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CN101466836A - 多巴胺能神经元祖细胞标志物187a5 - Google Patents

多巴胺能神经元祖细胞标志物187a5 Download PDF

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CN101466836A CNA2007800217365A CN200780021736A CN101466836A CN 101466836 A CN101466836 A CN 101466836A CN A2007800217365 A CNA2007800217365 A CN A2007800217365A CN 200780021736 A CN200780021736 A CN 200780021736A CN 101466836 A CN101466836 A CN 101466836A
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Sanitary Material R&d Management Co ltd
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Abstract

本发明的目的是提供用于多巴胺能神经元祖细胞的检测或选择的探针、引物、引物组和抗体。根据本发明，提供了：能够与187A5基因的核苷酸序列或其互补序列杂交的、用于中脑多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择的探针、引物和引物组，以及用于中脑多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的检测或选择的、对187A5蛋白具有结合性的抗体。

Description

多巴胺能神经元祖细胞标志物187A5
技术领域
本发明涉及作为多巴胺能神经元祖细胞标志物的187A5基因，具体而言，本发明涉及多巴胺能神经元祖细胞的检测手段、以及该细胞的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
多巴胺系统是与哺乳动物脑内重要的运动调节、激素分泌调节、情感调节等相关的非常重要的系统。因而，多巴胺能性神经传导的异常可引发各种神经系统障碍。例如，帕金森病是由中脑黑质的多巴胺能神经元特异性脱落原因引起的锥体外系统神经变性疾病(HARRISON’S PRINCIPLESOF INTERNAL MEDICINE第2卷第23版，Isselbacher等编，McGraw-Hill Inc.，NY(1994)pp.2275-7)。
帕金森病的治疗方法主要采用口服给与L-DOPA(3，4-二羟基苯丙氨酸)的方法以补偿多巴胺产量的减少，但已知该方法疗效的持续性不好。
因此，作为补偿失去的多巴胺能神经元的方法，人们最近正在尝试一种移植含有多巴胺能神经元祖细胞的6-9周龄流产胚胎的中脑腹侧区的治疗方法(美国专利第5690927号；Spencer等人(1992)N.Engl.J.Med.327：1541-8；Freed等人(1992)N.Engl.J.Med.327：1549-55；Widner等人(1992)N.Engl.J.Med.327：1556-63；Kordower等人(1995)N.Engl.J.Med.332：1118-24；Defer等人(1996)Brain 119：41-50；Lopez-Lozano等人(1997)Transp.Proc.29：977-80)。但是，现阶段，该方法不仅在细胞供应方面和伦理方面存在问题(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33：106；Turner等人(1993)Neurosurg.33：1031-7)，而且还被指出在感染污染的危险性、移植物的免疫排斥(Lopez-Lozano et al.(1997)Transp.Proc.29：977-80；Widner andBrudin(1988)Brain Res.Rev.13：287-324)、由于与糖酵解相比胚胎组织更主要地依赖脂类代谢而造成的存活率低下(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33：106)等各个方面存在问题。
为了解决伦理层面、供应不足等问题，人们又提出了例如利用猪源的皮质、纹及中脑细胞的方法等。(例如，特表平10-508487号公报；特表平10-508488号公报；特表平10-509034号公报)。在这些方法中，为了抑制排斥反应，必须要进行改变细胞表面抗原(MHC-I类抗原)的繁杂操作。作为消除移植物排斥的方法，例如，有人提出可通过同时移植Sertoli细胞而进行局部免疫抑制(特表平11-509170号公报；特表平11-501818号公报；Selawry和Cameron(1993)Cell Transplant 2：123-9)。虽然也可从MHC匹配的有血缘关系的人、他人的骨髓、骨髓银行及脐带血银行等获取移植细胞，但如果能够利用患者自身的细胞，就可以无需多余的操作和步骤而解决排斥反应的问题。
因而，有望实现来自于胚胎干细胞(ES细胞)、骨髓间质细胞等非神经系统细胞的体外多巴胺能神经元分化体系作为移植材料的应用，而以此代替流产胚胎来源的细胞。实际上，有报道称向大鼠帕金森病模型的病变纹移植后，ES细胞来源的多巴胺能神经元可以具有功能性(Kim et al.(2002)Nature 418：50-56)。可以认为将来，源自ES细胞或患者本人的神经干细胞的再生治疗会越来越重要。
在神经组织损伤的治疗方面，脑机能的再构建是必须的，为了能够与周围的细胞形成合适的连接(形成网络)，必须移植不是成熟细胞而可以体内分化为神经元的细胞。在神经元祖细胞移植方面，除上述供给方面的问题之外，该祖细胞可能分化为不均一的细胞群，也是存在的问题之一。例如，在帕金森病的治疗中，必须从含有儿茶酚胺的神经元中选择性地移植多巴胺能神经元。目前为止，作为已经提出的可用于帕金森病治疗的移植细胞，例如包括纹状体(Lindvallet al.(1989)Arch.Neurol.46：615-31；Widneret al.(1992)N.Engl.J.Med.327：1556-63)、人胚胎神经来源的无限增殖化细胞系(特表平8-509215号公报；特表平11-506930号公报；特表2002-522070号公报)、NT2Z细胞的有丝分裂后人神经元(特表平9-5050554号公报)、神经元原基细胞(特表平11-509729号公报)、通过外源基因转染而产生多巴胺等儿茶酚胺类物质的细胞、骨髓基质细胞(特表2002-504503号公报；特表2002-513545号公报)、基因修饰的ES细胞(Kim et al.(2002)Nature 418：50-56)等。然而，上述细胞均非仅含有多巴胺能神经元或可分化为多巴胺能神经元的细胞。
作为从未分化的细胞群中选择性地浓缩、分离多巴胺能神经元的方法，有人提出在多巴胺能神经元表达的酪氨酸羟化酶(以下也称为“TH”)等的基因的启动子/增强子的控制下，将表达荧光蛋白的报告基因导入细胞群中的各细胞，通过分离发出荧光的细胞，实现多巴胺能神经元在存活状态下的可视化，进而进行浓缩、分离或鉴定的方法(特开2002-51775号公报)。但是在该方法中，外源基因导入这样繁琐复杂的过程是必不可少的，而且在用于基因治疗的目的时，报告基因的存在也造成毒性、免疫原性方面的问题。
由此看来，现阶段帕金森病移植治疗中的一个大问题是：流产胚胎的中脑腹侧区来源的多巴胺能神经元祖细胞或分化诱导而得的多巴胺能神经元祖细胞均是多种细胞的混合物。考虑到形成神经回路的安全性，希望能够仅分离出目的细胞种类来使用。而且，考虑到细胞在移植目标的脑内的存活以及正确形成网络的能力，从治疗效果的观点来看，可以说希望分离出尽量早期的增殖祖细胞来进行移植。
到目前为止，已经报导了在多巴胺能神经元增殖祖细胞中表达的基因——Lrp4(WO2004/065599号公报)。此外，还报导了数个多巴胺能神经元祖细胞的标志物(WO2004/038018号公报、WO2005/052190号公报)。
发明内容
为了分离出在多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的基因，本发明人等从大鼠13.5日胚中脑腹侧和后脑腹侧分离了Lrp4(多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因)蛋白阳性的细胞，采用差减法(N-RDA)法在中脑中寻找Lrp4阳性细胞特异性基因，结果发现了在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的基因(187A5基因，在本说明书中也简称为“187A5”)(实施例2)。本发明正是基于以上认识。
本发明的目的是：提供多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测手段、多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测方法和多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测试剂盒。
此外，本发明目的还在于：提供对多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的分化诱导有效的物质的筛选方法。
此外，本发明目的还在于：提供用于帕金森病治疗的多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的制造方法。
本发明提供选自以下的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的多核苷酸(以下也称“187A5基因”)：
(i)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii)编码由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失而成的核苷酸序列和/或在SEQ IDNO：1的核苷酸序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；以及
(iv)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸。
本发明还提供选自以下的(v)、(vi)、(vii)和(viii)中的蛋白(以下又称“187A5蛋白质”)：
(v)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失而成的氨基酸序列和/或在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；和
(viii)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明还提供能够与187A5基因的核苷酸序列或其互补序列杂交的、用于多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择的探针或引物(以下分别也称“本发明的探针”和“本发明的引物”)。
本发明还提供用于多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择的、对187A5蛋白具有结合性的抗体(以下也称“本发明的抗体”)。
本发明还提供多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择方法(以下也称“本发明的检测方法”)，该方法包括检测187A5基因的表达或187A5蛋白的步骤。
本发明还提供用于多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择的试剂盒(以下也称“本发明的试剂盒”)，该试剂盒至少包含本发明的探针、引物、引物组或抗体。
本发明还提供用于多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的检测或选择的试剂(以下也称“本发明的检测用试剂”)，该试剂至少包含本发明的探针、引物、引物组或抗体。
本发明还提供对多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的分化诱导有效的物质的筛选方法，该方法包括检测187A5基因的表达或187A5蛋白的步骤。
本发明提供用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的制备方法。
本发明的探针、引物、引物组和抗体可以在中脑中作为多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞特异性标志物使用。因此，本发明在移植材料的纯度检测、多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的体外分化诱导方法的开发等方面是极其有价值的，其在推进再生医疗的实用化方面做出了很大贡献。此外，本发明的蛋白并非简单地表达，而是蛋白的一部分表达在细胞外。因此，通过以本发明的蛋白的细胞外域为指标，不仅能够确实地检测生活状态的细胞，该可以分离并获取该细胞，这可以说对再生医疗的实用化做出了更大贡献。
附图说明
图1显示了多巴胺能神经元细胞相关标志物基因的表达时期。
图2：采用免疫染色法对大鼠14.5日胚的中脑和后脑中Lrp4、TH蛋白的表达进行分析所得的结果。
图3：采用RT-PCR法对中脑和后脑Lrp4阳性细胞中187A5、Lmxla以及Lrp4的mRNA表达进行分析所得的结果。
图4：采用原位杂交对小鼠12.5日胚的中脑和后脑中187A5和Lrp4的mRNA表达进行分析所得的结果。
图5：采用RT-PCR法对通过SDIA法从ES细胞分化诱导得到的多巴胺能神经元增殖祖细胞中187A5、Lmxla以及Lrp4的mRNA表达进行分析所得的结果。
图6：采用RT-PCR法对通过5阶段法从ES细胞分化诱导得到的多巴胺能神经元增殖祖细胞中187A5、Lmxla以及Lrp4的mRNA表达进行分析所得的结果。
图7为显示小鼠187A5和187A5-SEAP的图。
图8：对187A5的信号序列活性的分析结果。
图9：采用细胞表面蛋白的生物素化修饰法对187A51蛋白的细胞表面表达进行分析的结果。
图10：采用FACS分析考察187A5蛋白的细胞表面表达的结果。图中方框包围的部分表示187A表达细胞。
图11：采用免疫染色法对小鼠11.5日胚的中脑和后脑腹侧的187A5蛋白的表达进行分析的结果。
图12：采用FACS分析对小鼠12.5日胚的中脑和后脑腹侧的187A5蛋白和Lrp4蛋白的表达进行考察的结果。
图13：采用FACS分析对通过SDIA法从ES细胞分化诱导得到的多巴胺能神经元增殖祖细胞中187A5蛋白和Lrp4蛋白的表达进行考察的结果。
图14：对通过SDIA法从ES细胞分化诱导得到的187A5/Lrp4共阳性细胞进行分离和培养的结果。
图15示意性地显示了可用于选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的DNA构建体的结构。
发明的具体实施方式
以下，针对本发明进行具体说明。以下的描述是用于说明本发明的示例，并非意味着本发明仅限于这些实施方式。本说明书中使用的全部技术术语、科学术语和专业术语均具有本发明所属技术领域的普通技术人员一般性理解的含义，这里仅是出于对特定实施方式进行说明的目的而使用，并非意味着限定。只要不脱离其要旨，本发明可以各种方式实施。而且，本说明书引用全部现有技术文献和公开公报、专利公报及其它专利文献均作为参考并入本说明书中，可以用于本发明的实施。
[多巴胺能神经元祖细胞]
在本发明中，作为检测或选择的对象的“多巴胺能神经元祖细胞”是指成熟前的多巴胺能神经元细胞。
此外，在本发明中，作为检测或选择的对象的“多巴胺能神经元增殖祖细胞”是指分裂停止前的多巴胺能神经元祖细胞。
多巴胺能神经元从神经上皮细胞开始，历经增殖祖细胞(proliferativeprogenitor cell)、有丝分裂后的前体细胞(postmitotic precursor cell)等分化阶段，分化为成熟多巴胺能神经元。多巴胺能神经元祖细胞是多巴胺能神经元的祖细胞；这其中，多巴胺能神经元增殖祖细胞是多巴胺能神经元的最早期的祖细胞，因而，可以期待其具有移植目标的脑内的高存活率和高网络形成能力。因此，多巴胺能神经元祖细胞，特别是多巴胺能神经元增殖祖细胞对帕金森病等起因于多巴胺能神经元的变性脱落造成的多巴胺减少的疾病的移植治疗是有价值的。
以本发明的探针、引物、引物组或抗体为指标选择出的细胞是多巴胺能神经元祖细胞，所以，在安全性、存活率、网络形成能力等方面，其与现有的异种细胞集团或导入了外源基因的多巴胺能神经元祖细胞相比是帕金森病等神经变性疾病的移植治疗所优选的。特别是，当使用本发明的探针、引物、引物组或抗体检测或选择的细胞是分裂停止前的多巴胺能神经元祖细胞即增殖中的多巴胺能神经元祖细胞时，有可能在脑内的最适位置分化成熟，还存在多巴胺能神经元祖细胞在体内进一步增殖的可能性，因而，可以期待更长期的治疗效果。因此可以说，本发明在帕金森病等神经变性疾病的有效移植治疗的实用化方面开辟了途径。
[187A5基因和蛋白]
在本发明中，“187A5基因”表示编码187A5蛋白的那些，不仅包括cDNA，还包括基因组DNA。此外，还包括相应的RNA。
在本发明中，作为多巴胺能神经元祖细胞存在的指标的“187A5基因”，在小鼠中，已经作为功能未知序列登录在数据库中，而在人、大鼠、牛、犬、黑猩猩等中，仅是预测了序列。公开每个序列的GenBank登录号如下。
人：XM_044062(SEQ ID NO：3(碱基序列)、SEQ ID NO：4(氨基酸序列)，以下顺序同)、AK126715(SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6)、HSM803256(SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8)、HSM803467(SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10)
小鼠：AK028289(SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12)、AK157823(SEQ IDNO：13(碱基序列))、AK028541(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15)、AK035053(SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17)、XM_485684(SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：19)、AK163356(SEQ ID NO：20(碱基序列))
大鼠：XM_344107(SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22)
牛：XM_509147(SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24)
犬：XM_543360(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26)
黑猩猩：XM_522557(SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28)
在本发明中，作为在中脑部位的多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)中选择性表达的基因，人187A5基因的cDNA序列(SEQID NO：1)已经确定；此外，作为在多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)中选择性表达的蛋白(多肽)，人187A5蛋白(多肽)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)已经确定。
本领域技术人员能够基于SEQ ID NO：1的187A5基因核苷酸序列或SEQ ID NO：2的187A5蛋白氨基酸序列，确定各种动物的187A5基因核苷酸序列或187A5蛋白氨基酸序列。例如，基于人或小鼠的187A5基因或187A5蛋白进行同源性检索，可以检索并确定该动物的187A5基因或187A5蛋白。因此，在本发明中，“187A5基因”和“187A5蛋白”除了是指人来源的187A5基因或人来源的187A5蛋白之外，还包括各种动物(优选哺乳动物)的187A5基因或187A5蛋白。
作为187A5基因的例子，可以列举出：
编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸序列的人187A5蛋白的多核苷酸；
编码包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：19的氨基酸序列的小鼠187A5蛋白的多核苷酸；
编码包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的大鼠187A5蛋白的多核苷酸；
编码包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的牛187A5蛋白的多核苷酸；
编码包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的犬187A5蛋白的多核苷酸；和
编码包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的黑猩猩187A5蛋白的多核苷酸。
作为187A5基因的例子，还可以列举出：
包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9所示的人187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；
