CN101500559B - 用于认知恢复和运动恢复的磷酸二酯酶4抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了改善动物与中枢神经系统(CNS)疾病和病症相关的认知和运动缺陷的方法。该方法通常包括给予所述动物磷酸二酯酶4抑制剂和任选地在足以改善表现的条件下训练所述动物。

Description

用于认知恢复和运动恢复的磷酸二酯酶4抑制剂

背景技术

据估计，有4-5百万的美国人(约2％老年人和15％的超过65岁的老年人)具有一定形式和程度的认知缺陷。出现认知缺陷(认知功能异常或者丧失，所述认知功能是获取、保留并使用知识的过程)通常与中枢神经系统(CNS)疾病或病症有关，所述中枢神经疾病或病症包括与年龄有关的记忆损害、精神错乱(有时称为急性混乱状态)、痴呆(有时分为阿尔茨海默病型痴呆或者非阿尔茨海默病型痴呆)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病(舞蹈病)、智力迟钝、脑血管疾病(如，中风、缺血)、情感疾病(如，抑郁症)、精神疾病(如，精神分裂症、孤独症(卡纳综合征)、神经疾病(如，焦虑、强迫性障碍)、注意力缺乏障碍(ADD)、硬膜下血肿、常压脑积水、脑肿瘤、头或脑外伤。

认知功能异常通常表现为一种或多种认知缺陷，这包括记忆缺陷(学习新信息的能力或者回忆以前学过的信息的能力受损)、失语症(语言/言语障碍)、运用不能(尽管运动功能完整无缺但是进行运动活动的能力受损)、执行功能(即，计划、组织、排序、提炼)障碍。

认知功能异常显著地妨碍了社交和/或工作，这妨碍了个体进行日常生活的活动，并大大地影响了个体的自主性以及生活的质量。

通常采用认知训练方案以恢复患有一定形式和程度的认知功能异常的个体的认知功能。例如，通常采用认知训练方案进行中风恢复和与年龄相关的记忆丧失的恢复。由于在个体中要获得特定方面认知特性(能力或者功能)的改善或提高，必须进行多期训练，因此，认知训练方案常常是非常昂贵并费时的。

人脑的损伤经常导致运动和认知的损害。尽管，由于危重症医学(criticalcare medicine)和患者处理的进步，在创伤性脑损伤(TBI)后，患者恢复的结果获得改善，但是，目前没有已知的处理方法能预防在TBI后的神经细胞的死亡以及功能异常。尽管已经证明有多种处理方法在TBI的临床前模型中具有神经保护作用，但是这些方法中的绝大多数对人无效。

在TBI后，患者的病情一旦稳定，护理的标准要求广泛的运动或者认知恢复。在恢复过程中，患者经常能获得丧失的功能，最终获得改善的功能结果。如果能开发药物治疗在TBI后能够促进运动或认知功能的恢复，并进而改善功能，这将是有益的。

在大鼠中，良好表征的侧位液压冲击(LFP)脑损伤导致海马、丘脑和皮质(包括运动皮质)中大量的凋亡性和坏死性细胞死亡。该神经细胞死亡导致神经功能异常以及多个脑系统的损伤。研究表明在侧位液压冲击脑损伤后，在运动和认知功能方面均存在缺陷(Hamm，RJ.et al.，Behav.Brain Res.，59(1-2)：169-173(1993)；Gong et al.，Brain Res.，700(1-2)：299-302(1995)；Hamm，R.J，.J Neurotrauma.，18(11)：1207-16(2001)；Floyd et al.，JNeurotrauma.，19(3)：303-16(2002)；Hallam et al.，J Neurotrauma，21(5)：521-39(2004))。广泛的恢复可以改善各种实验脑损伤后的神经行为结果。目前的理论认为，在恢复过程中，在损伤的脑组织以及在损伤区域周边的神经元被重新训练获得一些丧失的功能。所述的“重新训练”是一种学习的形式，并通过诱导神经可塑性来进行。

大量的研究表明，在诱导长程记忆以及神经可塑性中，环式-AMP(cAMP)和下游转录因子cAMP-响应元件结合蛋白(CREB)是重要的调节因子(Yin，J.C.et al.，Cell，79(1)：49-58(1994)；Bourtchuladze，R.et al.，Cell，79(1)：59-68(1994)；Impey，S.et al.，Nat.Neurosci.，1(7)：595-601(1998))。损害cAMP/CREB信号传导的遗传或者药理学干涉损害长程记忆形成以及突触的可塑性。相反地，促进cAMP/CREB信号传导的遗传或者药理学干涉有助于长程记忆形成以及突触的可塑性。

发明内容

本发明涉及给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物，该药物能(1)比任何目前的方法更有效地恢复各种形式的认知功能异常；(2)提高正常的认知性能(能力或者功能)；(3)比任何目前的方法更有效地恢复各种形式的运动功能异常；或者(4)提高正常的运动性能(能力或者功能)。给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物可以用于在认知或者运动训练后持续获得性能的脑功能的任何方面。因此，给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物可以用于恢复存在一定形式和程度的认知或者运动功能异常的动物的认知或者运动功能或者用于提高(改善)动物的正常认知或者运动性能。给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物还可以用于精确地调节新获得的移植的干细胞的突触连接，所述移植的干细胞分化成神经元。

如本文所述，可以单独给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物，也可以在增强认知训练(ACT)的条件下给予。ACT包括两部分：(1)针对于各脑(认知或者运动)功能的特定的训练方案，和(2)给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物。这种组合可以通过以下方式促进认知训练：通过缩短所需要的训练期所持续的时间和/或次数以获得相应于单独的认知训练所获得的性能；或者通过在训练过程之间需要较短的休息间隔或者无休息间隔以获得性能。这种组合还可以通过缩短所需要的训练过程所持续的时间和/或次数促进认知训练，以产生特定神经元回路的神经元活动；这种组合或者还通过缩短为了在神经元回路的突触连接中产生CREB依赖的长程结构/功能(即，长时间持续地)变化所需要的训练过程所持续的时间和/或次数或者神经元活动的基本模式促进认知训练。以这种方式，给予促进环式AMP响应元件结合蛋白(CREB)途径的药物可以提高现有认知训练方案的效率，从而产生显著的经济效益。

结果，本发明提供了一种促进有需要的动物(尤其是人或者其它哺乳动物或者脊椎动物)认知性能的特定方面的方法，该方法包括：(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂；和任选地(b)在足以改善研究的动物的特定的认知任务的表现的条件下训练动物。

在本文中，“促进剂”还可以称为“促进CREB途径的药物”。

本文提供了用于改善动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。本文还提供了用于持续改善动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的特定的认知任务的表现的条件下训练动物。CNS疾病和病症包括与年龄相关的记忆缺陷、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病(舞蹈病)、其它老年痴呆)、精神疾病(如，抑郁症、精神分裂症、孤独症、注意力缺乏障碍)、外伤导致的功能丧失(例如，脑血管疾病(如，中风、缺血)、脑肿瘤、头或者脑损伤)、遗传缺陷(例如，鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、神经纤维瘤病、科-洛综合征、雷特综合征、肌强直营养不良、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)、威廉斯综合征和学习不能。可以预期的是，在停止或中止给予促进剂后，用促进CREB途径功能的促进剂处理动物，可以获得持续的、保持的或者永久的认知任务的表现的改善。

本文提供了用于改善有需要的动物中与智力迟钝相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂(如，磷酸二酯酶4抑制剂)处理所述动物。本文还提供了用于持续改善动物中与智力迟钝相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂(如，磷酸二酯酶4抑制剂)，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与智力迟钝相关。智力迟钝影响认知加工以及认知功能，包括学习和记忆获得。智力迟钝可以是由于以下因素导致的：染色体或者遗传因素、先天感染、致畸剂(药物和其它化学物质)、营养不良、辐射或者其它不清楚的影响植入和胚胎发育的因素。智力迟钝综合征包括鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、纤维神经瘤、科-洛综合征、雷特综合征、肌强直营养不良、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)、威廉斯综合征)(Weeber，E.J.et al，Neuron，33：845-848(2002))。

本文提供的用于改善动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物，所述动物经历了神经元干细胞或者神经胶质干细胞操作。本文还提供了用于持续改善动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善，所述动物经历了神经元干细胞操作。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以刺激或者诱导动物的神经元活动或者神经元活动模式的条件下训练动物。所谓的“神经元干细胞操作”意指(1)将外源的神经元干细胞移植到动物的脑部或者脊柱中；(2)刺激或诱导动物内部的神经元干细胞增殖；或者(3)支持神经元细胞功能的干细胞。

本文中提供了用于改善动物的神经元活动或者神经元活动的模式的兴奋性(stimulation)、例如构成特定神经元回路的基础的神经元活动或者神经元活动的模式的兴奋性的方法，所述方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。本文还提供了用于持续改善动物的神经元活动或者神经元活动的模式的兴奋性、例如构成特定神经元回路的基础的神经元活动或者神经元活动的模式的兴奋性的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以刺激或者诱导动物的神经元活动或者神经元活动模式的条件下训练动物。

在一种实施方式中，本发明涉及用于改善动物中与年龄相关的记忆缺陷相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。在另一种实施方式中，本发明涉及用于持续改善动物中与年龄相关的记忆缺陷相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与年龄相关的记忆缺陷相关。

在另一种实施方式中，本发明涉及用于改善动物中与神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病(舞蹈病)、其它老年痴呆)相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。在另一种实施方式中，本发明涉及用于持续改善动物中与神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病(舞蹈病)、其它老年痴呆)相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以持续改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与神经退行性疾病相关。

在另一种实施方式中，本发明涉及用于改善动物中与精神疾病(如，抑郁症、精神分裂症、孤独症、注意力缺乏障碍)相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。在另一种实施方式中，本发明涉及用于持续改善动物中与精神疾病(如，抑郁症、精神分裂症、孤独症、注意力缺乏障碍)相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与精神疾病相关。

在另一种实施方式中，本发明涉及用于改善动物中与外伤导致(traumadependent)的认知功能丧失(例如，脑血管疾病(如，中风、缺血)、脑肿瘤、头或者脑损伤)相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。在另一种实施方式中，本发明涉及用于持续改善动物中与外伤导致的认知功能丧失(例如，脑血管疾病(如，中风、缺血)、脑肿瘤、头或者脑损伤)相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与外伤导致的认知功能丧失相关。

