Chemistry(有机化学中的保护基)”，Plenum Press，London and New York 1973；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，第三版，Wiley，New York 1999；“The Peptides(肽)”；第3卷(编辑：E.Gross和J.Meienhofer)，Academic Press，London and New York1981；“Methoden der organischen Chemie”(Methods of OrganicChemistry(有机化学方法))，Houben Weyl，第4版，第15/I卷，GeorgThiemeVerlag，Stuttgart 1974；H.-D.Jakubke和H.Jeschkeit，

Peptide，Proteine”(Amino acids，Peptides，Proteins(氨基酸、肽、蛋白质))，Verlag Chemie，Weinheim，Deerfield Beach，and Basel1982；以及Jochen Lehmann，“Chemie der Kohlenhydrate：Monosaccharide und DeriVate”(Chemistry of Carbohydrates：Monosaccharides and Derivatives(碳水化合物化学：单糖及衍生物))，GeorgThieme Verlag，Stuttgart 1974。保护基的特性是它们可以例如通过溶剂解、还原、光解或可选择的是在生理条件下(例如通过酶裂解)容易地除去。

所有上述处理步骤可以在本身已知的反应条件下进行，优选特别提及的那些，不存在或通常存在溶剂或稀释剂，优选对所用的试剂是惰性的并且溶解它们的溶剂或稀释剂，不存在或存在催化剂、缩合剂或中和剂，例如离子交换剂，例如阳离子交换剂，例如以H⁺形式，这取决于在降低、正常或升高的温度下反应和/或反应物的性质，在例如温度范围为约-100℃至约190℃、优选约-80℃至约150℃、例如-80至-60℃、室温、-20至40℃或回流温度下，在大气压下或在升高或降低的压力的密闭容器中，和/或在惰性气氛下，例如在氩气或氮气气氛下。

溶剂(适合于任何特殊反应的那些溶剂)可以选自包括特别提及的那些，例如水、酯类(例如低级烷基-低级链烷酸酯，例如乙酸乙酯)、醚类(脂肪族醚类(例如乙醚)或环醚类(例如四氢呋喃或二噁烷))、液体芳香烃类(例如苯或甲苯)、醇类(例如甲醇、乙醇或者1-或2-丙醇)、腈类(例如乙腈)、卤代烃类(例如二氯甲烷或氯仿)、酰胺类(例如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺)、碱类(例如杂环氮碱，例如吡啶或N-甲基-吡咯烷-2-酮)、羧酸酐(例如低级链烷酸酐，例如乙酸酐)、环、直链或支链烃类(例如环己烷、己烷或异戊烷)或者这些的混合物，例如水溶液，除非在处理描述中另外说明。此类溶剂混合物还可以用于处理，例如通过色谱法或分配。

本发明还涉及那些处理形式，其中将在处理的任何阶段中作为中间体可获得的化合物用作原料并且进行剩下的处理步骤，或者其中原料是在反应条件下形式的或以衍生物形式(例如保护的形式或盐形式)应用，或者通过本发明处理可获得的化合物是在处理条件下产生的并且在原位进一步处理。在本发明的处理中，优选应用那些产生优选描述的式I化合物的原料。本发明还涉及新的中间体和/或原料。特别优选与实施例中提及的那些相同或相似的反应条件。

本发明优选的实施方案

在优选的实施方案中和在上下文更全面范围的实施方案中，以及在权利要求中，任何一个或多个或所有通用表达可以被上下文提供的相应的更特别的定义替代，从而获得更强大的本发明优选的实施方案。

