CN101490270A - 用于穿越血脑屏障并进入脑部癌细胞的转运剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于将货物化合物递送到脑部癌细胞中和/或穿越血脑屏障的方法和物质。所述货物化合物的递送是通过使用源于奈瑟氏球菌属外膜蛋白例如Laz的蛋白质转运肽而实现的。本发明还提供了由五肽AAEAP组成的合成转运肽。本发明进一步公开了治疗癌症、特别是脑部癌症以及其他脑部相关疾病的方法。进一步地，本发明提供了成像和诊断癌症、特别是脑部癌症的方法。

Description

用于穿越血脑屏障并进入脑部癌细胞的转运剂及其使用方法

相关的申请

本申请根据35 U.S.C.§§119和120要求2006年7月6日提交的名为“用于穿越血脑屏障并进入脑部癌细胞的转运试剂及其使用方法”的美国临时专利申请NO.60/818,510、2005年7月19日提交的美国临时专利申请No.60/700,297、2005年10月6日提交的美国专利申请No.11/244,105的优先权。这些申请的完整内容通过引用完全合并在此。

政府利益的声明

本申请的主题得到来自国家卫生研究所(NIH)，Bethesda，Maryland，U.S.A.的支持(拨款编号ES04050-18)。在本发明中政府可拥有某些权力。

背景

用于脑部的新药的开发比用于身体其他部分的药物进展要慢得多。这种缓慢的进展大部分是由于大多数药物不能穿越形成血脑屏障(BBB)的脑毛细血管壁进入脑部。大约100％的大分子药物和大于98％的小分子药物不能穿越BBB。仅仅一小类药物、具有高度脂溶解性以及分子量小于400-500道尔顿的小分子实际地穿越BBB。在穿越BBB的小分子中，仅有很小的百分比以药学上有意义的量穿越BBB。(Pardridge，MolecularInnovations 3：90-103(2003))

仅有少数脑部的疾病响应可以穿越BBB的小分子药物，例如抑郁症、情感障碍、慢性疼痛和癫痫症。远远更多的脑部疾病不响应常规的脂可溶小分子量药物，例如阿尔茨海默病、中风/神经保护、脑和脊髓损伤、脑癌、脑部的HIV感染、各种产生共济失调的失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、影响脑部的儿童先天遗传性错误、帕金森氏病和多发性硬化。即使可获得有效的小分子药物的少数脑部疾病也需要进一步的研究和新的、改进的药物的开发。同上。

特别难以治疗的是脑部的癌症。脑中癌症的常见形式是多形性成胶质细胞瘤(GBM)和间变性星形细胞瘤(AA)。患有GBM的患者的平均存活是大约10到12个月，而患有AA的患者的平均存活是3到4年。对于患有GBM的患者，手术将延长他们的生命仅数月。(Kufe et al.，CancerMedicine，§§23 and 83，(6^thed.BC Decker，2003))通过手术和局部放射治疗GBM的大多数情况产生原始肿瘤边缘的2到4cm内的复发。同上。

施用不能穿越BBB的药物进入脑部的当前方法包括通过颅骨切开术、在头部钻孔的方法以及通过侧脑室内(ICV)或脑内(IC)注射的药物施用。对于IC施用，药物存留在针的尖端处沉积的位置上。对于ICV施用，药物分布仅仅远至同侧脑室的室管膜表面，不能显著地穿透进入脑实质。因此，IVC和IC施用方法到达低于1％的脑体积，仅有少数的脑部疾病可以通过这种有限的穿透来治疗。同上。

相比之下，药物递送的穿血管途径可以治疗实际上100％的脑部神经元。因为每个神经元通过它自己的血管灌注，穿血管施用的药物可以在跨越BBB后到达每个神经元。然而，由于没有容许药物穿越BBB的药物靶向系统，穿血管施用途径对于绝大多数药物候选物是不可用的。

尽管大多数药物和其他分子不能穿越BBB，已知某些细菌和真菌/病毒病原体穿越BBB引起感染。(Nassif，et al.，Trends Microbiol.10：227-232(2002))这些细菌性病原体可以是细胞外的，例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和大肠杆菌(Escherichia coli)K-1，或细胞内的，例如单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes)或结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。细胞内病原体主要通过隐藏在感染的白细胞内部侵入脑脊膜，细胞外病原体通过首先散布在血流中然后直接与脑内皮的腔侧相互作用、从而破坏脑部微血管内皮细胞的紧密连接来进入中枢神经系统。(Nassif et al.，同上；Drevets & Leenen，Microbes Infect.2：1609-1618(2000)；Kim，Subcell.Biochem.33：47-59(2000))这种相互作用容许病原体侵入脑脊膜引起脑膜炎。利用体外的穿越BBB的单层和双层模型以及分离不能通过这种模型单层或双层的细菌突变体，多种细菌蛋白已经总体上与BBB的侵入和穿越相关联。(Huang & Jong，Cell.Microbiol.3：277-287(2001))例如，E.coli K-1基因例如ibeA、ibeB、aslA、yijP和ompA，或编码蛋白如IV型菌毛、Ope、Opa的脑膜炎奈瑟氏球菌基因等等，以及病毒蛋白例如HIV表面蛋白gp120，都已经被认为容许对BBB的有效侵入和穿越以引起感染。对于细胞外的细菌性病原体来说，这些蛋白被认为容许粘附和随后的BBB突破用以侵入脑脊膜。(Nassif et al.，同上；Huang & Jong，同上。)没有单个的细菌表面蛋白被证明促进紧密连接的破坏以容许穿越BBB。

天青蛋白(azurin)样基因存在于许多淋球菌和脑膜炎球菌中，例如淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌。(Gotschlich & Seiff，FEMS Microbiol.Lett.43：253-255(1987)；Kawula，et al.，Mol.Microbiol.1：179-185(1987))天青蛋白由许多病原菌产生，在这些基因之间存在显著的序列同源性。(Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))称为“H.8”的蛋白表位在病原性奈瑟氏球菌之中是保守的，通过称为H.8的单克隆抗体的结合来检测。两种不同的淋球菌基因，laz和lip，编码与H.8单克隆抗体交叉反应的蛋白质。(Hayashi & Wu，J.Bioenerg.Biomembr.22：451-471(1990))

许多病原体具有天青蛋白样蛋白，但奈瑟氏球菌属是独特的，具有附着其上的H.8区域。Laz和Lip是淋球菌外表面蛋白，其含有信号肽脂蛋白共有序列，所述共有序列由细菌酶信号肽酶II识别，其加工该序列以产生半胱氨酸残基与脂肪酸和甘油的N-末端酰化作用。(Hayashi & Wu，同上；Yamada，etal.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005)).Lip脂蛋白，约6.3kDa，几乎完全由基序Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(AAEAP(SEQ ID NO：25))的五肽重复构成，而Laz脂蛋白，约17kDa，在N-末端包含一39个氨基酸的区域，其含有不完全的AAEAP(SEQ ID NO：25)重复。(Gotschlich & Seiff，同上；Kawula，et al.，同上；Woods et al.，Mol.Microbiiol.3：43-48(1989)).在Laz中在这39个氨基酸N-末端区域之外是与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)天青蛋白高度同源的127个氨基酸的区域。(Cannon，Clin.Microbiol.Rev.2：S1-S4(1989))Laz参与对抗氧化性逆境和铜毒性的防御，并提高体外原代人类宫颈上皮分析中的存活率。(Wu，et al.，Infect.Immun.73：8444-8448(2005))

第三种淋球菌外膜蛋白Pan1也具有AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复基序。(Hoehn and Clark，Infection and Immunity，60：4704-4708(1992))Lip的大小在不同的奈瑟氏球菌属菌株中不同。在菌株FA 1090中，Lip长度是71个氨基酸，具有AAEAP(SEQ ID NO：25)的13个重复和不是重复的一部分的六个氨基酸。在菌株R10中，Lip长度是76个氨基酸，具有14个AAEAP(SEQ ID NO：25)重复。(Cannon，同上)纯化的Lip肽是强力的炎性调节剂，能够诱导永生的人类子宫颈内上皮细胞释放趋化因子白细胞介素-8(IL-8)和细胞因子IL-6，和用toll样受体2转染的人类胚肾293细胞产生IL-8和活化转录因子NF-κB。(Fisette，et al.，J.Biol.Chem.278：46252-46260(2003))

鉴于全世界大量的患有严重脑部和脊髓病症的患者，需要的是可以携带亲水性分子和大分子穿越BBB的转运系统。优选地，这种递送系统将具有高度的特异性以容许药物靶向脑部而不产生一般性渗漏的BBB。进一步地，成功的递送系统将一般是良性的，并且容许在患者中重复使用该系统而没有不希望的副作用。在某些情况下，成功的递送系统将同样地将药物递送到脑部的所有区域。在其它情况下，递送系统将特异性地将药物递送到脑部癌细胞。

发明概述

本发明提供了来自奈瑟氏球菌属外膜蛋白的转运肽，其可以促进附着的或相连的货物化合物(cargo compound)转运进入脑部癌细胞和/或穿越血脑屏障。本发明还提供了转运肽和它的货物化合物的复合物，以及使用所述复合物和所述转运肽来诊断和治疗脑部癌症以及诊断和治疗其他与脑部相关的疾病的方法。最后，本发明提供了包含所述转运肽和/或复合物、和/或编码它们的核酸的试剂盒。

本发明的一个方面是分离的转运肽，其是来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan1的变体、衍生物或结构等效物，并且其促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。Laz的H.8区域(SEQ ID NO：24)可以与这些转运肽具有至少90％的氨基酸同一性。在某些实施方式中，所述转运肽是SEQ ID NO：24。在其他实施方式中，所述转运肽可以被修饰以延长或优化所述肽在血流中的半衰期。

本发明的另一个方面是转运肽，其包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQID NO：25)的至少4个不完全或完全重复组成的区域，该区域的每个总长度具有至少约50％的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复。在某些实施方式中，所述不完全或完全重复的区域至少约90％地相同于包含相同数量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQ ID NO：25)重复的肽。在某些实施方式中，这些转运肽是合成的。在其他实施方式中，这些转运肽可以被修饰以延长或优化这些肽在血流中的半衰期。

本发明的另一个方面是包含连接到转运肽的至少一个货物化合物的复合物，所述转运肽包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQ ID NO：25)的至少4个不完全或完全重复组成的区域，其中这个区域不包含低于约50％的所述肽。本发明的另一个方面是包含与来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan 1的变体、衍生物或结构等效物连接的至少一种货物化合物的复合物，所述变体、衍生物或结构等效物促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。在某些实施方式中，所述货物化合物是铜氧还蛋白(cupredoxin)，例如天青蛋白、质体蓝素(plastocyanin)、铁硫菌蓝蛋白(rusticyanin)、假天青蛋白(pseudoazurin)、橙绿屈挠素(auracyanin)和天青蛋白样蛋白，特别是来自铜绿假单胞菌的天青蛋白。在其他实施方式中，所述复合物被修饰以延长或优化所述肽在血流中的半衰期。这种复合物可以另外包含铜氧还蛋白衍生的转运肽。

这种复合物的货物化合物可以是蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、染料、微粒、纳粒、毒素和药物。在某些实施方式中，所述货物化合物是蛋白质，所述复合物是融合蛋白。在其他实施方式中，所述货物化合物是毒素。所述货物化合物可以是用于抑郁症、情感障碍、慢性疼痛、癫痫症、阿尔茨海默病、中风/神经保护、脑和脊髓损伤、脑部癌症、脑的HIV感染、各种产生共济失调的失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、影响脑部的儿童先天遗传性错误、帕金森氏病和/或多发性硬化的治疗的治疗剂。所述货物化合物可以是可检测物质，例如通过荧光测定、显微镜检查、X射线CT、MRI和/或超声可检测的物质。

在某些实施方式中，所述复合物处在药学上适合的载体中。所述药学上适合的载体可以是用于静脉内施用的。在其他实施方式中，所述药学上可接受的载体适合于侧脑室内或脑内的注射。

本发明的另一个方面是一种方法，包括使一或多个细胞与复合物接触，所述复合物包含与来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan1的变体、衍生物或结构等效物连接的至少一种货物化合物，所述变体、衍生物或结构等效物促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。所述细胞可以来自中枢神经系统的肿瘤，特别是星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、脊髓肿瘤、神经节神经胶质瘤、神经细胞瘤或髓母细胞瘤。

本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其中本发明的复合物以治疗有效量施用给患者。在某些实施方式中，所述复合物静脉内地、体表地、皮下地、肌内地施用或施用到细胞或肿瘤中。在其他实施方式中，所述复合物与另一种癌症治疗共同施用。

本发明的另一个方面是在患者中使癌症成像的方法，包括向患者施用具有可检测的货物化合物的复合物，以及检测在所述患者内所述货物化合物的位置。在某些情况下，所述货物化合物是X射线造影剂，其通过X射线CT检测。在其它情况下，所述货物化合物是磁共振成像造影剂，其通过MRI检测。在其它情况下，所述货物化合物是超声造影剂，其通过超声成像检测。

本发明的另一个方面是诊断癌症的方法，包括使细胞与具有可检测的货物化合物的本发明的复合物接触并检测所述货物化合物。

本发明的另一个方面是一种试剂盒，包含试剂与分离的转运肽，所述转运肽是来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan 1的变体、衍生物或结构等效物，并且其促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包含试剂，所述试剂包含药学上可接受的载体。在其他实施方式中，所述试剂盒包含用于所述试剂的施用的工具。