包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的小鼠187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；
包含SEQ ID NO：21所示的大鼠187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；
包含SEQ ID NO：23所示的牛187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；包含SEQ ID NO：25所示的犬187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；和
包含SEQ ID NO：27所示的黑猩猩187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸。
作为187A5基因，可以列举出选自以下的(i’)、(ii’)、(iii’)和(iv’)中的多核苷酸：
(i’)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii’)编码由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失而成的核苷酸序列和/或在上述序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii’)下述多核苷酸，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白；
(iv’)下述多核苷酸，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
作为187A5基因，可以列举出编码选自以下的(v’)、(vi’)、(vii’)和(viii’)中的蛋白的多核苷酸：
(v’)包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白；
(vi’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失，和/或在上述氨基酸序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii’)由下述多核苷酸编码，且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；
(viii’)由与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ IDNO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
此外，本发明优选提供选自以下的(i”)、(ii”)、(iii”)和(iv”)中的多核苷酸：
(i”)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii”)编码由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在该核苷酸序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii”)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；
(iv”)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸。
此外，本发明优选提供编码选自以下的(v”)、(vi”)、(vii”)和(viii”)中的蛋白的多核苷酸：
(v”)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi”)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该氨基酸序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii”)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；和
(viii”)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明更优选提供选自以下的(i”’)、(ii”’)、(iii”’)和(iv”’)中的人来源多核苷酸：
(i”’)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii”’)编码由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii”’)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；
(iv”’)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有95％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸。
此外，本发明更优选提供编码选自以下的(v”’)、(vi”’)、(vii”’)和(viii”’)中的人来源的蛋白的多核苷酸：
(v”’)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi”’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii”’)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；以及
(viii”’)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明进一步优选提供包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的人来源的多核苷酸。
此外，本发明进一步优选提供编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的人来源的蛋白的多核苷酸。
作为187A5蛋白(多肽)的例子，可以列举出：
包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQID NO：10的氨基酸序列的人187A5蛋白；
包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19的氨基酸序列的小鼠187A5蛋白；
包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的大鼠187A5蛋白；
包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的牛187A5蛋白；
包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的犬187A5蛋白；和
包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的黑猩猩187A5蛋白。
作为187A5蛋白(多肽)的例子，还可以列举出：
由包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5SEQ ID NO：7或SEQID NO：9所示的人187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白；
由包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的小鼠187A5基因核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白；
由包含SEQ ID NO：21所示的大鼠187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白；
由包含SEQ ID NO：23所示的牛187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白；
由包含SEQ ID NO：25所示的犬187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白；和
由包含SEQ ID NO：27所示的黑猩猩187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列编码的蛋白。
作为187A5蛋白(多肽)，可以列举出选自以下的的(i’)、(ii’)、(iii’)和(iv’)中的蛋白：
(i’)由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列编码的蛋白；
(ii’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列中、发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在上述序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii’)由下述核苷酸序列编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述核苷酸序列与由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交；
(iv’)由下述核苷酸序列编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述核苷酸序列与由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性。
此外，作为187A5蛋白(多肽)，可以列举出选自以下的(v’)、(vi’)、(vii’)和(viii’)中的蛋白：
(v’)包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白；
(vi’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在上述序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii’)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；
(viii’)由与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ IDNO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明优选提供选自以下的(i”)、(ii”)、(iii”)和(iv”)中的蛋白(多肽)：
(i”)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的蛋白；
(ii”)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中、发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失而成的核苷酸序列和/或在SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一侧或两末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii”)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交；
(iv”)由下述多核苷酸编码，且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性。
此外，本发明优选提供选自以下的(v”)、(vi”)、(vii”)和(viii”)中的蛋白(多肽)：
(v”)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi”)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii”)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；
(viii”)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明更优选提供选自以下的(i”’)、(ii”’)、(iii”’)和(iv”’)中的人来源的蛋白(多肽)：
(i”’)由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的蛋白；
(ii”’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或该核苷酸序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii”’)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交；
(iv”’)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有95％以上的同一性。
此外，本发明更优选提供选自以下的(v”’)、(vi”’)、(vii”’)和(viii”’)中的人来源的蛋白(多肽)：
(v”’)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi”’)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii”’)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；
(viii”’)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有95％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
本发明进一步优选提供由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码的人来源的蛋白。
此外，本发明进一步优选提供包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的人来源的蛋白。
在本说明书中，“在多核苷酸中、发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的”以及“在氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的”是指通过定点突变诱导等公知技术方法产生的变异，或者在能够自然发生的程度内的多个核苷酸或氨基酸的取代等。对于多核苷酸而言，还包括单碱基多态(SNPs)。在核苷酸和氨基酸的变异的个数方面，可以例如发生1～30个、优选1～20个、更优选1～10个、更优选1或数个(例如9个以下)、特别优选1～4个、最优选1～2个核苷酸和氨基酸的插入、取代或缺失和/或添加到一个或两个末端。
变异氨基酸序列优选具有1或多个(例如1个～数个、或者1、2、3或4个)保守取代的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在(ii)、(ii’)、(ii”)或(ii”’)中，导入核苷酸序列中的插入、取代、缺失或增加的数目优选为1或数个(例如9个以下)，更优选为1～6个，特别优选为1～4个、最优选为1～2个。
在(vi)、(vi’)、(vi”)或(vi”’)中，导入氨基酸序列中的插入、取代、缺失或增加的数目优选为1或数个(例如9个以下)，更优选为1～6个，特别优选为1～4个、最优选为1～2个。
在本说明书中，“保守取代”是指将1或多个氨基酸残基取代为化学性质相似的其它氨基酸残基，而不在实质上改变蛋白的功能。例如包括：将某个疏水性残基取代为其它疏水性残基的情况、将某个极性残基取代为带相同电荷的其它极性残基，等等。可以进行这种取代的功能上相似的氨基酸，就每种氨基酸而言是本领域技术人员公知的。作为具体例子，作为非极性(疏水性)氨基酸可以列举出：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以列举出：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷(碱性)氨基酸，可以列举出：精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。作为带负电荷(酸性)的氨基酸，可以列举出：天冬氨酸、谷氨酸等。
作为变异核苷酸序列，可以列举出具有下列取代的核苷酸序列：将SEQID NO：1的核苷酸序列中的512位的鸟嘌呤取代为腺嘌呤、844位的鸟嘌呤取代为腺嘌呤、1360位的鸟嘌呤取代为腺嘌呤、2458位的腺嘌呤取代为鸟嘌呤、2991位的腺嘌呤取代为鸟嘌呤。变异核苷酸序列可以具有上述的全部取代，也可以具有上述取代中的一部分的组合。
作为变异氨基酸序列，可以列举出具有下列取代的氨基酸序列：将SEQID NO：2的氨基酸序列中的161位的精氨酸取代为组氨酸、272位的缬氨酸取代为异亮氨酸、444位的缬氨酸取代为异亮氨酸、或者810位的精氨酸取代为甘氨酸。变异氨基酸序列可以具有上述的全部取代，也可以具有上述取代中的一部分的组合。
在本说明书中，“在严格条件下杂交”是指：在严格条件下与目标多核苷酸杂交。具体而言，可以列举出下述多核苷酸，当利用FASTA、BLAST、Smith-Waterman(Meth.Enzym.，164，765(1988))等同源性检索软件使用缺省(初始设定)参数进行计算时，所述多核苷酸与目标核苷酸序列具有至少70％以上、优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上，特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性。此外，“严格条件”可以按照下述方法进行：在本领域技术人员通常可以使用的杂交缓冲液中、在40℃～70℃、优选60℃～65℃等温度下进行反应，在15～300mmol/L，优选15～60mmol/L等盐浓度的洗涤溶液中进行洗涤。温度、盐浓度可以根据所使用的探针的长度适宜调整。而且，洗涤杂交物时的条件，可以在0.2或2×SSC、0.1％SDS、温度20℃～68℃的条件下进行。选择严格条件(高严紧度)还是选择温和条件(低严紧度)，可以用洗涤时的盐浓度或温度来设置差异。当用盐浓度来设置杂交的差异时，可以这样进行：使用0.2×SSC、0.1％SDS作为严格洗涤缓冲液(高严紧度洗涤缓冲液)，使用2×SSC、0.1％SDS作为温和洗涤缓冲液(低严紧度洗涤缓冲液)。此外，当用温度来设置杂交的差异时，严格条件时为68℃、中等程度(中等严紧度)时为42℃、温和条件时为室温(20℃～25℃)，可以均在0.2×SSC、0.1％SDS的条件下进行。
通常，在实施预杂交时，在与杂交相同的条件下进行；而杂交和预洗涤并不一定在相同条件下进行。
杂交可以采用公知方法进行。此外，当使用市售文库时，可以按附带的使用说明书所描述的方法进行。
在本说明书中，对氨基酸序列而言，“同一性”(有时也称同源性)是指：在被比较的序列之间，构成各个序列的氨基酸残基的一致程度。此时，需要考虑空位(gap)的存在和氨基酸的性质(Wilbur，Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730(1983))。在同源性的计算方面，可以使用商业软件BLAST(Altschul：J.Mol.Biol.215：403-10(1990))、FASTA(Peasron：Methods in Enzymology183：63-69(1990))等。
“同一性”的数值均可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值，例如，可以在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的同源性算法BLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BL-AST/中使用缺省(初始设定)参数来计算。
与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少70％以上同一性的核苷酸序列优选可以是具有80％以上、更优选90％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性的核苷酸序列。
与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少70％以上同一性的氨基酸序列优选可以是具有80％以上、更优选90％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、特别优选98％以上、最优选99％以上的同一性的氨基酸序列。
在本发明中，如果给定SEQ ID NO：2的氨基酸序列，则可以容易地确定编码它的核苷酸序列，可以对编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的各种核苷酸序列进行选择。因此，编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白的多核苷酸是指：SEQ ID NO：1所表示的cDNA序列的一部分或全部，以及具有编码同一氨基酸、且具有处于简并关系的密码子作为cDNA序列的序列。而且，还指包含内含子或非翻译区的基因组DNA。在发明中，还包括与之相应的RNA序列。
在本说明书中，是否“具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能”，可以通过对与187A5基因的表达相关联的生物现象或功能进行评价来确定，例如：对在中脑中、在多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞中是否选择性表达进行评价。