本发明优选涉及游离形式或可药用盐形式的式I化合物，其中

-R₁是-CH₃或者被以下取代基C_1-7烷氧基或C_1-7烷基取代的苯基，苯基取代基优选是C_1-7烷氧基，优选C_1-4烷氧基；或者

-R₃是C_1-7烷基，优选C_1-4烷基；或者

-R₁是-CH₃或者被C_1-7烷氧基、优选C_1-4烷氧基取代的苯基，

-R₂是-NH-CO-苯基，其中苯基环被一个或两个选自氟、C_1-7烷氧基(优选C_1-4烷氧基)或三氟甲基的取代基取代，或

-CO-NH-苯基，其中苯基环被一个或两个选自C_1-7烷氧基(优选C_1-4烷氧基)或三氟甲基的取代基取代，并且

-R₃是C_1-7烷基，优选C_1-4烷基；或者

-R₁是-CH₃或被C_1-4烷氧基(优选甲氧基)取代的苯基，

-R₂是-NH-CO-苯基，其中苯基环被一个或两个选自氟、C_1-4烷氧基(优选甲氧基)或三氟甲基的取代基取代，或

-CO-NH-苯基，其中苯基环被一个或两个选自C_1-4烷氧基(优选甲氧基)或三氟甲基的取代基取代；并且

-R₃是C_1-4烷基，优选甲基。

在进一步的实施方案中，本发明涉及

-药物制剂，该药物制剂包含式I化合物或其可药用盐，以及至少一种可药用载体。

-式I化合物或其可药用盐，其用于诊断性或治疗性治疗动物或人体。

-式I化合物或其可药用盐在治疗蛋白激酶调节响应的疾病中的用途，或者在制备用于治疗蛋白激酶调节响应的疾病的药物制剂中的用途，例如其中蛋白激酶调节响应的疾病是一种或多种选自对抑制一种或多种蛋白酪氨酸激酶具有响应的疾病，所述的激酶选自c-src激酶、VEGF-受体激酶(例如KDR和Flt-1)、RET-受体激酶和/或Ephrin受体激酶(例如EphB2激酶、EphB4激酶或相关激酶)，例如其中所治疗的疾病是一种或多种选自以下的疾病：增殖疾病，例如白血病(特别是慢性粒细胞白血病(CML)或ALL)、增生、纤维变性(例如肝硬化)、血管发生、银屑病、动脉粥样硬化(特别是动脉或移植后动脉粥样硬化)、血管平滑肌增生(例如血管成形术后的狭窄或再狭窄)，肿瘤或癌症疾病，特别是良性或特别是恶性肿瘤或癌症疾病，更特别是实体瘤，例如脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤或胃肠癌、结肠直肠腺瘤，黑素瘤或颈与头的肿瘤(例如头与颈的鳞状癌)、肾小球膜细胞增殖疾病、恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤、瘤形成，特别是上皮特征的，例如在乳房癌的情况中，表皮过度增殖(非癌症)，特别是银屑病、前列腺增生；卡波西肉瘤、血栓形成、硬皮病；免疫系统疾病；中枢或外周神经系统疾病，其中至少一种蛋白(优选酪氨酸)激酶(特别是选自优选提及的那些蛋白酪氨酸激酶)参与信号转导；视网膜病变例如糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼或黄斑变性、肥胖症、血管母细胞瘤、血管瘤；糖尿病肾病；恶性肾硬化、炎性疾病例如类风湿或风湿炎性疾病，特别是关节炎，例如类风湿性关节炎、其它慢性炎性障碍例如慢性哮喘、子宫内膜异位症、克隆病、霍奇金病、肾小球肾炎、炎性肠病、血栓性微血管病综合征、移植排斥反应、肾小球病、神经组织损伤、伤口愈合、老年斑、接触性皮炎和再狭窄例如支架诱导的再狭窄。

-制备式I化合物的方法，该方法包括在式V’的原料与式VI的原料之间形成酰胺键，其中R₁、R₂和R₃如以上定义的，并且如果需要，将式I化合物转化为不同的式I化合物，将可获得的式I化合物的盐转化为游离化合物或不同的盐，将可获得的游离的式I化合物转化为其盐，和/或将可获得的式I化合物的异构体混合物分离为单个异构体。

药物组合物

本发明还涉及包含优选新的式I化合物的药物组合物、它们在治疗(在本发明更广的方面还包括预防)中的用途或治疗疾病或障碍的方法，其取决于不适当的蛋白(特别是酪氨酸)激酶活性，特别是以上提及的优选的障碍或疾病，本发明还涉及用于所述用途的化合物和药物制剂以及它们的制备，特别是用于所述用途。更通常的是，药物制剂在式I化合物的情况中是有用的。

本发明的药理学可接受的化合物可以存在于药物组合物中或用于例如制备药物组合物，所述的药物组合物包含有效量的式I化合物或其可药用盐作为活性成分，与一种或多种无机或有机、固体或液体、可药用载体(载体物质)一起或混合。

本发明还涉及药物组合物，其适合施用于温血动物，特别是人(或施用于衍生自温血动物，特别是人的细胞或细胞系，例如淋巴细胞)，用于治疗(在本发明更广的方面，还包括预防，例如预防对抗)对抑制蛋白质(特别是酪氨酸)激酶活性响应的疾病，该药物组合物包含一定量的式I化合物或其可药用盐(优选其对所述抑制是有效的)以及至少一种可药用载体。

本发明的药物组合物是用于肠内(例如鼻、直肠或口服)或非肠道(例如肌内或静脉内)施用于温血动物(特别是人)的那些，其包含有效剂量的药理学活性成分，单独或与有效量的可药用载体一起。活性成分的剂量取决于例如温血动物的种类、体重、年龄和个体情况、个体药代动力学数据、所治疗的疾病和施用方式。

本发明还涉及治疗疾病的方法，其对抑制取决于不适当的蛋白(特别是酪氨酸)激酶活性的疾病有响应，该方法包括特别是给温血动物(例如人)施用预防或特别是治疗有效量的式I化合物或其可药用盐，因为所提及的疾病之一需要此类治疗。

施用于温血动物(例如约70kg体重的人)的式I化合物或其可药用盐的剂量优选为约3mg至约10g、更优选约10mg至约1.5g、最优选约100mg至约1000mg/人/天，优选分为1至3个单剂量，其可以例如是相同大小。通常，儿童接受成人剂量的一半。

药物组合物包含约1％至约95％、优选约20％至约90％的活性成分。本发明的药物组合物可以是例如单位剂型，例如是安瓿、小瓶、栓剂、锭剂、片剂或胶囊剂形式。

本发明的药物组合物以本身已知的方法制备，例如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或配制处理。