在另一种实施方式中，本发明涉及用于改善动物中与遗传缺陷(例如，鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、神经纤维瘤病、科-洛综合征、雷特综合征、肌强直营养不良、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)、威廉斯综合征)相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。在另一种实施方式中，本发明涉及用于持续改善动物中与遗传缺陷相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物的缺陷与遗传缺陷相关。

本发明提供了用于改善动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的运动缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的运动训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理所述动物。本文还提供了用于持续改善有需要的动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的运动缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。在一种实施方式中，所述方法还包括在足以改善动物的特定的运动任务的表现的条件下训练动物。CNS疾病和病症包括与年龄相关的记忆缺陷、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS或洛盖赫里格病(Lou Gehrig’s disease)、运动神经元疾病、亨廷顿病(舞蹈病)、其它老年痴呆)、精神疾病(如，抑郁症、精神分裂症、孤独症、注意力缺乏障碍)、外伤导致的功能丧失(例如，脑血管疾病(如，中风、缺血)、脑肿瘤、头、脑或脊椎损伤)、遗传缺陷(例如，鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、神经纤维瘤病、科-洛综合征、雷特综合征、肌强直营养不良、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)、威廉斯综合征)和学习不能。可以预期的是，在停止或中止给予促进剂后，用促进CREB途径功能的促进剂处理动物，可以获得保持的或者永久的运动任务表现的改善。

可以预期的是，在各种实施方式中，所述促进剂包括磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂。PDE4抑制剂的实例包括环戊苯吡酮和具有下式的化合物：

其中，″Me″为“甲基”，″cPent″为“环戊基”。可以理解的是，上式包括它的对映体以及它们的混合物。该化合物可以按照美国专利No.6,458,829所述的方法制备，该专利的教导内容并入本文作为参考。在一个特殊的实施方式中，上式中的第3位和第5位碳原子为S构型(HT-0712)：

其中，″Me″为“甲基”，″cPent″为“环戊基”。在美国公开No.2002/0028842A1(2002年3月7日公开)、美国专利No.6,458,829B1、美国专利No.6,525,055B1、美国专利No.5,552,438、美国专利No.6,436,965、和美国专利No.6,204,275中还公开了PDE4抑制剂的其它实例。PDE4抑制剂的其它实例为本领域公知的，并易于获得。

附图说明

图1是物体识别(OR)试验的时间过程图。试验由一个训练期、接着24小时后的测试期组成(除了对于STM试验有4小时的间隔)。在损伤前，大鼠进行5次试验以评价损伤前的记忆分数。然后使大鼠TBI，恢复7天，按照以下方式进行OR恢复：试验6损伤后的基线(BS1)；试验7用药物训练(TD1)；试验8为短程记忆(STM)测试，训练与检测之间的间隔为4小时，在训练和检测之间不给药；试验9建立第2基线(BS2)；试验10-14为在药物辅助下的认知恢复(在每个训练期前给药)；试验15为在训练时不给药的条件下休息1周后的第一次恢复后记忆评分(Ass1)；试验16为休息5周后的第二次恢复后记忆评分(Ass2)；试验17为休息1周后的第三次恢复后记忆评分(Ass3)；追踪训练(trace conditioning)，休息1周后的追踪测试。

图2显示在交错台阶(staggered step)上的运动恢复。在损伤前，对大鼠进行训练至交错台阶任务的标准表现(A-D，第0天)。使所有的大鼠脑部受损，然后进行恢复训练7天。检测对于交错台阶任务中的错误(步伐错误)的平均数(图2A&B)以及等待时间(图2C&D)(第1天，基线)。所有的大鼠的错误步伐数显著增加(p＜0.001)。在每天使大鼠进行恢复并用PDE4抑制剂环戊苯吡酮(n＝11)和HT-0712(n＝13)处理后，错误步伐数较少(图2A)，并且等待时间缩短(图2C)，然后，对大鼠进行恢复并用载体处理(n＝11)。给予PDE4抑制剂HT-0712但不进行交错台阶恢复的大鼠比用载体处理并不进行恢复的动物的错误步伐数少(图2B)，等待时间短(图2D)(^*＝p＜0.05)。

图3显示物体识别能力(平均DI±S.E.M.)。一天的对物体识别的记忆保持能力依赖于长时程记忆的形成。在损伤大鼠前，对大鼠训练了5次试验。每一次试验由对一对相同的物体进行7.5分钟的训练期和在24小时后评价长时程记忆保持能力的测试期组成。记忆保持能力用区别指数定量(参见方法部分)。在损伤之前，使大鼠辨别以前探测的物体(旧物体)和新物体。将所有损伤前的试验平均获得单个的损伤前区别指数(图3A)。在后来给予药物和载体处理的组之间的记忆性能无显著差异(图3A)。在脑损伤后以及恢复7天后，两组大鼠对物体识别的长时程记忆存在缺陷(图3B)。两组大鼠对物体识别无显著差异。因此，在对所有组处理前，大脑损伤损害了大鼠对物体识别的正常的24小时记忆(图3B)。接着的试验是在训练前20分钟给予大鼠0.15mg/kg的HT-0712或载体(腹腔注射)。HT-0712组偏爱新的物体，并且其区别指数(p＜0.01)明显高于载体组的区别指数(图3C)。为了确定是否是脑损伤导致了短时程记忆缺陷，在接下的试验中，训练大鼠并且不给予药物，在间隔4小时后进行检测，而不是在间隔标准的24小时后进行检测。两组的大鼠都偏爱新的物体，并且两组之间没有显著差异。因此，可以推出LFP脑损伤只导致了大鼠在24小时的对物体识别的记忆缺陷，但没有导致其在4小时的对物体识别的记忆缺陷(^*＝p＜0.05)。

图3E显示大鼠在损伤前对物体识别能力。一天的对物体识别的记忆保持能力依赖于长时程记忆能力的形成。对大鼠进行一对相同的物体训练7.5分钟，然后在24小时后，进行测试以评价记忆保持能力。记忆保持能力用区别指数定量。在损伤前，反复进行训练以及检测24小时后的记忆保持能力的试验5次。在损伤前的训练中，没有将大鼠分成处理组，并且没有进行PDE4处理。在损伤前，比较组之间的t-检验(Student′s t test)表明在任一检测日大鼠对物体的识别能力均不存在显著差异(试验1，p＝0.591；试验2，p＝0.177；试验3，p＝0.911；试验4，p＝0.755；试验5，p＝0.780)。

图4显示药物辅助认知能力(平均DI±SEM)。在第一天进行的反复认知恢复中，不给大鼠注射药物或者载体，第二次检测大鼠(图4A，试验0)。在该第二次基线评价时，载体组和HT-0712组之间没有显著差异。然后，每天给予大鼠HT-0712或载体进行药物辅助认知恢复，试验5次(图4A，试验1-5)。在进行恢复试验1(p＝0.001)、试验2(p＝0.001)、试验3(p＝0.007)、和试验5(p＝0.001)中，HT-0712组大鼠的表现明显优于载体组。为了评价没有药物时恢复改善的记忆能力，在没有进行药物处理时训练/检测大鼠。接受HT-0712辅助认知恢复的组的表现明显优于接受载体的组(图4B)。为了确定长时程记忆缺陷的改善是否由于反复给予HT-0712所产生的亚急性效果，大鼠休息一周后在不给予药物的条件下再次检测长时程记忆功能(图4C)。仍保持了PDE4辅助认知恢复的效果。HT-0712组的表现明显优于载体处理组的表现(^*＝p＜0.05)。

图5显示认知恢复的长期效果：为了确定PDE4辅助认知恢复后记忆功能的改善是否是持久的，在恢复结束后8周检测大鼠的物体识别能力(图5A)。PDE4辅助恢复组的表现明显优于载体处理组。然后检测大鼠对追踪恐惧训练的1周的记忆保持能力。PDE4辅助认知恢复组仍然明显优于载体处理组(图5B)(^*＝p＜0.05)。这种改善的记忆功能反映了另一中依赖于海马的记忆任务。

图5C表示进行运动恢复的动物对于追踪恐惧训练的记忆能力。为了确定在PDE4辅助药物恢复组中运动能力(运动记忆)的改善是运动能力特异的，还是它反映了改善了对追踪恐惧的记忆的认知能力，在进行运动恢复1周后训练追踪恐惧记忆。在训练1周后检测大鼠的追踪恐惧记忆。给予PDE4的组/进行恢复的组/没有进行恢复的组之间没有显著差异。

具体实施方式

对于许多物种(包括人)进行的许多种任务，间隔的训练方案(多个训练期，在每个训练期之间有休息间隔)比集中训练方案(多个训练其，在训练期之间没有休息间隔)能产生更强的、持续时间更长的记忆。

巴甫洛夫在果蝇中进行的嗅觉学习的行为-遗传研究已经确定集中训练产生维持最少4天的持续较长的记忆，这种记忆不依赖于蛋白质合成，不受CREB-阻抑蛋白转基因的过表达干扰，而在萝卜突变体(radish mutants)中受干扰(Tully，T.et al.，Cell，79(1)：35-47(1994)；和Yin，J.C.et al.，Cell，79(1)：49-58(1994))。相反，有休息间隔的训练方案产生维持最少7天的持续较长的记忆，这种记忆依赖于蛋白质合成，受CREB-阻抑蛋白转基因的过表达干扰，而在萝卜突变体中是正常的(Tully，T.et al.，Cell，79(1)：35-47(1994)；和Yin，J.C.et al.，Cell，79(1)：49-58(1994))。在进行间隔的训练一天后，记忆的保持包括不依赖蛋白质合成的以及不依赖CREB的早期记忆(ARM)和依赖蛋白质合成的以及依赖CREB的长时程记忆(LTM)。额外的集中训练不足以产生LTM(Tully，T.et al.，Cell，79(1)：35-47(1994)；和Yin，J.C.et al.，Cell，79(1)：49-58(1994))。