本发明提供包含下述多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的248位～397位或792位～877位的氨基酸序列中的至少5个氨基酸残基(优选至少6个氨基酸残基)或其全部构成。该蛋白相当于187A蛋白的氨基酸序列中的高识别性部分，所以，可以用作能够高准确度识别187A5蛋白的抗体的抗原。
187A5蛋白是I型1次跨膜蛋白，其表达在细胞表面，取向为N末端侧位于细胞外。因此，通过使用了与该蛋白具有结合性的抗体的流式细胞术，能够分离表达该蛋白的活细胞。
本发明提供包含下述多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的28位～927位、SEQ ID NO：4的氨基酸序列的16位～1267位、SEQ IDNO：6的氨基酸序列的1位～550位、SEQ ID NO：8的氨基酸序列的1位～542位、SEQ ID NO：10的氨基酸序列的1位～418位、SEQ ID NO：12的氨基酸序列的76位～964位、SEQ ID NO：15的氨基酸序列的40位～928位、SEQ IDNO：17的氨基酸序列的1位～540位、SEQ ID NO：19的氨基酸序列的40位～1106位、SEQ ID NO：22的氨基酸序列的24位～1524位、SEQ ID NO：24的氨基酸序列的43位～1018位、SEQ ID NO：26的氨基酸序列的43位～908位或SEQ ID NO：28的氨基酸序列的1位～866位的氨基酸序列的至少5个氨基酸残基(优选至少6个氨基酸残基)或其全部构成。该蛋白相当于187A蛋白的氨基酸序列的细胞外区域，所以，可以用作用于制备下述抗体的抗原，所述抗体能够在保持生活状态的情况下检测出作为检测对象的细胞。
本发明提供本发明的蛋白用作检测或选择多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的指标的用途。
[探针、引物和引物组]
用于多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的检测或选择的本发明的探针和引物，能够与187A5基因特异性杂交。根据实施例2，在处于多巴胺能神经元发生期的小鼠12.5日胚中，187A5的mRNA在Lrp4阳性多巴胺能神经元祖细胞所存在的中脑最腹侧的脑室区域(脑室区；VZ)和中脑最背侧的顶板区域选择性表达，但在Lrp4阳性的后脑底板细胞中不表达，因此可知：187A5的mRNA在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达。因而，187A5基因的表达作为多巴胺能神经元祖细胞的指标是有用的。因此，本发明的探针、引物和引物组可以用作多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的检测用标志物。
本发明的探针和引物只要能够检测187A5基因的表达即可，其是指由多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的碱基或碱基对构成的聚合体。已知双链cDNA也可以用于组织原位杂交，本发明的探针和引物也包含这样的双链cDNA。作为在组织中RNA的检测中特别优选的探针和引物，可以列举出RNA探针(核糖核苷酸探针)。
作为本发明的探针和引物，例如可以包含由187A5基因的核苷酸序列或其互补序列的连续至少10个、优选至少15个核苷酸构成的核苷酸序列。此外，作为本发明的探针和引物，例如可以包含由优选10～50个或10～30个、更优选15～50个或15～30个、更优选20～50个或20～30个、更优选25～50个或25～30个、最优选26～39个或26～35个核苷酸构成的核苷酸序列。
本发明的探针和引物的长度可以为至少10个碱基，优选为至少15个碱基，更优选为至少20个碱基、更优选为至少25个碱基。此外，本发明的探针和引物的长度可以优选为10～50个或10～30个碱基、更优选为15～50个或15～30个碱基、更优选为20～50个或20～30个碱基、更优选25～50个或25～30个碱基、最优选26～39个碱基或26～35个碱基。
根据本发明的探针和引物的优选实施方式，可以提供下述多核苷酸：所述多核苷酸包含由187A5基因的核苷酸序列或其互补序列的连续至少10个(更优选至少15个)核苷酸构成的核苷酸序列，能够与187A5基因杂交，能够用于中脑中多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的检测或选择，并且其长度为15～50个或15～30个碱基、优选25～50个或25～30个碱基、最优选26～39个碱基或26～35个碱基。
根据本发明的探针的优选实施方式还提供下述多核苷酸，所述多核苷酸能够与187A5基因的核苷酸序列中的高识别性部分杂交。通过使用这样的多核苷酸，能够更高准确度地检测祖细胞优选增殖祖细胞。作为这样的多核苷酸，可以列举出下述多核苷酸，所述多核苷酸与包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的774位～1221位或2403位～2666位的核苷酸序列的一部分或全部的核苷酸序列互补。
根据本发明的引物的优选实施方式还提供下述多核苷酸，所述多核苷酸能够通过核酸扩增方法扩增187A5基因的核苷酸序列中的高识别性部分，或者能够与187A5基因的核苷酸序列中的高识别性部分杂交。通过使用这样的多核苷酸，能够更高准确度地检测祖细胞优选增殖祖细胞。作为这样的多核苷酸，可以列举出下述多核苷酸，所述多核苷酸能够通过核酸扩增方法扩增包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的774位～1221位或2403位～2666位的核苷酸序列的一部分或全部的核苷酸序列。
本发明的探针可以在Northern印迹法、Southern印迹法、原位杂交等检测目的基因的公知方法中，按常规方法作为探针使用。
本发明的探针可以基于本说明书中公开的核苷酸序列来化学合成。探针的制备是公知的，可以按照例如《Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.》(Cold Spring Harbor Press(1989)、《Current Protocols in MolecularBiology》(John Wiley & Sons(1987-1997))实施。
本发明的引物可以以由2种以上的该引物构成的引物组的形式使用。
本发明的引物和引物组，可以在利用PCR法、RT-PCR法、实时PCR法、原位PCR等核酸扩增方法检测目的基因的公知方法中，按照常规方法作为引物和引物组使用。
可以对本发明的引物组进行选择，使得其能够通过PCR法等核酸扩增方法扩增出187A5基因的核苷酸序列。核酸扩增方法是公知的，核酸扩增方法中引物组的选择是本领域技术人员所清楚的。例如在PCR法中，可以对引物进行选择，使得：两个引物(引物对)中的一个与187A5基因双链DNA的正链配对，另一个引物与双链DNA的负链配对，并且一个引物与由另一个引物延伸而成的延伸链配对。此外，在LAMP法(WO00/28082号公报)中，对于靶基因，从3’末端侧起规定了F3c、F2c、F1c这3个区域，从5’末端侧起规定了B1、B2、B3这3个区域，利用这6个区域可以设计4种引物。
本发明的引物可以基于本说明书中公开的核苷酸序列来化学合成。引物的制备是公知的，可以按照例如《Molecular Cloning，A Laboratory Manual2nd ed.》(Cold Spring Harbor Press(1989)、《Current Protocols in MolecularBiology》(John Wiley & Sons(1987-1997))实施。
[抗体]
本发明的抗体能够特异性地识别187A5蛋白。根据实施例5，确认了187A5蛋白存在于多巴胺能神经元祖细胞。因而，187A5蛋白的存在可以用作为包括多巴胺能神经元增殖祖细胞在内的多巴胺能神经元祖细胞的指标。因此，本发明的抗体可以用作多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元祖细胞检测用标志物。
187A5蛋白表达以N末端侧处于细胞外的取向在细胞表面表达(实施例4)，所以，本发明的抗体从能够以活细胞的状态检测或选择多巴胺能神经元祖细胞这方面来看是有利的(实施例6)。此外，本发明的抗体从能够对ES细胞来源的细胞进行检测或选择这方面来看是有利的(实施例7)。
用于获得本发明的抗体的187A5蛋白只要具有187A5的抗原性即可，可以列举出上述蛋白。此外，还包括具有在187A5蛋白的氨基酸序列中发生1或多个氨基酸残基的缺失、插入、取代或增加而得的氨基酸序列的蛋白。公知这样的蛋白可以维持与原蛋白相同的生物学活性(Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662-6；Zoller和Smith(1982)Nucleic Acids Res.10：6487-500；Wang等(1984)Science 224：1431-3；Dalbadie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6409-13)。在维持原蛋白的抗原性状态下、在某种蛋白中进行1或多个氨基酸残基的缺失、插入、取代或增加的方法是公知的。例如，可以这样获得：采用定点突变诱导方法制备编码突变蛋白的多核苷酸并使其适宜地表达(Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nded.Cold Spring Harbor Press(1989)；Current Protocols in Molecular BiologyJohn Wiley & Sons(1987-1997)，Section 8.1-8.5；Hashimoto-Goto等(1995)Gene152：271-5；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92；Kramer和Fritz(1987)Method.Enzymol.154：350-67；Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6)。
本发明的抗体还包括对187A5蛋白的一部分特异的抗体。即，除了具有187A5蛋白的全长氨基酸序列的多肽之外，用于获得本发明的抗体的187A5蛋白还包括具有与187A5蛋白的至少6个以上氨基酸残基(例如8、10、12或15个以上氨基酸残基)同一的序列的多肽片段。本说明书中的187A5蛋白多肽片段只要具有187A5蛋白或其抗原性即可，可以是任何片段。
作为优选的片段，可以列举出187A5蛋白的氨基末端等多肽片段。多肽的抗原决定部位，可采用分析蛋白质氨基酸序列的疏水性/亲水性的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Bio.157：105-22)、二级结构分析方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47：251-76)进行推定，并进一步通过计算机程序(Anal.Biochem.151：540-6(1985))或采用合成短肽并检验其抗原性的PEPSCAN法(特表昭60-500684号公报)等进行确认。
作为与187A5蛋白具有结合性的抗体的例子，可以列举出：
与由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQID NO：10的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体；
与由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体；
与由SEQ ID NO：22的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体；
与由SEQ ID NO：24的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体；
与由SEQ ID NO：26的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体；和
与由SEQ ID NO：28的氨基酸序列或其一部分构成的蛋白具有结合性的抗体。
本发明的抗体的优选实施方式提供识别187A5蛋白中的高识别性多肽部分的抗体。通过使用这样的抗体，可以高准确度地检测祖细胞优选增殖祖细胞。作为这样的抗体，可以列举出与包含下述多肽的蛋白具有结合性的抗体，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的248位～397位或792位～877位氨基酸序列的至少5个氨基酸残基(优选至少6个氨基酸残基)或其全部构成。
此外，本发明的抗体的优选实施方式提供：识别187A5蛋白的表达在细胞外的多肽部分的抗体。通过使用这样的抗体，可以在生活状态下检测祖细胞优选增殖祖细胞。作为这样的抗体，可以列举出与187A5蛋白的表达在细胞外的多肽部分具有结合性的抗体，例如可以列举出与包含下述多肽的蛋白具有结合性的抗体，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的28位～927位、SEQ ID NO：4的氨基酸序列的16位～1267位、SEQ ID NO：6的氨基酸序列的1位～550位、SEQ ID NO：8的氨基酸序列的1位～542位、SEQID NO：10的氨基酸序列的1位～418位、SEQ ID NO：12的氨基酸序列的76位～964位、SEQ ID NO：15的氨基酸序列的40位～928位、SEQ ID NO：17的氨基酸序列的1位～540位、SEQ ID NO：19的氨基酸序列的40位～1106位、SEQ ID NO：22的氨基酸序列的24位～1524位、SEQ ID NO：24的氨基酸序列的43位～1018位、SEQ ID NO：26的氨基酸序列的43位～908位或SEQ IDNO：28的氨基酸序列的1位～866位的氨基酸序列的至少5个氨基酸残基(优选至少6个氨基酸残基)或其全部构成。
本发明的抗体可以采用本领域技术人员公知的方法获得(例如《CurrentProtocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons(1987)；Antibodies：ALaboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFV)、人源化抗体、多特异性抗体以及Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fv等抗体片段(fragment)。
如果是多克隆抗体，则可以采集用抗原致敏的哺乳动物的血液，通过公知方法从该血液中分离血清，作为含有多克隆抗体的血清。
视需要，还可以从该血清中进一步分离含多克隆抗体的级分。
如果是单克隆抗体，则可以采集从用抗原致敏的哺乳动物的脾脏或淋巴结获得的抗体生成细胞，使其与骨髓瘤细胞等细胞融合，克隆化所得的杂交瘤(融合细胞)，从其培养物中回收抗体，作为单克隆抗体。
作为免疫抗原，可以使用187A5蛋白的片段。或者，可以使用基于上述氨基酸序列合成的抗原。抗原也可以以与载体蛋白所成的复合物的形式使用。在抗原与载体蛋白的复合物的制备中，可以使用各种缩合剂，例如可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等。载体蛋白可以是牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白等常用的载体蛋白，通常采用以1～5倍量的比例偶联的方法。
作为免疫动物，可以列举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、犬、猪、羊、马或牛等，优选小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等。接种方法可以列举出皮下、肌肉或腹腔内施用。施用时，可以与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合后施用，施用可以通常每2～5周进行1次。
可以使从免疫后动物的脾脏或淋巴结获得的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞发生细胞融合，并以杂交瘤的形式将其分离出来。作为骨髓瘤细胞，可以使用小鼠、大鼠、人等来源的骨髓瘤细胞，优选与抗体生成细胞同种来源的骨髓瘤细胞，但有些情况下也可以在异种间进行。
杂交瘤(细胞融合)操作可以按已知方法(例如Nature，256，495，1975)实施。作为促融合剂，可以列举出聚乙二醇、仙台病毒等，通常通过如下方法实施细胞融合：使用20～50％左右浓度的聚乙二醇(平均分子量1000～4000)，在20℃～40℃、优选30℃～37℃的温度下，在抗体生成细胞数与骨髓瘤细胞数之比通常为1:1～10:1左右的条件下，反应约1～10分钟左右。
对于抗体生成杂交瘤的筛选，可以使用各种免疫化学方法。可以列举出例如：使用包被了187A5蛋白的微孔板的ELISA法，使用包被了抗免疫球蛋白抗体的微孔板的EIA法，在对含187A5蛋白的样品进行电泳后又使用硝酸纤维素转印膜的免疫印迹法，等等。
从这样的孔出发，进一步采用例如有限稀释法进行克隆化，可以获得克隆。杂交瘤的选择和培养通常使用添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)且含有10～20％胎牛血清的动物细胞用培养基(例如RPMI1640)进行。将这样获得的克隆植入到预先施用了降植烷(プリスタン)的SCID小鼠的腹腔内，10～14日后采集含高浓度单克隆抗体的腹水，可以作为抗体纯化的原料。此外，也可以培养该克隆，将其培养物作为抗体纯化的原料。
单克隆抗体的纯化可以采用作为免疫球蛋白纯化方法为人所知的方法。例如，采用硫酸铵分级法、PEG分级法、乙醇分级法、阴离子交换剂的利用、以及使用187A5蛋白的亲和层析等方法可以容易地实现。
从血清中纯化多克隆抗体也可以采用相似的方法进行。
[检测方法]
187A5 基因的表达充当如上所述的多巴胺能神经元祖细胞且优选多巴胺能神经元增殖祖细胞存在的指标。因此，根据本发明，可通过检测187A5基因的表达来检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本说明书中使用的“检测187A5基因的表达”的方法不特别限定，只要其能够检测待检验细胞样品中187A5基因的表达，并且可以例如通过以下步骤进行：
(a)使待检验细胞样品与本发明的探针、引物或引物组接触；和
(b)检测反应性的有无。
本说明书中使用的“检测反应性的有无”的方法包括例如杂交方法和核酸扩增方法。
本说明书中使用的“待检验细胞样品”可以是被认为含有多巴胺能神经元祖细胞且优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞样品，可优选使用中脑腹侧区中的细胞。可通过已知方法获得中脑腹侧区中的细胞(Studer，L，等人Nature Neurosci(1998)1：290-295)。例如，可使用胚胎(优选人类流产胚胎)或患者的中脑腹侧区的自身细胞作为待检验细胞样品。此外，可以使用含有体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞且优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的培养细胞。可以使用已知方法，例如SDIA方法(Kawasaki等人Neuron(2000)28(1)：31-40)或5阶段法(Lee，SH.等人，Nature Biotech(2000)18：675-579)，使用已知的ES细胞(Kawasaki等人，Neuron(2000)28(1)：31-40和Lee，SH等人，Nature Biotech(2000)18：675-579)、骨髓间质细胞、神经源性永生化细胞系(特表平8-509215、特表平11-506930和特表2002-522070)或神经元胚性细胞(特表平11-509729)等细胞作为起始材料，通过分化处理来进行体外诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞或多巴胺能神经元增殖祖细胞。优选地，可使用经SDIA方法分化处理的ES细胞作为待检验细胞样品。
本说明书中使用的“SDIA方法”可通过将ES细胞与基质细胞系PA6在无血清培养基中共培养而进行(Kawasaki等人.Neuron(2000)28(1)：31-40)。此外，所述“5阶段法”可以如下进行。在非黏附性培养板上有血清存在下培养ES细胞，从而形成拟胚体(EB)。接着使EB附着于黏附性培养板上，从而选择神经祖细胞。最后，向其中加入生长因子，例如Shh、FGF2或FGF8，从而诱导多巴胺能神经元祖细胞(Lee，SH.，等人.Nature Biotech(2000)18：675-579))。
根据本发明的检测方法的第一个实施方案，利用本发明的探针，使所述检测用多核苷酸与核酸样品(mRNA或其转录物)杂交，检测杂交复合物，即核苷酸双链。由此可以检测细胞样品中187A5基因的表达。
关于杂交方法的详细过程，可以参考《Molecular Cloning，A LaboratoryManual2nd ed.》(Cold Spring Harbor Press(1989)，尤其是第9.47-9.58节)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons(1987-1997)，尤其是第6.3-6.4节)，以及《DNA Cloning1：Core Techniques A PracticalApproach2nd ed.》(Oxford University(1995)，关于条件可具体参考第2.10节)。