优选应用活性成分的溶液和悬浮液，并且特别是等渗水溶液或悬浮液，在应用之前制备这些溶液或悬浮液是可能的，例如在冻干组合物的情况中，其包含活性成分，单独或与载体、例如甘露醇一起。药物组合物可以是无菌的和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且以本身已知的方法制备，例如通过常规的溶解或冻干方法。所述的溶液或悬浮液可以包含增加粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。

在油中的悬浮液包含作为油组分的常规用于注射目的的植物油、合成油或半合成油。同样可以特别提及的是液体脂肪酸酯，其包含作为酸组分的具有8至22、特别是12至22个碳原子的长链脂肪酸，例如月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸，或相应不饱和酸，例如油酸、反油酸、芥酸、顺芜酸或亚油酸，如果需要，加入抗氧化剂，例如维生素E、β-胡萝卜素或3，5-二-叔丁基-4-羟基甲苯。那些脂肪酸酯的醇组分具有最多6个碳原子，并且是单-或多-羟基，例如一-、二-或三-羟基醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇或者它们的异构体，但是特别是二元醇和甘油。因此，脂肪酸酯的以下实例被提及：油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、“Labrafil M 2375”(聚氧乙烯甘油三油酸酯，Gattefossé，Paris)、“Miglyol 812”(具有C8至C12链长的饱和脂肪酸的三甘油酯，Hüls AG，Germany)，但是特别是植物油，例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

注射或输注组合物以常规方法在无菌条件下制备；相同的条件还用于将组合物引入安瓿或小瓶并且密封容器。

用于口服施用的药物组合物可以通过以下方法获得：将活性成分与固体载体混合，如果需要，将产生的混合物制粒，如果希望或必需，在加入适合的赋形剂后，将混合物制成片剂、锭剂片芯或胶囊剂。将它们装入塑料载体中使得活性成分得以分散或以计算量释放出来，这也是可能的。

适合的载体特别是填充剂，例如糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制剂和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，例如应用例如玉米、小麦、大米或土豆淀粉的淀粉糊，明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，和/或，如果需要，崩解剂，例如以上提及的淀粉和/或羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。赋形剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸、滑石粉、硬脂酸或其盐，例如硬脂酸镁或钙，和/或聚乙二醇。将锭剂片芯用适合的、任选肠包衣，特别是应用浓缩的糖溶液，其可以包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛，或在适合的有机溶剂中的包衣溶液，或，用于制备肠包衣、适合的纤维素制剂溶液，例如乙基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯。胶囊剂是由明胶制成的干燥填充的胶囊剂和由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊剂。干燥填充的胶囊剂可以包含颗粒形式的活性成分，例如与以下物质一起：填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或助流剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)，并且如果需要，与稳定剂一起。在软胶囊剂中，优选将活性成分溶于或悬浮于适合的油性赋形剂、例如脂肪油、石蜡油或液体聚乙二醇中，也可能加入稳定剂和/或抗菌剂。可以将染料或色素加入至片剂或锭剂包衣或胶囊壳中，例如用于鉴别目的或用于说明活性成分的不同剂量。

式I化合物还可以用于有利地与其它生物学活性剂，优选与其它抗增殖剂组合。此类抗增殖剂包括但不限于芳香酶抑制剂；抗雌激素剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；诱导细胞分化进程的化合物；环加氧酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；抗肿瘤抗代谢剂；铂化合物；靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物和进一步的抗血管发生的化合物；靶向、降低或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物；促性激素释放素激动剂；抗雄激素剂；甲硫氨酸氨基肽酶抑制剂；二膦酸；生物响应改性剂；抗增殖抗体；类肝素酶抑制剂；Ras致癌亚型抑制剂；端粒末端转移酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂；在治疗恶性血液病中所用的药物；靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制剂；和替莫唑胺(TEMODAL

)。

本文所用的术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制雌激素产生的化合物，即分别将底物雄烯二酮和睾酮转化为雌酮和雌二醇。该术语包括但不限于甾体类，特别是阿他美坦、依西美坦和福美坦，并且特别是非甾体类，特别是氨鲁米特、罗谷亚胺(roglethimide)、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦可以例如以其上市的形式施用，例如商标为AROMASIN。福美坦可以例如以其上市的形式施用，例如商标为LENTARON。法倔唑可以例如以其上市的形式施用，例如商标为AFEMA。阿那曲唑可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ARIMIDEX。来曲唑可以例如以其上市的形式施用，例如商标为FEMARA或FEMAR。氨鲁米特可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ORIMETEN。包含化疗剂(其是芳香酶抑制剂)的本发明组合特别用于治疗激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

本文所用的术语“抗雌激素剂”涉及在雌激素受体水平拮抗雌激素作用的化合物。该术语包括但不限于他莫昔芬、氟维司群、雷洛昔芬和盐酸雷洛昔芬。他莫昔芬可以例如以其上市的形式施用，例如商标为NOLVADEX。盐酸雷洛昔芬可以例如以其上市的形式施用，例如商标为EVISTA。氟维司群可以如US-4,659,516中公开的那样配制或其可以例如以其上市的形式施用，例如商标为FASLODEX。包含化疗剂(其是抗雌激素剂)的本发明组合特别用于治疗雌激素受体阳性肿瘤，例如乳腺肿瘤。