本发明的另一个方面是核酸分子。在某些实施方式中，所述核酸编码分离的转运肽，其是来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan 1的变体、衍生物或结构等效物，并且其促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。在其他实施方式中，所述核酸编码转运肽，所述转运肽包含由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQ ID NO：25)的至少4个不完全或完全重复组成的区域，其中这个区域不包含低于约50％的所述肽。在其他实施方式中，所述核酸编码包含融合蛋白的复合物，所述融合蛋白包含与转运肽连接的至少一种蛋白质货物化合物。

本发明的另一个方面是治疗或诊断患有与脑部相关的疾病的患者的方法，包括向所述患者共同施用本发明的转运肽和至少一种货物化合物。在其他实施方式中，铜氧还蛋白衍生的转运肽与所述转运肽和/或货物化合物共同施用。

序列的简要说明

SEQ ID NO：1是淋球菌laz基因的基因组DNA编码序列，Genbank登录号Y00530。

SEQ ID NO：2是铜绿假单胞菌天青蛋白基因的基因组DNA编码序列。

SEQ ID NO：3是淋球菌laz基因的H.8区域的基因组DNA编码序列。

SEQ ID NO：4是PCR扩增淋球菌的Laz编码基因(laz)的正向引物。

SEQ ID NO：5是PCR扩增淋球菌的Laz编码基因(laz)的反向引物。

SEQ ID NO：6是PCR扩增pUC18-laz的3.1kb片段的正向引物。

SEQ ID NO：7是PCR扩增pUC18-laz的3.1kb片段的反向引物。

SEQ ID NO：8是PCR扩增pUC19-paz的0.4kb片段的正向引物。

SEQ ID NO：9是PCR扩增pUC19-paz的0.4kb片段的反向引物。

SEQ ID NO：10是PCR扩增pUC19-paz的3.3kb片段的正向引物。

SEQ ID NO：11是PCR扩增pUC19-paz的3.3kb片段的反向引物。

SEQ ID NO：12是PCR扩增pUC18-laz的0.13kb片段的正向引物。

SEQ ID NO：13是PCR扩增pUC18-laz的0.13kb片段的反向引物。

SEQ ID NO：14是PCR扩增来自pGEX-5X-3的GST编码基因的正向引物。

SEQ ID NO：15是PCR扩增来自pGEX-5X-3的GST编码基因的反向引物。

SEQ ID NO：16是PCR扩增来自pUC18-laz的信号肽和H.8编码区的正向引物。

SEQ ID NO：17是PCR扩增来自pUC18-laz的信号肽和H.8编码区的反向引物。

SEQ ID NO：18是PCR扩增来自pUC18-laz的H.8编码区的正向引物。

SEQ ID NO：19是PCR扩增来自pUC18-laz的H.8编码区的反向引物。

SEQ ID NO：20是PCR扩增来自pGEX-5X-3-H.8的GST-H.8融合区域的正向引物。

SEQ ID NO：21是PCR扩增来自pGEX-5X-3-H.8的GST-H.8融合区域的反向引物。

SEQ ID NO：22是淋球菌菌株F62 Laz蛋白的氨基酸序列，Genbank登录号Y00530。

SEQ ID NO：23是铜绿假单胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是来自淋球菌F62 Laz蛋白的H.8区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是五肽基序的氨基酸序列。

附图的简要说明

图1.图1描绘了来自淋球菌的laz(A)和来自铜绿假单胞菌的paz(B)的示意图。用于在E.coli中克隆和超表达的铜绿假单胞菌天青蛋白基因由天青蛋白基因本身(paz)和确定它的周质位置的信号肽(psp)序列组成(B)。laz的H.8区域框内克隆到包括奈瑟氏球菌属信号序列nsp的paz基因的5′-末端(C)(pUC18-H.8-laz)或paz基因的3′-末端(D)(pUC19-paz-H.8)。制备构建体的详细步骤在实施例1中给出。naz，在laz基因中存在的淋球菌的天青蛋白样序列；nsp，奈瑟氏球菌属信号肽序列。两种情况中的信号肽序列都被切割以产生成熟的Paz(周质)蛋白和Laz(表面暴露的)蛋白。(E)，Laz、Paz和融合蛋白的SDS-PAGE。H.8融合蛋白例如Laz、H.8-Paz或Paz-H.8(都大约17kDa)的不规则迁移先前已经在脂质化(lapidated)的含H.8蛋白中注意到了(Cannon，Clin.Microbiol.Rev.2：S1-S4(1989)；Fisette，et al.，J.Biol.Chem.278：46252-46260(2003))。

图2.图2描绘了说明H.8-Paz融合蛋白对各种癌细胞的细胞毒性程度的图表。(A)合成的H.8肽、Paz、Laz和在Paz的羧基末端的H.8融合物(Paz-H.8)和Paz的氨基末端的H.8融合物(H.8-Paz)对成胶质细胞瘤LN-229细胞的细胞毒性。以3种不同浓度(10、20和40μM)的所述蛋白处理细胞6、12和24h。进行MTT分析来测量活细胞的程度以计算细胞毒性(细胞死亡百分比)。为了计算细胞毒性百分比，采用未处理的活细胞的值作为100％，在Paz、Laz和H.8融合蛋白处理的样品中测量活细胞的数量。然后根据死细胞的数量确定细胞毒性的程度(％)。(B)H.8肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz对人类乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性。所有处理条件与上述的(A)类似。

图3.图3描绘了各种荧光标记的天青蛋白相关蛋白对成胶质细胞瘤LN-229和乳腺癌MCF-7细胞的进入。(A)与Alexa 

568结合的H.8肽、Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz(各20μM)在盖玻片上与LN-229细胞在37℃温育30分钟，之后采集图像。(B)由共焦显微镜检查显现的、如(A)所描述的、与Alexa 568结合的各种蛋白进入MCF-7细胞的内在化。(C)由共焦显微镜检查显现Laz的内在化。不同浓度(2、4、8和18μM)的荧光标记的Laz在37℃与LN-229细胞温育30分钟。核用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)标记成蓝色。(D)与Alexa 

 568结合的Laz(10μM)与LN-229细胞在37℃温育各种时间(5、10、20和30分钟)。通过共焦显微镜检查显现内在化。(E)与Alexa 

 568结合的Paz(10μM)在盖玻片上在37℃与LN-229细胞温育各种时间，之后采集图像。在(E)中检测到非常少的可测量荧光。

图4.图4描绘了柱形图，其标明了图3A-D中共焦显微镜图像中发现的荧光的定量。(A)在图3A中图像中的荧光定量。使用

进行天青蛋白中的荧光的定量。误差柱代表单个样本中三种不同细胞中荧光的标准偏差。(B)附图3B中图像中的荧光定量。如附图4A中进行定量。(C)在图3C中图像中的荧光数量。如图4A中进行定量。(D)在附图3D中图像中的荧光定量。如附图4A中进行定量。

图5.使用H.8-GST融合蛋白的组合处理促进成胶质细胞瘤LN-229细胞中Alexa 

 568标记的Paz的摄取。未标记的20μM(A)H.8、(B)GST、(C)GST-H.8、(D)H.8-GST、(E)PBS缓冲液和20μM与Alexa

 568结合的Paz在37℃与LN-229细胞温育30分钟。通过共焦显微镜检查显现内在化。(F)有或者没有Paz的合成的H.8肽、GST以及GST-H.8/H.8-GST融合衍生物的细胞毒性。大约5×10³个LN-229细胞接种到96孔培养皿中，用有20μM Paz(+Paz)或没有20μM Paz(-Paz)的各20μMH.8肽、GST、GST-H.8、H.8-GST或相同体积的PBS缓冲液处理。图6.图6描绘了用与

 800CW(LI-COR Biotechnology，Lincoln，Nebraska)结合的Paz、H.8-Paz和Laz注射的小鼠的脑部图像。(A)来自活小鼠的脑部图像。将500μg的与

 800CW结合的Paz、H.8-Paz和Laz腹膜内注射到活的裸鼠中。24h后，处死小鼠，取出脑，检测荧光并使用LI-COR 红外成像系统测量。(B)如(A)中处理的裸鼠脑的中脑外侧(rostral mesencephalon)区域图像。水平地切割小鼠脑，采集图像。

图7.图8描绘了E.coli中H.8-Gst融合蛋白的SDS-PAGE、Western印迹和定位的共焦显微镜图像。具有克隆的gst、H.8-gst或gst-H.8基因的E.coliBL21(DE3)细胞在37℃用0.1mM IPTG培养。细胞团用PBS洗涤两次，全细胞裂解液在SDS-PAGE上电泳。Coomassie蓝染色被用于蛋白质的检测。(B).重复上述操作，但这次单独地分离全细胞裂解液和周质间隙的内容物，在SDS-PAGE上电泳(20μg蛋白质)，通过使用单克隆的抗GST抗体的Western印迹检测GST或GST-H.8融合蛋白来测定蛋白质的总浓度和周质浓度。(C).携带克隆的gst、H.8-gst或gst-H.8基因(表5)的E.coli菌株BL21(DE)细胞在37℃用0.4mM IPTG培养。一毫升每种这些细菌培养物进行离心，收集产生的细菌团。在用PBS洗涤两次之后，施加含有抗GST抗体(1:2000)的1mL的1％ FBS-PBS。温育细胞悬液1h，然后用PBS洗涤两次。细菌细胞与FITC结合的抗兔IgG在1％ FBS-PBS中温育30分钟。为了除去未结合的抗体，再次洗涤细胞，在冰上用乙醇固定。在共焦显微镜(×100物镜)下观察用DAPI(给予蓝色着色)处理的E.coli样品，对单个细胞拍照。(D).携带pUC19-paz(铜绿假单胞菌天青蛋白)、pUC19-laz(奈瑟氏球菌属)、pUC18-H.8-paz或pUC18-laz-H.8的E.coli细胞在37℃在存在0.1mM IPTG的情况下培养过夜。离心0.5ml的这种培养物，产生的细菌团用冷却的PBS洗涤两次。施加1mL 1％ FBS-PBS中的抗天青蛋白抗体(1:500)并在冰上孵育1h。用PBS洗涤两次之后，施加结合FITC的抗兔抗体，在冰上孵育30分钟，用PBS洗涤两次，用冷乙醇固定。通过共焦显微镜(×100物镜)观察细菌样品。

实施方式的详细描述

定义

如在此使用的，术语“细胞”包括该术语的单数和复数，除非特别地描述为“单个细胞”。

如在此使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地使用来指代氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，在其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语＂多肽＂、＂肽＂和＂蛋白质＂还包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂连接(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、羟基化和ADP核糖基化。要理解的是，多肽不总是完全是直链的。例如，作为泛素化作用的结果多肽可以是支链的；一般作为翻译后事件的结果(包括天然的加工事件和由非天然发生的人类操作导致的事件)，它们可以是环状的(有或没有分支)。环状的、支链的和分支环状的多肽可以通过非翻译的天然过程、也可以通过完全的合成方法来合成。合成肽是没有细胞成分的帮助制成的肽。产生肽的合成方法是本领域公知的，并且是商业上可获得的。进一步地，本发明预期本发明的蛋白质的氨基端含甲硫氨酸变体和氨基端甲硫氨酸减少变体的用途。

如在此使用的，使用“疾病”包括相对于正常的解剖学和生理学的偏离，其构成活体动物或其一个部分的正常状态的损伤，其阻断或改变了身体功能的性能。

如在此使用的，术语“抑制细胞生长”是指减慢或停止细胞分裂和/或细胞增殖。该术语还包括细胞发育的抑制或细胞死亡的提高。

如在此使用的，术语“患有”包括当前展现疾病的症状、即使没有可见症状具有病理状况、处于从疾病的恢复中、和已从疾病恢复。

如在此使用的，术语“治疗”包括防止、降低、停止或逆转与疾病或要治疗的疾病相关的症状的进展或严重性。因而，术语“治疗”包括视情况的药物、治疗和/或预防施用。

“治疗有效量”是有效防止、降低、停止或逆转受试者要治疗的特定疾病的现有症状的发展、或部分或全部减轻所述症状的量。治疗有效量的确定处在本领域技术人员的能力范围内。

如在此使用的，术语“基本上纯的”，当用于修饰本发明的蛋白质或其他细胞产物时，是指，例如，从生长培养基或细胞内容物分离的蛋白质，处于基本上没有或不搀杂其他蛋白质和/或活性抑制化合物的形式。术语“基本上纯的”是指量为分离的部分干重的至少约75％的因素，或至少“基本上75％纯的”。更特别地，术语“基本上纯的”是指活性化合物干重的至少约85％的化合物，或至少“基本上85％纯的”。最特别地，术语“基本上纯的”是指活性化合物干重的至少约95％的化合物，或至少“基本上95％纯的”。术语“基本上纯的”还可以用于修饰合成地产生的本发明的蛋白质或化合物，其中，例如，合成的蛋白质从合成反应的试剂和副产品中分离。

如在此使用的，术语“药物级”，当指本发明的肽或化合物时，是一种肽或化合物，其基本上或实质上从在它的天然状态发现时通常伴随该材料的成分(包括合成试剂和副产品)中分离，以及基本上或实质上从将损害它作为药物的用途的成分中分离。例如，“药物级”肽可以从任何致癌物中分离。在某些情况下，“药物级”可以用预期的施用方法来修饰(例如，“静脉内药物级”)，以指明一种肽或化合物，其基本上或实质上从将使该组合物不适合向患者静脉内施用的任何物质分离。例如，“静脉内药物级”肽可以从洗涤剂(例如SDS)和抗菌剂(例如叠氮化物)分离。

用语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指物质基本上或实质上没有通常与天然状态下存在的所述物质相伴的成分。因而，根据本发明的分离的肽优选地不含有在所述肽的原位环境中与所述肽通常相关的材料。“分离的”区域是指不包括多肽的完整序列的区域，所述区域来自所述多肽。“分离的”核酸、蛋白或其相应片段已经基本上从它的体内环境移出，从而它可以由技术人员操作，例如但不限于核酸片段的核苷酸测序、限制性消化、定点诱变、以及亚克隆到表达载体中，以及以基本上纯的量获得所述蛋白质或蛋白片段。