使用杂交方法的187A5基因表达的检测可以例如通过以下步骤进行：
(a-1)使源自待检验细胞样品的多核苷酸与本发明的探针接触；和
(b-1)检测杂交复合物。
在步骤(a-1)中，可以使从被认为包含多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的细胞样品制备的mRNA或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)作为源自待检验细胞样品的多核苷酸与探针接触。
在使用探针的检测方法中，所述探针可以被标记。所述标记包括使用放射性(例如32P、14C和35S)、荧光(例如FITC和铕)、酶(例如过氧化物酶或碱性磷酸酶)反应如化学着色等的标记。
可以利用众所周知的方法进行杂交产物的检测，所述方法例如northern杂交、southern杂交或菌落杂交。
检测到杂交复合物的细胞是表达187A5基因的细胞，因此可以确定该细胞为多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
根据本发明的检测方法的第二个实施方案，利用针对本发明的引物或引物组，通过核酸扩增方法扩增核酸样品(mRNA或其转录物)，检测扩增产物。由此，可以检测细胞样品中187A5基因的表达。
使用核酸扩增方法的187A5基因表达的检测可以例如通过以下步骤进行：
(a-2)利用源自待检验细胞样品的多核苷酸作为模板，利用本发明的引物或引物组实施核酸扩增方法；和
(b-2)检测形成的扩增产物。
在步骤(a-2)中，可以使用从被认为包含多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的样品制备的mRNA或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)作为模板。
可以利用核酸扩增方法(例如PCR法、RT-PCR法、实时PCR法或LAMP法)进行扩增产物的检测。
检测到扩增产物的细胞是表达187A5基因的细胞，因此可以确定该细胞为多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
187A5蛋白是如上所述的多巴胺能神经元祖细胞且优选多巴胺能神经元增殖祖细胞存在的指标。因此，根据本发明，可通过检测187A5蛋白来检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本说明书中使用的“检测187A5蛋白”的方法不特别限定，只要其能够检测待检验细胞样品中的187A5蛋白，例如包括抗原-抗体反应方法。
根据针对本发明的检测方法的第三个实施方案，使本发明的抗体与细胞样品接触，检测抗原-抗体反应。由此可以检测细胞样品中的187A5蛋白。
使用抗原-抗体反应的187A5蛋白的检测可以例如通过以下步骤进行：
(c)使源自待检验细胞样品的蛋白质与本发明的抗体接触；和
(d)检测反应性的有无。
本发明书中使用的“检测反应性存在与否”的方法例如包括抗原-抗体反应方法。
本说明书中使用的“待检验细胞样品”可以是被认为包含多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的待检验细胞样品，优选中脑腹侧区中的细胞或含有体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞(优选多巴胺能神经元增殖祖细胞)的培养细胞。例如，源自胚胎中脑的细胞样品可用作待检验细胞样品。用于获得待检验细胞样品的方法如上所述。
[0133]使用抗原-抗体反应方法的187A5蛋白的检测可以例如通过以下步骤进行：
(c-1)使源自待检验细胞样品的蛋白质与针对本发明的抗体接触；和
(d-1)检测抗原-抗体复合物。
用于检测抗原-抗体反应的方法是本领域技术人员众所周知的，例如可以用免疫学方法检测被认为包含多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的待检验细胞样品中的187A5蛋白。作为所述免疫学方法，可以将先前已知的方法(例如免疫组织染色法、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹法、凝集法、竞争法或夹心法)应用于根据需要经适当处理(例如细胞分离或提取操作)的细胞样品。免疫组织染色法可以例如通过以下方法进行：使用标记抗体的直接法和使用能与抗体结合的标记抗体的间接法。关于标记试剂，可以使用已知的标记物质，例如荧光物质、放射性物质、酶、金属或色素。
源自待检验细胞样品的蛋白质优选为包括胞外区(即N-末端区)的多肽。
检测到抗原-抗体复合物的细胞是表达187A5蛋白的细胞，因此可以确定其为多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
对于用在帕金森病的治疗中，多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的纯度宜较高。
通过不仅一次，而是重复地实施各个上述检测步骤，可以增强检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，可以通过实施上述步骤两次或更多次，以更高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，通过与其他标志物基因，优选除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因一起使用，可以进一步增强多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞检测或选择的准确度。
因此，根据针对本发明的检测方法，可以通过与多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因(除187A5基因之外)或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或其蛋白质、或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，并不仅检测187A5基因或其蛋白质的表达，而且检测上述其他标志物基因或其蛋白质的表达，从而以更高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞且优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在各个分化阶段中选择性表达的多巴胺能神经元相关的标志物基因示于图1。
在以检测187A5基因的表达为特征的检测方法中，可以通过与多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因(除了187A5基因)或其蛋白质一起使用，并不仅检测187A5基因，而且检测多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因(除了187A5基因)或其蛋白质的表达，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(a)中，可以通过使用检测到多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因(除了187A5基因)或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(b)中，检测到反应性的细胞(例如，检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)是既表达187A5基因，又表达除了187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为经检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(b)中检测到反应性的细胞(例如，检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-1)——即检测除了187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质的表达——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，步骤(e-1)中，检测到除了187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质的表达的细胞，是既表达187A5基因、又表达除了187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为以检测或选择到的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5基因的表达为特征的检测方法中，通过与有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，可以确定这样的事实，即187A5基因被表达，但未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质。从而，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(a)中，可以通过使用未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(b)中，检测到反应性的细胞(例如检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)，是表达187A5基因，但不表达有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(b)中检测到反应性的细胞(例如检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-2)——即检测有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(e-2)中未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是表达187A5基因、但不表达有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因并且也没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，且优选检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5基因的表达为特征的检测方法中，通过与除了187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，并不仅检测187A5基因，而且检测多巴胺能神经元祖细胞标志物基因(除了187A5基因)的表达或其蛋白质，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(a)中，可以通过使用检测到除了187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(b)中，检测到反应性的细胞(例如，检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)是既表达187A5基因，又表达除了187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，在步骤(b)中，对于检测到反应性的细胞(例如检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-3)——即检测除了187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(e-3)中，检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是那些既表达187A5基因的细胞，又表达除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，且优选检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5基因的表达为特征的检测方法中，通过与成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，可以确定这样的事实，即187A5基因被表达，但未检测到成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质的表达。从而，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(a)中，可以通过使用未检测到成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(b)中，检测到反应性的细胞(例如检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)是表达187A5基因，但不表达成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(b)中检测到反应性的细胞(例如检测到杂交复合物或扩增产物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-4)——即检测成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质的表达——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，步骤(e-4)中，未检测到成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是那些表达187A5基因，但不表达成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5蛋白为特征的检测方法中，通过与除了187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，并不仅检测187A5蛋白，而且检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质的表达，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(c)中，可以通过使用检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(d)中，检测到反应性的细胞(例如检测到抗原-抗体复合物的细胞)，是既有187A5蛋白存在，又表达除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(d)中检测到反应性的细胞(例如检测到抗原-抗体复合物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-1)——即检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，步骤(e-1)中，检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是有187A5蛋白存在，并且表达除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或者有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞
在以检测187A5蛋白为特征的检测方法中，通过与有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，可以确定这样的事实，即187A5蛋白被表达，但未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质。从而，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(c)中，可以通过使用未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(d)中，检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)是那些有187A5蛋白存在，但不表达有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(d)中检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-2)——即检测有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(e-2)中，未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是有187A5蛋白存在，但不表达有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5蛋白为特征的检测方法中，还可以通过与除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，并不仅检测187A5蛋白，而且检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(c)中，可以通过使用检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(d)中，检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)，是那些有187A5蛋白存在，并且表达除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
此外，关于步骤(d)中检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-3)——即检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(e-3)中，检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞，是那些有187A5蛋白存在，且表达除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在以检测187A5蛋白为特征的检测方法中，还可以通过与成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质一起使用，确定如下事实，即187A5蛋白被表达，但未检测到成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。从而，可以以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地，在步骤(c)中，可以通过使用未检测到成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞作为待检验细胞样品，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，在步骤(d)中，检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)是有187A5蛋白存在，但不表达成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞
此外，关于步骤(d)中检测到反应性的细胞(例如，检测到抗原-抗体复合物的细胞)，可以通过实施进一步包括步骤(e-4)——即检测成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质——的方法，从而以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。在此情况下，步骤(e-4)中，未检测到成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质的细胞是那些有187A5蛋白存在，但不表达成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因且没有其蛋白质存在的细胞。从而，可以以较高的准确度确定所述细胞为所检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质”是指“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因”或“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质”。
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因”包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)中表达的除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因，例如Lrp4基因、Nato3基因、Msx1基因、Msx2基因和Mash1基因。
Lrp4基因记载于WO 2004/065599。Nato3基因记载于WO 2007/021003。Msx1基因和Msx2基因记载于WO 2007/021004。Mash1基因记载于Kele J，Simplicio N，Ferri AL，Mira H，Guillemot F，Arenas E，Ang SL.Neurogenin 2 isrequired for the development of ventral mesencephalon dopaminergic neurons.Development.2006 Feb；133(3)：495-505.