本文所用的术语“抗雄激素剂”涉及能够抑制雄激素的生物学作用的任何物质，并且包括但不限于比卡鲁胺(CASODEX)，其可以例如如US-4,636,505中公开的那样配制。

本文所用的术语“促性激素释放素激动剂”包括但不限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林是在US-4,100,274中公开的，并且可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ZOLADEX。阿巴瑞克可以例如如US-5,843,901中公开的那样配制。

本文所用的术语“拓扑异构酶I抑制剂”包括但不限于托泊替康、吉马替康(gimatecan)、伊立替康、喜树碱及其类似物，9-硝基喜树碱和大分子喜树碱结合物PNU-166148(WO-99/17804中的化合物A1)。伊立替康可以例如以其上市的形式施用，例如商标为CAMPTOSAR。托泊替康可以例如以其上市的形式施用，例如商标为HYCAMTIN。

本文所用的术语“拓扑异构酶II抑制剂”包括但不限于蒽环类，例如多柔比星，例如包括脂质体形式，例如CAELYX、柔红霉素、表柔比星、伊达比星和奈莫柔比星，蒽醌类米托蒽醌和洛索蒽醌，以及鬼臼毒素类依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ETOPOPHOS。替尼泊苷可以例如以其上市的形式施用，例如商标为VM26-BRISTOL。多柔比星可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN。表柔比星可以例如以其上市的形式施用，例如商标为FARMORUBICIN。伊达比星可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ZAVEDOS。米托蒽醌可以例如以其上市的形式施用，例如商标为NOVANTRON。

术语“微管活性剂”涉及微管稳定剂、微管去稳定剂和微管聚合抑制剂，包括但不限于紫杉烷类，例如紫杉酚和多西他赛，长春花生物碱类，例如长春碱，特别是硫酸长春碱，长春新碱，特别是硫酸长春新碱，以及长春瑞滨、discodermolides、秋水仙碱和埃博霉素(epothilones)及其衍生物，例如埃博霉素B或其衍生物。紫杉醇可以例如以其上市的形式施用，例如商标为TAXOL。多西他赛可以例如以其上市的形式施用，例如商标为TAXOTERE。硫酸长春碱可以例如以其上市的形式施用，例如商标为VINBLASTIN R.P.。硫酸长春新碱可以例如以其上市的形式施用，例如商标为FARMISTIN。Discodermolide可以例如如US-5,010,099中公开的那样获得。还包括埃博霉素衍生物，其是在WO-98/10121、US-6,194,181、WO-98/25929、WO-98/08849、WO-99/43653、WO-98/22461和WO-00/31247中公开的。特别优选埃博霉素A和/或B。

本文所用的术语“烷化剂”包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲(BCNU或Gliadel)。环磷酰胺可以例如以其上市的形式施用，例如商标为CYCLOSTIN。异环磷酰胺可以例如以其上市的形式施用，例如商标为HOLOXAN。

术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”涉及抑制组蛋白脱乙酰基酶并且具有抗增殖活性的化合物。这些化合物包括WO-02/22577中公开的化合物，特别是N-羟基-3-[4-[[(2-羟基乙基)[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺、N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可药用盐。其进一步特别包括辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。

术语“抗肿瘤抗代谢剂”包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)；卡培他滨；吉西他滨；DNA脱甲基化基，例如5-氮杂胞苷和地西他滨；甲氨蝶呤；依达曲沙；以及叶酸拮抗剂，例如培美曲塞。卡培他滨可以例如以其上市的形式施用，例如商标为XELODA。吉西他滨可以例如以其上市的形式施用，例如商标为GEMZAR。还包括单克隆抗体曲妥珠单抗，其可以例如以其上市的形式施用，例如商标为HERCEPTIN。

本文所用的术语“铂化合物”包括但不限于卡铂、顺铂(cisplatin)、顺铂(cisplatinum)和奥沙利铂。卡铂可以例如以其上市的形式施用，例如商标为CARBOPLAT。奥沙利铂可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ELOXATIN。

本文所用的术语“靶向/降低蛋白或脂质激酶活性的化合物和进一步的抗血管发生的化合物”包括但不限于：蛋白酪氨酸激酶和/或丝氨酸和/或苏氨酸激酶抑制剂或脂质激酶抑制剂，例如

a)靶向、降低或抑制血小板衍生生长因子受体(PDGFR)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，特别是抑制PDGF受体的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼、SU101、SU6668和GFB-111；

b)靶向、降低或抑制成纤维细胞生长因子受体(FGFR)活性的化合物；

c)靶向、降低或抑制胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)活性的化合物，特别是抑制IGF-IR的化合物，例如WO-02/092599中公开的那些化合物；

d)靶向、降低或抑制Trk受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

e)靶向、降低或抑制Axl受体酪氨酸激酶家族活性的化合物；

f)靶向、降低或抑制c-Met受体活性的化合物；

g)靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶(PDGFR家族的部分)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Kit受体酪氨酸激酶家族活性的化合物，特别是抑制c-Kit受体的化合物，例如伊马替尼；

h)靶向、降低或抑制c-Abl家族成员和它们的基因融合产物(例如BCR-Abl激酶)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制c-Abl家族成员和它们的基因融合产物活性的化合物，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如伊马替尼、PD180970、AG957、NSC680410或ParkeDavis的PD173955；