越来越多的证据将这些结果从无脊椎动物扩展到哺乳动物。例如，在海兔(Aplysia)中，分子操纵CREB的表达，会产生与果蝇相似的结果，抑制或增强(i)在细胞培养中的感觉运动的单突触的易化(facilitatory)电生理响应的LTM和(ii)感受和运动神经元之间的连接，这种连接通常在间隔地运用易化刺激后产生(Bartsch，D.et al.，Cell，83(6)：979-992(1995))。在大鼠中，向海马区或者杏仁核注射反义RNA寡核苷酸抑制两种不同任务的LTM的形成，这两种任务分别依赖于上述两个解剖区的活动(Guzowski，J.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(6)：2693-2698(1997)；和Lamprecht，R.et al.，J.Neurosci.，17(21)：8443-8450(1997))，对于小鼠，在CREB突变的小鼠中，对于暗示和明示的任务中的LTM形成均有缺陷(Bourtchuladze，R.et al.，Cell，79(1)：59-68(1994))。

对于携带有CRE-依赖的报告基因(β-半乳糖苷酶)的转基因小鼠进行依赖海马的皮质层的恐惧条件反射或者被动避免任务的训练诱导了在海马的CA1和CA3区域表达CRE-依赖的报告基因表达。对这些小鼠进行杏仁核依赖的恐惧条件发射任务的训练诱导了在杏仁核表达CRE-依赖的报告基因，而在海马区没有表达CRE-依赖的报告基因。因此，引起LTM形成的训练方案也诱导了在哺乳动物脑中特定解剖区域的CRE-依赖的基因的转录(Impey，S.et al.，Nat.Neurosci.，1(7)：595-601(1998))。

利用这些动物模型，已表明了三种促进LTM的突出的情况。第一，过表达CREB-激活蛋白转基因不需要进行多个间隔的训练期，而是仅在一个训练期后即引起LTM形成(一个训练期正常情况下在24小时后只保存很少的或者没有记忆(Yin，J.C.et al.，Cell，81(1)：107-115(1995))。第二，向大鼠的杏仁核注射病毒表达的CREB-激活蛋白转基因还足以增强对于加强的恐惧振惊应答的集中训练后的记忆，这省去了间隔训练中的休息间隔(Josselyn，S.A.et al.，Society for Neuroscience，Vol.24，Abstract 365.10(1998)；和Josselyn，S.A.et al.，J.Neurosci.，21：2404-2412(2001))。第三，如果对突变的小鼠进行了不同的间隔的训练方案，在CREB-缺陷的小鼠(Bourtchuladze，R.et al.，Cell，79(1)：59-68(1994))中能正常地形成LTM(Kogan，J.H.et al.，Curr.Biol.，7(1)：1-11(1997))。

在脊椎动物脑的发育的可塑过程和细胞的可塑过程中，CREB还以各种形式出现。例如，神经元的活动增强了皮质中的CREB活性(Moore，A.N.et al.，J.Biol.Chem.，271(24)：14214-14220(1996))。CREB还介导了海马区的发育可塑过程(Murphy，D.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(4)：1482-1487(1997))；介导了体感觉皮质区的发育可塑过程(Glazewski，S.et al.，Cereb.Cortex，9(3)：249-256(1999))；介导了纹状体的发育可塑过程(Liu，F.C.et al.，Neuron，17(6)：1133-1144(1996))；介导了视觉皮质区的发育可塑过程(Pham，T.A.et al.，Neuron，22(1)：63-72(1999))。

在人的神经退行疾病和脑损伤中，CREB似乎收到影响。例如，在阿尔茨海默病中，CREB的激活和/或表达受到破坏(Ikezu，T.et al.，EMBO J.，15(10)：2468-2475(1996)；Sato，N.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，232(3)：637-642(1997)；Yamamoto-Sasaki，M.et al.，Brain.Res.，824(2)：300-303(1999)；Vitolo，O.V.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，13217-13221(2002))。在癫痫发作或缺血后，CREB的激活和/或表达也增加(Blendy，J.A.et al.，Brain Res.，681(1-2)：8-14(1995)；和Tanaka，K.et al.，Neuroreport，10(11)：2245-2250(1999))。″环境强化″是神经保护性的，通过CREB活化来防止细胞死亡。(Young，D.et al.，Nat.Med.，5(4)：448-453(1999))。

在药物过敏和停药期间，CREB发挥功能。例如，CREB受乙醇的影响(Pandey，S.C.et al.，Alcohol Clin.Exp.Res.，23(9)：1425-1434(1999)；Constantinescu，A.et al.，J.Biol.Chem.，274(38)：26985-26991(1999)；Yang，X.et al.，Alcohol Clin.Exp.Res.，22(2)：382-390(1998)；Yang，X.et al.，J.Neurochem.，70(1)：224-232(1998)；和Moore，M.S.et al.，Cell，93(6)：997-1007(1998))；受可卡因的影响(Carlezon，W.A.，Jr.et al.，Science，282(5397)：2272-2275(1998))；受吗啡的影响(Widnell，K.L.et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，276(1)：306-315(1996))；受甲基苯丙胺的影响(Muratake，T.et al.，Ann N.Y.Acad.Sci.，844：21-26(1998))和受大麻素的影响(Calandra，B.et al.，Eur.J.Pharmacol，374(3)：445-455(1999)；和Herring，A.C.et al.，Biochem.Pharmacol.，55(7)：1013-1023(1998))。

能刺激CREB/CRE转导途径的信号转导途径是cAMP调节系统。与此一致的是，缺乏腺苷酸环化酶1(AC1)和AC8酶的小鼠不能学习(Wong S.T.etal.，Neuron，23(4)：787-798(1999))。在这些小鼠中，将毛喉素给予到海马的CA1区域中能恢复依赖海马的任务的学习记忆能力。此外，用能提高cAMP水平的(如，环戊苯吡酮和D1受体激动剂)药物处理老年大鼠能改善年龄相关的依赖海马的记忆丧失以及细胞的长时程增强(Barad，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95(25)：15020-15025(1998))。这些后面的数据表明cAMP信号传导在学习受损的老年大鼠中是缺失的(Bach，M.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(9)：5280-5285(1999))。

本发明涉及一种新的方法，该方法能(1)恢复认知功能异常的各种形式或者(2)促进正常的认知表现。给予促进CREB途径的药物通过一般的突触可塑性的分子机制作用，突触可塑性显然将新获得的体验的生物化学效果转化为突触的持久的结果变化。给予促进CREB途径的药物可以用于脑功能的各方面，其在进行认知训练后显示持续的性能获得。因此，促进CREB途径的药物可以用于恢复动物中任何形式的认知或者运动功能异常，或者提高或改善动物中正常的认知或者运动性能的任何方面。

越来越多的证据表明在成年的脑中，神经元继续增殖(Arsenijevic，Y.etal.，Exp.Neurol.，170：48-62(2001)；Vescovi，A.L.et al.，Biomed.Pharmacother.，55：201-205(2001)；Cameron，H.A.and McKay，R.D.，J.Comp.Neurol.，435：406-417(2001)；和Geuna，S.et al.，Anat.Rec，265：132-141(2001))，并且这种增殖响应于各种经历(Nilsson，M.et al.，J.Neurobiol.，39：569-578(1999)；Gould，E.et al.，Trends Cogn.Sci.，3：186-192(1999)；Fuchs，E.and Gould，E.，Eur.J.Neurosci.，12：2211-2214(2000)；Gould，E.et al.，Biol.Psychiatry，48：715-720(2000)；和Gould，E.et al.，Nat.Neurosci.，2：260-265(1999))。已暗示进行试验的策略以将神经元干细胞移植到成年的脑中用于各种治疗性适应症(Kurimoto，Y.et al.，Neurosci.Lett.，306：57-60(2001)；Singh，G.，Neuropathology，21：110-114(2001)；和Cameron，H.A.and McKay，R.D.，Nat.Neurosci.，2：894-897(1999))。关于在胚胎发育时期的神经发生现已知道很多(Saitoe，M.and Tully，T.，″Making connections between synaptic andbehavioral plasticity in Drosophila″，In Toward a Theory of Neuroplasticity，J.McEachem and C.Shaw，Eds.(New York：Psychology Press.)，pp.193-220(2000))。神经元的分化、神经突的延长和最初的突触靶的识别都似乎以不依赖活动的方式发生。然而，随后的突触发生和突触生长需要正在形成的神经元的活性以功能相关的方式进行精确的突触连接。这些发现表明移植的神经元干细胞的功能(最终的)的整合需要神经元的活性。因此，给予增强CREB途径的药物可以用于训练适当的神经元回路以对新获得的移植的干细胞进行精确地调节突触的连接，所述干细胞分化为神经元。“训练适当的神经元回路”意指在适当的神经元回路中诱导神经元活动模式，这种活动对应于由特定的认知训练方案所诱导的活动。所述的认知训练方案可以诱导这种神经元活动。此外，还可以通过直接的电刺激神经元回路诱导神经元活动。“神经元活动”和“神经活动”可以交换使用。

ACT包括对每一种脑功能进行特异的训练方案和常规地给予促进CREB途径的药物。所述的脑训练方案(认知训练)在特定的脑区域诱导神经元活动，并改善特定的脑(认知)功能表现。促进CREB途径的药物，也别称为促进剂，对于将新获得的信息巩固到LTM中是必须的。所谓的“促进CREB途径的功能”是指能够增强或改善CREB-依赖的基因的表达的能力。通过增加内源性的CREB产量(例如，直接或间接地刺激内源基因以产生增加的CREB)或者通过增加功能性的(生物活性的)的CREB，可以增强或者改善CREB-依赖的基因的表达。参见，例如美国专利No.5,929,223、美国专利No.6,051,559、和国际公开号WO9611270(1996年4月18日公开)，这些参考文献的全部内容引入本文作为参考。给予促进CREB途径的药物可以减少所需要的训练的量以产生相当于单独训练所获得的表现。尤其是，ACT通过减少所需要的训练期的数量改善认知训练以产生相对于单独的认知训练所获得的表现，或者ACT通过在相邻的训练之间需要更短休息间隔的或者不需要休息间隔改善认知训练以产生表现增益。以这种方式，ACT可以提高认知训练技术的效率，从而产生显著的经济效益。所谓的“表现增益(performance gain)”是指认知表现的某一方面的改善。