除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因的表达的方法，例如包括如上所述的杂交方法和核酸扩增方法。
“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质”包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)中表达的除了187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质，优选包括仅在多巴胺能神经元增殖祖细胞中被检测到的蛋白质。
所述蛋白质包括Lrp4基因、Nato3基因、Msx1基因、Msx2基因和Mash1基因的蛋白质。
除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知蛋白质的表达的方法，例如包括如上所述的抗原-抗体反应方法。
“有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质”包括在中脑最腹侧套层(ML区)中表达的基因或其蛋白质，包括Nurr1基因、En1基因、En2基因、Ptx3基因和TH基因。此外，所述标志物基因包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)中表达的基因或其蛋白质，包括65B13基因。
Nurr1基因记载于Science.199711；276(5310)：248-50。En1基因记载于J.Neurosci.2001 21(9)：3126-34。En2基因记载于J.Neurosci.2001 21(9)3126-34。Ptx3基因记载于Proc.Natl.Acad.Sci.1997 94：13305-10。TH基因记载于Science 1997 11；276(5310)：248-50。65B13基因描述于WO2004/038018。
有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因或其蛋白质的表达的方法，例如包括如上所述的杂交方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法。
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因或其蛋白质”是指“除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因”或“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元祖细胞标记物蛋白质”。
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因”包括在中脑最腹侧区中表达的除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因，包括Lmxla基因。
Lmxla基因描述于WO 2005/052190。
除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因的表达的方法，例如包括如上所述的杂交方法和核酸扩增方法。
“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元祖细胞标记物蛋白质”包括在中脑最腹侧表达的除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元祖细胞标记物蛋白质。所述蛋白质包括例如Lmxla基因的蛋白质。
除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元祖细胞标记物蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知蛋白质的表达的方法，例如包括如上所述的抗原-抗体反应方法。
“成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因”包括例如DAT基因。
DAT基因记载于Development 2003 131：1145-55。
成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因或其蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因或其蛋白质的表达的方法，例如包括如上所述的杂交方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法。
此外，通过与包含187A5基因的启动子可操作连接于标志物基因的基因构建体的载体一起使用，可以进一步提高多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的检测或选择的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，通过与187A5基因的启动子可操作连接于标志物基因的基因构建体一起使用，同时不仅检测187A5基因或其蛋白质的表达，而且检测标志物基因的表达，可以以更高的准确度检测或选择多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
使用包含187A5基因的启动子可操作连接于标志物基因的基因构建体的载体进行的多巴胺能神经元祖细胞的检测，可以根据例如特开2002-51775来实施。
将能够在多巴胺能神经元祖细胞中表达的187A5基因的启动子/增强子控制下被检测到的标志物基因引入细胞群体中的各细胞，检测所述标志物基因的表达，从而可以检测多巴胺能神经元祖细胞。
具体地，通过实施下述步骤可以检测或选择多巴胺能神经元祖细胞：用包括本发明的基因的启动子和标志物基因可操作连接的基因构建体的载体转化待检验细胞样品，检测待检验细胞样品中标志物基因的表达。在此情况下，该步骤中，可以以较高的准确度确定检测到标志物基因的表达的细胞为检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本说明书中使用的“本发明的基因的启动子”的核苷酸序列包括通过下文描述的187A5基因的表达区分析获得的启动子区的核苷酸序列，还包括其具有大致等同的启动子活性的修饰序列。
本说明书中使用的“标志物基因”可以是能够在187A5基因的启动子/增强子控制下被检测到的标志物基因，包括GFP。
本说明书中使用的“基因构建体”可以具有如下结构：其中在187A5基因的表达控制序列(包括启动子、增强子等)的控制下，187A5基因连接在标志物基因的上游或下游。另外，可以将编码标志物的基因敲入(knockin)187A5基因座位。作为所述基因构建体的优选实施方案，可例举具有示意地描述于图152-4的结构的构建体。
[检测试剂盒]
本发明提供用于实施针对本发明的检测方法的检测试剂盒。
本发明的检测试剂盒的第一个实施方案包括用于实施针对本发明的检测方法的第一个实施方案的检测试剂盒，具体地，包括一种用于检测187A5基因表达的试剂盒，其至少含有本发明的探针。该探针可以被标记。该检测试剂盒通过杂交体形成方法检测187A5基因的表达。因此，第一个实施方案的检测试剂盒可根据需要进一步包括各种用于实施杂交体形成方法的试剂，例如，用在标记检测中的底物复合物、杂交缓冲液，说明书和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂盒包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的试剂盒，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。这些探针、引物、引物组或抗体可以被标记。所述检测试剂盒通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中的任何一种方法，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
本发明的检测试剂盒的第二个实施方案包括用于实施本发明的检测方法的第二个实施方案的检测试剂盒，具体地，包括一种用于检测187A5基因表达的试剂盒，其至少含有本发明的引物或本发明的引物组。该检测试剂盒通过核酸扩增方法检测187A5基因的表达。因此，第二个实施方案的检测试剂盒可根据需要进一步包括各种用于实施核酸扩增方法的试剂，例如，缓冲液、表明扩增反应能正常进行的内标，说明书，和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂盒包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的试剂盒，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。探针、引物、引物组或抗体可以被标记。检测试剂盒通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中任何一种方法，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
本发明的检测试剂盒的第三个实施方案包括一种用于实施本发明的检测方法的第三个实施方案的检测试剂盒。具体地，包括一种用于检测187A5蛋白的试剂盒，其至少含有本发明的抗体。该抗体可以被标记。该检测试剂盒通过检测抗原-抗体反应检测187A5蛋白的表达。因此，第三个实施方案的检测试剂盒可根据需要进一步包括各种用于实施抗原-抗体反应的试剂，例如，用在ELISA方法等中的二抗、显色试剂、缓冲液，说明书，和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂盒包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的试剂盒，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。所述探针、引物、引物组或抗体可以被标记。所述检测试剂盒通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中任何一种，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
此外，作为用于以较高准确度实施检测的检测试剂盒，可包括根据本发明的第一至第三个实施方案的检测试剂盒，其进一步包括载体，所述载体包含187A5基因的启动子与标志物基因可操作连接的基因构建体。
[检测试剂]
本发明提供用于实施针对本发明的检测方法的检测试剂。
本发明的检测试剂的第一个实施方案包括用于实施本发明的检测方法的第一个实施方案的检测试剂，具体地，包括一种用于检测187A5基因表达的检测试剂，其至少含有本发明的探针。该探针可以被标记。该检测试剂通过杂交体形成方法检测187A5基因的表达。因此，第一个实施方案的检测试剂可根据需要进一步包括各种用于实施杂交体形成方法的试剂，例如，用在标记检测中的底物复合物、杂交缓冲液，说明书，和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的检测试剂，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。探针、引物、引物组或抗体可以被标记。检测试剂通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中任何一种，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
本发明的检测试剂的第二个实施方案包括用于实施针对本发明的检测方法的第二个实施方案的检测试剂，具体地，包括一种用于检测187A5基因表达的试剂，其至少含有本发明的引物或本发明的引物组。该检测试剂通过核酸扩增方法检测187A5基因的表达。因此，第二个实施方案的检测试剂可根据需要进一步包括各种用于实施核酸扩增方法的试剂，例如，缓冲液、表明扩增反应可正常进行的内标，说明书，和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的检测试剂，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。这些探针、引物、引物组或抗体可以被标记。所述检测试剂通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中任何一种，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
本发明的检测试剂的第三个实施方案包括用于实施本发明的检测方法的第三个实施方案的检测试剂，具体地，包括用于检测187A5蛋白的检测试剂，其至少含有本发明的抗体。该抗体可以被标记。该检测试剂通过检测抗原-抗体反应检测187A5蛋白的表达。因此，第三个实施方案的检测试剂可根据需要进一步包括各种用于实施抗原-抗体反应的试剂，例如，用于ELISA方法等中的二抗、显色试剂、缓冲液，说明书，和/或器材等等。
此外，用于以较高准确度实施检测的检测试剂包括进一步含有探针、引物、引物组或抗体的检测试剂，所述探针、引物、引物组或抗体可检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。所述探针、引物、引物组或抗体可以被标记。所述检测试剂通过杂交体形成方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法中的任何一种方法，进一步检测除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或其蛋白质、除187A5基因之外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质，或者成熟的多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
此外，作为用于以较高准确度实施检测的检测试剂，可以例举包括根据本发明的第一至第三个实施方案的检测试剂，其进一步包括载体，所述载体包含187A5基因的启动子与标志物基因可操作连接的基因构建体。
[筛选方法]
可应用根据本发明的检测方法来筛选对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的物质。具体地，通过利用187A5基因的表达或其蛋白质作为指标，确定通过候补物质的加入是否诱导分化为多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞，从而可筛选对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的成分。
因此，本发明提供一种用于筛选对诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的物质的方法，包括以下步骤：
(i)使可分化成多巴胺能神经元祖细胞的细胞与待检验物质接触；和
(ii)检测已与待检验物质接触的细胞中187A5基因的表达或其蛋白质。
步骤(i)中可分化成多巴胺能神经元祖细胞的细胞优选为可分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞，优选可从胚胎中脑收集或从含有由ES细胞诱导分化的神经元祖细胞的培养细胞收集。
步骤(i)中“与待检验物质接触”可以例如通过将待检验物质加至培养细胞来进行，所述培养细胞包含可分化成多巴胺能神经元祖细胞的细胞，优选可分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞。
所述“待检验物质”包括例如合成的低分子化合物、蛋白质、合成肽、纯化或部分纯化的多肽、抗体、细菌释放物质(包含细菌代谢物)和核酸(例如反义、核酶和RNAi)，优选为化合物或其盐，或其溶剂合物(例如水合物)，但并不限于此。所述“待检验物质”可以是新物质或已知物质。
在步骤(ii)中，可以根据本发明的检测方法，来检测187A5基因的表达或其蛋白质。
具体地说，分别对于使用杂交方法的检测通过实施步骤(a-1)和(b-1)，对于使用核酸扩增的检测方法通过实施步骤(a-2)和(b-2)，对于使用抗原-抗体反应的检测方法通过实施步骤(c-1)和(d-1)，可以检测187A5基因的表达或其蛋白质。
在步骤(ii)中，当通过接触待检验物质而检测待检验细胞样品中187A5基因的表达或其蛋白质时，可以确定该物质为对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞有效的物质。
通过根据本发明的筛选方法鉴定的物质可以用作对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞有效的物质。
本发明提供用于筛选对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的物质的方法，其进一步包括以下步骤：