i)靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸激酶的Raf家族成员、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK、Ras/MAPK和PI(3)激酶家族或PI(3)-激酶-相关激酶家族成员和/或细胞周期蛋白依赖性激酶家族(CDK)成员活性的化合物，并且特别是US-5,093,330中公开的那些星孢素衍生物，例如米哚妥林；进一步的化合物的实例包括例如UCN-01、沙芬戈、BAY43-9006、苔藓抑素1、哌立福辛、伊莫福新、RO 318220和RO 320432、GO 6976、Isis 3521、LY333531/LY379196、异喹啉化合物(例如WO-00/09495中公开的那些)、FTIs、PD184352或QAN697(P13K抑制剂)；

j)靶向、降低或抑制蛋白酪氨酸激酶活性的化合物，例如甲磺酸伊马替尼(GLIVEC/GLEEVEC)或酪氨酸磷酸化抑制剂。酪氨酸磷酸化抑制剂优选是低分子量(Mr<1500)的化合物或其可药用盐，特别是选自以下的化合物：亚苄基丙二腈(benzylidenemalonitrile)类或S-芳基苯丙二腈(S-arylbenzenemalonirile)或双底物喹啉类化合物，更特别是选自以下的任何化合物：Tyrphostin A23/RG-50810、AG 99、Tyrphostin AG 213、Tyrphostin AG 1748、Tyrphostin AG 490、Tyrphostin B44、TyrphostinB44(+)对映异构体、Tyrphostin AG 555、AG 494、Tyrphostin AG 556、AG957和adaphostin(4-{[(2，5-二羟基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金刚烷酯，NSC 680410，adaphostin)；以及

k)靶向、降低或抑制受体酪氨酸激酶的表皮生长因子家族(同-或异二聚体的EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)活性的化合物，例如靶向、降低或抑制表皮生长因子受体家族活性的化合物特别是抑制EGF受体酪氨酸激酶家族成员(例如EGF受体、ErbB2、ErbB3和ErbB4)或结合EGF或EGF相关配体的化合物、蛋白质或抗体，并且特别是WO-97/02266(例如实施例39的化合物)中或EP-0 564 409、WO-99/03854、EP-0 520 722、EP-0566 226、EP-0 787 722、EP-0 837 063、US-5,747,498、WO-98/10767、WO-97/30034、WO-97/49688、WO-97/38983并且特别是WO-96/30347(例如称为CP 358774的化合物)、WO-96/33980(例如化合物ZD1839)和WO-95/03283(例如化合物ZM105180)中通常并且特别地公开的那些化合物、蛋白质或单克隆抗体；例如曲妥珠单抗(例如HerpetinR)、西妥昔单抗、易瑞沙、厄洛替尼(Tarceva^TM)、CI-1033、EKB-569、GW-2016、E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3或E7.6.3以及WO-03/013541中公开的7H-吡咯并-[2，3-d]嘧啶衍生物。

进一步的抗血管发生的化合物包括具有另外机制的化合物，对于它们的活性，例如与蛋白或脂质激酶抑制无关，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。

靶向、降低或抑制蛋白或脂质磷酸酶活性的化合物是例如磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制剂，例如冈田酸或其衍生物。

诱导细胞分化进程的化合物是例如维生素A酸、α-、γ-或δ-生育酚或α-、γ-或δ-生育三烯酚(tocotrienol)。

本文所用的术语“环加氧酶抑制剂”包括但不限于例如Cox-2抑制剂、5-烷基取代的2-芳基氨基苯基乙酸和衍生物，例如塞来昔布(CELEBREX)、罗非昔布(VIOXX)、依托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯基乙酸，例如5-甲基-2-(2’-氯-6’-氟苯胺基)苯基乙酸，芦米考昔。

术语“mTOR抑制剂”涉及抑制雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)并且具有抗增殖活性的化合物，例如西罗莫司(Rapamune

)、依维莫司(Certican^TM)、CCI-779和ABT578。

本文所用的术语“二膦酸”包括但不限于依替膦酸(etridonic acid)、氯膦酸、替鲁膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、利塞膦酸和唑来膦酸。“依替膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为DIDRONEL。“氯膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为BONEFOS。“替鲁膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为SKELID。“帕米膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为AREDIA^TM。“阿仑膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为FOSAMAX。“伊班膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为BONDRANAT。“利塞膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ACTONEL。“唑来膦酸”可以例如以其上市的形式施用，例如商标为ZOMETA。

本文所用的术语“类肝素酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制硫酸肝素降解的化合物。该术语包括但不限于PI-88。

本文所用的术语“生物响应改性剂”是指淋巴因子或干扰素，例如干扰素γ。

本文所用的术语“Ras致癌亚型抑制剂”，例如H-Ras、K-Ras或N-Ras，是指靶向、降低或抑制Ras致癌活性的化合物，例如“法尼基转移酶抑制剂”，例如L-744832、DK8G557或R115777(Zarnestra)。

本文所用的术语“端粒末端转移酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制端粒末端转移酶活性的化合物，特别是抑制端粒末端转移酶受体的化合物，例如telomestatin。