在此对于肽使用的术语“变体”，是指氨基酸序列变体，与野生型多肽相比其具有替换、缺失或插入的氨基酸。变体可以是野生型肽的截短体。“添加”是从野生型蛋白质内去除一个或多个氨基酸，而“截短”是从野生型蛋白质的一个或多个末端去除一个或多个氨基酸。因而，变体肽可以通过操作编码所述多肽的基因来产生。通过改变所述多肽的基本组成或特征，而不是至少某些其基本活性，可以产生变体。例如，奈瑟氏球菌属转运肽的“变体”可以是保持了其穿越BBB和/或进入脑部癌细胞的能力的突变的奈瑟氏球菌属转运肽。在某些情况下，变体肽用非天然氨基酸(例如ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基)合成。(Ghadiri & Fernholz，J.Am.Chem.Soc，112：9633-9635(1990)).在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过20、19、18、17或16个替换、缺失或插入的氨基酸。在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过15、14、13、12或11个替换、缺失或插入的氨基酸。在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过10、9、8或7个替换、缺失或插入的氨基酸。在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过6个替换、缺失或插入的氨基酸。在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过5或4个替换、缺失或插入的氨基酸。在某些实施方式中，与野生型肽相比，所述变体具有不超过3、2或1个替换、缺失或插入的氨基酸。

在此使用的术语“氨基酸”意为包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包含通过一个、两个、三个或更多碳原子、一般一个(α)碳原子直接连接的至少一个羧基和至少一个氨基的任何部分。

在此对于肽使用的术语“衍生物”是指来源于目标肽的肽。衍生包括肽的化学修饰，从而所述肽将仍然保持某些它的一些基本活性。例如，奈瑟氏球菌属转运肽的“衍生物”可以是保持了其穿越BBB和/或进入脑部癌细胞的能力的化学上修饰的奈瑟氏球菌属转运肽。感兴趣的化学修饰包括，但不限于，肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化或糖基化。此外，衍生的肽可以是多肽或其片段与化合物的融合物，所述化合物例如但不限于，另一种肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或可检测的探针。

术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为当比对两个序列时在多肽中与候选序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸同一性％，比对序列，如果有必要，引入缺口来实现最大的序列同一性％；保守性替换不被认为是序列同一性的部分。确定同一性百分比的氨基酸序列比对方法是本领域技术人员公知的。通常，公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件被用于比对肽序列。在特定的实施方式中，使用长复杂性过滤器、预期10、字大小3、存在性11和延伸1的缺省参数来使用Blastp(可从国家生物技术信息中心，Bethesda MD获得)。

当比对氨基酸序列时，给定氨基酸序列A与、和、或相对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者其可以称为给定氨基酸序列A具有或包含与、和、或相对给定氨基酸序列B的一定氨基酸序列同一性％)可以计算为：

氨基酸序列同一性％＝X/Y*100

其中

X是通过序列比对程序或算法对A和B的比对，作为同一的匹配评分的氨基酸残基的数量，

Y是B中氨基酸残基的总数。

如果氨基酸序列A的长度不同于氨基酸序列B的长度，A对B的氨基酸序列同一性％不会等于B对A的氨基酸序列同一性％。当将较长的序列与较短的序列比较时，较短的序列将是“B”序列。例如，当将截短的肽与相应的野生型多肽比较时，截短的肽将是“B”序列。

概述

本发明涉及用于递送货物化合物穿越血脑屏障(BBB)和/或进入脑部癌细胞的方法和物质，以及用于治疗哺乳动物脑部癌症以及脑部和中枢神经系统的其他疾病的物质和方法。如在此公开的，现在已知的是由基序AAEAP(SEQ ID NO：25)的重复组成的肽区域将容许相连的或融合的肽和其他货物化合物被转运穿越血脑屏障和/或进入哺乳动物脑部癌细胞。更具体地，淋球菌蛋白Laz的H.8区域可以用于转运相连的或融合的蛋白质和其他货物化合物穿越BBB和/或进入脑部癌细胞。此外，预期的是在AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复的使用中类似于H.8区域的肽可以用于转运蛋白质和其他货物化合物穿越BBB和/或进入脑部癌细胞，所述肽例如Lip蛋白的部分或全部以及Pan 1蛋白的部分或全部，两种都来自淋球菌。由本发明递送的货物化合物包括但不限于，蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸(包括反义核酸)、染料、荧光标签和放射性标签、微粒或纳粒、毒素、无机和有机分子、小分子、和药物。在某些实施方式中，所述药物和/或毒素杀死肿瘤细胞。在其他实施方式中，所述货物化合物治疗脑部的各种疾病。

已知的是许多铜氧还蛋白蛋白，例如铜绿假单胞菌天青蛋白，具有特异性地进入并杀死许多类型的哺乳动物癌细胞的能力。(Yamada et al.，Cell.Biol.7：1418-1431(2005)；Hiraoka et al，PNAS 101：6427-6432(2004)；Hiraoka et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.338：1284-1290(2005))还已知的是铜绿假单胞菌天青蛋白对于脑部癌细胞例如成胶质细胞瘤细胞没有细胞毒性。参见实施例2。令人震惊地，现在已知的是，来自淋球菌和其他奈瑟氏球菌的Laz蛋白、天青蛋白样蛋白能够特异性地进入并杀死脑部癌细胞例如成胶质细胞瘤细胞以及其他肿瘤。参见实施例2和7。此外，现在已知的是Laz蛋白的H.8结构域当融合到铜绿假单胞菌天青蛋白的N-末端或C-末端时可以赋予它进入和杀死成胶质细胞瘤细胞的能力。参见实施例2和3。

还令人震惊地，现在已知的是，H.8区域不必要物理上附着于共同施用的蛋白质(例如天青蛋白)来赋予该蛋白进入成胶质细胞瘤细胞的能力。参见实施例5。与单独的天青蛋白相比，H.8和融合到GST的N-末端的H.8都提高了物理上不附着的天青蛋白进入成胶质细胞瘤细胞的能力，然而融合到GST的C-末端的H.8是无效的。进一步地，H.8和融合到GST的N-末端的H.8当与天青蛋白共同施用时都增强了天青蛋白对成胶质细胞瘤细胞的细胞毒性。参见实施例5。

令人震惊地，现在已知Laz的H.8结构域赋予了它融合的蛋白质穿越活小鼠的血脑屏障并定位到脑部的能力。参见实施例6。

最后，现在已知H.8区域负责E.coli中融合蛋白的表面呈现。参见实施例7。虽然GST和具有融合到C-末端的H.8的GST都在表达它们的E.coli的周质间隙中积累，具有融合到N-末端的H.8的GST被转运到E.coli细胞的表面。虽然不意图将本发明限制于任何作用机制，H.8区域引起融合蛋白转运到细菌细胞表面的能力可能与H.8区域容许融合蛋白穿越BBB的能力相关。由于脑膜炎球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌)穿越BBB侵入脑膜(Nassif，et al，同上；Huang & Jong，同上.)，可能的是这种细菌使用表面暴露的细胞成分来破坏BBB。脑膜炎奈瑟氏球菌的IV型菌毛与脑微绒毛样膜凸起的形成相关，已知这种菌毛的回缩在奈瑟氏球菌属和人类细胞之间的相互作用中起到核心作用。(Pujol et al.，PNAS 96：4017-4022(1999)；Merz et al.，Nature 407：98-102(2002))然而，已知IV型菌毛在与其他细胞的菌毛介导的接触形成时回缩，认为脑膜炎奈瑟氏球菌的其他未知的表面成分负责穿越BBB。(Nassif et al.，同上)因而可能的是表面呈现的H.8区域直接涉及容许奈瑟氏球菌属穿越BBB并且与人类脑部癌细胞相互作用。

Laz H.8区域是Laz的N-末端的39个氨基酸区域，其含有不完全的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复。预期的是该AAEAP(SEQ ID NO：25)重复单元可以用于设计将转运货物穿越BBB和/或进入脑部癌细胞的肽。进一步地，预期的是来自淋球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的具有AAEAP(SEQ ID NO：25)重复的其他外膜蛋白的氨基酸序列可以用于设计将转运货物穿越BBB和/或进入脑部癌细胞的肽。其他感兴趣的奈瑟氏球菌属外膜蛋白包括但不限于Lip和Pan 1。(Trees et al.，J.Clin.Microbiol.38：2914-2916(2000)；Hoehn and Clark，Infection and Immunity60：4704-4708(1992))

本发明涉及用于递送货物化合物穿越血脑屏障进入脑部和/或进入脑部癌细胞的方法和材料。根据本发明的货物化合物的递送伴随着使用适合的转运肽。在本发明的一个实施方式中，所述货物化合物与本发明的奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP转运肽连接。在另一个实施方式中，所述货物化合物与本发明的奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP转运肽共同施用。在另一个实施方式中，所述货物化合物与铜氧还蛋白衍生的转运肽和本发明的奈瑟氏球菌属或AAEAP转运肽连接。

在一个实施方式中，货物化合物被递送以抑制癌细胞(例如脑部癌细胞)中的细胞生长。这种癌细胞可以来自，例如，星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、脊髓肿瘤、神经节神经胶质瘤、神经细胞瘤和髓母细胞瘤。例如，所述货物化合物可以是细胞周期调节蛋白，例如p53；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，例如p16、p21或p27；自杀蛋白，例如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其他免疫调节蛋白，例如白介素1、白介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或毒素，例如铜绿假单胞菌外毒素A，等等。在某些实施方式中，上述化合物种类之一的生物学活性片段被递送。在另一个实施方式中，所述货物化合物被递送以产生目标组织的图像。例如，所述目标组织可以是癌，所述货物化合物可以是一种通常用于产生通过X射线计算机断层(CT)、磁共振成像(MRI)和超声检测的图像的化合物。在这些实施方式中，所述货物化合物可以是γ射线或正电子发射放射性同位素、磁共振成像造影剂、X射线造影剂和/或超声造影剂。在其他实施方式中，所述货物化合物可以被递送以治疗与脑相关的疾病。

奈瑟氏球菌属转运肽和AAEAP转运肽

本发明提供了转运肽，其容许将连接的或联合的货物转运到哺乳动物脑部癌细胞中而不是非癌细胞中、和/或转运所述货物穿越BBB。已经发现的是，奈瑟氏球菌属外膜蛋白，例如Laz，包含蛋白转运结构域H.8结构域，其促进连接的货物进入哺乳动物脑部癌细胞和/或穿越BBB的进入。本发明提供了来自奈瑟氏球菌属外膜蛋白的奈瑟氏球菌属转运肽。本发明进一步提供了包含AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复的天然或合成的转运结构域，其可以用于将连接的或联合的货物转运到哺乳动物脑部癌细胞中和/或穿越BBB。

术语“奈瑟氏球菌属转运肽”是指奈瑟氏球菌属外膜蛋白的全部或片段，其包括货物进入脑部癌细胞和/或穿越BBB所需的氨基序列。适合的奈瑟氏球菌属外膜蛋白包括但不限于来自淋球菌的Laz、Lip或Pan 1。特别感兴趣的是来自脑膜炎奈瑟氏球菌和淋球菌的Laz。确定包含货物进入脑部癌细胞和/或穿越BBB所需的氨基序列的外膜蛋白可以通过鉴定进入脑部癌细胞或穿越BBB所需的那些肽的任何方法进行。在一种这样的方法中，奈瑟氏球菌属外膜蛋白的全部或片段被连接到标记物质，进行测试来确定奈瑟氏球菌属外膜蛋白的全部或片段是否进入脑部癌细胞和/或穿越BBB。可以用于鉴定适合的奈瑟氏球菌属外膜蛋白或其片段的方法在实施例4和7中找到。

可以用于本发明的适合的奈瑟氏球菌属外膜蛋白包括奈瑟氏球菌的外膜蛋白，其被H.8抗体识别，和/或由AAEAP(SEQ ID NO：25)基序的几个完全或不完全重复组成。在某些实施方式中，奈瑟氏球菌属转运肽被H.8抗体识别。用于确定蛋白质或肽是否被H.8抗体识别的方法和参数在Cannon et al.，Infection and Immunity 43：994-999(1984)中描述。

本发明还提供AAEAP转运肽，其是由AAEAP(SEQ ID NO：25)基序的多个完全或不完全重复组成的肽，其可以转运连接的或联合的货物化合物进入哺乳动物脑部癌细胞和/或穿越BBB。如在此使用的“不完全”重复被定义为一种AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽的重复，其中所述五个氨基酸中的至少一个不是AAEAP(SEQ ID NO：25)基序的部分。在其他实施方式中，所述不完全重复可以具有不超过1、2、3或4个不是AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽的部分的氨基酸。在某些实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽是Laz蛋白的1-39位氨基酸(SEQ ID NO：24)。在某些实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽是长度至少约20个氨基酸、长度至少约40个氨基酸、长度至少约60个氨基酸、或长度至少约80个氨基酸。在其他实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽长度不超过约40个氨基酸、长度不超过约100个氨基酸、长度不超过约200个氨基酸、或长度不超过约400个氨基酸。在某些实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽与奈瑟氏球菌属外膜蛋白(例如SEQ ID NO：22)具有至少约90％的氨基酸序列同一性、至少约95％的氨基酸序列同一性或至少约99％的氨基酸序列同一性。