本发明提供了一种在有需要的动物(尤其是人或者其它哺乳动物或者脊椎动物)中增强特定方面的认知性能的方法，该方法包括(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂；和任选地(b)在足以改善动物的特定的认知任务的表现的条件下训练动物。

例如，对患有抑郁症(单极)和/或恐怖症的患者采用正规的认知训练方案，以帮助他们忘记与抑郁症和/或恐怖症相关的病理反应并学习合适的行为。给予促进CREB途径的药物任选地结合认知训练减少了在这些患者中获得性能所需要的训练期的时间和/或数量。这样，可以在较短的时间范围内实现总体的治疗。

类似地，对患有孤独症的患者采用正规的认知训练方案，以帮助他们忘记病理反应并学习合适的行为。给予促进CREB途径的药物任选地结合认知训练减少了在这些患者中获得性能所需要的训练期的时间和/或数量。

对恢复中风的患者(中风恢复)，尤其是恢复损害或者丧失感觉运动功能的患者采用正规的认知训练方案(例如，物理治疗、生物反馈的方法)。给予促进CREB途径的药物结合认知训练减少了在这些患者中获得性能所需要的训练期的时间和/或数量。结果，可以预期在丧失的认知或者运动功能方面可以获得更快的更有效的恢复。

在学习新的语言或者学习演奏新的乐器时，采用正规的认知训练方案(例如，集中训练，间隔的训练)。给予促进CREB途径的药物结合认知训练减少了获得性能所需要的训练期的时间和/或数量。结果，学会新的语言或者学会演奏新的乐器需要更少的练习(训练期)。

对学习、语言或阅读不能的个体采用正规的认知训练方案以改善学习和/或表现。给予促进CREB途径的药物结合认知训练减少了在这些个体中获得性能所需要的训练期的时间和/或数量。

对个体采用正规的认知训练方案以训练神经元回路，从而精确地调节新获得的移植的干细胞的突触连接，所述移植的干细胞分化为神经元。给予促进CREB途径的药物结合认知训练减少了在这些个体的特定神经元回路中诱导产生神经元活动模式所需要的训练期的时间和/或数量。

采用正规的认知训练方案以反复地刺激个体的神经元的活动或者构成特定神经元回路中的神经元的活动模式。给予促进CREB途径的药物结合认知训练减少了所需要的训练期的时间和/或数量，在所述神经元回路的突触连接中诱导产生依赖CREB的长时程结构/功能(即，持久的)变化。

加强的恢复训练治疗可以改善脑损伤后功能的恢复。当存活的神经元被“重新训练”获得丧失的功能时，这种恢复通过残余脑组织的重新组建实现。神经可塑性的变化被认为构成这种重新组建的基础。激活cAMP/CREB途径对于神经可塑性中的经历依赖的变化是必需的步骤。检测了HT-0712和环戊苯吡酮对于侧位液压冲击(LFP)脑损伤后的运动和认知功能恢复的效果。将成年的大鼠训练到熟练运动任务(交错台阶)上的标准表现，然后用LFP装置损伤大鼠。在恢复一周后，在给予PDE4抑制剂或者载体的情况下对大鼠进行技能运动恢复。HT-0712和环戊苯吡酮显著地提高了运动恢复。在单独一组动物中，首先检测大鼠对物体识别的基线记忆表现。在损伤后，对大鼠训练4小时后，大鼠具有完整的物体识别能力，在24小时后存在记忆力缺陷。在对物体识别的认知进行反复训练(认知恢复训练)过程中给予HT-0712或载体。在进行6期恢复后，HT-0712组的表现明显优于载体组的表现。在不给予药物的前提下，这种记忆改善持续了长达8周，并且转化为对追踪恐惧训练的记忆表现的改善。意想不到的是，PDE4抑制剂HT-0712可以用于改善脑受损后的运动和认知功能的恢复。

训练可以包括一个或多个训练期，并且所述训练可以是适于改善对被研究的认知任务的表现的训练。例如，如果所需要的是获得语言能力的改善，所述训练集中于语言的获得。如果所需要的是改善学习演奏乐器的能力，所述训练集中于学习演奏乐器。如果所需要的是改善特定的运动技能，所述训练集中于特定的运动技能的获得。所述特定的被研究的认知任务与适当的训练匹配。

本发明还提供了反复刺激动物的神经元活动或神经元活动的模式、例如构成特定神经元回路的基础的神经元活动或神经元活动的模式的方法，该方法包括(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂；和(b)在足以刺激或诱导动物的神经元活动或神经元活动模式的条件下训练动物。在这种情况下，所述训练为能适当刺激或诱导动物的神经元活动或神经元活动模式的训练。

所谓的“多个训练期”意指两个或多个训练期。可以在一个或多个训练期之前、之中或之后给予所述促进剂。在一个特定的实施方式中，在每一训练期之前和之中给予所述促进剂。用促进剂处理并结合各训练期也被称作“促进处理”。所谓的“训练”意指认知训练。

正规的认知训练方案是本领域公知的，并且易于获得。可以参见，例如，Kami，A.and Sagi，D.，″Where practice makes perfect in text discrimination：evidence for primary visual cortex plasticity″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：4966-4970(1991)；Kami，A.and Sagi，D.，″The time course of learning avisual skill″，Nature，365：250-252(1993)；Kramer，A.F.et al.，″Taskcoordination and aging：explorations of executive control processes in the taskswitching paradigm″，Acta Psychol，(Amst)，101：339-378(1999)；Kramer，A.F.et al.，″Training for executive control：Task coordination strategies and aging″，InAging and Skilled Performance：Advances In Theory and Applications，W.Rogers et al.，eds.(Hillsdale，NJ.：Erlbaum)(1999)；Rider，R.A.and Abdulahad，D.T.，″Effects of massed versus distributed practice on gross and fine motorproficiency of educable mentally handicapped adolescents″，Percept.Mot.Skills，73：219-224(1991)；Willis，S.L.and Schaie，K.W.，″Training the elderly on theability factors of spatial orientation and inductive reasoning″，Psychol.Aging，1：239-247(1986)；Willis，S.L.and Nesselroade，C.S.，″Long-term effects offluid ability training in old-old age″，Develop.Psychol.，26：905-910(1990)；Wek，S.R.and Husak，W.S.，″Distributed and massed practice effects on motorperformance and learning of autistic children″，Percept.Mot.Skills，68：107-113(1989)；Verhaehen，P.et al.，″Improving memory performance in the agedthrough mnemonic training：a meta-analytic study″，Psychol.Aging，7：242-251(1992)；Verhaeghen，P.and Salthouse，T.A.，″Meta-analyses of age-cognitionrelations in adulthood：estimates of linear and nonlinear age effects and structuralmodels″，Psychol.Bull.，122：231-249(1997)；Dean，C.M.et al.，″Task-relatedcircuit training improves performance of locomotor tasks in chronic stroke：arandomized，controlled pilot trial″，Arch.Phys.Med.Rehabil.，81：409-417(2000)；Greener，J.et al.，″Speech and language therapy for aphasia followingstroke″，Cochrane Database Syst.Rev.，CD000425(2000)；Hummelsheim，H.andEickhof，C，″Repetitive sensorimotor training for arm and hand in a patient withlocked-in syndrome″，Scand.J.Rehabil.Med.，31：250-256(1999)；Johansson，B.B.，″Brain plasticity and stroke rehabilitation.The Willis lecture″，Stroke，31：223-230(2000)；Ko Ko，C，″Effectiveness of rehabilitation for multiplesclerosis″，Clin.Rehabil.，13(Suppl.1)：33-41(1999)；Lange，G.et al.，″Organizational strategy influence on visual memory performance after stroke：cortical/subcortical and left/right hemisphere contrasts″，Arch.Phys.Med.Rehabil.，81：89-94(2000)；Liepert，J.et al.，″Treatment-induced corticalreorganization after stroke in humans″，Stroke，31：1210-1216(2000)；Lotery，A.J.et al.，″Correctable visual impairment in stroke rehabilitation patients″，AgeAgeing，29：221-222(2000)；Majid，M.J.et al.，″Cognitive rehabilitation formemory deficits following stroke″(Cochrane review)，Cochrane Database Syst.Rev.，CD002293(2000)；Merzenich，M.et al.，″Cortical plasticity underlyingperceptual，motor，and cognitive skill development：implications forneurorehabilitation″，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，61：1-8(1996)；Merzenich，M.M.et al.，″Temporal processing deficits of language-learningimpaired children ameliorated by training″，Science，271：77-81(1996)；Murphy，E.，″Stroke rehabilitation″，J.R.Coll.Physicians Lond.，33：466-468(1999)；Nagarajan，S.S.et al.，″Speech modifications algorithms used for traininglanguage learning-impaired children″，IEEE Trans.Rehabil.Eng.，6：257-268.(1998)；Oddone，E.et al.，″Quality Enhancement Research Initiative in stroke：prevention，treatment，and rehabilitation″，Med.Care 38：192-1104(2000)；Rice-Oxley，M.and Turner-Stokes，L.，″Effectiveness of brain injuryrehabilitation″，Clin.Rehabil.，13(Suppl 1)：7-24(1999)；Tallal，P.et al.，″Language learning impairments：integrating basic science，technology，andremediation″，Exp.Brain Res.，123：210-219(1998)；Tallal，P.et al.，″Languagecomprehension in language-learning impaired children improved withacoustically modified speech″，Science，271：81-84(1996)；Wingfield，A.et al.，″Regaining lost time：adult aging and the effect of time restoration on recall oftime-compressed speech″，Psychol.Aging，14：380-389(1999)，将这些参考文献的全文并入本文作为参考。

本文中所使用的术语“动物”包括哺乳动物以及其它的动物，脊椎动物和无脊椎动物(例如，鸟、鱼、爬行动物、昆虫(例如，果蝇)、软体动物(例如，海兔))。本文所使用的术语“哺乳动物”意指任何脊椎动物，包括单孔类动物、有袋动物和有胎盘哺乳动物，这些动物通过哺乳喂养其幼年期的后代，并通过产出活的崽(eutharian或者有胎盘哺乳动物)或者产卵(metatharian或者没有胎盘哺乳动物)。哺乳动物的实例包括人和灵长类(例如，猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、几内亚猪)和反刍动物(例如，牛、猪、马)。