本文所用的术语“甲硫氨酸氨基肽酶抑制剂”是指靶向、降低或抑制甲硫氨酸氨基肽酶活性的化合物，例如bengamide或其衍生物。

本文所用的术语“蛋白酶体抑制剂”是指靶向、降低或抑制蛋白酶体活性的化合物，例如PS-341或MLN341。

本文所用的术语“基质金属蛋白酶抑制剂”或(“MMP抑制剂”)包括但不限于胶原素拟肽(peptidomimetic)和非素拟肽抑制剂、四环素衍生物，例如异羟肟酸盐素拟肽抑制剂巴马司他及其口服生物可利用的类似物，马立马司他(BB-2516)、普啉司他(AG3340)、metastat(NSC 683551)、BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211、MMI270B或AAJ996。

本文所用的术语“在治疗恶性血液病中所用的药物”包括但不限于FMS样酪氨酸激酶抑制剂，例如靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；干扰素；1-b-D-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)和bisulfan；以及ALK抑制剂，例如靶向、降低或抑制退行发育淋巴瘤激酶的化合物。

“靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物”特别是抑制Flt-3的化合物、蛋白质或抗体，例如PKC412、米哚妥林、星孢素衍生物、SU11248和MLN518。

本文所用的术语“HSP90抑制剂”包括但不限于靶向、降低或抑制HSP90的内腺苷三磷酸酶活性的化合物；通过泛素蛋白酶体途径降解、靶向、降低或抑制HSP患者蛋白质的化合物。靶向、降低或抑制HSP90的内腺苷三磷酸酶活性的化合物特别是抑制HSP90的腺苷三磷酸酶活性的化合物、蛋白质或抗体，例如17-烯丙基氨基，17-脱甲氧基格尔德霉素(17AAG)(格尔德霉素衍生物)；其它格尔德霉素相关化合物；根赤壳菌素和HDAC抑制剂。

本文所用的术语“抗增殖抗体”包括但不限于曲妥珠单抗(Herceptin^TM)、rastuzumab-DM1、贝伐珠单抗(Avastin^TM)、利妥昔单抗(Rituxan

)、PRO64553(抗-CD40)和2C4抗体。“抗体”表示例如完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体形成的多特异性抗体以及抗体片段，只要它们显示预期的生物学活性。

对于治疗急性粒细胞白血病(AML)，式I化合物可以与标准白血病疗法组合应用，特别是与用于治疗AML的疗法组合应用。特别的是，式I化合物可以与例如法尼基转移酶抑制剂和/或用于治疗AML的其它药物(例如柔红霉素、多柔比星、Ara-C、VP-16、替尼泊苷、米托蒽醌、伊达比星、碳铂和PKC412)组合施用。

通过代号、通用或商品名称鉴定的活性剂的结构可以从现行版本的标准汇编“The Merck Index(默克索引)”或从数据库例如PatentsInternational(例如IMS World Publications)中获得。

上述化合物(其可以与式I化合物组合应用)可以如本领域描述的那样(例如以上引用的文献1制备和施用。

式I化合物还可以有利地与已知的治疗方法、例如施用激素或特别是辐射组合应用。

式I化合物可以特别用作放射增敏剂，特别是用于治疗对放射疗法不敏感的肿瘤。

对于“组合”，其表示或是在一个剂量单位形式中的固定组合，或是用于组合施用的部分的药盒，其中式I化合物和组合伴侣可以是在相同时间单独施用或者在时间间隔内分开施用，其特别使组合伴侣显示联合、例如协同作用，或其任何组合。

以下实施例说明本发明，而不限制本发明的范围。

实施例

温度以摄氏度测量。除非另外说明，反应在室温(RT)下进行。

TLC中的R_f值表示每种物质迁移的距离与洗脱液前沿迁移的距离的比值。TLC的R_f值是在5×10cm的TLC板(硅胶F₂₅₄，Merck，Darmstadt，Germany)上测量的；实施例中的溶剂系统表示如下：

^＊10％甲醇/90％二氯甲烷

^＊＊5％甲醇/95％二氯甲烷

如果没有另外说明，分析HPLC条件如下：

色谱柱：Column Engineering，Inc.，Matrix，3μm C18 150×4.6mm(Lot#205)，通过215和254nm处的紫外吸收检测。柱温是35℃并且保留时间(t_R)以分钟给出。流速：1mL/分钟。

梯度：水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)＝98/2，达1分钟，在10分钟内至100％乙腈(0.1％TFA)。在100％保持2分钟(总运行时间：13分钟)。

缩略语：

HPLC          高效液相色谱法

Isolute       

HM-N by International Solvent Technology

min          分钟

mL           毫升

MS-ES        电喷雾质谱法

R_f           TLC的前沿比

RT           室温

TFA          三氟乙酸

TLC       薄层色谱法

t_R        保留时间

UV        紫外

原料

合成苯胺结构单元的通用方法(用N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基- 苯甲酰胺的结构式和离析物来说明)：

左上表示的化合物N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺是通过将相应的硝基化合物(N-(4-甲基-3-硝基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺)(A)与Raney-Nickel在甲醇中、在室温下氢化而获得的。中间体(A)是通过将4-甲基-3-硝基-苯基胺(B)与3-三氟甲基-苯甲酰氯(C)在二氯甲烷中、在室温下应用三乙胺反应而获得的。中间体(A)获得很好的产率。类似的并且不同的苯胺已经描述过(例如CAS no.30069-31-9)。对于偶联，优选应用相应的酰氯。