术语“AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽”是指包含完全和/或不完全AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复的区域的肽。AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽可以通过标准方法合成，或可以通过基于细胞的表达系统来增殖。在某些实施方式中，所述AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽由至少2个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、至少4个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、至少6个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、至少8个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、至少10个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、至少15个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复或至少20个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复组成。在某些实施方式中，所述AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽由不超过10个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、不超过20个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、不超过30个AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、或不超过40个AAEAP(SEQID NO：25)五肽重复组成。在某些实施方式中，所述AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽仅由完全AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、仅由不完全AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、或由完全和不完全AAEAP(SEQID NO：25)五肽重复的混合物组成。

在某些实施方式中，所述AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽仅由AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复组成。在其他实施方式中，所述AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽由每个总长度至少约95％的AAEAP(SEQ IDNO：25)五肽重复、每个总长度至少约90％的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、每个总长度至少约80％的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复、每个总长度至少约50％的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复组成。在某些实施方式中，重复的区域与包含相同数量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQ ID NO：25)重复的肽具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的同一性。

在某些实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽和/或AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽可以用于促进转运连接的货物选择性地进入脑部癌细胞和/或穿越BBB。在其他实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽和/或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽可以用于转运共同施用的货物进入脑部癌细胞和/或穿越BBB。

奈瑟氏球菌属转运结构域或AAEAP转运结构域的修饰

在本发明的其他实施方式中，奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQID NO：25)转运肽被化学地修饰或遗传地改变来产生保持了转运货物化合物进入脑部癌细胞或穿越BBB的能力的变体和衍生物。

奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的变体可以通过标准技术合成。衍生物是直接地或通过修饰或部分替换从天然氨基酸形成的氨基酸序列。变体可以是类似物，其是具有与天然化合物类似但不相同的结构、某些组分或侧链与天然化合物不同的氨基酸序列。类似物可以合成或来自不同的进化来源。如果衍生物或类似物含有修饰的氨基酸，变体可以是全长的或不是全长的。

本发明提供了奈瑟氏球菌属转运肽的氨基酸序列变体，与野生型多肽相比，其具有替换、缺失或插入的氨基酸。本发明的变体可以是奈瑟氏球菌属转运肽的截短体。如在此使用的，多肽的“截短体”是从多肽序列的至少一个末端除去至少一个氨基酸残基产生的肽。在某些实施方式中，截短的肽产自从多肽序列的一端或两端除去至少一个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少120个氨基酸残基或至少150个氨基酸残基。在某些实施方式中，所述组合物包含肽，所述肽由奈瑟氏球菌属转运肽的区域组成，所述区域少于全长奈瑟氏球菌属转运肽。在某些实施方式中，所述组合物包含肽，所述肽由截短的奈瑟氏球菌属转运肽的超过约10个残基、超过约15个残基或超过约20个残基组成。在某些实施方式中，所述组合物包含肽，所述肽由截短的奈瑟氏球菌属转运肽的不超过约100个残基、不超过约70个残基、不超过约50个残基，不超过约40个残基或不超过约30个残基组成。

奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的变体包括但不限于，包含区域的分子，所述区域在相同大小的氨基酸序列上或当与比对的序列比较时，以至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性基本上与奈瑟氏球菌属转运肽(SEQ ID NO：24)或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽同源，其中所述比对通过同源性算法来进行。术语在奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽与候选序列之间的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为当比对两个序列时在奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽中与候选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。

所述变体还包括用非天然存在的合成氨基酸制成的肽。例如，非天然存在的氨基酸可以整合到变体肽中来延长或优化组合物在血流中的半衰期。这种变体包括但不限于，D，L-肽(非对映异构体)(Futaki et al.，J.Biol.Chem.276(8)：5836-40(2001)；Papo et al.，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller et al.，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987)).；含有稀有氨基酸的肽(Lee et al.，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004)).；以及接有烃类环钩(hydrocarbon stapling)的含烯烃的非天然氨基酸(Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski et al.，Science 305：1466-1470(2004))，以及包含ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基的肽。

在其他实施方式中，本发明的肽是奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的衍生物。所述转运肽的衍生物是所述肽的化学修饰体，从而所述肽仍然保持某些其基本活性。例如，转运肽的“衍生物”可以是保持了其穿越BBB和/或进入脑部癌细胞的能力的化学上修饰的转运肽。产生改变的奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP转运肽活性的衍生作为本发明的部分是预期的，只要这样的活性丧失不是明显的。如在此使用的，“明显的丧失”是与未改变的肽相比超过约50％的活性。感兴趣的化学修饰包括，但不限于，肽的酰胺化、乙酰化、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修饰、磷酸化和糖基化。此外，衍生的肽可以是转运肽、或其变体、衍生物或结构等效物与化合物的融合物，所述化合物例如但不限于，另一种肽、药物分子或其他治疗剂或药剂或可检测的探针。

感兴趣的衍生物包括化学修饰体，由此本发明的肽和组合物在血流中的半衰期可以例如通过本领域技术人员公知的几种方法被延长或优化，所述化学修饰体包括但不限于，环化的肽(Monk et al.，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest et al.，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、N-和C-末端修饰体(Labrie et al.，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990)).、以及接有烃类环钩的含烯烃的非天然氨基酸(Schafmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walenski et al.，Science 305：1466-1470(2004))、以及包含ε-(3，5-二硝基苯甲酰基)-赖氨酸残基的肽。

预期的是本发明的转运肽可以是奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的变体、衍生物和/或结构等效物。例如，所述肽可以是已经被PEG化的奈瑟氏球菌属转运肽的截短体，因而使得它同时是变体和衍生物。在一个实施方式中，使用接有通过钌催化的烯烃置换的全烃类“环钩(staple)”的含携带烯烃的链(tether)的α，α-二取代的非天然氨基酸来合成本发明的肽。(Scharmeister et al.，J.Am.Chem.Soc.122：5891-5892(2000)；Walensky et al.，Science 305：1466-1470(2004)).此外，作为奈瑟氏球菌属转运肽的结构等效物的肽可以与其他肽融合，因而产生既是结构等效物又是衍生物的肽。这些实例仅仅是说明性的而不是限制本发明。

改变可以被引入奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽中，其引起奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的氨基酸序列中的改变，其不使奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQID NO：25)转运肽丧失转运货物化合物进入脑部癌细胞和/或穿越BBB的能力。“非必需”氨基酸残基是可以在奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的序列中改变而不使它丧失转运货物化合物进入细胞和/或穿越BBB的能力，而“必需”氨基酸残基是这种活性所需的。

可以进行的“保守性”替换的氨基酸是本领域公知的。有用的保守性替换在表1，“优选的替换”中示出。其中一种类型的氨基酸被相同类型的另一个氨基酸替代的保守性替换落入本发明的范围内，只要所述替换不使所述奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽的活性丧失。产生改变的奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽活性的这种改变作为本发明的部分是预期的，只要活性的丧失不是明显的。如在此使用的，“明显的丧失”是与未改变的肽相比超过约50％的活性。

表1 优选的替换

影响(1)多肽骨架的结构，例如β-片层或α-螺旋构象、(2)电荷、(3)疏水性、或(4)目标位点的侧链的主体(bulk)的“非保守性”替换可以改变奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽功能。如表2所示，基于常见的侧链性质将残基分组。非保守性替换需要将这些类别中的一类的成员换为另一类。

其中一种类型的氨基酸被不同类型的另一个氨基酸替代的非保守性替换落入本发明的范围内，只要所述替换不使所述奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的活性丧失。产生改变的奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽活性的这种改变作为本发明的部分是预期的，只要活性的丧失不是明显的。

表2.氨基酸类别

在其他实施方式中，本发明预期奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQID NO：25)转运肽的结构等效物，其具有与淋球菌Laz的1-39位氨基酸残基(SEQ ID NO：24)的显著结构相似性。特别地，奈瑟氏球菌属转运肽的结构等效物和淋球菌Laz的1-39位氨基酸残基(SEQ ID NO：24)之间的显著结构同源性通过使用VAST算法来确定(Gibrat et al.，CurrOpin Struct Biol 6：377-385(1996)；Madej et al.，Proteins 23：356-3690(1995))。在特定的实施方式中，来自奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的结构等效物与淋球菌Laz的1-39位氨基酸残基(SEQ ID NO：24)的结构比较的VAST p值是低于约10^-3、低于约10^-5、或低于约10^-7。在其他实施方式中，奈瑟氏球菌属转运肽的结构等效物和淋球菌Laz的1-39位氨基酸残基(SEQ ID NO：24)之间的显著结构同源性可以通过使用DALI算法确定(Holm & Sander，J.Mol.Biol.233：123-138(1993))。在特定的实施方式中，配对结构比较的DALI Z分值是至少约3.5、至少约7.0、或至少约10.0。

对奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的修饰可以使用本领域已知的方法进行，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。可以对克隆的DNA进行定点诱变(Carter，Biochem J.237：1-7(1986)；Zoller and Smith，Methods Enzymol.154：329-50(1987))、盒式诱变、限制选择诱变(Wells et al.，Gene 34：315-23(1985))或其他已知的技术来产生编码奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽变体的核酸。此外，编码奈瑟氏球菌属转运肽变体或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽变体的核苷酸可以通过本领域公知的方法合成。

奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽-货物化合物复合物

在本发明的另一个方面，提供的是转运肽-货物复合物，其中奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP转运肽与至少一种货物化合物复合。这些复合物的转运肽可以是奈瑟氏球菌属转运肽、AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽或两者之一的变体、衍生物或结构等效物。由本发明递送的货物化合物包括但不限于，蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸(包括反义核酸)、染料、微粒或纳粒、毒素、无机和有机分子、小分子、和药物。这种转运肽-货物复合物可以用于为了治疗目的递送药物进入脑和/或脑部癌细胞、以及一般的癌细胞，用于为了诊断目的递送成像化合物到脑部癌细胞和一般的癌细胞，以及用于需要递送特定的化合物进入脑部和/或进入脑部癌细胞的任何其他目的。货物化合物可以附于所述转运肽的C-末端或N-末端。

在某些实施方式中，所述奈瑟氏球菌属转运肽或AAEAP转运肽与铜氧还蛋白衍生的转运肽复合。在2005年10月6日提交的美国专利申请NO.11/244,105中提供了铜氧还蛋白衍生的转运肽，通过引用将其明确地合并在此。在某些实施方式中，所述铜氧还蛋白衍生的转运肽是包含铜绿假单胞菌天青蛋白的50-77位氨基酸区域的其变体、衍生物或结构等效物。

如在此使用的，术语“复合的”、“复合物”或“连接的”是指在要复合的成分之间的物理联合。在某些情况下，所述物理联合可以不是直接的，但可以通过连接基团或另一种成分来介导。成分可以是蛋白质、其他有机分子或无机分子，等等。在成分之间的物理联合可以通过共价键、疏水性键和/或范德华力、或保持所述成分处于物理联合的任何其他方式。在本发明的各种实施方式中，所述货物化合物可以包含：对癌细胞有细胞毒性的铜氧还蛋白，例如来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(SEQ ID NO：24)(“wt-天青蛋白”)；来自蓝细菌蓝藻(Phormidium laminosum)的质体蓝素；来自铁氧化硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的铁硫菌蓝蛋白；来自裂环无色杆菌(Achromobacter cycloclastes)的假天青蛋白；来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringa)、脑膜炎奈瑟氏球菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)的天青蛋白；来自橙色绿屈挠菌(Chlorqflexus aurantiacus)或淋球菌的橙绿屈挠素A和B；和其他天青蛋白和天青蛋白样蛋白。在其他实施方式中，所述货物化合物可以是细胞色素c，例如来自淋球菌的细胞色素C₅₅₁。在其他实施方式中，所述货物化合物可以是保持了其在癌细胞中的细胞毒性的任何上述化合物的变体。

在一个实施方式中，所述货物化合物可以是可检测的物质，例如荧光物质，如绿色荧光蛋白；发光物质；酶，例如β-半乳糖苷酶；或放射性标记的或生物素化的蛋白，被递送以赋予细胞可检测的表型。类似地，用可检测物质(例如荧光物质)标记的微粒或纳粒可以被递送。适合的纳粒的一个实例在2002年5月7日授权的美国专利NO.6,383,500中找到，通过引用将其明确地合并在此。许多这种可检测物质对于本领域技术人员是已知的。

在某些实施方式中，所述货物化合物可以是适合于X射线计算机断层、磁共振成像、超声波成像或放射性核素闪烁照相的可检测物质。在这些实施方式中，为了诊断目的将货物化合物施用给患者。作为货物化合物施用造影剂来增强通过X射线CT、MRI和超声获得的图像。在各种实施方式中，所述货物化合物是γ射线或正电子发射放射性同位素、磁共振成像造影剂、X射线造影剂和/或超声造影剂。

经由奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽靶向脑肿瘤组织的、有或者没有铜氧还蛋白衍生的转运肽的放射性核素货物化合物的施用，可以用于放射性核素闪烁照相。在某些实施方式中，奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽可以含有有或者没有货物化合物的放射性核苷酸。美国专利公开NO.2006/0039861提供了肽靶向的、多聚的造影剂，用作放射性核素造影剂。适合于X射线成像的商业上可获得的货物化合物包括但不限于

(碘克沙醇)、

(碘海醇)和

可从GE Healthcare(Chalfont St.Giles，United Kingdom)获得。

经由奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽靶向脑肿瘤组织的、有或者没有铜氧还蛋白衍生的转运肽的超声造影剂货物化合物的施用，可以用于超声成像。适合用作货物化合物的超声造影剂包括但不限于，生物相容性气体的微泡、液体载体和表面活性剂微球体，进一步包括在靶向部分和微泡之间的任选的连接部分Ln。感兴趣的微泡包括但不限于表3中提供的那些。在本文中，术语液体载体是指水溶液，术语表面活性剂是指任何两亲性物质，其导致溶液中界面张力降低。用于形成表面活性剂微球体的适合的表面活性剂的列表在EP0727225A2中公开，通过引用明确地合并在此。术语表面活性剂微球体包括纳球、脂质体、泡囊等等。在某些实施方式中，超声造影剂是脂质体或葡聚糖。所述生物相容性气体可以是空气或碳氟化合物(例如C3-C5全氟烷)，其提供了产生回声的差异并因而提供了超声波成像中的对比。所述气体可以被封入或包含在微球体中，所述微球体上任选地经由连接基团连接了奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽。所述连接可以是共价的、离子的或通过范德华力。