(iii-1)检测在与待检验物质接触后的上述细胞中除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质。
当步骤(ii)中检测到187A5基因的表达或其蛋白质，且步骤(iii-1)中检测到除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或其蛋白质时，可以确定该物质为以较高准确度诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞的有效成分。
步骤(iii-1)可在步骤(i)之后实施，可在步骤(ii)之前或之后实施。
本发明提供用于筛选对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的成分的方法，其进一步包括以下步骤：
(iii-2)检测与待检验物质接触后的所述细胞中有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质的表达。
当在步骤(ii)中检测到187A5基因或其蛋白质的表达，但在步骤(iii-2)中未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质时，可以以较高的准确度确定该物质为对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞有效的成分。
步骤(iii-2)可在步骤(i)之后实施，可在步骤(ii)之前或之后实施。
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因或其蛋白质”是指“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因”或“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质”。
“除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因”包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)中表达的除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因，包括Lrp4基因、Nato3基因、Msx1基因、Msx2基因和Mash1基因。
除187A5基因之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因的表达的方法，例如上述的杂交方法和核酸扩增方法。
“除187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质”包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)中表达的除了187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质，优选仅在多巴胺能神经元增殖祖细胞中被检测到的蛋白质。
所述蛋白质包括Lrp4基因、Nato3基因、Msx1基因、Msx2基因和Mash1基因的蛋白质。
除了187A5蛋白之外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记物蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知蛋白质的表达的方法，例如包括抗原-抗体反应方法。
“有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质”包括在中脑最腹侧套层(ML区)中表达的基因或其蛋白质，包括例如Nurr1基因、En1基因、En2基因、Ptx3基因和TH基因。此外，所述标志物基因或其蛋白质包括在中脑最腹侧脑室带区(VZ区)中表达的基因或其蛋白质，包括65B13基因。
有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因或其蛋白质的检测不特别限定，只要使用可检测已知基因或其蛋白质的表达的方法，例如包括上述的杂交方法、核酸扩增方法和抗原-抗体反应方法。
本发明提供用于筛选诱导对于分化成多巴胺能神经元祖细胞有效的成分的方法，其进一步包括以下步骤：
(iii-3)用载体转化已与待检验物质接触的细胞，并检测细胞中标志物基因的表达，其中所述载体包含基因构建体，所述构建体中187A5基因的启动子与标志物基因基因可操作连接。
当在步骤(ii)中检测到187A5基因的表达或其蛋白质，且在步骤(iii-3)中检测到标志物基因的表达时，可以以较高准确度确定该物质为对于诱导分化成多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞有效的成分。
步骤(iii-3)可在步骤(i)之后实施，可在步骤(ii)之前或之后实施。此外，步骤(iii-3)可在步骤(iii-1)或步骤(iii-2)之后实施。
[生产方法]
根据本发明的检测方法可以检测或选择多巴胺能神经元祖细胞。多巴胺能神经元祖细胞可用在帕金森病的治疗中。因此，可以从利用187A5基因的表达或其蛋白质作为指标而检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞来生产用于帕金森病治疗的多巴胺能神经元祖细胞。
这里，多巴胺能神经元祖细胞优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本发明提供一种用于生产多巴胺能神经元祖细胞的方法，包括以下步骤：
(i)获得可能包含多巴胺能神经元祖细胞的细胞；
(ii)利用本发明的检测方法检测或选择多巴胺能神经元祖细胞；和
(iii)培养步骤(ii)中获得的细胞。
本发明提供一种用于帕金森病的治疗试剂，其包括用根据本发明的检测方法检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本发明提供用根据本发明的检测方法检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞在制备用于帕金森病治疗的药物中的用途。
本发明提供一种用于治疗帕金森病的方法，其包括将用根据本发明的检测方法检测或选择的多巴胺能神经元祖细胞，优选多巴胺能神经元增殖祖细胞移植到哺乳动物(包括人类)的脑中。
在本说明书中，“检测”还包括“鉴别(discrimination)”。此外，“检测”不仅包括细胞作为对象被鉴别为特定种类细胞的情况，还包括细胞作为对象被鉴别为非特定种类细胞的情况。
实施例
[实施例1]多巴胺能神经元祖细胞选择性基因的分离和序列分析
已经鉴定Lrp4基因为用于分离多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞表面标志物(WO 2004/065599)，由此，利用抗-Lrp4抗体分离源自ES细胞的多巴胺能神经元增殖祖细胞成为可能。因而，下文将描述多巴胺能神经元增殖祖细胞选择性基因的分离和序列分析。
(1)Lrp4阳性细胞的分离
首先，利用accumax(MS Techno Systems)分散大鼠13.5日胚胎的中脑和后脑腹侧区，然后不经固定和透化处理，使用抗-Lrp4单克隆抗体〔获自杂交瘤(保藏号FERM BP-10315和FERM BP-10316)，稀释至1/10，1％胎牛血清(JRH)，5％胎大鼠血清(JRH)，1mM EDTA(Invitrogen)/PBS(Sigma)〕于4℃将细胞染色30min。然后，使用FACS缓冲液〔PBS+1％胎牛血清(JRH)+1mM EDTA〕，于4℃洗涤3次，每次3min，使用PE标记的抗-仓鼠IgG抗体(Becton Dickinson，8μg/ml、1％胎牛血清、5％胎大鼠血清、1mMEDTA/PBS)于4℃将细胞染色20min。然后，以同样的方式进行洗涤。染色后，用细胞分选仪(FACS vantage SE，Becton Dickinson)分离Lrp4-阳性细胞(图2)。分离后立即用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)从该细胞制备总RNA，用cNNA合成试剂盒(TAKARA)合成双链cDNA。接着，用限制性核酸内切酶Rsa I(TAKARA)消化合成的cDNA，然后向其中加入ad2。用ad2S作为引物通过PCR扩增所述cDNA。
扩增在下述条件下进行：于72℃保温5min，然后进行如下反应20个循环：94℃30s，65℃30s，72℃2min，最后于72℃保温2min。
ad2S：CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT(SEQ ID NO：29)
ad2A：ACGGAATGATGT(SEQ ID NO：30)
用含有以下成分的反应溶液进行PCR。
10×ExTaq        5μl
2.5mM dNTP       4μl
ExTaq            0.25μl
100μM引物        0.5μl
cDNA             2μl
蒸馏水           38.25μl
接着，使用相当于4ng、0.4ng和0.04ng扩增cDNA的cDNA作为模板，在以下的反应系统中进行PCR。
10×ExTaq        1μl
2.5mM dNTP       0.8μl
ExTaq           0.05ul
100μM引物       各0.1μl
cDNA            1μl
蒸馏水          6.95μl
94℃保温2min后，进行如下扩增反应：94℃ 30s，65℃ 30s和72℃2min，最后，于72℃保温2min。PCR扩增进行26个循环。
以下引物用在PCR中。
Lrp4：TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG(SEQ ID NO：31)
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG(SEQ ID NO：32)
Lmxla：TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG(SEQ ID NO：33)
GAGTTGTAGACGCTCTGTTCAATGGC(SEQ ID NO：34)
结果表明，Lrp4基因在中脑和后脑Lrp4-阳性细胞任何一种中以近似相等的水平表达。但确定了Lmx1a基因(WO 2005/052190)(其为多巴胺能神经元和多巴胺能神经元祖细胞的标志物基因)仅在中脑Lrp4-阳性细胞中强表达(图3)。因此，认为中脑Lrp4-阳性细胞含有多巴胺能神经元增殖祖细胞，但后脑Lrp4-阳性细胞不含多巴胺能神经元增殖祖细胞。
因此，接着利用该样品，使用差减法(N-RDA)(描述于WO 2004/065599)在中脑中搜寻Lrp4-阳性细胞特异的基因。结果表明，分离的cDNA片段之一(187A5)是一个编码功能未知基因的片段。接着，利用下列引物用上述RT-PCR方法确定了该基因的表达。
187A5：ACCAGGAAGGACAATGCCATTCGTCC(SEQ ID NO：35)
CCTTCTTCACCTTGGCTCTTAGGATG(SEQ ID NO：36)
结果，证实了187A5基因在中脑Lrp4-阳性细胞中以与Lmx1a基因同样的方式特异性表达(图3)。
(2)序列分析
数据库检索的结果表明，获得了被认为是该基因全长的大鼠和小鼠cDNA序列〔例如，序列号：小鼠187A5 AK028289、小鼠187A5 AK157823(移码)、小鼠187A5 AK028541、小鼠187A5 XM_485684(备选)、小鼠187A5 AK163356(移码)、大鼠187A5 XM_344107(预测)〕。还获得了被认为是人类同源基因的部分序列(SEQ ID NO：1)，但不能获得其全长序列。因此，对人类基因组序列进行同源性检索，预测了人cDNA序列。但对于5’末端附近，未能发现具有高同源性的区域。因此，利用5’RACE方法进行序列测定。
从1μg人胚胎脑mRNA(Clontech)，用5’RACE核心试剂盒(TAKARA)扩增cDNA，并进行自身连接。通过使用以下引物，扩增了cDNA5’末端。将得到的片段克隆到pCR II(Invitrogen)，进行序列测定。
RT反应：CATCCCAGTCTC(SEQ ID NO：37)
初次PCR：TGGAGAAGGTTGTGCCTCTGGACTTG(SEQ ID NO：38)
CTGGTTGGCTTCCTTGAGGAAGAAGG(SEQ ID NO：39)
二次PCR：TCCTGCGGGACAAAGTCTACCTGAGC(SEQ ID NO：40)
CTGAGGATGTGGTAGCTCACAGGTAG(SEQ ID NO：41)
用以下混合物进行PCR反应。
10×ExTaq           5μl
2.5mM dNTP          4μl
ExTaq               0.25μl
100μM引物           各0.5μl
模板                1μl
DMSO                1.5μl
蒸馏水              37.25μl
94℃保温2min后，进行如下扩增反应：94℃30s，65℃30s和72℃2min，最后，于72℃保温2min。对于初次PCR，该PCR扩增进行35个循环，用初次PCR产物稀释10倍作为模板进行二次PCR，扩增进行20个循环。
接着，为了证实预测序列是正确的，将其分为三个分区，分别用RT-PCR扩增。将PCR产物克隆到pCR II(Invitrogen)，进行序列测定。
从0.5μg人胚胎脑mRNA(Clontech)，用RNA PCR试剂盒(TAKARA)扩增cDNA。使用该cDNA作为模板，进行PCR。
[0258]通过使用以下引物，扩增了5′末端附近。
人187A5 F4：GAGGTCGACGCCACCATGCGCTCCGAGGGTGCGGCCCCC(SEQ ID NO：42)
人187A5 R1：GGGTCCATAGCTGGCATTGAGCACTG(SEQ ID NO：43)
用以下混合物进行PCR反应。
10×LATaq       5μl
MgCl2           5μl
2.5mM dNTP      8μl
LATaq           0.5μl
100μM引物       各0.5μl
cDNA            1μl
DMSO            1.5μl
蒸馏水          28μl
94℃保温2min后，进行如下扩增反应35个循环：94℃30s，65℃30s和72℃3.5min，最后，于72℃保温2min。
通过联合使用下列引物F12和R5还有F13和R4扩增剩余区域。
人187A5 F12：CTACCTGTGAGCTACCACATCCTCAG(SEQ ID NO：44)
人187A5 R5：TTCTCTGCCAGGATGGAGTCAGACAG(SEQ ID NO：45)
人187A5 F13：ACTGGCAGTTCGACATCACTCACCTG(SEQ ID NO：46)
人187A5 R4：GAGGAATTCCAGTACAAGGAAGGCATCTGGGCAGG(SEQ ID NO：47)
序列测定的结果表明，编码这种人类基因的蛋白质显示出与小鼠187A5蛋白整个区域有高同源性，有77％的氨基酸同一和87％的氨基酸同源。因此，认为该基因是人187A5同源基因(SEQ ID NO：1)。
[实施例2]利用187A5基因原位杂交的表达分析
为了详细地研究多巴胺能神经元谱系的细胞中187A5基因的表达模式，根据以下方案利用原位杂交进行187A5和Lrp4mRNAs的表达分析。
首先，用下述方法生产DIG-探针。
从12.5日小鼠(获自SLC)胚胎，切出中脑后脑区。用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)制备总RNA，用cDNA合成试剂盒(TAKARA)合成双链cDNA。接着，用合成的cDNA作为模板，在以下的反应系统中扩增187A5和Lrp4的cDNA。
10×ExTaq        5μl
2.5mM dNTP       4μl
ExTaq            0.25μl
100μM引物        各0.5μl
cDNA             1μl
DMSO             1.5μl
蒸馏水           37.25μl
扩增在如下条件下进行：94℃保温5min后，进行如下反应35个循环：94℃30s，65℃30s和72℃2min，最后，于72℃保温2min。
在PCR中使用以下引物。
187A5：AGCTGAGCCACCTTCTCAGTCCAGAC(SEQ ID NO：48)
CCACGTCCAGGTCTTGACAAACCCAC(SEQ ID NO：49)
Lrp4：GACAGTGAACCTTTGGTCACTGATGG(SEQ ID NO：50)