反向的3-氨基-苯甲酰胺衍生物3-氨基-4-甲基-N-(3-三氟甲基-苯基)-苯甲酰胺和3-氨基-N-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺是根据类似的方法，应用相应的可商购获得的原料合成的。

实施例1：5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟 甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺

将5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸(100mg，0.43mmol)、TPTU(140mg，0.47mmol)和DIEA(184mL，1.07mmol)在室温下搅拌直至完全形成中间体活化的酯。然后，加入N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(126mg，0.43mmol)，并且将混合物加热至90℃达3小时，通过加入水猝灭，并且应用乙酸乙酯萃取。将产物通过自动柱色谱法纯化，并且在高真空泵下干燥，产生标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝10.57分钟；MS-ES：(M+H)+＝510；TLC^＊：R_f＝0.62。

原料制备如下：

步骤1.1：5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸

将5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺(2.0g，8.6mmol)在30mL8M氢氧化钠溶液和20mL乙醇中加热至回流达18小时。应用6MHCl溶液将反应酸化至pH6，并且将形成的沉淀通过过滤分离并且在真空泵下干燥，得到标题化合物。HPLC：t_R＝7.29分钟；MS-ES：(M+H)+＝234；TLC^＊：R_f＝0.33。

步骤1.2：5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酰胺

将5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-腈(18.3g，69.8mmol)缓慢加入至93mL浓硫酸(1680mmol)中，将温度保持在10和15℃之间。完全加入之后，将反应混合物搅拌1小时。然后，将混合物倾倒在冰/水上，并且将pH调至pH 8。将形成的沉淀通过过滤分离并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物。HPLC：t_R＝6.92分钟；MS-ES：(M+H)+＝233；TLC^＊＊：R_f＝0.27。

步骤1.3：5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-腈

在4-甲氧基-苯基肼盐酸盐(20g，89.5mmol)(Fluka)的乙醇悬浮液中滴加入三乙胺(13.1mL，94mmol)。在该溶液中分小批加入乙氧基亚甲基丙二腈(11g，89.5mmol)(Aldrich)，因为该反应是放热的。将产物沉淀通过过滤分离，用醚洗涤并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物。HPLC：t_R＝6.07分钟；MS-ES：(M+H)+＝215；TLC^＊＊：R_f＝0.52。

实施例2：5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟 甲基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺

应用实施例1中描述的相同方法，除了应用3-氨基-4-甲基-N-(3-三氟甲基-苯基)-苯甲酰胺替代N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。产物通过自动柱色谱法分离并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝10.65分钟；MS-ES：(M+H)+＝510；TLC^＊：R_f＝0.63。

实施例3：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲 酰基氨基)-苯基]-酰胺

将5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸(80mg，0.57mmol)、EDC-HCl(111mg，0.57mmol；Fluka)和HOBt(77mg，0.57mmol；Fluka)在2mL干燥的DMF中搅拌。1小时后，没有原料剩余，并且加入N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(167mg，0.57mmol)。将反应在90℃下搅拌16小时，通过加入水猝灭，并且应用乙酸乙酯萃取。产物通过自动柱色谱法纯化，并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝9.22分钟；MS-ES+：(M+H)+＝418；TLC^＊：R_f＝0.38。

原料制备如下：

步骤3.1：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸

将5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(16.4g，97mmol)在97mL2M氢氧化钠溶液和100mL乙醇中加热至回流。完全皂化后，将混合物用6MHCl溶液酸化至pH5，并且将形成的沉淀通过过滤分离。将产物在高真空泵下干燥并且将标题化合物分离，为白色固体。HPLC：t_R＝4.65分钟；MS-ES+：(M+H)+＝142；TLC^＊：R_f＝0.24。

步骤3.2：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯

将甲基肼(7.6mL，0.14mol；Aldrich)用25mL乙醇稀释。加入三乙胺(20mL，0.14mol)并且将混合物冷却至0℃。分小批加入2-氰基-3-乙氧基-丙烯酸乙酯(24.02g，0.14mol；Fluka)，并且将混合物在室温下搅拌18小时。将乙醇减压除去，并且将获得的油状物结晶。将产物悬浮于乙醚中并且通过过滤分离。获得标题化合物，为淡黄色固体。HPLC：t_R＝6.87分钟；MS-ES+：(M+H)+＝170。

实施例4：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯基 氨基甲酰基)-苯基]-酰胺

应用实施例3中描述的相同方法，除了应用3-氨基-4-甲基-N-(3-三氟甲基-苯基)-苯甲酰胺替代N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。将产物通过自动柱色谱法分离，并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝9.54分钟；MS-ES：(M+H)+＝418；TLC^＊：R_f＝0.33。

实施例5：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯 甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺

应用实施例3中描述的相同方法，除了应用N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-4-甲氧基-3-三氟甲基-苯甲酰胺替代N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。将产物通过自动柱色谱法分离，并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝9.21分钟；MS-ES：(M+H)+＝448；TLC^＊：R_f＝0.34。

实施例6：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-氟-3-三氟甲基-苯甲酰 基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺

应用实施例3中描述的相同方法，除了应用N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-4-氟-3-三氟甲基-苯甲酰胺替代N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。将产物通过自动柱色谱法分离，并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝9.45分钟；MS-ES：(M+H)+＝436；TLC^＊：R_f＝0.30。

实施例7：5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯 基氨基甲酰基)-2-甲基-苯基]-酰胺

应用实施例3中描述的相同方法，除了应用3-氨基-N-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯基)-4-甲基-苯甲酰胺替代N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。将产物通过自动柱色谱法分离，并且在高真空泵下干燥，得到标题化合物，为白色固体。HPLC：t_R＝9.30分钟；MS-ES：(M+H)+＝448；TLC^＊：R_f＝0.32。

实施例8：软胶囊剂

如下制备5000粒软明胶胶囊剂，每粒包含作为活性成分的0.05g式I化合物：

组分：

活性成分               250g

Lauroglycol            2升

制备方法：将粉末状的活性成分悬浮于Lauroglykol^＊(丙二醇月桂酸酯，Gattefossé S.A.，Saint Priest，France)中，并且在湿的粉磨机中研磨，以产生约1至3μm的粒径。然后，应用胶囊填充机将每份0.419g的混合物装入软明胶胶囊中。

实施例9：片剂

按照标准方法制备片剂，每片包含作为活性成分的100mg式I化合物：

组分

活性成分               100mg

结晶乳糖               240mg

Avicel                 80mg

PVPPXL                 20mg

Aerosil                2mg

硬脂酸镁               5mg

             ----------------------

                       447mg

制备：将活性成分与载体物质混合，并且通过压片机(Korsch EKO，冲模直径10mm)压制。

Avicel

是微晶纤维素(FMC，Philadelphia，USA)。PVPPXL是交联聚乙烯聚吡咯烷酮(BASF，Germany)。

是二氧化硅(Degussa，Germany)。

实施例10：EDhB4激酶活性的抑制

应用上述的试验体系，试验实施例1至7的化合物抑制EphB4激酶的能力。发现特别是在概述中给出的范围内的IC₅₀值(μmol/L)。

Claims (12)

1.游离形式或盐形式的下式化合物

其中

R₁是C_1-7烷基或者被C_1-7烷氧基或C_1-7烷基之一取代的苯基；

R₂是-NH-CO-苯基，其中苯基环被一个或两个选自卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代，或者

是-CO-NH-苯基，其中苯基环被一个或两个选自卤素、C_1-7烷氧基或三氟甲基的取代基取代；并且

R₃是C_1-7烷基或卤素。

2.权利要求1的式I化合物，其中

R₁是C_1-7烷基或者被C_1-7烷氧基取代的苯基；并且

R₃是C_1-7烷基。

3.权利要求1或权利要求2的式I化合物，其中

R₁是-CH₃或者被甲氧基取代的苯基；

R₂是-NH-CO-苯基，其中苯基环被一个或两个选自氟、甲氧基或三氟甲基的取代基取代，或者

是-CO-NH-苯基，其中苯基环被一个或两个选自甲氧基或三氟甲基的取代基取代；并且

R₃是-CH₃。

4.权利要求1至3中任意一项的游离形式或可药用盐形式的式I化合物，其选自以下化合物，包括

5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺，

5-氨基-1-(4-甲氧基-苯基)-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺，

5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺，

5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯基氨基甲酰基)-苯基]-酰胺，

5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺，

5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-氟-3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-2-甲基-苯基]-酰胺和

5-氨基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酸[5-(4-甲氧基-3-三氟甲基-苯基氨基甲酰基)-2-甲基-苯基]-酰胺。

5.药物组合物，该药物组合物包含权利要求1中定义的作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及可药用载体或稀释剂。

6.权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物，其用作药物。

7.权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物，其用于治疗或预防蛋白激酶调节响应的病症、疾病或障碍。

8.权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物作为药物在治疗或预防蛋白激酶调节响应的病症、疾病或障碍中的用途。

9.权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物在制备用于治疗或预防蛋白激酶调节响应的病症、疾病或障碍的药物中的用途。

10.在需要此类治疗或预防的个体中治疗或预防蛋白激酶调节响应的病症、疾病或障碍的方法，该方法包括给此类个体施用治疗有效量的权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物。

11.组合，该组合包含治疗有效量的权利要求1中定义的游离形式或可药用盐形式的式I化合物和第二种药物，用于同时或依次施用。

12.制备权利要求1中定义的游离形式或盐形式的式I化合物的方法，该方法包括以下步骤

在游离形式或盐形式的式(V’)的原料与游离形式或盐形式的式(VI)的原料或其活性衍生物之间形成酰胺键

在式(V’)中，R₂和R₃如式I中定义的，

在式(VI)中，R₁如式I中定义的，

随后任选将产生的化合物还原、氧化或其它官能化，裂解任选存在的任何保护基，将可获得的式I化合物转化为不同的式I化合物，将可获得的式I化合物的盐转化为游离化合物或不同的盐，将可获得的式I的游离化合物转化为其盐，和/或将可获得的式I化合物的异构体混合物分离为单个异构体，

并且回收如此可获得的游离形式或盐形式的式I化合物。