表3.用作超声造影剂的微泡和它们的组成。

经由奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽靶向脑肿瘤组织的、有或者没有铜氧还蛋白衍生的转运肽的X射线造影剂货物化合物的施用，可以用于X射线计算机断层和X射线成像的其他形式。适合用作货物化合物的当前的商业性X射线造影剂可以分成两类：1)离子造影剂，具有离子的羧基，和2)非离子造影剂，其不含有任何离子基团。商业上可获得的离子造影剂的实例包括

(泛影酸)和(碘克沙酸盐)，而非离子剂包括

(碘海醇)、

(碘帕醇)、

(碘佛醇)和(碘克沙醇)。适合用作货物化合物的其他X射线造影剂包括但不限于，一种或多种X射线吸收性的或原子序数20或更大的“重”原子，进一步包含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽和X射线吸收原子之间的任选的连接部分L_n。在X射线造影剂中经常使用的重原子是碘。已经公开了由金属螯合物组成的X射线造影剂(例如，美国专利NO.5,417,959)和由多种金属离子组成的多螯合物组成的X射线造影剂(例如，美国专利NO.5,679,810)。多核的聚簇复合物已经作为X射线造影剂公开(例如，美国专利NO.5,804,161、PCTWO91/14460和PCT WO 92/17215)。其他X射线造影剂是本领域技术人员公知的，可以与本发明中的货物化合物同样好地使用。

经由奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽靶向脑肿瘤组织的、有或者没有铜氧还蛋白衍生的转运肽的MRI造影剂货物化合物的施用，可以用于MRI成像。适合用作货物化合物的MRI造影剂包括但不限于，一种或多种顺磁性金属离子，进一步包括在奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽和所述顺磁性金属离子之间的任选的连接部分L_n。金属螯合物的金属离子可以是顺磁性离子。适合的金属离子包括具有22-29(包括)、42、44和58-70(包括)的原子序数并且具有+2或+3的氧化态的那些金属离子。这种金属离子的实例是铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)和镱(III)。适合用作货物化合物的商业上可获得的MRI造影剂包括但不限于来自GE Healthcare(Chalfont St.Giles，United Kingdom)的

(钆双胺)和

在另一个实施方式中，货物化合物被递送以杀死或抑制癌细胞(例如脑部癌细胞或其他癌细胞)的生长。例如，货物化合物可以是细胞周期调节蛋白，例如p53；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，例如p16、p21或p27；自杀蛋白，例如胸苷激酶或硝基还原酶；细胞因子或其他免疫调节蛋白，例如白介素1、白介素2或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；或毒素，例如铜绿假单胞菌外毒素A，等等。在其他实施方式中，上述化合物种类之一的生物学活性片段可以被递送。

在又一个实施方式中，所述货物化合物是用于治疗癌症的药物。这种药物包括，例如，5-氟尿嘧啶；干扰素α；氨甲蝶呤；他莫昔芬和硫酸长春新碱(Vincrinstine)。适合于治疗癌症的其他货物化合物包括但不限于：烷化剂，例如氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、氮丙啶和三氮烯；抗代谢物，例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物和嘧啶类似物；抗生素，例如蒽环类、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素D和普卡霉素；酶例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白转移酶抑制物；5α-还原酶抑制物；17β-羟甾醇脱氢酶3型的抑制物；激素剂，例如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕酮和黄体生成素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管破坏剂，例如海鞘素或它们的类似物和衍生物；微管稳定剂，如紫杉烷类，例如紫杉酚、多西紫杉酚

和它们的类似物，和埃博霉素，例如埃博霉素A-F和它们的类似物；植物衍生产物，例如长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷类；和拓扑异构酶(topiosomerase)抑制物；异戊二烯基蛋白转移酶抑制物；以及杂剂(miscellaneous agent)例如羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲三聚氰胺、铂配位络合物(例如顺式铂氨和卡铂)；和其他用作抗癌和细胞毒剂的药剂，例如生物反应修饰物、生长因子；免疫调节物和单克隆抗体。

这些抗癌剂和细胞毒剂种类的代表性的实例包括但不限于氮芥氢氯化物、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、卡莫司汀(carmustin)、环己亚硝脲、甲基环己亚硝脲、链脲菌素、硫替派、氮烯唑胺、氨甲蝶呤、硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、氟达拉宾、pentastatin、克拉屈宾(cladribin)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素、柔红霉素、伊达比星、硫酸博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、safracin、沙弗拉霉素(saframycin)、quinocarcin、discodermolide、长春新碱、长春碱、酒石酸长春瑞滨、依托泊甙、磷酸依托泊甙、替尼泊甙、紫杉醇、他莫昔芬、雌氮芥、雌氮芥磷酸钠、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diynese、左旋四咪唑、aflacon、干扰素、白细胞介素、阿地白介素、非格司亭、沙莫司亭、利妥昔单抗、BCG、维甲酸、盐酸伊立替康、betamethosone、盐酸吉西他滨、六甲蜜胺(altretamine)和盐酸托泊替康(topoteca)以及其任何类似物或衍生物。

可用作货物化合物的抗癌剂和其他细胞毒剂的实例包括以下的：德国专利No.4138042.8、WO 97/19086、WO 98/22461、WO 98/25929、WO98/38192、WO 99/01124、WO 99/02224、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890、WO 99/28324、WO 99/43653、WO 99/54330、WO 99/54318、WO 99/54319、WO 99/65913、WO 99/67252、WO 99/67253和WO 00/00485中找到的埃博霉素衍生物；WO 99/24416(还参见美国专利NO.6,040,321)中找到的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物；和WO97/30992以及WO 98/54966中发现的异戊二烯基蛋白转移酶抑制物；以及例如在美国专利NO.6,011,029中分类地和具体地描述的那些药剂，其化合物可以与任何NHR调节物(例如AR调节物、ER调节物)一起采用、与LHRH调节物一起采用，特别是在癌症的治疗中。

货物化合物的其他实例包括可以有益地递送到脑部的那些化合物。这些货物化合物包括用于治疗与脑部相关的疾病的药物和其他治疗剂。这些与脑部相关的疾病包括但不限于，忧郁症、情感障碍、慢性疼痛、癫痫症、阿尔茨海默病、中风/神经保护、脑和脊髓损伤、脑部癌症、脑的HIV感染、各种产生共济失调的失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、影响脑部的儿童先天遗传性错误、帕金森氏病和多发性硬化。

可以用作货物化合物来治疗忧郁症和情感障碍的抗抑郁药物包括但不限于三环抗忧郁药，例如去甲替林、文拉法辛

和萘发扎酮(nefazadone)

；选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)，例如费洛克汀

、舍曲林

、氟伏沙明

帕罗西汀

和西酞普兰

、镇静米氮平

以及更有活性的安非他酮(bupropion)

。还感兴趣的是头痛和偏头痛药物，包括但不限于麦角胺、二氢麦角胺、酮洛芬、普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔、阿替洛尔、美多心安和萘羟心安。

可以用作货物化合物来治疗慢性疼痛的药物包括但不限于常见的镇痛药，例如醋氨酚

；抗炎药物例如阿斯匹林；非甾族抗炎性药物(NSAID)例如布洛芬

和萘普生

；阿片类镇痛药例如吗啡样阿片样物质；抗抑郁药和抗发作药物。

可以用作货物来治疗癫痫症的药物包括但不限于苯巴比妥、地仑丁、三甲双酮

、地西泮

、酰胺咪嗪

丙戊酸

(乙琥胺)、

(乙琥胺)、确乐多(trileptal)、酰胺咪嗪、

(左乙拉西坦)、拉莫三嗪、乙酰唑胺、triagabine、丙戊酸钠、普瑞巴林、氯硝西泮、酰胺咪嗪、托吡酯、丙戊酸、拉莫三嗪、乙琥胺、氯巴占、氨己烯酸、左乙拉西坦、加巴喷丁、唑尼沙胺、麦苏林、苯妥英和奥卡西平。

可以用作货物化合物来治疗阿尔茨海默病的药物包括但不限于胆碱酯酶抑制剂，例如

(以前被称为

)(加兰他敏)、

(利斯的明)、

(多奈哌齐)、

(塔克林)和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、

(美金刚胺)。

可以用作货物化合物来治疗中风或用于神经保护的药物包括但不限于、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素、TNF-α、雌激素、褪黑素和大麻素。

可以用作货物化合物来治疗脑部HIV感染的药物包括但不限于非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)例如delavardine、施多宁(efavirenz)和奈韦拉平；核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)例如阿巴卡韦、阿巴卡韦、拉米夫定、阿巴卡韦、拉米夫定、齐多夫定、去羟肌苷、恩曲他滨、恩曲他滨、替诺福韦DF、拉米夫定、拉米夫定、齐多夫定、司他夫定、替诺福韦DF、扎昔他宾和齐多夫定；蛋白酶抑制物(PI)例如氨普那韦、阿扎那韦、呋山那韦、茚地那韦、洛匹那韦、利托那韦、奈芬那韦、利托那韦、沙奎那韦和替拉那韦；以及融合抑制剂例如恩夫韦肽。

可以用作货物化合物来治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的药物包括但不限于肌酸、

NAALAD酶、neurodex、

氧甲氢龙、辅酶Q10、托吡酯

、扎利罗登、茚地那韦、米诺环素以及丁螺环酮。

可以用作货物化合物来治疗亨廷顿病的药物包括但不限于抗精神病药，例如氟哌啶醇，或其他药物，例如氯硝西泮、抗抑郁药，例如费西汀、舍曲林和去甲替林；镇静剂以及锂；米诺环素、西酞普兰和Ethyl-EPA

可以用作货物化合物来治疗帕金森氏病的药物包括但不限于抗胆碱能药或金刚烷胺、左旋多巴(L-dopa)、溴麦角环肽、培高利特、普拉克索、罗匹尼罗、司来吉兰和金刚烷胺。

可以用作货物化合物来治疗多发性硬化的药物包括但不限于促肾上腺皮质激素(更了解的为ACTH)、脱氢可的松、氢化泼尼松、甲基强的松龙、倍他米松、地塞米松、β干扰素(

和)、α干扰素、

(米托蒽醌)、环孢(Sandimmune)、环磷酰胺

、氨甲蝶呤、咪唑硫嘌呤

和克拉屈滨

在又一个实施方式中，所述货物化合物是编码上述化合物种类之一的核酸。

提供上述实例仅用于说明，许多其他这样的化合物是本领域技术人员已知的。

编码奈瑟氏球菌属转运结构域或AAEAP转运结构域、或与货物化合物连接的上述任一结构域的核酸

在另一个方面，本发明提供了编码奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽和其变体、或融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含与货物化合物连接的奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽，其中所述货物化合物是蛋白质。根据本发明的核酸分子可以通过本领域已知技术的组合来制备。在这些核酸中使用的编码序列可以是在编码特定肽的天然基因组DNA中存在的那些，或可以从已知的密码子设计。这些编码序列也可以考虑要表达所述肽的有机体的可选的密码子利用和优选的的密码子利用来设计。奈瑟氏球菌属/AAEAV(SEQ ID NO：25)转运肽和转运肽-货物复合物的核酸序列可以通过化学合成或克隆分别制备。然后可以使用连接酶将核酸序列连接在一起以得到目标核酸分子。使用奈瑟氏球菌属转运结构域或AAEAP转运结构域递送货物化合物的方法

本发明的组合物可以用于，例如，细胞类型的检测或成像，用于癌症的治疗、特别是中枢神经系统或脑部癌症的治疗，或用于与脑部相关的疾病的治疗。所述组合物可以以治疗有效量施用。一般地，宿主生物体是哺乳动物，例如人类或动物。在某些实施方式中，所述货物化合物与奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽复合地递送，而在其他实施方式中，所述货物化合物与奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽共同施用但不与之复合。超过一种货物化合物可以与奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽共同施用。货物化合物的共同施用可以与所述转运肽的施用同时发生，在同一药物制品中，或在施用所述转运肽约一小时之内施用的另一药物制品中。此外，奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽与货物化合物的共同施用可以包括奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的施用，其自所述货物化合物的施用开始超过约一小时但少于约两小时、四小时、六小时、十二小时或二十四小时发生。在某些实施方式中，奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽、货物化合物和铜氧还蛋白衍生的转运肽可以共同施用。在其他实施方式中，奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽可以和与货物化合物复合的铜氧还蛋白衍生的转运肽共同施用。.