所述动物可以为具有一定形式和程度的认知功能异常的动物，也可以是具有正常的认知表现的动物(即，没有任何形式的认知缺陷(任何的认知功能异常或丧失))。

通常与脑功能异常和中枢神经系统(CNS)疾病或病症相关的认知功能异常是由于遗传、疾病、损伤和/或年龄导致的。与CNS疾病和病症相关的一定形式和程度的认知缺陷(功能异常)包括但不限于：

1)与年龄相关的记忆缺陷；

2)神经退行性疾病，如，精神错乱(急性混乱状态)；痴呆，包括阿尔茨海默病和非阿尔茨海默病型的痴呆，包括但不限于Lewy小体痴呆、血管型痴呆、宾斯旺格痴呆(皮质层下动脉硬化脑病、与帕金森疾病相关的痴呆)、进行性核上麻痹、亨廷顿病(舞蹈病)、皮克病、常压脑积水、克雅病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、神经梅毒(普通的局部麻醉)或HIV感染、额叶痴呆综合征、与脑创伤相关的痴呆(包括拳击手痴呆、脑创伤、硬膜下血肿、脑肿瘤、甲状腺机能减退、维生素B₁₂缺乏、颅内辐射；其它的神经退行性疾病；

3)精神疾病，包括情感障碍(心境障碍)，例如但不限于，抑郁症(包括抑郁的假痴呆症)；精神疾病，例如但不限于，精神分裂症和孤独症(卡纳综合征)；神经病，例如但不限于，焦虑、强迫性神经病；注意力缺乏障碍；

4)与外伤有关的认知功能丧失，例如但不限于，与脑血管疾病相关的(由脑血管疾病导致的)认知功能丧失，所述脑血管疾病包括中风和缺血(包括缺血中风)；脑外伤(包括硬膜下血肿和脑肿瘤)；脑损伤、由于冠状动脉旁路接枝(CABG)外科手术和神经毒性导致的并发症、兴奋毒性、和癫痫发作；

5)由于遗传缺陷导致的与疾病相关的一定形式和程度的认知功能异常，例如但不限于，鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)、神经纤维瘤病、科-洛综合征、强直性营养不良、雷特综合征、威廉斯综合征、克兰费尔特综合征、镶嵌性、13三体综合征(帕陶综合征)、18三体综合征(爱德华综合征)、特纳综合征、猫叫综合征、莱-尼综合征(高尿血症)、亨特综合征、洛氏眼脑肾综合征(Lowe′soculocerebrorenal syndrome)、戈谢病、胡尔勒综合征(粘多糖存积症)、尼-皮病、泰-莎病、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、氨基酸尿症、酸血症、结节性硬化和原发性小头(primary microcephaly)；

6)学习、语言或者阅读不能(尤其存在儿童中)。所谓的“学习不能”意指影响个体学习方法的基本的心理过程的疾病。学习不能可以导致听力、思考、交谈、阅读、书写、拼读、算术或者它们的组合困难。学习不能包括知觉障碍、诵读困难和发育性失语。

术语“认知能力”和“认知功能”是本领域公认的术语，本文中采用的就是本领域接受的含义。所谓的“认知任务”意指认知功能。认知功能包括记忆获取、视觉辨别、听觉辨别、执行功能、运动技能学习、抽象推理、空间能力、言语和语言技能以及语言获得的能力。所谓的“促进特定方面的认知能力”意指能够增强或改善特定的认知或者脑功能，例如记忆获得或者学习任务的能力。所谓的“改善特定的认知任务的表现”意指相对于训练前的表现改善了特定认知任务或脑功能方面的表现。例如，如果在中风后，患者只能摆动脚指头，在改善性能(获得性能)后，患者能够，例如行走。

“提供持续的改善”意指在停止给予促进剂后仍然保留改善的特定认知任务的表现。

因此，本发明还涉及改善动物(尤其是人或者其它哺乳动物或者脊椎动物)的与CNS疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括在不进行正规的认知训练的情况下用促进CREB途径功能的促进剂处理动物。本发明还涉及持续地改善动物(尤其是人或者其它哺乳动物或者脊椎动物)的与CNS疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括给予动物促进CREB途径功能的促进剂，并检测所述的持续的改善。本发明还涉及进一步包括在足以改善动物的特定的认知任务的表现的条件下训练动物的方法。

在一种实施方式中，本发明涉及治疗需要所述治疗的动物中与年龄相关的记忆缺陷相关的认知缺陷的方法，该方法包括(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂；和任选地(b)在足以改善动物在认知任务中的表现的条件下训练动物，所述动物的认知缺陷与年龄相关的记忆缺陷相关。

在特定的实施方式中，所述促进剂为磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂。PDE4抑制剂的实例包括环戊苯吡酮和具有下式的化合物：

其中，″Me″为“甲基”，″cPent″为“环戊基”。可以理解的是，上式包括它的对映体以及它们的混合物。该化合物可以按照美国专利No.6,458,829所述的方法制备，该专利的教导内容并入本文作为参考。在一个特殊的实施方式中，上式中的第3位和第5位碳原子为S构型：

其中，″Me″为“甲基”，″cPent″为“环戊基”。在美国公开No.2002/0028842A1(2002年3月7日公开)、美国专利No.6,458,829B1、美国专利No.6,525,055B1、美国专利No.5,552,438、美国专利No.6,436,965、和美国专利No.6,204,275中还公开了PDE4抑制剂的其它实例。PDE4抑制剂的其它实例为本领域公知的，并易于获得。

智力迟钝影响认知加工过程和认知功能，包括学习和记忆的获得(Weeber，E.J.et al.，Neuron，33：845-848))。智力迟钝可以由以下因素导致的：染色体或者基因因素、先天感染、致畸剂(药物和其它化学物质)、营养不良、辐射或者影响胚胎植入和胚胎发生的未知的疾病。智力迟钝症状包括但不限于，克兰费尔特综合征、镶嵌性、13三体综合征(帕陶综合征)、18三体综合征(爱德华综合征)、特纳综合征、猫叫综合征、莱-尼综合征(高尿血症)、亨特综合征、洛氏眼脑肾综合征(Lowe′s oculocerebrorenal syndrome)、戈谢病、胡尔勒综合征(粘多糖存积症)、尼-皮病、泰-莎病、半乳糖血症、枫糖尿病、苯丙酮尿症、氨基酸尿症、酸血症、结节性硬化和原发性小头(primarymicrocephaly)。智力迟钝症状还包括鲁宾斯坦综合征、唐氏综合征、安格尔曼综合征、神经纤维瘤病、科-洛综合征、雷特综合征、强直性营养不良、脆性X综合征(如，脆性X-1、脆性X-2)和威廉斯综合征(Weeber，E.J.et al.，Neuron，33：845-848(2002))。

本发明还涉及治疗经历了神经元干细胞操作的动物中与中枢神经系统(CNS)的疾病或者病症相关的认知缺陷的方法，该方法包括(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂，和(b)在足以刺激或者诱导动物的神经元活动或者神经元活动模式的条件下训练动物。所谓的“神经元干细胞操作”意指(1)将外源的神经元干细胞移植到动物的脑部或者脊柱中；或(2)刺激或诱导动物内部的神经元干细胞增殖。将神经元干细胞移植到动物脑或者脊柱中的方法是本领域所公知的，并且容易获得(参见，例如，Cameron，H.A.and McKay，R.D.，Nat.Neurosci.，2：894-897(1999)；Kurimoto，Y.et al.，Neurosci.Lett.，306：57-60(2001)；和Singh，G.，Neuropathology，21：110-114(2001))。刺激或诱导动物内部的神经元干细胞增殖的方法是本领域所公知的，并且容易获得(参见，例如，Gould，E.et al.，Trends Cogn.Sci，3：186-192(1999)；Gould，E.etal.，Biol.Psychiatry，48：715-20(2000)；Nilsson，M.et al，J.Neurobiol，39：569-578(1999)；Fuchs，E.and Gould，E.，Eur.J Neurosci.，12：2211-2214(2000)；和Gould，E.et al.，Nat.Neurosci.，2：260-265(1999))。将神经元干细胞移植到动物脑或者脊柱中的特定的方法以及刺激或诱导动物内部的神经元干细胞增殖的具体方法对于实施本发明来说不是关键的。

本发明还涉及改善或增强具有学习障碍、语言或者阅读不能或者它们的组合的动物的学习和/或表现的方法，该方法包括(a)给予动物促进CREB途径功能的促进剂，和(b)在足以改善动物执行认知任务的表现的条件下训练动物，所述动物具有学习、语言或者阅读不能。

本文中所使用的促进剂为具有药理活性的化合物，它们包括药物、化学化合物、离子化合物、有机化合物、有机配体(包括辅因子)、糖、重组的和合成的肽、蛋白质、拟肽、核酸序列(包括基因)、核酸产物、和其它分子和组合物。

例如，促进剂可以是细胞透过性cAMP类似物(例如，8-溴cAMP)、腺苷酸环化酶1(AC1)激活蛋白1(例如，毛喉素)、影响G-蛋白连接受体的药物(例如，但不限于肾上腺素受体和阿片样物质受体以及它们的配体(如，苯乙基胺))、细胞内钙离子浓度的调节剂(例如，毒胡萝卜素、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体激活剂)、导致cAMP降解的磷酸二酯酶抑制剂(例如，磷酸二酯酶1(PDE1)抑制剂(例如，伊菠丁基甲基黄嘌呤(iso-buto-metho-xanthine，IBMX))、磷酸二酯酶2(PDE2)抑制剂(例如，伊菠丁基甲基黄嘌呤(IBMX))、磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂、磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂(例如，环戊苯吡酮、HT0712)等)(还参见，例如美国专利No.6,458,829B1，美国公开No.2002/0028842A1(2002年3月7日公开)；和蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调节因子，其调节CREB蛋白质的激活以及CREB-依赖的基因的表达。促进剂可以是外源性的CREB、CREB类似物、CREB样分子、CREB的生物活性片段、CREB融合蛋白质、编码外源CREB、CREB类似物、CREB样分子、CREB的生物活性片段、CREB融合蛋白质的核酸序列。