GCCTTCCTGTCCTGGGATCAGCTTGG(SEQ ID NO：51)
将扩增的cDNA片段克隆到pCR II(Invitrogen)，用作模板，从而在以下的反应系统中合成了DIG-探针(所有试剂购自Roche)。
RNA聚合酶缓冲液        2μl
NTP标记混合物          2μl
RNA酶抑制剂            1μl
RNA聚合酶(T7或SP6)        2μl
模板DNA           1μg
蒸馏水            共20μl
37℃2h之后，于37℃进行DNase I(Roche)处理15min，通过乙醇沉淀收集DIG-RNA探针。
接着，摘出12.5日小鼠胚胎，用4％PFA(WAKO)/PBS于4℃固定2小时。然后，用20％蔗糖(WAKO)/PBS于4℃置换该溶液过夜后，用OCT(Sakura Seiki Co.，Ltd.)包埋该胚胎。制备12μm厚的切片，在载玻片上干燥，然后用4％PFA室温再固定30分钟。用PBS洗涤后，于68℃进行杂交[1μg/ml
DIG-RNA探针、50％甲酰胺(Nacalai Tesque，Inc.)、5×SSC、1％SDS、50μg/ml酵母RNA(Sigma)、50μg/ml肝素]40小时。然后，于68℃进行洗涤(50％甲酰胺、5×SSC、1％SDS)，进一步于68℃进行洗涤(50％甲酰胺、5×SSC)。用1×TBST于室温洗涤后，进行封闭(封闭剂：Roche)。用碱性磷酸酶标记的抗-DIG抗体(DAKO)于4℃与其反应过夜，洗涤(1×TBST、2mM左旋咪唑)后，用NBT/BCIP(DAKO)作为底物染色。
结果表明，在处于产生多巴胺能神经元阶段的12.5日小鼠胚胎中，显示了187A5的mRNA在中脑最腹侧脑室区(脑室区：VZ区)(其中存在Lrp4-阳性多巴胺能神经元祖细胞)和中脑最背侧顶板区中选择性表达(图4)。另一方面，在后脑腹侧区中未识别该表达。由此，证实了187A5的mRNA不在Lrp4阳性的后脑底板细胞中表达。
根据上述结果，显示了187A5的mRNA在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达。同时表达Lrp4和187A5基因的细胞限于中脑最腹侧脑室区中存在的多巴胺能神经元增殖祖细胞。因此，认为可联合利用这些标志物以更高的准确度鉴别多巴胺能神经元增殖祖细胞。
[实施例3]187A5基因在从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元中的表达
研究了当ES细胞被体外诱导分化成多巴胺能神经元时187A5基因是否表达。
首先，根据SDIA方法(Kawasaki等人.Neuron.2000Oct；28(1)：31-40)，将ES细胞(由Riken CDB的Mr.Nishikawa提供的源自小鼠的CCE株，Kawasaki et al.Neuron.200028(1)：31-40.)诱导分化成多巴胺能神经元。诱导后第6天从该细胞分离Lrp4-阳性和Lrp4-阴性细胞(WO 2004/065599的实施例5)，分离后立即从该细胞制备总RNA。利用该总RNA作为模板，合成和扩增了cDNA。
此外，根据5阶段法〔Lee et al.(2000)Nat.Biotech.18：675-679，小鼠多巴胺能神经元分化试剂盒(R&D系统)〕，将ES细胞(CCE)诱导分化成多巴胺能神经元。阶段4的第7天从该细胞分离Lrp4-阳性和Lrp4-阴性细胞(WO 2004/065599的实施例8)，分离后立即从该细胞制备总RNA。利用该总RNA作为模板，合成和扩增了cDNA。
接着，使用相当于4ng、0.4ng和0.04ng扩增cDNA的cDNA作为模板，在以下的反应系统中进行PCR。
10×ExTaq        1ul
2.5mM dNTP       0.8μl
ExTaq            0.05μl
100μM引物        各0.1μl
cDNA             1μl
DMSO             0.3μl
蒸馏水           6.65μl
94℃保温2min后，进行如下扩增反应：94℃30s，65℃30s和72℃2min，最后，于72℃保温2min。PCR扩增进行26个循环。
以下引物用在PCR中。
Lmxla：TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG(SEQ ID NO：33)
TCTGAGGTTGCCAGGAAGCAGTCTCC(SEQ ID NO：52)
另外，对于Lrp4和187A5，使用实施例1的引物。
结果表明，证实了187A5基因在使用任何一种方法的分化诱导中均表达，特别是在Lrp4-阳性细胞中强表达(图5和图6)。因此可见，不管是在源自小鼠和大鼠胚胎中脑的细胞中，还是在通过SDIA方法和5阶段法中任何一种方法所诱导分化的细胞中，187A5的mRNA均在多巴胺能神经元祖细胞中表达。具体地说，由此可见187A5基因对于鉴别源自胚胎中脑的多巴胺能神经元祖细胞，以及对于鉴别由ES细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞，都可以作为有用的标志物。
[实施例4]187A5蛋白在细胞表面的表达
在187A5蛋白中，存在一处被认为是跨膜区的序列。如果187A5蛋白在细胞表面表达，则可以利用能与187A5蛋白结合的抗体通过流式细胞仪分离187A5-阳性活细胞，它们可望用于制备帕金森病等的移植材料。因此，研究了187A5蛋白的细胞内定位。
(1)信号序列的分析
就I型跨膜蛋白来说，信号序列通常存在于N-末端的附近，紧随信号序列之后被切割，使得蛋白可在膜上表达。计算机检索的结果表明(PSORT
II，http://psort.ims.utokyo.ac.jp/form2.html)，未在小鼠187A5基因中发现被预测为信号序列的序列。另一方面，人187A5基因N-末端的附近存在类似信号序列的序列。因此，研究了187A5基因中是否存在功能性信号序列。
制备一种构建体，其中将编码小鼠cDNA中从N-末端至第45位氨基酸的区域连接至缺少信号序列的分泌型碱性磷酸酶cDNA，并将该构建体转染至293E细胞。收集培养第4天的培养上清液，用Aurora试剂盒(ICN)检测碱性磷酸酶活性(图7)。
结果表明，当表达缺少信号序列的分泌型碱性磷酸酶(对照)时，由于不分泌该蛋白质，从而在上清液中未发现碱性磷酸酶活性。相反，就其中连接了N-末端序列的融合蛋白来说，在上清液中发现了强活性。由此可见，融合蛋白借助187A5的N-末端序列被高效地分泌(图8)。由此证明，187A5的N-末端附近存在功能性信号序列。这表明187A5蛋白是I型单次跨膜分子。
(2)187A5在细胞表面的表达(生物素化方法)
为了确定187A5蛋白是否在细胞表面表达，研究了当用生物素仅标记细胞表面上的蛋白质时，187A5蛋白是否被生物素标记。
将187A5C-末端添加HA标签的构建体转染至NS20Y细胞。2天后，用冷PBS洗涤该细胞2次，然后向其中加入5ml 0.5mg/ml的EZ-连接的磺基-NHS-SS-生物素(PIERCE)(溶于PBS+1mM CaCl2、0.5mM MgCl2)。室温反应30分钟。用冷PBS洗涤2次后，收集细胞，然后悬于600μl溶解缓冲液(1％SDS、10mM Tris-Cl、100mM NaCl、1mM EDTA)中，经超声处理。14000rpm离心3分钟后，收集上清液。向其中加入20μl链霉抗生物素蛋白珠子(PIERCE)，室温旋转1小时后，用溶解缓冲液洗涤两次。将75μlSDS-PAGE样品缓冲液加至所述珠子中，100℃3分钟后，通过离心收集结合蛋白。利用抗-HA抗体(Roche)通过Western印迹检测187A5蛋白。
结果显示了187A5蛋白以高效率被生物素标记(图9)。因此，认为187A5蛋白在细胞表面表达。
(3)187A5在细胞表面的表达(FACS分析)
研究了是否可用FACS方法检测187A5蛋白。制备了一种构建体，其中将编码从预测的187A5剪切位点(第39位氨基酸)起C-末端侧的cDNA连接到紧随前胰蛋白酶原(preprotrypsin)的信号序列和编码FLAG标签的序列之后。通过表达该构建体，可在信号序列剪切后表达其中N-末端添加了FLAG标签的187A5。通过反转录病毒载体将该构建体稳定引入B300.19细胞。用FACS缓冲液[PBS+1％胎牛血清(JRH)+1mM EDTA]洗涤亲本细胞和转化体。然后，与10μg/ml抗-FLAG抗体(SIGMA)冰上反应30分钟，用FACS缓冲液洗涤。继续与PE-标记的抗-小鼠IgG抗体(Jackson)(稀释至1/200)冰上反应30分钟，用FACS缓冲液洗涤。染色后，用流式细胞仪(FACS calibur，Becton Dickinson)进行分析。
结果表明，与亲本株不同，在稳定的转化体中检测到了与FLAG抗体强反应的群体(图10)。由此可见，187A5以N-末端侧位于细胞外朝向表达在细胞表面上，可利用抗体通过FACS检测。具体地，认为187A5作为分离多巴胺能神经元祖细胞的活细胞的标志物是有用的。
[实施例5]187A5蛋白的表达分析
使用187A5基因中编码胞外区的基因序列，根据以下方案生产了抗-187A5抗体，用免疫组织染色进行表达分析。
首先，将小鼠187A5基因中编码胞外区(SEQ ID NO：15的氨基酸1-919)的基因序列基因导入至293E细胞，表达并回收187A5蛋白的胞外区。用回收的蛋白质免疫大鼠，然后提取淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合。从融合的细胞群体选择能与187A5反应的克隆。从该克隆的培养上清液纯化抗-187A5单克隆抗体。接着，用4％PFA/PBS(-)于4℃将11.5日小鼠胚胎固定2小时。然后，用20％蔗糖/PBS(-)于4℃置换过夜，之后用OCT包埋。制备12um厚的切片，贴到载玻片上，然后室温干燥30分钟，再用PBS(-)润湿。然后，室温进行封闭[25％Blockace(Dainippon Sumitomo Pharma Co.，Ltd)]30分钟。将制备的抗-187A5单克隆抗体(稀释2倍的培养上清液，2.5％Blockace/PBS)于室温与其反应2.5小时，然后用0.01％TritonX-100/PBS(-)于室温洗涤4次，每次10分钟。使Cy3-标记的抗-大鼠IgG抗体(Jackson，10μg/ml，2.5％Blockace/PBS)于室温与其反应1小时，以同样的方式进行洗涤。然后，用PBS(-)于室温进行洗涤5分钟，进行封固。
利用制备的抗-187A5单克隆抗体通过免疫组织染色的表达分析结果表明，与实施例2的结果一样，在处于产生多巴胺能神经元阶段的E11.5的中脑腹侧区中发现了187A5蛋白的存在，而在其中不产生多巴胺能神经元的后脑腹侧区中则未发现187A5蛋白的存在(图11)。
根据这些结果，证实了多巴胺能神经元祖细胞中存在187A5蛋白。
[实施例6]存在187A5蛋白的细胞的检测
使用实施例5中制备的抗-187A5单克隆抗体，用流式细胞仪检测了其中存在187A5蛋白的细胞。
首先，用细胞解离液(Invitrogen)分散小鼠E12.5胚胎的中脑和后脑腹侧区，然后不经固定和透化处理，使用抗-187A5单克隆抗体(纯化抗体稀释至1/10、1％胎牛血清、1mM EDTA/PBS)和抗-Lrp4抗体(培养上清液稀释至1/2、1％胎牛血清、1mM EDTA/PBS)于4℃将细胞染色20min。然后，使用1％胎牛血清和1mM EDTA/PBS-，于4℃洗涤3次，每次3min。用生物素标记的抗-亚美尼亚(Armenian)仓鼠IgG抗体(Jackson，10μg/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)于4℃将细胞染色20min，以同样的方式进行洗涤。然后，用APC-标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen，8μg/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)和PE-标记的抗-大鼠IgG抗体(Jackson，20μg/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)于4℃将细胞染色20min，以同样的方式进行洗涤。染色后，用流式细胞仪进行检测。
通过使用制备的抗-187A5单克隆抗体的流式细胞术的结果表明，检测到了其中存在187A5蛋白的细胞群体(图12)。这里，可以不经固定和透化处理检测其中存在187A5蛋白的细胞，由此提示可通过使用带有细胞分选仪的流式细胞仪将其中存在187A5蛋白的细胞以活细胞状态加以分离。此外，证实了187A5蛋白存在于所有中脑Lrp4-阳性细胞，即多巴胺能神经元祖细胞中。另一方面，证实了在不含有多巴胺能神经元祖细胞的后脑Lrp4-阳性细胞中不存在187A5蛋白。
根据这些结果，显示了187A5抗体对于分离多巴胺能神经元祖细胞是有用的。
[实施例7]187A5蛋白在从ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元中的表达
用细胞解离液(Invitrogen)分散含有通过SDIA方法从ES细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞的细胞群，然后不经固定和透化处理，使用实施例5中制备的抗-187A5单克隆抗体(纯化抗体稀释至1/10、10％敲除血清替代品、1％胎牛血清、1mM EDTA/SDIA分化培养基)和抗-Lrp4抗体(培养上清液稀释至1/2、10％敲除血清替代品、1％胎牛血清、1mMEDTA/SDIA分化培养基)于4℃将细胞染色20min。然后，使用10％敲除血清替代品、1％胎牛血清和1mM EDTA/SDIA分化培养基，于4℃洗涤3次，每次3min。用生物素标记的抗亚美尼亚仓鼠IgG抗体(Jackson，10μg/ml，10％敲除血清替代品，1％胎牛血清，1mM EDTA/SDIA分化培养基)于4℃将细胞染色20min，以同样的方式进行洗涤。然后，用APC-标记的链霉抗生物素蛋白(Pharmingen，8μg/ml，10％敲除血清替代品，1％胎牛血清，1mM EDTA/SDIA分化培养基)和PE-标记的抗-大鼠IgG抗体(Jackson，20μg/ml，10％敲除血清替代品，1％胎牛血清，1mM EDTA/SDIA分化培养基)于4℃将细胞染色20min，以同样的方式进行洗涤。染色后，用流式细胞仪检测187A5-和Lrp4-表达细胞。
流式细胞仪的结果表明，与小鼠胚胎中脑同样地检测到了其中存在187A5和Lrp4蛋白的细胞群体(图13)。
根据这些结果，显示了187A5抗体对于分离源自ES细胞的多巴胺能神经元祖细胞也是有用的。
[实施例8]利用抗体分离Lrp4-表达细胞
为了证实分离的187A5/Lrp4-共阳性细胞分化成多巴胺能神经元，使用Nurr1(一种有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物)进行了以下实验。
[0302]将通过SDIA方法从ES细胞体外诱导分化后分离的细胞接种到包被了聚-L-鸟氨酸(Sigma，PBS中0.002％)、层粘连蛋白(Invitrogen，PBS中2.5μg/ml)和纤连蛋白(Sigma，PBS中5μg/ml)的载玻片上，在N2(Invitrogen，1×)、B27(Invitrogen，1×)、抗坏血酸(Sigma，200μM)BDNF(Invitrogen，20ng/ml)和10％敲除血清替代品(Invitrogen)/SDIA分化培养基中于37℃培养6天。用2％PFA/PBS将培养的细胞于4℃固定20分钟，用PBS于4℃洗涤两次，每次10分钟。然后，用0.3％Triton X-100/PBS于室温进行透化处理30分钟，用10％正常驴血清/Blockace于室温进行封闭20分钟。接着，于室温与抗-Nurr1抗体(自制培养上清液稀释至1/1000，10％正常驴血清，2.5％Blockace，0.1％Triton X-100/PBS)和抗-HuC/D抗体(Molecular Probe，1/50，4μg/ml，10％正常驴血清，2.5％Blockace，0.1％TritonX-100/PBS)反应1小时，继续于4℃反应过夜。第二天，使用0.1％TritonX-100/PBS，室温洗涤4次，每次10分钟。然后，于室温与FITC-标记的抗-小鼠IgG抗体和Cy3-标记的抗-大鼠IgG抗体(均为Jackson，3μg/ml，10％正常驴血清，2.5％Blockace，0.1％Triton X-100/PBS)反应1小时。之后以同样的方式进行洗涤，并用PBS室温洗涤5分钟。封固后观察细胞。
通过流式细胞仪分离的细胞体外培养6天的结果表明，与作为对照的未分离细胞相比较，明显诱导了许多Nurr1-阳性多巴胺能神经元(图14)。
根据这些结果，显示了187A5/Lrp4-共阳性细胞确实是多巴胺能神经元谱系的祖细胞，并可在体外成熟。
序列表
<110>卫材R&D管理有限公司(Eisai R&D Management Co.，Ltd.)