在本发明的其他各种实施方式中，奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽体外、先体外后体内或体内递送货物化合物进入细胞。例如，通过向细胞培养物(例如活检物)添加奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQID NO：25)转运肽和货物化合物的复合物，可以实现体外递送。或者，通过向从患者移出的样品(例如血液、组织或骨髓)添加所述复合物，并将所述处理的样品返回到患者中，可以实现先体外后体内递送。通过直接向患者施用所述复合物，也可以实现递送。本发明的方法可以用于治疗的、预防的、诊断的或研究的目的。

含有奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的组合物，包括包含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的复合物可以通过任何适合的途径施用，例如，通过口服、口腔的、吸入、舌下的、直肠的、阴道的、经尿道的、鼻的、体表的、经皮肤的(即经皮的)、或胃肠外的(包括静脉内的、肌内的、皮下的、和冠状动脉内施用)，或通过侧脑室内的或者脑内的注射。本发明的组合物和其药物制剂可以以任何有效量施用来实现它预期的目的。当为了治疗癌症或任何其它需要治疗的疾病来施用时，所述组合物以治疗有效量施用。各种货物化合物的剂量和施用安排的指导可以采集自许多参考文献，其描述这些化合物在治疗或诊断中的使用，例如Physicians′Desk Reference(PDR)，或由本领域普通技术人员另外确定。

本发明的组合物可以通过常规的公知灭菌技术来灭菌，或可以无菌过滤。产生的水溶液可以被封装来照原样使用，或被冻干，冻干的制品在施用之前与无菌溶液组合。当以静脉内的方式施用根据本发明的奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽、货物化合物和/或转运肽-货物化合物复合物时，施用可以通过静脉滴注或间歇性的输注。

参与护理的提供者或临床医师根据患者的状况确定确切的剂型、给药途径和剂量。剂量和间隔可以依个体调整以提供足以维持治疗效果的本发明的组合物的血浆水平。一般地，期望的组合物在与根据预定施用途径和标准药物实践所选择的药物载体的混合物中施用。

适合的剂量可以取决于例如所采用的含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQID NO：25)转运肽的化合物、货物化合物、宿主、施用模式和要治疗或诊断的疾病的性质和严重性而变化。然而，在本发明的方法的一个实施方式中，在人类中获得满意的治疗结果需要约0.001到约20mg/kg体重的含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的化合物或奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽复合物。在一个实施方式中，用于人类中的治疗的标明的每日剂量在约0.7mg到约1400mg含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽的化合物或奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽复合物的范围内，例如以每日剂量、每周剂量、每月剂量和/或连续剂量给药方便地施用。每日剂量可以是每天1到12次或更多的不连续的剂量。或者，剂量可以每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周和类似地天数增加直到31天或更久地施用。定量给药可以是持续的、间歇性的或单剂量，使用任何可应用的给药形式，包括片剂、贴片、静脉内施用，等等。更具体地，所述组合物以治疗有效量施用。在特定的实施方式中，所述治疗有效量是约0.01-20mg/kg体重。在特定的实施方式中，所述剂量水平是约10mg/kg/天、约15mg/kg/天、约20mg/kg/天、约25mg/kg/天、约30mg/kg/天、约35mg/kg/天、约40mg/kg/天、约45mg/kg/天或约50mg/kg/天。

在某些实施方式中，向患者导入含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽的组合物或奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽复合物的方法是，与其他已知用于治疗癌症的药物共同施用。这种方法是本领域公知的。在特定的实施方式中，含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的组合物或奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽复合物是混合物(cocktail)的一部分，或者含有或与其他治疗癌症的药物的共同给药的一部分。这种药物包括在此列出的用于癌症治疗的任何货物化合物。

包含本发明的组合物的药物组合物可以根据本发明使用，可以按照常规的方式使用一种或多种生理学可接受的载体配制成可以治疗地使用的制剂，所述生理学可接受的载体包含便于所述组合物的加工的赋形剂和助剂、用于抑制或刺激所述组合物的分泌的活性剂、或其混合物。

编码奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽或组合了转运肽和货物化合物之一和/或铜氧还蛋白衍生的转运肽的融合蛋白的核酸分子可以插入载体中并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(美国专利No.5,328,470)或通过立体定向注射来递送给受试者。(Chenet al.，Proc Natl Acad Sci USA，91：3054-57(1994))基因治疗载体的药物制剂可以包含可接受的稀释剂，或可以包含缓释基质，其中包埋了基因递送工具。或者，当可以从重组细胞完整地产生完整基因递送载体(例如，逆转录病毒载体)时，药物制剂可以包含产生该基因递送系统的一种或多种细胞。

在一个方面，所述组合物作为DNA来递送，从而在原位产生所述复合物。在一个实施方式中，所述DNA是“裸露的”，如例如Ulmer et al.，Science 259：1745-49(1993)所描述和Cohen，Science 259：1691-92(1993)所综述的。通过将裸DNA包被在载体(例如生物可降解的珠)上可以增加裸DNA的摄取，所述载体然后被有效地转运到细胞中。在这种方法中，DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的任何各种递送系统中，包括核酸表达系统、细菌表达系统和病毒表达系统。将DNA掺入到这些表达系统中的技术是本领域普通技术人员公知的。参见，例如，WO90/11092、WO93/24640、WO 93/17706和美国专利No.5,736,524。

用于在生物体之间往返遗传物质的载体可以被分为两种一般类型：克隆载体是复制型质粒或噬菌体，具有在适合的宿主细胞中增殖非必需的区域，其中可以插入外源DNA；所述外源DNA被复制和增殖，如同它是载体的成分一样。表达载体(例如，质粒、酵母或动物病毒基因组)用于将外源遗传物质引入宿主细胞或组织以转录并翻译外源DNA，如所述组合物的DNA。在表达载体中，导入的DNA被可操作地连接到元件(例如启动子)，其给宿主细胞信号以转录插入的DNA。某些启动子是特别有用的，例如可诱导的启动子，其响应于特殊因子来调控基因转录。将组合物多核苷酸可操作地连接到诱导型启动子可以调控奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽组合物多肽或片段的表达。典型的诱导型启动子的实例包括对α-干扰素、热激、重金属离子和类固醇例如糖皮质激素(Kaufman，Methods Enzymol.185：487-511(1990))和四环素起反应的那些启动子。其他理想的诱导型启动子包括对于导入了构建体的细胞不是内源的那些启动子，然而，当外源地提供诱导剂时，在那些细胞中是应答性的。一般地，有用的表达载体通常是质粒。然而，其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)是预期的。

载体选择由使用的生物体或细胞和期望的载体结局所指示。一般地，载体包含信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

含有奈瑟氏球菌属转运结构域的药物组合物

含有奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的本发明的药物组合物或与货物化合物连接的奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的复合物可以以任何常规的方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、滚糖衣、乳化、封入、包埋或冻干步骤。奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽复合物可以容易地与本领域公知的药学上可接受的载体组合。这种载体允许制剂被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、淤浆、悬浮液，等等。适合的赋形剂还可以包括，例如，填充物和纤维素制剂。其他赋形剂可以包括，例如，调味剂、着色剂、防粘剂、增稠剂，和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂。

在各种实施方式中，所述药物组合物包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲液、碳水化物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸，例如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油、盐水溶液、含水葡萄糖和甘油溶液，达到近似生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质，例如缓冲剂、张度调节剂、润湿剂等等。应认识到，虽然可以采用本领域普通技术人员已知的任何适合的载体来施用本发明的组合物，载体的类型将取决于施用的模式而变化。化合物也可以使用公知的技术封入脂质体内。也可以采用生物可降解的微球体作为本发明的组合物的载体。例如，在美国专利No.4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344和5,942,252中显示了适合的生物可降解的微球体。如在此使用的“化合物”包括本发明的肽、氨基酸序列、货物化合物和复合物以及核酸。

用于制备药物组合物以施用所述奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ IDNO：25)转运肽、货物和转运肽-货物复合物和核酸的静脉内液体可以由类晶体或胶体组成。如在此使用的类晶体是无机盐或其他水溶性分子的水溶液。如在此使用的胶体含有较大的不溶性分子，例如明胶。静脉内液体可以是无菌的。

可以用于静脉内施用的晶样液体包括但不限于，生理盐水(0.9％浓度的氯化钠溶液)、林格氏乳酸盐或林格氏溶液，以及5％的葡萄糖水溶液(有时称为D5W)，如表4中所描述的。

表4：常见的晶体溶液的组成

*林格氏乳酸盐还含有28mmol/L乳酸盐、4mmol/L K⁺和3mmol/LCa²⁺。

本发明的组合物在血流中的半衰期可以被延长或优化，例如，通过本领域技术人员公知的几种方法，包括但不限于，环化的肽(Monk et al.，BioDrugs 19(4)：261-78，(2005)；DeFreest et al.，J.Pept.Res.63(5)：409-19(2004))、D，L-肽(非对映异构体)(Futaki et al.，J.Biol.Chem.Feb 23；276(8)：5836-40(2001)；Papo et al.，Cancer Res.64(16)：5779-86(2004)；Miller et al.，Biochem.Pharmacol.36(1)：169-76，(1987))、含有非天然氨基酸的肽(Lee et al.，J.Pept.Res.63(2)：69-84(2004))、以及N-末端修饰和C-末端修饰(Labrie et al.，Clin.Invest.Med.13(5)：275-8，(1990))。特别感兴趣的是d-异构化(替换)和肽稳定性的修饰，经由D-替换或L-氨基酸替换。

当通过注射施用时，组合物可以配制在水性溶液中，优选的在生理学地相容的缓冲液(例如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)中。该溶液可包含配制剂(formulatory agent)例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述组合物可以是粉末形式用于在使用前与适合的载体(vehicle)(例如，无菌的无热原水)构制。

当通过吸入施用时，所述组合物可以以气溶胶喷射的形式从加压包或喷雾器、借助适合的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体)来递送。对于加压的气雾剂来说，剂量单位可以通过提供阀门来递送计量的量来确定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶的药囊和药筒可以配制为含有蛋白和适当的粉末基质(base)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

当通过体表施用来施用时，所述组合物可以被配制为溶液、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、悬浮液等等，如本领域公知的。在某些实施方式中，施用是通过经皮贴片的方式。当通过栓剂施用时(例如，直肠或阴道)，组合物还可被配制在含有常规栓剂基质的组合物中。

当口服施用时，所述组合物可以与本领域公知的药学上可接受的载体组合容易地配制。可以采用固体载体，例如甘露醇、乳糖、硬脂酸镁等等；这种载体允许趋化因子被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、淤浆、悬浮液等等，用于由要治疗的受试者口服摄入。对于口服腔固体剂型，例如粉末、胶囊和片剂，适合的赋形剂包括填充物(例如糖类)、纤维素制剂、成粒剂和粘合剂。

本领域公知的其他方便的载体还包括多价载体，例如细菌荚膜多糖、葡聚糖或遗传工程化的载体。此外，包含所述组合物的缓释制剂允许释放所述组合物持续延长的时间，从而没有所述缓释制剂时，组合物将在引发或增强治疗效果之前从受试者的系统清除，和/或被例如蛋白酶和简单的水解作用降解。

包含奈瑟氏球菌属/AAEAP(SEQ ID NO：25)转运结构域的试剂盒

在另一个方面，本发明提供了在包装或容器中含有一种或多种以下物质的试剂盒：(1)包含与货物化合物连接的奈瑟氏球菌属或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的复合物的试剂；(2)含有药学上可接受的佐剂或赋形剂的试剂；(3)用于施用的工具，例如注射器；(4)施用的说明。其中在相同的容器中存在部分(1)-(4)的两个或多个的实施方式也是预期的。在其他实施方式中，所述试剂盒部分可以包括包含奈瑟氏球菌属或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的试剂，以及包含所述货物化合物的独立的试剂。在其他实施方式中，所述试剂盒包括包含奈瑟氏球菌属或AAEAP(SEQ ID NO：25)转运肽的试剂，而不包括包含所述货物化合物的试剂。在其他实施方式中，所述试剂被配制用于静脉内施用，和/或施用的工具适合于静脉内施用。在某些实施方式中，所述试剂盒可以包含铜氧还蛋白衍生的转运肽，特别是铜绿假单胞菌天青蛋白。在其他实施方式中，所述试剂盒可以包含用于将货物化合物连接到奈瑟氏球菌属/AAEAP转运肽或铜氧还蛋白衍生的转运肽的试剂。

当提供试剂盒时，组合物的不同成分可以包装在分开的容器中，在使用前即时混合。这种成分的分开包装可以允许长期保存而不丧失活性成分的功能。

试剂盒中包括的试剂可以在任何类型的容器中提供，从而保持了不同成分的寿命，并且所述试剂不被容器的材料吸附或改变。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干的多肽或多核苷酸、或缓冲液，其在中性的、非反应性气体(例如氮气)中包装。安瓿可以由任何适合的材料构成，例如玻璃、有机聚合物(例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等等)、陶瓷、金属或保持类似试剂一般采用的任何其他材料。适合的容器的其他实例包括简单的瓶子，其可以由与安瓿类似的材料制造，以及包膜，其可以包含箔排列的内部，例如铝或合金。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器，等等。容器也可以有无菌的进人孔，例如具有塞子的瓶子，所述塞子可以被皮下注射针刺穿。其他容器可以具有由容易移动的膜分隔的两个区室，在移除膜时允许两个部分混合。可移除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶，等等。

试剂盒还可以提供说明材料。说明书可以打印在纸或其他基质上，和/或可以作为电子可读介质例如软磁盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像磁带、录音磁带、闪存设备等等来提供。详细的说明书可以与试剂盒不是物理上关联的；而是，可以指引用户到试剂盒的厂家或分销商指定的因特网网站，或作为电子邮件提供。

本发明的更完整的理解可以通过参考以下具体实施例来获得。仅为了例示的目的而不是限制本发明的范围，描述了实施例。当条件可以表明适宜或变得适宜时，形式上的改变和等效物的替换是预期的。虽然在此已经采用了特定的术语，这种术语意图是描述性的意义，而不是为了限制的目的。可以产生以上阐述的本发明的修饰和变化，而不背离其精神和范围，因而，如通过附随的实施方式所指明的，仅加以这样的限制。

实施例

实施例1.Laz和H.8-天青蛋白融合基因的克隆和表达

淋球菌的laz基因根据它的已知序列(SEQ ID NO：1)来克隆(图1A)。称为paz的铜绿假单胞菌天青蛋白基因(SEQ ID NO：2)(图1B)和来自淋球菌的laz的H.8表位的序列(SEQ ID NO：3)被用于在paz的5′末端框内克隆以产生H.8-paz(图1C)或在paz的3′末端框内克隆以产生paz-H.8(图1D)，如下所述。

细胞系和试剂。人类癌细胞、细菌菌株和质粒在表5中列出。人类乳腺癌MCF-7细胞和脑肿瘤LN-229细胞来自芝加哥伊利诺斯大学(UIC)的外科肿瘤学系的储用培养物中心。细胞培养在具有Eagle′s盐、含有2mM L—谷氨酰胺、0.1mM MEM必需氨基酸并添加有10％热灭活胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEM中。所有细胞在37℃在5％ CO₂中进行培养。(Yamada，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，et al.，Oncogene 23：2367-2378(2004)).