促进剂也可以是CREB功能调节因子或者编码CREB功能调节因子的核酸序列。本文中所使用的CREB功能调节因子具有调节CREB途径功能的能力。所谓的“调节”意指变化(增强或者降低)或改变CREB途径功能的能力。

促进剂可以是能够增强CNS中的CREB功能的化合物。这些化合物包括但不限于影响膜的稳定性、流动性以及特异性免疫刺激性的化合物。在特定的实施方式中，促进剂能够短暂地增强CNS中的CREB途径功能。

本文中的CREB类似物或者衍生物被定义为其氨基酸序列与内源性CREB的氨基酸序列类似的蛋白质。本文中的所述的类似的氨基酸序列被定义为与内源性CREB的氨基酸序列具有足够的相同性，以具有内源性CREB的生物活性，但所述的类似的氨基酸序列具有一个或多个“沉默”的变化。CREB类似物包括哺乳动物的CREM、哺乳动物的ATF-1和其它CREB/CREM/ATF-1亚家族成员。

本文中所使用的术语CREB样分子是指具有与CREB相似功能的蛋白质。CREB样分子在氨基酸序列上不必与内源性CREB的序列类似。

CREB的生物活性的多肽片段可以仅包括CREB的全长氨基酸序列的一部分，但具有生物活性。这种片段可以通过去除羧基或者氨基末端以及内部缺失制备。

融合蛋白包括连接到第二部分上的本文所述的CREB蛋白(称为第一部分)，所述第二部分不存在于所述CREB蛋白中。所述第二部分可以是单独的氨基酸、肽或者多肽或者其它有机部分，例如糖、脂质或者无机分子。

本文中的核酸序列被定义为核酸分子的杂聚物。所述核酸分子可以是双链或者单链的，并且可以是脱氧核糖核苷酸(DNA)分子(例如，cDNA或者基因组DNA)或者核糖核苷酸(RNA)分子。这样，例如，所述核酸序列可以是含有一个或多个的外显子，按需要具有或不具有内含子，以及一个或多个适当的调控序列。在一个实施例中，所述核酸分子含有编码所需要的核酸产物的单一可读框。所述核酸序列是“可操作地连接”到适当的启动子上。

编码所需要的CREB蛋白、CREB类似物(包括CREM、ATF-1)、CREB样分子、CREB的生物活性片段、CREB融合蛋白、CREB功能调节因子的核酸序列可以从自然中分离得到，或者通过修饰天然的序列或者从头制备；例如，按照如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York(1998)；和Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd edition，Cold Spring Harbor University Press，New York.(1989)所述的方法制备。可以通过本领域的公知的方法分离核酸或者将其融合在一起的，例如，使用和制备兼容的克隆或者限制性位点。

通常，所述核酸序列可以是编码所需要的CREB蛋白、CREB类似物、CREB样分子、CREB融合蛋白、CREB功能调节因子的基因。通常，这种基因可操作地连接到适当的能够影响CREB蛋白或者CREB功能调节因子的表达的调控序列上，优选影响CNS中的CREB蛋白或者CREB功能调节因子的表达。本文中所使用的术语“可操作地连接”被定义为将基因(或者核酸序列)以能够使该基因(或者核酸序列)表达的方式连接到调控序列上。通常，可操作地连接的意指邻接的。

调控序列包括转录启动子、任选的调控转录的操纵子序列、编码适当信使RNA(mRNA)核糖体结合位点的序列以及调控转录的终止和翻译的序列。在特定的实施方式中，可以使编码CREB蛋白、CREB类似物、CREB样分子、CREB的生物活性片段、CREB融合蛋白、CREB功能调节因子的重组基因受能被诱导或者抑制的启动子的调控，从而更大程度地调控所述产物的水平。

本文中所使用的术语“启动子”通常是指结构基因的编码区的上游(5′)的DNA序列，其通过提供RNA聚合酶和引发转录所需要的其它因子的识别和结合位点来调控编码区的表达。适当的启动子是本领域公知的。启动子的实例包括SV40和人的延长因子(EFI)。其它适当的启动子为本领域易于获得的(参见，例如Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，Inc.，New York(1998)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor University Press，New York(1989)；和美国专利No.5,681,735。

所述促进剂可以通过多种机制促进CREB途径。例如，促进剂可以影响诱导CREB-依赖的基因表达的信号转导途径。CREB-依赖的基因表达的诱导可以通过例如，上调CREB功能的正效应物和/或下调CREB功能的负效应物实现。CREB功能的正效应物包括腺苷酸环化酶和CREB激活蛋白。CREB功能的负效应物包括cAMP磷酸二酯酶(cAMP PDE)和CREB阻抑蛋白。

促进剂可以通过生物化学的方式作用于CREB蛋白的激活蛋白或者阻抑蛋白形式和/或含有转录复合物的CREB蛋白的上游，或者直接作用于CREB蛋白的激活蛋白或者阻抑蛋白形式和/或含有转录复合物的CREB蛋白来促进CREB途径的功能。例如，可以通过提高CREB蛋白的转录水平、转录后水平，或者转录和转录后水平来影响CREB途径的功能；可以通过改变CREB蛋白对转录复合物的其它必要成分(例如，CREB-结合蛋白(CBP蛋白))的亲和力影响CREB途径的功能；通过改变含有CREB蛋白的转录复合物对启动子中的DNA CREB响应元件的亲和力影响CREB途径的功能；或者通过诱导对CREB蛋白异构体的被动的或者主动的免疫性影响CREB途径的功能。促进剂促进CREB途径的功能的具体的机制对于实施本发明并不重要。

促进剂可以以不同的方式直接给予动物。在一个优选的实施方式中，以全身给药的方式给予促进剂。其它的给药途径通常为本领域公知的，包括静脉给药(包括灌输和/或大药丸注射)、脑室内给药、鞘内给药、胃肠外给药、黏膜给药、植入给药、腹膜内给药、口腔给药、皮内给药、透皮给药(例如，以缓释聚合物的形式)、肌肉内给药、皮下给药、局部给药、硬膜外给药等途径。还可以采用其它适当的给药途径，例如，通过上皮或者黏膜皮肤内层(lining)实现吸收。特定的促进剂还可以通过基因治疗的方式给予，其中，通过例如载体将编码特定治疗蛋白质或者肽的DNA分子给予动物，所述载体导致特定的蛋白质或者肽在体内以治疗的水平表达并分泌。

本文中使用的术语载体是指核酸载体，例如，DNA质粒、病毒或者其它适当的复制子(例如，病毒载体)。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、短小病毒(例如，腺伴随病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(如正黏病毒(例如，流感病毒))、棒状病毒(例如，狂犬病毒和疱疹性口腔炎病毒)、副黏病毒(例如，麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒(例如，小RNA病毒和甲病毒)和双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒1型和2型、埃巴病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、禽痘病毒、和肿瘤增殖病毒(canarypox)。其它的病毒包括诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒(flavivirus)、呼肠病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤(avian leukosis-sarcoma)、哺乳动物的C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒(lentivirus)、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and their replication，In Fundamental Virology，ThirdEdition，B.N.Fields，et al.，Eds.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。其它的实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T-细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿免疫缺陷病毒、猿肉瘤病毒、鲁氏肉瘤病毒、和慢病毒(lentivirus)。其它载体的实例描述在，例如McVey等的美国专利No.5,801,030，该专利的教导内容引入本文作为参考。

可以按照本领域公知的方法将编码蛋白质或肽(例如，CREB蛋白、CREB类似物(包括CREM、ATF-1)、CREB样分子、CREB的生物活性片段、CREB融合蛋白、CREB功能调节因子的核酸序列插入到核酸载体中(参见，例如Ausubel et al.，Eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，New York(1998)；Sambrook et al.，Eds.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd edition，Cold Spring Harbor University Press，New York(1989))。

给药的模式优选给药到靶细胞的位置。在特定的实施方式中，给药的靶细胞为给药到神经元。

促进剂可以与其它的生物活性药剂的组分一起给予，例如与药学上可接受的表面活性剂(例如，甘油酯)、赋形剂(例如，乳糖)、稳定剂、防腐剂、保湿剂、润滑剂、抗氧化剂、递体(carrier)、稀释剂和载体(vehicle)。如果需要，还可以添加一些甜味剂、增香剂和/或着色剂。

可以将促进剂制成组合有药学上可以接受的肠胃外的媒介物的溶液、悬浮液、乳液或者冻干粉。这种媒介物的实例为水、盐水、林格溶液、等渗的氯化钠溶液、葡萄糖溶液、和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物(如混合的油)。所述媒介物或者冻干粉可以含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。可以通过常规的技术对所述制剂进行灭菌。适当的药学上的载体描述在Remington′sPharmaceutical Sciences中。

给予动物的促进剂的剂量为导致CREB-依赖的基因(尤其是神经元中的)表达发生变化所需要的量。给予动物的促进剂的剂量(包括给药的频率)取决于各种因素而发生变化，所述因素包括：特定促进剂的药代动力学特征、给药的模式和途径；接受者的身高、年龄、性别、健康状况、体重以及善食状况；被治疗症状的性质和程度或者被增强或者调节的认知功能的性质和程度、共同治疗的种类、治疗频率、和所期望达到的效果。

根据如症状的性质和程度、共同治疗物质的种类和所期望达到的效果，可以以单一剂量或者分开的剂量(例如，间隔几天、几周或者几个月的一系列的剂量)，或者以缓释的形式给予促进剂。可以与本发明组合使用其它的治疗方案或者药剂。

接着将通过以下实施例说明本发明，这些实施例不视为以任何方式进行限制。

实施例

受试者为103只成年的雄性的SD(Sprague-Dawley)大鼠(Taconic，Gremantown，NY)，在试验开始时体重为275-300g。将大鼠单独置于温控动物设施中，明暗周期为12:12小时，动物可以随意摄取食物和水。所有的动物试验方案与NIH指南一致，该动物试验方案是被冷泉港实验室动物护理和使用委员会认可的