<120>多巴胺能神经元祖细胞标志物187A5
<130>166071PX
<150>JP2006-108786
<151>2006-04-11
<160>52
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3402
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(31)..(3357)
<223>
<400>1
Figure A200780021736D00701
Figure A200780021736D00711
Figure A200780021736D00721
Figure A200780021736D00741
<210>2
<211>1108
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Figure A200780021736D00742
Figure A200780021736D00751
Figure A200780021736D00771
Figure A200780021736D00781
<210>3
<211>5961
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4347)
<223>
<400>3
Figure A200780021736D00782
Figure A200780021736D00791
Figure A200780021736D00801
Figure A200780021736D00811
Figure A200780021736D00821
Figure A200780021736D00831
<210>4
<211>1448
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Figure A200780021736D00842
Figure A200780021736D00861
Figure A200780021736D00871
Figure A200780021736D00881
Figure A200780021736D00891
<210>5
<211>3810
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2196)
<223>
<400>5
Figure A200780021736D00892
Figure A200780021736D00901
Figure A200780021736D00921
<210>6
<211>731
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Figure A200780021736D00922
Figure A200780021736D00931
Figure A200780021736D00951
<210>7
<211>3804
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(3)..(2174)
<223>
<400>7
Figure A200780021736D00952
Figure A200780021736D00961
Figure A200780021736D00971
Figure A200780021736D00981
<210>8
<211>723
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Figure A200780021736D00991
Figure A200780021736D01011
<210>9
<211>3558
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(1801)
<223>
<400>9
Figure A200780021736D01012
Figure A200780021736D01021
Figure A200780021736D01031
Figure A200780021736D01041
<210>10
<211>599
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Figure A200780021736D01051
Figure A200780021736D01061
<210>11
<211>3820
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3432)
<223>
<400>11
Figure A200780021736D01062
Figure A200780021736D01071
Figure A200780021736D01081
Figure A200780021736D01091
Figure A200780021736D01101
<210>12
<211>1143
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>12
Figure A200780021736D01111
Figure A200780021736D01121
Figure A200780021736D01131
Figure A200780021736D01141
<210>13
<211>5114
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>13
Figure A200780021736D01161
Figure A200780021736D01171
<210>14
<211>4226
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(91)..(3414)
<223>
<400>14
Figure A200780021736D01181
Figure A200780021736D01201
Figure A200780021736D01211
<210>15
<211>1107
<212>PTR
<小家鼠(Musmusculus)
<400>15
Figure A200780021736D01221
Figure A200780021736D01231
Figure A200780021736D01241
Figure A200780021736D01251
<210>16
<211>3582
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(152)..(2311)
<223>
<400>16
Figure A200780021736D01261
Figure A200780021736D01271
Figure A200780021736D01281
Figure A200780021736D01291
<210>17
<211>719
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>17
Figure A200780021736D01292
Figure A200780021736D01301
Figure A200780021736D01311
<210>18
<211>5639
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(79)..(3936)
<223>
<400>18
Figure A200780021736D01312
Figure A200780021736D01331
Figure A200780021736D01341
Figure A200780021736D01361
<210>19
<211>1285
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>19
Figure A200780021736D01372
Figure A200780021736D01381
Figure A200780021736D01401
Figure A200780021736D01411
<210>20
<211>2683
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>20
Figure A200780021736D01412
<210>21
<211>5112
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(5112)
<223>
<400>21
Figure A200780021736D01432
Figure A200780021736D01441
Figure A200780021736D01451
Figure A200780021736D01471
Figure A200780021736D01481
<210>22
<211>1703
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400>22
Figure A200780021736D01511
Figure A200780021736D01521
Figure A200780021736D01531
Figure A200780021736D01541
<210>23
<211>3908
<212>DNA
<213>牛(Bos taurus)
<220>
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<222>(1)..(3600)
<223>
<400>23
Figure A200780021736D01552
Figure A200780021736D01561
Figure A200780021736D01571
Figure A200780021736D01581
Figure A200780021736D01591
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<211>1199
<212>PRT
<213>牛(Bos taurus)
<400>24
Figure A200780021736D01601
Figure A200780021736D01611
Figure A200780021736D01621
Figure A200780021736D01631
Figure A200780021736D01641
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<212>DNA
<213>家猫(Canis familiaris)
<220>
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Figure A200780021736D01651
Figure A200780021736D01661
Figure A200780021736D01671
Figure A200780021736D01681
<210>26
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<212>PRT
<213>家猫(Canis familiaris)
<400>26
Figure A200780021736D01682
Figure A200780021736D01691
Figure A200780021736D01711
<210>27
<211>3144
<212>DNA
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<220>
<221>CDS
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<223>
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Figure A200780021736D01722
Figure A200780021736D01731
Figure A200780021736D01741
Figure A200780021736D01751
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<212>PRT
<213>黑猩猩(Pan troglodytes)
<400>28
Figure A200780021736D01752
Figure A200780021736D01761
Figure A200780021736D01771
Figure A200780021736D01781
Figure A200780021736D01791
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Figure A200780021736D01793
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Figure A200780021736D01814
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Figure A200780021736D01821
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Figure A200780021736D01822
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Figure A200780021736D01823
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Figure A200780021736D01824
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Figure A200780021736D01825
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Figure A200780021736D01826
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<400>51
Figure A200780021736D01833
<210>52
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物
<400>52
Figure A200780021736D01834

Claims (71)

1.一种用于多巴胺能神经元祖细胞的检测或选择的探针或引物，该探针或引物能够与
选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的多核苷酸，或者
编码选自以下(v)、(vi)、(vii)和(viii)中的蛋白的多核苷酸
的核苷酸序列或其互补序列杂交：
(i)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii)编码蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白由下述氨基酸序列构成且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能：所述氨基酸序列由在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列所编码；
(iii)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；和
(iv)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；
(v)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；和
(viii)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
2.根据权利要求1所述的探针或引物，其中，所述多核苷酸来自人、小鼠、大鼠、牛、犬或黑猩猩。
3.根据权利要求1或2所述的探针或引物，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27构成的组。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的探针或引物，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列是包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列之774位～1221位或2403位～2666位的核苷酸序列的一部分或全部的核苷酸序列。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的探针或引物，该探针或引物由包含所述多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的至少10个连续核苷酸的多核苷酸所构成。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的探针或引物，该探针或引物的长度至少为25个碱基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的探针或引物，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
8.一种引物组，其由两种以上的权利要求1～7中任一项所述的引物构成。
9.能够与选自以下的(v)、(vi)、(vii)和(viii)中的蛋白或其部分结合的抗体：
(v)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii)由与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白；
(viii)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中，所述蛋白或其部分是包含下述多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸248位～397位或792位～877位的氨基酸序列的至少5个氨基酸残基或其全部所构成。
11.根据权利要求9所述的抗体，其中，所述蛋白或其部分是表达于细胞外的多肽区。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中，所述蛋白或其部分包含下述多肽，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸28位～927位、SEQ ID NO：4的氨基酸16位～1267位、SEQ ID NO：6的氨基酸1位～550位、SEQ ID NO：8的氨基酸1位～542位、SEQ ID NO：10的氨基酸1位～418位、SEQ ID NO：12的氨基酸76位～964位、SEQ ID NO：15的氨基酸40位～928位、SEQ ID NO：17的氨基酸1位～540位、SEQ ID NO：19的氨基酸40位～1106位、SEQ ID NO：22的氨基酸24位～1524位、SEQ ID NO：24的氨基酸43位～1018位、SEQ IDNO：26的氨基酸43位～908位或SEQ ID NO：28的氨基酸1位～866位的氨基酸序列的至少5个氨基酸残基或其全部所构成。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的抗体，其中，所述蛋白或其部分为由至少6个氨基酸构成的多肽。
14.根据权利要求9～13中任一项所述的抗体，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
15.一种检测或选择多巴胺能神经元祖细胞的方法，该方法包括：检测权利要求1的多核苷酸的表达的步骤，或者检测权利要求9的蛋白的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，检测多核苷酸的表达的步骤包括：
(a)使权利要求1～8中任一项所述的探针、引物或引物组与受试细胞样品接触的步骤；和
(b)检测有无反应性的步骤。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中，检测多核苷酸的表达的步骤包括：
(a-1)使权利要求1～7中任一项所述的探针与受试细胞样品来源的多核苷酸接触的步骤；和
(b-1)检测杂交复合物的步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，在步骤(a-1)中，使由受试细胞样品制备的mRNA或由该mRNA转录的互补DNA与所述探针接触。
20.根据权利要求15或16所述的方法，其中，检测多核苷酸的表达的步骤包括：
(a-2)以受试细胞样品来源的多核苷酸为模板，使用权利要求1～7中任一项所述的引物或权利要求8所述的引物组实施核酸扩增方法的步骤；和
(b-2)检测形成的扩增产物的步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，在步骤(a-2)中，使用由受试细胞样品制备的mRNA或由该mRNA转录的互补DNA作为模板。
22.根据权利要求15或16所述的方法，其中，检测蛋白的步骤包括：
(c)使权利要求9～14中任一项所述的抗体与受试细胞样品接触的步骤；和
(d)检测有无反应性的步骤。
23.根据权利要求15或16所述的方法，其中，检测蛋白的步骤包括：
(c-1)使权利要求9～14中任一项所述的抗体与受试细胞样品来源的蛋白接触的步骤；和
(d-1)检测抗体抗原复合物的步骤。
24.根据权利要求17～23中任一项所述的方法，其中，所述受试细胞样品是被诱导向多巴胺能神经元增殖祖细胞分化的ES细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述分化诱导通过SDIA法进行。
26.根据权利要求17～23中任一项所述的方法，其中，所述受试细胞样品是得自胚胎中脑腹侧区域的细胞。
27.根据权利要求17～26中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)或步骤(c)中使用下述细胞作为受试细胞样品：
检测到了除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达的细胞、或者检测到了除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白的细胞；
未检测到有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的细胞；
检测到了除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达的细胞、或者检测到了除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白的细胞；或者
未检测到成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的细胞。
28.根据权利要求17～26中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)或步骤(d)之后还包括：
(e-1)检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达、或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白的步骤；
(e-2)检测有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的步骤；
(e-3)检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达、或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白的步骤；或者
(e-4)检测成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的步骤。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因为在中脑最腹侧脑室区域中表达的基因。
30.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因选自由Lrp4基因、Msx1基因、Msx2基因、Nato3基因和Mash1基因构成的组。
31.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白为在中脑最腹侧脑室区域表达的蛋白。
32.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白为下述基因的蛋白，所述基因选自由Lrp4基因、Msx1基因、Msx2基因、Nato3基因和Mash1基因构成的组。
33.根据权利要求27或28所述的方法，其中，有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因为在中脑最腹侧套层区中表达的基因。
34.根据权利要求27或28所述的方法，其中，有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因选自由Nurr1基因、En1基因、En2基因、Ptx3基因、TH基因或65B13基因构成的组。
35.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因为在中脑最腹侧区域中表达的基因。
36.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因为Lmx1a基因。
37.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白为在中脑最腹侧表达的蛋白。
38.根据权利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白为Lmx1a基因的蛋白。
39.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因为DAT基因。
40.根据权利要求17～39中任一项所述的方法，其中，该方法还包括用下述载体转化受试细胞样品，并检测该受试细胞样品中标志物基因的表达的步骤，所述载体包含由所述多核苷酸的启动子与标志物基因可操作连接而成的基因构建体。
41.用于检测或选择多巴胺能神经元祖细胞的试剂盒，该试剂盒至少包含权利要求1～7中任一项所述的探针或引物、权利要求8所述的引物组或权利要求9～14中任一项所述的抗体。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
43.根据权利要求41或42所述的试剂盒，该试剂盒还包含：
能够检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白的探针、引物、引物组或抗体；
能够检测有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的探针、引物、引物组或抗体；
能够检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白的探针、引物、引物组或抗体；或者
能够检测成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的探针、引物、引物组或抗体。
44.根据权利要求41～43中任一项所述的试剂盒，该试剂盒还包含下述载体，所述载体包含由所述多核苷酸的启动子与标志物基因可操作连接而成的基因构建体。
45.用于检测或选择多巴胺能神经元祖细胞的试剂，该试剂至少包含权利要求1～7中任一项所述的探针或引物、权利要求8所述的引物组或权利要求9～14中任一项所述的抗体。
46.根据权利要求45所述的试剂，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
47.根据权利要求45或46所述的试剂，该试剂还包含：
能够检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白的探针、引物、引物组或抗体；
能够检测有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的探针、引物、引物组或抗体；
能够检测除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物基因的表达或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元祖细胞标志物蛋白的探针、引物、引物组或抗体；或者
能够检测成熟多巴胺能神经元细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的探针、引物、引物组或抗体。
48.根据权利要求45～47中任一项所述的试剂，该试剂还包含下述载体，所述载体包含由所述多核苷酸的启动子与标志物基因可操作连接而成的基因构建体。
49.一种用于筛选对多巴胺能神经元祖细胞的分化诱导有效的物质的方法，该方法包括以下步骤：
(i)使能够分化成多巴胺能神经元祖细胞的细胞与受试物质接触的步骤；和
(ii)检测与受试物质接触后的所述细胞中权利要求1的多核苷酸的表达或权利要求9的蛋白的步骤。
50.根据权利要求49所述的筛选方法，其中，多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，该方法还包括：
(iii-1)检测与受试物质接触后的所述细胞中、除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因的表达或者除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白的步骤。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因为在中脑最腹侧脑室区域表达的基因。
53.根据权利要求51所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物基因选自由Lrp4基因、Msx1基因、Msx2基因、Nato3基因和Mash1基因构成的组。
54.根据权利要求51所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白为在中脑最腹侧脑室区域中表达的蛋白。
55.根据权利要求51所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标志物蛋白为下述基因的蛋白，所述基因选自由Lrp4基因、Msx1基因、Msx2基因、Nato3基因和Mash1基因构成的组。
56.根据权利要求50所述的方法，该方法还包括：
(iii-2)检测与受试物质接触后的所述细胞中、有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因的表达或该基因的蛋白的步骤。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因为在中脑最腹侧套层区域中表达的基因。
58.根据权利要求56所述的方法，其中，有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标志物基因选自由Nurr1基因、En1基因、En2基因、Ptx3基因、TH基因或65B13基因构成的组。
59.根据权利要求50所述的方法，该方法还包括：
(iii-3)用载体转化与受试物质接触后的所述细胞，并检测该细胞中标志物基因的表达的步骤，所述载体包含由所述多核苷酸的启动子与标志物基因可操作连接而成的基因构建体。
60.一种制备多巴胺能神经元祖细胞的方法，该方法包括：
(i)获得可能包含多巴胺能神经元祖细胞的细胞的步骤；
(ii)采用权利要求15～40中任一项所述的方法检测多巴胺能神经元祖细胞的步骤；和
(iii)培养步骤(ii)中检测出或选择出的细胞的步骤。
61.根据权利要求60所述的制备方法，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为用于帕金森病治疗的多巴胺能神经元祖细胞。
62.根据权利要求60或61所述的制备方法，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
63.选自以下的(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的多核苷酸：
(i)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii)编码由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列编码，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中发生一个或多个核苷酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；
(iv)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列构成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且编码具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸。
64.根据权利要求63所述的多核苷酸，该多核苷酸来自人、小鼠、大鼠、牛、犬或黑猩猩。
65.根据权利要求63或64所述的多核苷酸，该多核苷酸选自由SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25和SEQ IDNO：27构成的组。
66.选自以下的(v)、(vi)、(vii)和(viii)中的蛋白：
(v)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；
(vi)由下述氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中发生一个或多个氨基酸的插入、取代、缺失和/或在该序列的一个或两个末端发生一个或多个氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii)由下述多核苷酸编码、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸与编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交；和
(viii)由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列构成、且具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的蛋白等同的功能的蛋白。
67.根据权利要求66所述的蛋白，该蛋白为I型跨膜蛋白。
68.包含下述多肽的蛋白：
由SEQ ID NO：2的氨基酸248位-397位或者792位-877位氨基酸序列的至少5个氨基酸残基或其全部所构成的多肽，或者
由SEQ ID NO：2的氨基酸28位～927位、SEQ ID NO：4的氨基酸16位～1267位、SEQ ID NO：6的氨基酸1位～550位、SEQ ID NO：8的氨基酸1位～542位、SEQ ID NO：10的氨基酸1位～418位、SEQ ID NO：12的氨基酸76位～964位、SEQ ID NO：15的氨基酸40位～928位、SEQ ID NO：17的氨基酸1位～540位、SEQ ID NO：19的氨基酸40位～1106位、SEQ ID NO：22的氨基酸24位～1524位、SEQ ID NO：24的氨基酸43位～1018位、SEQ ID NO：26的氨基酸43位～908位或SEQ ID NO：28的氨基酸1位～866位的氨基酸至少5个氨基酸残基或其全部所构成的多肽。
69.编码权利要求66～68中任一项所述蛋白的多核苷酸。
70.权利要求66～68中任一项所述蛋白作为用于检测或选择多巴胺能神经元祖细胞的指标的用途。
71.根据权利要求70所述的用途，其中，所述多巴胺能神经元祖细胞为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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