表5.癌细胞、细菌菌株和遗传构建体

^*Ap，氨苄青霉素；Km，卡那霉素；GST，谷胱甘肽-S-转移酶。

paz和laz基因的克隆和表达已经描述了天青蛋白基因的克隆和超表达。(Yamada，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，et al.，Oncogene 23：2367-2378(2004))通过PCR使用淋球菌菌株F62的基因组DNA作为模板DNA来扩增淋球菌的Laz编码基因(laz)。使用的正向和反向引物是5′-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3′(SEQ ID NO：5)，其中另外引入的EcoRI和KpnI限制性位点分别以下划线标出。1.0kb扩增的DNA片段，用EcoRI和KpnI消化，插入到pUC18载体(Yanisch-Perron，et al.，Gene 33：103-119(1985))的相应位点中，使得laz基因位于lac启动子的下游，来产生表达质粒pUC18-laz(表5，图1)。

用pUC19-paz和pUC18-laz作为模板通过PCR构建表达淋球菌Laz的H.8和铜绿假单胞菌的天青蛋白(Paz)融合物的质粒。对于H.8-Paz融合物，使用pUC18-paz作为模板和以下引物扩增3.1kb片段，

5′-(磷酸化的)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3*(SEQID NO：6)和5′-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3′(SEQ ID NO：7)，其中SalI位点以下划线标出。PCR扩增的0.4kb片段从作为模板的pUC19-paz和以下引物获得，

5′-(磷酸化的)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3′(SEQ IDNO：8)和5′-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3′(SEQ ID NO：9)，其中XhoI位点以下划线标出。将来自pUC18-laz的SaiI消化的PCR片段和来自pUC19-paz的XhoI消化的PCR片段克隆以产生表达质粒pUC18-H.8-paz(表5，图1)。

对于Paz-H.8融合物，用pUC19-paz作为模板和以下引物扩增3.3kb片段，5′-CTTCAGGGTCAGGGTGCCCTTCATC-3′(SEQ ID NO：10)和5′-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3′(SEQ ID NO：11)，其中BamHI位点以下划线标出。使用pUC18-laz作为模板和以下引物扩增0.13kb片段，5′-(磷酸化的)TGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCCTGC-3′(SEQID NO：12)和5′-TAGGATCCTTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3′(SEQ ID NO：13)，其中BamHI位点以下划线标出，另外引入的TTA、相应于细菌基因终止密码子是斜体的。将两个BamHI消化的PCR片段克隆以产生表达质粒pUC19-paz-H.8(表5)。

E.coliJM109被用作宿主菌株，用于天青蛋白和其衍生物基因的表达。重组E.coli菌株培养在含有100μg/ml氨苄青霉素、0.1mM IPTG和0.5mMCUSO₄的2×YT培养基中、在37℃培养16h来产生天青蛋白。

融合GST蛋白的质粒构建。谷胱甘肽S-转移酶(GST)编码基因使用pGEX-5X-3(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ)作为模板DNA通过PCR扩增。使用的正向和反向引物是5′-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3′(SEQ ID NO：14)和5′-CCCAAGCTTTCAGGGGATCCCACGACCTTCGATCAGATCC-3′(SEQ ID NO：15)，其中分别地，另外引入的限制性位点SacI和HindIII以下划线标出，另外引入的TCA，相应的细菌基因终止密码子是斜体的。用SacI和HindIII消化的1.0kb的扩增DNA片段被插入到pET29a载体的相应位点来产生表达质粒pET29a-gst(表5)。

对于H.8-GST融合，laz的信号肽和H.8编码区使用pUC18-laz作为模板DNA通过PCR扩增。使用的正向和反向引物是5′-GGAATTCATATGAAAGCTTATCTGGC-3′(SEQ ID NO：16)和5′-CCGGAATTCGGCAGCAGGGGCTTCGGC-3′(SEQ ID NO：17)，其中另外引入的NdeI和EcoRI位点的限制性位点分别以下划线标出。用NdeI和EcoRI消化的0.14kb的扩增DNA片段被插入到pET29a-gst载体的相应位点来产生表达质粒pET29a-H.8-gst(表5)。

对于GST-H.8融合，H.8编码区使用pUC18-laz作为模板DNA通过PCR扩增。使用的正向和反向引物是5′-CGGGATCCCCTGCTCTCAAGAACCTGCCGCGCC-3′(SEQ ID NO：18)和5′-CGGAATTCTTAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC AGG-3′(SEQ ID NO：19)，其中另外引入的限制性位点BamHI和EcoRI以下划线标出，引入的细菌基因终止密码子TTA是斜体的。用BamHI和EcoRI消化的0.14kb的扩增DNA片段被插入pGEX-5X-3载体的相应位点来产生pGEX-5X-3-H.8。GST-H.8融合区域然后用pGEX-5X-3-H.8作为模板DNA通过PCR扩增。使用的正向和反向引物是5′-CGAGCTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG-3′(SEQ ID NO：20)和5′-CCGCTCGAGTCAGGCAGCAGGGGCTTCGGCAG-3′(SEQ ID NO：21)，其中另外引入的限制性位点SacI和XhoI位点以下划线标出，引入的细菌基因终止密码子TCA是斜体的。用SacI和XhoI消化的1.1kb的扩增DNA片段被插入到pET29a载体的相应位点来产生表达质粒pET29a-gst-H.8(表5)。

E.coli BL21(DE3)被用作宿主菌株，用于gst和其融合衍生物的表达。

当携带这些质粒的E.coli菌株在存在IPTG的情况下进行培养时，如对天青蛋白所描述的裂解细胞和纯化蛋白(Yamada，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，et al.，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))，各种天青蛋白衍生物在SDS-PAGE作为单个成分迁移(图1E)，而含H.8的蛋白质(约17kDa)显示了不规则的迁移，如之前注意到的(Cannon et al.，同上；Fisette et al.，同上)。

实施例2.H.8增强铜绿假单胞菌天青蛋白对成胶质细胞瘤细胞而不是乳腺癌细胞的细胞毒性

已经报道了Paz对癌细胞的优先进入(Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))和它在体外和体内对人类黑素瘤(Yamada，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002))和乳腺癌(Punj，et al.，Oncogene 23：2367-2378(2004))的细胞毒性。然而，已知Paz或Laz对脑肿瘤如成胶质细胞瘤没有影响。在此研究了Paz、Laz、H.8-Paz(H.8表位在Paz的N-末端)和Paz-H.8(H.8表位在Paz的C-末端)对成胶质细胞瘤(LN-229细胞系)和乳腺癌(MCF-7细胞系)细胞的影响。

蛋白质的制备。铜绿假单胞菌的天青蛋白(Paz)、淋球菌的Laz、Paz-H.8和H.8-Paz如先前描述的进行纯化。(Yamada，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14098-14103(2002)；Punj，et al.，Oncogene23：2367-2378(2004)；Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))所有的重组GST融合物衍生物如以前描述的进行纯化。(Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))购买化学合成的39个氨基酸的H.8肽。

细胞毒性分析。进行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基)四唑溴化物(MTT)分析来确定对癌细胞的细胞毒性。在37℃、5％ CO₂将细胞(每孔5×10³个)接种到100:1培养基的96孔培养皿中。过夜温育之后，除去上清液，将含有指定的各种浓度的蛋白质的新鲜培养基添加到附着的细胞中。这些细胞被温育指定的各种时间，之后向培养物添加10μl 5mg/mlMTT(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)溶液并在37℃温育2小时通过MTT分析来测定活细胞的数量。通过添加100μl异丙醇中的40mM HCl来终止MTT反应。根据Mosmann描述的方法分光光度地测量形成的MTT甲月替(J.Immunol.Methods 65：55-63(1983))。

合成的H.8肽对成胶质细胞瘤LN-229(图2A)或者乳腺癌MCF-7(图2B)细胞有非常少的细胞毒性。在成胶质细胞瘤(图2A)中而不是在乳腺癌(图2B)细胞中，天青蛋白(Paz)的影响是剂量依赖性的，虽然很低，随着天青蛋白浓度从10μM提高到40μM细胞毒性提高。提高的细胞毒性仅仅或多或少地超过6h温育期。最显著的是Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在成胶质细胞瘤和乳腺癌细胞中细胞毒性方面的差异。虽然在MCF-7细胞中对于不同的温育时间Paz、Paz-H.8、H.8-Paz和Laz在所有剂量具有基本上相同的细胞毒性(图2B)，对于成胶质细胞瘤细胞Paz具有比Paz-H.8、H.8-Paz或Laz低得多的细胞毒性，特别是在较短的温育期(6h)。因而H.8部分虽然本身缺乏细胞毒性，看起来增强了Paz的细胞毒性，但仅仅针对成胶质细胞瘤而不针对乳腺癌细胞。

实施例3.Paz或Laz中存在的H.8表位促进成胶质细胞瘤细胞中天青蛋白的摄取

与Paz相比Paz-H.8、H.8-Paz和Laz对成胶质细胞瘤细胞的增强的细胞毒性提出了问题，H.8部分是否以某种方式促进成胶质细胞瘤细胞中天青蛋白的摄取。Alexa 

 568标记的红色荧光蛋白(Invitrogen-MolecularProbes Corp.，Carlsbad CA)被用于测定成胶质细胞瘤和乳腺癌细胞内部这些蛋白的内在化。这种技术先前被用于展现MCF-7细胞中天青蛋白的内在化(Punj，et al.，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))。

共焦显微镜检查。为了制备显微样品，在37℃在5％ CO₂下将细胞在盖玻片上培养过夜。预温的37℃新鲜培养基与红色荧光标记的(Alexa 568)天青蛋白或GST融合衍生物混合，与细胞温育指定的时间。用PBS洗涤细胞，在-20℃用甲醇固定5分钟。在用PBS洗涤三次并加入含有1.5mg/ml用于核染色的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)Vector Laboratories，Burlingame CA)之后，通过使用Carl Zeiss LSM510激光扫描共焦显微镜采集图像。(Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))

与Paz-H.8、H.8-Paz和Laz相比，天青蛋白(Paz)以降低的效力被内在化，表明了Paz进入成胶质细胞瘤LN-229细胞的屏障(图3A和4A)。相比之下，如先前报道的在乳腺癌MCF-7细胞中Paz被有效地内在化，与Paz-H.8、H.8-Paz或Laz相比具有同等或略高的效力(图3B和4B)。(Punj，etal.，Oncogene 23：2367-2378(2004)；Yamada，et al.，Cell.Microbiol.7：1418-1431(2005))在LN-229细胞中Laz进入的剂量依赖性展现了在37℃在30分钟温育期期间约16μM的最佳浓度(图3C和4C)，高于该浓度将没有进一步的增强(数据未显示)。在10μM浓度下，虽然在约10到20分钟内大部分Laz在LN-229细胞中被内在化(图3D和4D)，在这种条件下Paz的内在化是最小的(附图3E)，表明Paz内在化在LN-229细胞中是天生低效的。在LN-229细胞中与Laz类似但与Paz形成对比的Paz-H.8和H.8-Paz的显著内在化(图3A和4A)看来表明了H.8部分的相对位置，在Paz的N-末端还是C-末端，不影响它促进成胶质细胞瘤细胞中Paz部分内在化的能力。

实施例4.H.8部分促进在成胶质细胞瘤而不是在乳腺癌细胞中的Paz进入

为了确定H.8表位是否如Laz中的需要成为Paz的部分，或它能否单独起作用来促进Paz进入成胶质细胞瘤细胞，除了单独的H.8之外使用了各种H.8融合蛋白。由于小肽(如39个氨基酸的合成H.8部分)在溶液中具有低稳定性，我们构建了与H.8部分的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合物，类似于Paz-H.8或H.8-Paz，使得H.8被整合到GST的N-末端(H.8-GST)或GST的C-末端(GST-H.8)。在实施例1中描述了GST融合肽的构建。发红色荧光的结合Alexa 

 568的Paz与未标记的合成H.8肽、GST、GST-H.8和H.8-GST融合蛋白单独地进行温育，以及与磷酸盐缓冲盐水(PBS)温育作为对照，在37℃温育30分钟后在LN-229细胞中测定20μM Paz混合物的内在化。与PBS(图5E)、GST(图5B)或GST-H.8(图5C)相比，当单独地与Paz导入时，合成的H.8肽确实增强了Paz内在化(图5A)。荧光的定量显示H.8肽促进Paz进入达2.1倍。然而，H.8-GST的存在显著地增强(超过3倍)Paz的内在化(图5D)。另一方面，GST-H.8仅显示了轻微的促进(图5C)。Paz本身仅缓慢地(图5E)进入成胶质细胞瘤细胞，表明在脑肿瘤细胞中的进入由H.8介导。单独的H.8不进入成胶质细胞瘤细胞(图3A)，但它促进Paz的内在化的能力(图5A)反映了它促进蛋白质进入脑肿瘤细胞的能力。