交错台阶任务的运动恢复

在本研究中采用的交错台阶任务为按照由Klint等在Journal of Neurotrauma，21st Annual National Neurotrauma Society Symposium，20(10)：(2003)描述的方法进行。交错台阶任务由长8’宽3.5’的跑道组成，在该跑道上连接有一系列的28个升高的台阶。台阶交替地偏离中心线5cm，每两个台阶之间相距25cm。这种布置使得顶部行走平面直接与350g大鼠的正常行走步态一致。在跑道的中央放置一片薄的树脂玻璃(8’长，2.5”宽，2mm厚)，以防止大鼠在台阶之间摇摆，并且可以用作动物的支柱以从台阶的行走表面跌倒时重新获得立足点。树脂玻璃围绕跑道的侧面和顶部以限制动物向侧面或者向上的运动。在跑道的两端连接有黑暗的居住的盒子。在居住的盒子的内部和外部连接有明亮的灯和具有白噪声发生器的扬声器，从而将其围绕于跑道内。使用计算机控制的门以控制从居住的盒子中的进/出。

在第1-13天，训练大鼠，使之适应跑道，并训练它们通过在台阶的顶部表面上步进而自由穿过跑道。一旦熟悉跑道后，使用负的加强训练范例训练动物，使(1)离开居住盒子；(2)穿过跑道；和(3)进入到对面的居住盒子中以结束负的刺激(明亮的灯和白噪声)。在休息60秒后，采用相同的负的加强训练范例训练大鼠回到原来的居住的盒子中。在训练的第14天开始，每天训练大鼠5次，直到它们的表现满足了标准的表现(等待时间＜12秒，并且在3次连续的穿越中，错误1次或者更少)。每一次爪子滑落台阶或者没有落在台阶的顶部表面的直接一步记为一次错误。

在大鼠达到标准后24小时，使用LFP装置损伤大鼠。使动物恢复7天。在损伤后的第8天，采用交错台阶任务检测大鼠的基线表现(穿越3次)。在随后的一天中，将动物随机地分配到5个处理组中的一个中：用载体处理并进行恢复的组(n＝11)、用0.15mg/kg的HT-0712处理并进行恢复的组(n＝13)、用0.1mg/kg的环戊苯吡酮处理并进行恢复的组(n＝11)、用0.15mg/kg的HT-0712处理并且不进行恢复的组(n＝10)、或者用载体处理而没有进行恢复的组(n＝10)。在进行恢复训练前20分钟腹膜内注射(或者对于不进行恢复训练的组每天注射一次)。恢复/注射重复进行了连续8天。在第10天(恢复的最后一天)，不注射，并且检测所有大鼠执行SS任务的表现。

追踪训练

在结束运动恢复后一周，对大鼠进行追踪恐惧的训练。将标准化的大鼠环境(contextual)恐惧训练仪(Med Associates，Inc.，VA)置于黑暗的声音减弱的盒子(Med Associates，Inc.，VA)。在训练日，在开始条件刺激(CS)之前将大鼠置于训练室中2分钟，所述条件刺激为2800Hz的声音(tone)，在75dB持续20秒钟。在声音结束后30秒，给予动物0.5mA震扰(shock)非条件刺激(US)两秒。内部试验间隔(inter-trial interval)分开US结束(offset)与进行的CS。对大鼠训练5对的CS和US。在进行最后一次US后，使大鼠在室内停留另外30秒钟，然后使它回到自己居住的笼子中。在每次试验后，用75％的乙醇和水彻底清洗仪器后，干燥并通风。在训练后7天测试大鼠。为了与训练日的环境相区别，测试在新的声音减弱的室内进行，并且内部的室具有新的大小、颜色、结构和照明。使用Windex溶液代替乙醇来洗涤室。每次检测包括120秒钟的适应，然后20秒钟的声音(CS)，然后是240秒钟的休息间隔，直到CS进行3次。在5秒的间隔中记数冻结(freezing)。冻结被定义为在5秒中有3秒钟完全失去运动。冻结分数的百分比通过在CS后的总的冻结的百分数减去CS前冻结的百分数(在最初的120秒内)计算。拍下每一个试验。在所有的试验中，试验者不知道药物处理和对象的训练情况。

采用反复的新的物体识别进行认知恢复

开放的探测活动场所(黑色的树脂玻璃盒：长80cm，宽60cm，高50cm，间接照亮达55流明)含有一薄层的笼垫，每天开始时更换半新的垫。直接安装在所述活动场所上方的摄相机记录所有训练和测试期。将物体置于所述盒子的中央区域的标记位置，受试者之间的物体的空间位置(左-右侧)被平衡。在OR训练前，每天训练动物4分钟使之对探测活动场所适应，连续进行3天。在训练时，大鼠可以自由地在含有两个相同的物体(例如，烛台)的探测活动场所探测7.5分钟。在训练后24小时，将大鼠放回到探测活动场所5分钟，该探测活动场所具有一个前一天被探测的物体和一个新的具有相似大小的物体。为了便于研究，将一个训练期和24小时后的测试期称为一次“试验”。在完成一次试验后的一天(24小时)，用新的一组相同的物体对动物进行训练开始新的试验，在第二天进行测试期。在进行认知恢复的过程中，对大鼠进行训练或者测试而没有任何天的休息。对每只大鼠共进行了17对的物体(5对在损伤之前进行的，13对在损伤之后进行的)训练。在训练中，记录接近的次数以及探测每一个物体所花费的时间。在测试时，记录探测每一个物体的所花费的时间。用探测新的物体和旧的物体所花费的时间，使用以下的公式((新的物体-旧的物体)/(新的物体+旧的物体))*100)，计算辨别指数。

认知恢复的时间过程如下：参见图1为恢复过程的代表图：第1-10天：试验1-5，损伤前分析；第11天：诱导试验的创伤性脑损伤(TBI)；第12-18天：从TBI恢复；第19-20天：试验6，损伤后基线(BS1)；第21-22天：试验7，用药物训练(TD1)；第23天：试验8，短程记忆(STM)测试，在训练与测试之间4小时间隔，并不给予药物；第24-25天：试验9，在用药物辅助恢复前建立第二基线(BS2)表现；第26-34天：试验10-14，用药物辅助认知恢复(在训练前20给药)；第35-36天：试验15，在训练时不给药的第一次恢复后记忆评价(Ass1)；第42-43天：试验16，在休息1周后的第二次恢复后记忆评价(Ass2)；第79-79天：试验17，在休息5周后的第三次恢复后记忆评价(Ass3)；第85天：追踪训练；第92天：追踪训练测试。

诱导创伤性脑损伤

使用良好表征的侧位液压冲击模式(LFP)方法产生创伤性脑损伤(Mcintosh et al.，Neuroscience，28(1)：233-44(1989)，Hallam et al.，JNeurotrauma，21(5)：521-39(2004)。简单地说，将大鼠麻醉，插管，并用外科手术用的空气作为载体气体机械通入2％的异氟醚。监控体温，采用反馈温度控制装置(Physitemp Instruments，Clifton，New Jersey)将体温维持在37.5±0.5℃。沿着头皮中线切开，在后囟点和前囟点之间的中间切开4.8mm的圆形的颅骨，距中心缝合线的右侧3.0mm。通过氰丙烯酸粘合剂(cyanoacrylicadhesive)和牙丙烯酸粘合剂(dental acrylic)将一个改进的leur-lock连接器(外伤套管，内部直径为2.6mm)缝合到颅骨切开部位。通过用液压冲击装置(VCU Biomedical Engineering，Richmond，VA)快速地将少量的盐水注射到闭合的脑腔中产生TBI。然后，将动物移开装置，并除去丙烯酸粘合剂和套管，缝合切口。用不含有异氟醚的室内空气继续通风直到动物自动地恢复呼吸。调节LFP装置以校准至严重的(3.2atm)脑损伤。这种脑损伤导致34％的死亡率(对于OR研究，30中大鼠存活22只，对于SS研究，85只大鼠中存活57只)。

药物的制备和注射

PDE4抑制剂HT-0712(0.15mg/kg)或环戊苯吡酮(0.1mg/kg)通过以盐水作为载体给予，该盐水中含有1.5％二甲亚砜(DMSO)and和10％的克雷莫福。根据以前的研究，选择的剂量为0.15mg/kg的HT-0712对于促进大鼠运动记忆的恢复是最有效的剂量(McDonald et al.，Society for Neuroscience，Vol.24，Abstract 681.7.(2004)。

统计学分析

所有的数据均表示为平均值±SEM。使用SPSS 12.0软件(SPSS，Chicago，Illinois)进行数据分析。对于所有的测试，显著性水平的标准为P＜0.05。为了比较损伤前和损伤后在交错台阶上的表现，采用配对t检验对所有组进行分析。采用ANOVA对组之间进行损伤后基线(第1天)和进行恢复后运动评价(第10天)进行分析。为了分析交错台阶恢复(第2-10天)，使用ANOVA以日作为受试者内的重复变量分析因变量(步伐错误或者等待时间)。采用Dunnett′s post-hoc检验确定注射载体与注射药物组之间的统计学差异。为了分析物体识别和追踪训练数据，使用Student′s非配对/检验在每一测试日的组之间进行比较。

结果

PDE4抑制剂促进运动恢复

我们以前的对正常的、年轻的成年小鼠的研究表明PDE4抑制剂HT-0712和环戊苯吡酮促进长时程记忆的形成(Bourtchouladze R.，et al.(2003)A mouse model of Rubinstein Taybi Syndrome：defective long-term memory isameliorated by inhibitors of phosphodiesterase 4.Proceedings of the NationalAcademy of Science U.S.A.100：10518-10522；Scott R.，et al.，(2002)CREB andthe discovery of cognitive enhancers.Journal of Molecular Neuroscience 19：171-177；Tully T.，et al.(2003)Targeting the CREB pathway for memoryenhancers.Nature Reviews Drug Discovery 2：267-77)。具体地说，这些药物通过减少获得最好的长时程记忆所需要的训练的量促进记忆的形成。而这些PDE4抑制剂可以通过减少恢复熟练运动功能所需要的恢复的量促进运动的恢复。为了达到那种效果，训练大鼠达到熟练的运动任务、交错台阶任务的标准表现。在大鼠达到标准表现后，采用LFP脑损伤设备损伤大鼠，并使之恢复一周。在损伤后7天(恢复的第一天)，与损伤前的基线比较，所有的脑损伤组在步态和熟练运动步进准确性上明显降低，这通过显著增加的步伐错误(t＝-18.36，p＝4.28e^-25)(图2A)和穿过等待时间(t＝-13.52，p＝7.86e^-19)(图2B)确定的。恢复第一天的ANOVA表明处理组之间的损伤后的基线表现没有显著差异(F_4，50＝0.646，p＝0.632)。接下来的一天天，将大鼠随机地分配到每天给予载体/抑制剂并进行恢复或者每天注射载体/PDE4抑制剂并且不进行恢复。对于接受恢复的大鼠，观察到药物处理对于交错台阶错误(F_2，32＝7.50，p＝0.02)和等待时间具有显著的影响。Dunnett post-hoc分析揭示了HT-0712组(p＝0.008)和环戊苯吡酮组(p＝0.004)的表现显著优于载体处理组。

此外，评价了每天注射载体/HT-0712并且不进行恢复的大鼠是否在最后的测试日改善了表现。在第10天的ANOVA比较表明具有显著的治疗效果(F_4，50＝10.11，p＝0.00004)。Post-hoc Bonferroni分析揭示载体组之间没有显著的差异(p＝1.0)，PDE4抑制剂组之间没有显著差异(p＝1.0)。然而，每天注射PDE4抑制剂的所有组的表现明显优于每天注射载体的对照组的表现(没有给出所有的比较)。具体地说，给予HT-0712而没有进行恢复的组的表现显著优于给予载体并且不进行恢复的组的表现(p＝0.01)，并明显优于给予载体并进行恢复的组的表现(p＝.028)。

PDE4抑制剂促进认知恢复

我们以前的实验表明PDE4抑制剂环戊苯吡酮和HT-0712能改善小鼠(尤其是CBP^+/-突变小鼠)的长时程记忆缺陷。这些CBP^+/-突变小鼠是鲁宾斯坦综合征的小鼠模型，这些小鼠由于在CREB途径中存在的分子损害导致了记忆缺陷(Bourtchouladze et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.，100(18)：10518-22，(2003)；Olike et al.，Hum Mol Genet.8(3)：387-96.(1999))。在训练时给予PDE4抑制剂HT-0712能将长时程记忆功能回复到与野生型小鼠相似的水平。大量的研究表明LFP损伤的大鼠存在长时程记忆缺陷(引用)。检测了两种主要的假设：(1)在训练时给予一次PDE4抑制剂HT-0712是否能改善脑损伤大鼠的记忆缺陷；和(2)是否可以使用PDE4抑制剂HT-0712促进脑损伤的大鼠的认知恢复。为了检测这些假设，需要的任务是：1)需要长时程记忆的形成；2)反复训练并检测记忆力；和3)确保单独的试验的表现不会被以前的试验的记忆能力干扰。物体识别任务满足上述的所有要求。物体识别不是令人厌烦的任务，该任务依赖于大鼠的天然的探测行为。在训练该项任务时，使大鼠置于两个相同的物体前。如果给予足够暴露(训练时间)，正常的大鼠对探测的物体形成LTM。当将大鼠置于两个不同的物体前(即，一个新的物体和一个以前探测的物体)时，大鼠在探测新物体上将花费较多的时间(引用)。可以通过使动物连续地接触不同组的新物体对相同的动物反复执行这项任务。因此，物体识别是检测上述假设的理想的任务。

在损伤前，对大鼠进行5次训练/测试试验，在训练后24小时检测物体识别记忆。对于所有的试验，大鼠对以前探测的物体留有记忆，并且偏爱新的物体(图3E)。在后来给予药物或者载体组之间记忆能力没有显著差异(图3E)。因此，对损伤前每一组的所有区别指数进行平均，获得每一组的损伤前的基线表现能力(图3A)。各组之间仍然没有显著差异(p＝0.391)。在试验5结束时，用LFP设备对大鼠进行损伤，并使之恢复7天。在损伤后的第一次基线试验中(图3B)，两组均表现出对物体识别的长时程记忆缺陷。各组之间对于第一次基线评价没有显著的统计学差异。因此，试验的脑损伤导致了对物体识别的记忆缺陷。

然后，对PDE4抑制剂HT-0712是否能促进脑损伤大鼠对物体识别的长时程记忆能力进行确定。将大鼠随机地分配到处理组，并在训练期前20分钟给大鼠注射载体或者HT-0712。在测试后，接受HT-0712的组的表现出偏爱新的物体，并且其表现显著优于给予载体的组的表现(p＝0.001)(图3B)。因此，单给予PDE4抑制剂HT-0712能够改善脑损伤大鼠的长时程记忆缺陷。

然后，对这些大鼠除了存在长时程记忆缺陷外是否还存在异常的短时程记忆进行确定。为了检测这一点，对两组(不给予药物)进行训练，并检测它们短时程(4小时)的记忆保持能力。在训练后4小时，两组都能记住以前探测过的物体，并且都偏爱新的物体。各组之间没有显著的区别(p＝0.311)。因此，LFP损伤损害了大鼠对物体识别的长时程记忆，但是对它们的短时程记忆没有影响，这些大鼠在训练后4小时表现正常。

为了确定单给予HT-0712是否能够改变大鼠的长时程记忆能力，在不注射药物或者载体的情况下进行第二次训练(图4A，第0天)。在检测时，载体组和和HT-0712组(p＝0.607)之间没有显著差异。这表明尽管单注射HT-0712能够改善试验的长时程记忆，单给予药物不能改善动物的物体识别记忆的缺陷。

开始进行用HT-0712处理的药物辅助认知恢复。对大鼠进行5次的OR训练/测试的试验。在每一次训练期前20分钟给予大鼠载体或者HT-0712。在恢复的第1天(p＝0.001)、第2天(p＝0.001)、第3天(p＝0.007)、和第5天(p＝0.001)，HT-0712组的表现明显优于载体组。

为了评价在药物辅助认知恢复后的长时程记忆功能的任何的改进，在不进行药物处理的情况下对大鼠进行训练/测试。接受HT-0712辅助恢复的组的表现明显优于接受载体的组(p＝0.003)(图4B)。这暗示在反复的认知恢复过程中给予PDE4抑制剂HT-0712能够改善脑损伤的大鼠对于物体识别的长时程记忆缺陷。

确定对观察的改善长时程记忆缺陷是由于反复给予HT-0712的亚急性效果导致的还是由于真正的恢复效果导致的。因此，让大鼠休息1周，然后在不给药的情况下评价长时程记忆功能。PDE4仍然保持辅助认知恢复的效果，并且HT-0712组的表现优于载体处理组(p＝0.04)(图4C)。

为了确定这种效果是否能持续较长的时间，让大鼠休息7周。对大鼠进行训练，使之重新适应OR活动场所。在重新适应后(恢复训练结束后8周)，检测大鼠的OR表现。仍然是接受HT-0712辅助恢复训练的组的表现明显优于接受载体的组的表现(图5A)。由此可以得出两个结论：首先，LFP脑损伤导致了对于物体识别任务的长时程记忆的长久缺陷；以及，其次，HT-0712辅助认知恢复可以改善对于物体识别任务的长时程记忆缺陷。

为了确定这种恢复是物体识别能力特异性的或者它能推广到其它海马依赖的任务，检测大鼠对追踪恐惧训练任务的记忆能力。在这种海马依赖的任务中，训练大鼠使之将声音(CS)和震扰(US)相联系。采用30秒钟的“追踪”间隔分离CS和US，产生海马依赖的任务(McEcheron et al.，Hippocampus，8(6)：638-46，(1998)。当在训练一周后检测大鼠时，接受HT-0712辅助认知恢复的组的表现明显优于载体组的表现(p＝0.012)(图5B)。这暗示HT-0712辅助认知恢复能推广到第二种海马依赖的任务。

由于认知恢复可以从一种海马依赖的任务推广到另一种海马依赖的任务，确定PDE4辅助恢复是否对于恢复的方法是特异的，或者它能否推广到在多种形式中都能获得改善。具体地说，也接受PDE4辅助运动恢复的动物是否还能改善对于非运动的任务的记忆能力？为了解决这一问题，在PDE4辅助运动恢复1周后，对进行了运动恢复的大鼠进行追踪恐惧任务的训练，在1周后进行检测。运动恢复的任何组之间没有显著差异(p＝0.185)(图5C)。

对进行运动恢复的动物和对于追踪恐惧记忆的认知恢复的动物直接进行统计学比较是存在问题的。在运动恢复组中观察更大的CS前的冻结(数据未显示)。可能是由于对运动的动物在交错台阶任务中用负的加强训练范式导致的结果，动物对任何非居住的笼子的环境具有不能适应特殊环境的提高的恐惧。这种提高了的不能适应特殊环境的恐惧表现为冻结，这可能掩盖了任何处理的效果。

在本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请通过引用的方式并入本文，它们引入的程度使这些出版物、专利和专利申请似乎是通过引用的方式具体而分别地并入。

尽管本发明参照优选的实施方式进行了详细的说明和描述，本领域的技术人员可以理解的是可以作出各种形式和细节的改变而不偏离所附权利要求所涵盖的本发明的范围。

Claims (7)

1.磷酸二酯酶4(PDE4)抑制剂在制备在不进行正规的认知训练的情况下通过将所述抑制剂给予动物并改善动物特定运动任务的表现而改善所述动物中与中枢神经系统(CNS)病症相关的运动缺陷的药物中的应用，其中所述抑制剂选自环戊苯吡酮或如式I所示的化合物或其对映体或混合物：

式I

其中"Me"为“甲基”，"cPent"为“环戊基”。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述运动任务是熟练运动任务。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述CNS病症是外伤性脑损伤。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述外伤性脑损伤选自中风和缺血，包括缺血中风；脑外伤，包括硬膜下血肿和脑肿瘤；脑损伤；由于冠状动脉旁路接枝(CABG)外科手术导致的并发症；神经毒性；兴奋毒性；和癫痫发作。

5.根据权利要求2所述的应用，其中所述CNS病症是外伤性脑损伤。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述抑制剂包含以下结构：

其中"Me"为“甲基”，"cPent"为“环戊基”。

7.权利要求1-6任一项的应用，其中所述动物是人。

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