实施例5.在存在H.8-GST的情况下Paz在成胶质细胞瘤细胞中增强的内在化引起了这种细胞中更高的细胞毒性。

我们在存在或不存在20μM Paz的情况下与LN-229细胞温育合成的H.8肽、GST、GST-H.8和H.8-GST蛋白(各20μM)24h，然后在24h后通过MTT分析测量活的成胶质细胞瘤细胞来测量细胞毒性的程度。在缺乏Paz的情况下，H.8肽、GST或GST融合蛋白都没有展现任何显著的细胞毒性(图5F，-Paz)。在存在20μM Paz的情况下，其本身在存在H.8肽或PBS的情况下展现了低细胞毒性(图5F，+Paz)，仅在存在H.8-GST的情况下观察到相当大的细胞毒性增强(图5F，+Paz)，而GST本身或GST-H.8确实显示了一定的细胞毒性增强(图5F，+Paz)。结合起来，这些数据表明当作为蛋白质的部分或在存在蛋白质(如Paz)时，H.8部分促进Paz在这些细胞中的转运，产生增强的细胞毒性。

实施例6.H.8介导BBB的穿越以容许进入脑部

H.8表位容许成胶质细胞瘤LN-229细胞中融合蛋白或单独的蛋白质的增强的内在化的能力(图3A、4A和5D)提出了问题：作为H.8-Paz的N-末端或Laz的部分的H.8是否促进BBB的穿越并容许将这些蛋白从外周循环转移到脑部微静脉。

分析在厂家建议的条件下使用

 800CW(LI-CORBiosciences，Lincoln，Nebraska)标记所有蛋白。将与

 800CW结合的500μg的Paz、H.8-Paz和Laz腹膜内注射到裸鼠中。24h后，处死小鼠，取出脑，并使用LI-COR 红外成像系统(84μm分辨率，1mm偏移量)检测脑成像。然后水平地切割小鼠脑部，采集中脑外侧区域图像用于标记的蛋白存在的检测。

天青蛋白的荧光的定量荧光的定量通过使用

如下测量：通过Photoshop的Lasso Tool选择一个细胞，从图像菜单的红色直方图获取平均值。对一个样品测量至少三个不同的细胞，计算标准差。将用红外染料

 800CW(LI-COR Bioscience)标记的500μgPaz、H.8-Paz和Laz蛋白腹膜内注射到活的裸鼠中。24h后，处死小鼠，分离脑，并使用LI-COR 

红外成像系统采集图像。虽然发现Paz少量地进入脑部微静脉，多得多的Laz和特别是H.8-Paz(超过4倍)在这种条件下在脑内检测到(图6)，表明H.8表位容许融合蛋白进入脑部的清楚的作用。

实施例7.当存在于N-末端时，H.8表位容许外周蛋白的细菌表面呈现。

为了研究H.8表位在Laz中的N-末端定位是否促成它的表面呈现，如实施例1中描述的在GST的N-末端和C-末端(图5)和Paz(图2和图3A/B和4A/B)构建了H.8融合衍生物。

E.coli中表面暴露的蛋白质的定位携带pET29a-gst、pET29a-H.8-gst或pET29a-gst-H.8的E.coli菌株BL21(DE3)和携带pUC19-paz、pUC19-paz-H.8、pUC18-H.8-paz或pUC18-laz的E.coli菌株JM109在37℃用0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)培养。离心一毫升每种这些细菌培养物，收集产生的细菌团。在用PBS洗涤两次之后，添加含有针对GST衍生物的抗GST抗体(1:2000)或针对天青蛋白衍生物的抗天青蛋白抗体(1:500)的1mL 1％ FBS-PBS。细胞悬液在冰上孵育1h，然后用PBS洗涤两次。施加针对GST衍生物的结合FITC的抗兔IgG或针对天青蛋白衍生物的结合FITC的抗兔抗体，并在冰上孵育30分钟。为了除去未结合的抗体，用PBS洗涤细胞两次，在冰上用乙醇固定。然后在共焦显微镜下观察用DAPI处理的E.coli样品。

纯化H.8融合蛋白(图1E和图7A)。在图7B中显示了GST以及N-末端和C-末端的两种H.8融合物(H.8-GST和GST-H.8)的细胞定位。当使用抗GST抗体通过Western印迹检测时，所有三种蛋白在E.coli中超量表达，并存在于E.coli的全细胞裂解液中(图7B)。当从E.coli分离周质部分时并检查三种蛋白质的存在时，GST和GST-H.8蛋白以显著的量被检测到(图7B，周质部分下的泳道1和3)，但仅少量的H.8-GST(图7B，周质部分下的泳道2)可以在这种周质部分中检测到。

为了检查其余的H.8-GST融合蛋白是否可能被转运到E.coli细胞的表面，培养并收获超表达三种蛋白质的细胞，洗涤，用抗GST抗体处理来结合任何表面暴露的GST，再次洗涤并用结合FITC的二级抗体处理。如果GST是表面暴露的，抗GST抗体将与它们结合，其然后可以通过结合FITC的二级抗体检测。实际上，仅携带H.8-GST的E.coli细胞显示了FITC产生的绿色荧光(图7C，H.8-GST)，表面H.8表位在GST的N-末端的存在促进了它转运到细胞表面。在GST的C-末端的H.8部分的存在(GST-H.8)以及GST本身主要仍为周质性的和胞内的，没有任何表面呈现(图7C，GST和GST-H.8)。

使用如上所述的相同技术，我们确定了Paz和Paz-H.8仍为胞内的(图7D，Paz和Paz-H.8)，而H.8-Paz和Laz都显示了表面呈现，确定了H.8在N-末端的存在，可能需要游离的半胱氨酸用于脂质化，对于融合蛋白通过外膜转运到达表面是重要的。

实施例8.患有癌症的患者的治疗

在患有癌症的患者中进行了H.8-Paz融合物(研究药物)的I/II期临床试验。特别地，来自淋球菌的Laz编码基因(laz)的H.8结构域以及货物化合物是来自铜绿假单胞菌的天青蛋白(paz)，产生了融合蛋白“H.8-paz”。这种融合蛋白将如实施例1中描述的来构建。

患有组织学上证实的脑部癌症、在通过当前可用的FDA批准的化学治疗药物和疗法的充分治疗后展现了临床的和放射照成像进展或复发的四十九位成年患者，将被编入施用所述研究药物的开放性远景研究。为了有资格编入研究，所有患者在批准的化学疗法疗程完成后展现了提高的可测量肿瘤体积。持久的转移性沉积和/或大小或体积的继续增加的证据必需被组织学地确定。这种组织学证据可以通过细针抽吸(FNA)活检来获得。

在从所有患者根据芝加哥伊利诺斯大学的机构审查委员会和FDA的知情同意之后将开始治疗程序。患者没有并发的疾病，例如其他恶性肿瘤、先前的恶性肿瘤史、血质不调、胰岛素依赖型糖尿病或其他严重的心血管疾病，其可能干扰推荐治疗的效果的合适评估。包括肝功能研究(LFT)的基线血液工作(全血球计数[CBC]和血清化学)将在治疗开始之前进行。所有有资格的患者在试验期间必需不同时接受任何癌症化学疗法。

通过每天静脉内注射药学上可接受的研究药物的制品来施用研究药物12周，观察受试者的任何剂量限制毒性。以10mg/kg/天开始的7个剂量水平，增加5mg/kg/天直到50mg/kg/天的最大剂量。每个剂量水平的效力将在患有晚期(advanced)可测量癌症的7位患者中记录。

通过在2维上(a和b)测量可测量肿瘤来估计反应。1)目标肿瘤的全部消失将被认为是完全反应(CR)；2)75％降低将被认为是极好的部分反应(PR)；以及3)良好反应(PR)将是处理后大小减少达50％。4)大小上25％的降低被认为是稳定的疾病(SD)，以及5)<25％将被认为是无反应(NR)。展现了疾病进展的患者将停止他们的治疗，但将跟踪额外的12周。

目标肿瘤的全部消失和大小上的任何减少将表明H.8-天青蛋白治疗对于治疗癌症是有效的。H.8-天青蛋白治疗有效的其他指标是新的脑肿瘤出现的减少率，和与肿瘤相关的血管生成疾病的减少。

本发明的描述的实例和系统的各种修改和改变对于本领域的技术人员是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已经结合具体实施方式描述了本发明，应当理解的是请求保护的本发明不应过度局限于这些特定实施方式。实际上，对于相关领域的技术人员明显的、用于进行本发明的描述的模式的各种修改，意于在以下权利要求书的范围之内。

Claims (44)

1.一种分离的转运肽，其是来自奈瑟氏球菌属的Laz、Lip或Pan 1的变体、衍生物或结构等效物，并且其促进连接的分子进入哺乳动物脑部癌细胞或穿越血脑屏障。

2.权利要求1的转运肽，其与Laz的H.8区域(SEQ ID NO：24)具有至少90％的氨基酸同一性。

3.权利要求1的转运肽，其中所述肽是SEQ ID NO：24。

4.权利要求1的转运肽，其中所述转运肽被修饰以延长或优化所述肽在血流中的半衰期。

5.一种包含区域的转运肽，所述区域由Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQID NO：25)的至少4个不完全或完全重复组成，并且所述转运肽每个总长度具有至少约50％的AAEAP(SEQ ID NO：25)五肽重复。

6.权利要求5的转运肽，其中所述重复区域与包含相同数量的Ala-Ala-Glu-Ala-Pro(SEQ ID NO：25)重复的肽具有至少约90％的同一性。

7.权利要求5的转运肽，其是合成的。

8.权利要求5的转运肽，其中所述转运肽被修饰以延长或优化所述肽在血流中的半衰期。

9.一种复合物，其包含至少一种货物化合物和一种转运肽，其中所述转运肽是权利要求5的肽，并且所述转运肽与所述货物化合物连接。

10.一种复合物，其包含至少一种货物化合物和一种转运肽，其中所述转运肽是权利要求1的肽，并且所述转运肽与所述货物化合物连接。

11.权利要求10的复合物，其中所述货物化合物是铜氧还蛋白，所述铜氧还蛋白选自天青蛋白、质体蓝素、铁硫菌蓝蛋白、假天青蛋白、橙绿屈挠素和天青蛋白样蛋白。

12.权利要求11的复合物，其中所述货物化合物是来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的天青蛋白。

13.权利要求10的复合物，其中所述复合物被修饰以延长或优化所述肽在血流中的半衰期。

14.权利要求10的复合物，其另外包含铜氧还蛋白衍生的转运肽。

15.权利要求10的复合物，其中所述货物化合物选自蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、染料、微粒、纳粒、毒素和药物。

16.权利要求10的复合物，其中所述货物化合物是蛋白质，所述转运肽与所述货物化合物连接以形成融合蛋白。

17.权利要求15的复合物，其中所述货物化合物是毒素。

18.权利要求10的复合物，其中所述货物化合物是用于疾病的治疗的治疗剂，所述疾病选自抑郁症、情感障碍、慢性疼痛、癫痫症、阿尔茨海默病、中风/神经保护、脑和脊髓损伤、脑部癌症、脑的HIV感染、各种产生共济失调的失调、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、影响脑部的儿童先天遗传性错误、帕金森氏病和/或多发性硬化。

19.权利要求10的复合物，其中所述货物化合物是可检测的物质。

20.权利要求19的复合物，其中所述可检测的物质是可通过选自荧光测定、显微镜检查、X射线CT、MRI和超声的方法检测的。

21.一种药物组合物，其包含药学上适合的载体中的权利要求10的复合物。

22.权利要求21的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适合于静脉内施用。

23.权利要求21的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体适合于侧脑室内或脑内注射。

24.一种方法，包括用权利要求10的复合物接触细胞。

25.权利要求24的方法，其中所述细胞来自中枢神经系统的肿瘤。

26.权利要求24的方法，其中所述细胞是癌细胞，所述癌选自星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、脊髓肿瘤、神经节神经胶质瘤、神经细胞瘤和髓母细胞瘤。

27.一种治疗患有癌症的患者的方法，包括给所述患者施用治疗有效量的权利要求10的复合物。

28.权利要求27的方法，其中所述复合物以选自静脉内、体表、皮下、肌内和进入肿瘤的方式施用。

29.权利要求27的方法，进一步包括共同施用另一种癌症治疗。

30.一种用于成像患者癌症的方法，包括向所述患者施用权利要求19的复合物，并检测所述货物化合物在所述患者中的位置。

31.权利要求30的方法，其中所述货物化合物是X射线造影剂，所述货物化合物的位置通过X射线CT检测。

32.权利要求30的方法，其中所述货物化合物是磁共振成像造影剂，所述货物化合物的位置通过MRI检测。

33.权利要求30的方法，其中所述货物化合物是超声造影剂，所述货物化合物的位置通过超声成像检测。

34.一种诊断癌症的方法，包括用权利要求19的复合物接触细胞，并检测所述货物分子的细胞位置。

35.一种试剂盒，包含试剂，所述试剂包含权利要求1的转运肽。

36.权利要求35的试剂盒，进一步包含试剂，所述试剂包含药学上可接受的载体。

37.权利要求35的试剂盒，进一步包含用于施用所述试剂的工具。

38.一种核酸分子，其编码权利要求1的转运肽。

39.一种核酸分子，其编码权利要求5的转运肽。

40.一种核酸分子，其编码权利要求10的复合物。

41.一种治疗或诊断患有脑部相关疾病的患者的方法，包括给所述患者共同施用权利要求1的转运肽和至少一种货物化合物。

42.权利要求41的方法，其中另外共同施用铜氧还蛋白衍生的转运肽。

43.一种治疗或诊断患有脑部相关疾病的患者的方法，包括给所述患者共同施用权利要求5的转运肽和至少一种货物化合物。

44.权利要求43的方法，其中另外共同施用铜氧还蛋白衍生的转运肽。

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