CN101426507A - 多聚氨基酸与抗生素的联合使用 - Google Patents

Abstract

本发明包含一种影响抗生素抗性、用于提高抗生素整体功效、以及用于杀死细菌的组合物和方法，其包括采用多聚氨基酸使得细菌以及抗性菌株对亲水性抗生素敏感并减小细菌对该抗生素的抗性。

Description

多聚氨基酸与抗生素的联合使用

技术领域

本发明总体上涉及细菌感染的药物治疗领域和消毒试剂领域。更特别地，本发明涉及影响抗生素功效以及改善抗生素整体功效和杀死细菌的组合物和方法。

背景技术

抗生素和其它抗菌剂已经被广泛地用来拯救无以数计的生命和减小多种疾病与感染的严重并发症。在广泛使用超过50年后，许多抗菌剂的抗菌效果正在变差，其中部分原因是因为细菌产生了抗性。特别地，抗生素的过度和广泛使用被认为促进了进化性耐受，这使细菌可以在最有效的药物中存活下来。对抗菌剂的抗性为微生物提供了生存便利并使得感染更加难以消除。

细菌抗性出现的日益增加提高了在医院或者其它场所中染上更严重感染性疾病的风险。例如，随着导致疾病的病原体对传统抗生素抗性的提高，诸如肺结核、淋病、疟疾以及少儿耳朵感染等疾病在目前更难被治愈。对收容有患严重疾病的患者的医院而言药物的抗性是尤其困难的问题，如果没有强有力或者毒性更大的抗生素的帮助这些患者无法抵抗感染。不幸地是，由于产生了具有更强生存能力的细菌，该细菌即便是在具有已知最强抗生素的环境中也能存活下来，这使得该问题变得更糟。正是这些具有更强抗药性的细菌持续折磨着医院里脆弱的患者。这种感染的结果是，抗生素抗性导致更长的住院时间、更高的死亡率和日益增加的卫生保健成本。

由此，一直都需要用以改善抗生素生物活性的组合物和方法。同样也需要可以对付细菌的抗生素抗性的有效治疗的组合物和方法。除了其它内容外，本发明所涉及的就是这些需求。

发明内容

首要地，本发明提供了用于改善抗菌剂和消毒剂功效的方法和组合物。其中用于改善抗生素对抗细菌及其耐药菌株功效的示意性方法和组合物包括施用多聚氨基酸以使细菌或抗生素抗性菌株对抗生素变得敏感，再服用抗生素从而杀死或抑制细菌。本发明大致原理是提供能够大幅提高抗生素和消毒剂抗菌效果的方法。

本发明大致包括通过单独或者和抗生素一起施用有效剂量的多聚氨基酸来治疗患者的细菌感染。在一个阐述性治疗过程中，可以对受治疗者同时施用多聚氨基酸和抗生素从而通过外源性补充来诱导它们各自处于适量水平，以便多聚氨基酸可以使细菌对抗生素变得敏感而抗生素则可以更好地杀死或抑制细菌。在另一个阐述性治疗过程中，可以在使用抗生素治疗之前或治疗一段时间之后对受治疗者施用多聚氨基酸。在另一个阐述性治疗过程中，在施用多聚氨基酸之前先用抗生素进行治疗，随后在施用多聚氨基酸来使细菌或细菌的抗性菌株对抗生素变得敏感。这样，和抗生素同时、先于抗生素、和/或在抗生素之后对受治疗者施用多聚氨基酸。

本发明所有的组合物包括在治疗上有效剂量的多聚氨基酸和抗生素。多聚氨基酸和/或抗生素的特定剂量取决于所使用的抗生素、所使用的多聚氨基酸、所治疗的疾病或感染、以及治疗的持续时间。一般而言，剂量可以根据这些因素而有所不同。优选的剂量是多聚氨基酸和/或抗生素在治疗意义上有效的最低剂量。可以采用让医师或兽医参与到医疗判断过程中的方法以确定合理的剂量。多聚氨基酸以及抗生素的有效给药形式、施用方式以及剂量可以通过经验来确定，根据本领域公知技术可以对此作出判断。

本发明的一个优点在于其允许采用某些较低浓度的抗生素来达到治疗效果。例如基于可以减小治疗期限、缩短处于加护病房或者处于医院或诊所中的时间、以及伴随的严重医院感染(在医院中感染)风险的降低等原因，本发明也有利于提高生存质量。

如果结合附图阅读下述优选实施方式的具体描述，本领域技术人员可以更容易地理解本发明。

附图说明

附图1所示的表描述了在各种浓度多聚氨基酸、化学物质和/或抗生素的情况下对铜绿假单胞菌的最小抑制值。

附图2所示的表描述了临床分离菌铜绿假单胞菌对由多种抗生素和多聚氨基酸组成的组合物的敏感性。

附图3所示的表描述了大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株对由多种抗生素和多聚氨基酸组成的组合物的敏感性。

附图4显示了杀灭人血清中铜绿假单胞菌PAO1的时间分析图。

附图5图示出经抗生素和多聚氨基酸构成的组合物处理后各种细胞中β-内酰胺酶活性降低。

附图6图示出干扰剂处理后多种细胞中β-内酰胺酶活性。

附图7图示出经抗生素和各种多聚氨基酸构成的组合物处理之后，仅仅可以检测到极低水平的β-内酰胺酶活性。

附图8所示的表描述了大肠杆菌菌株对环丙沙星和各种多聚氨基酸的组合物的敏感性。

具体实施方式

本发明优选实施方式包括提高抗生素和其它抗菌剂功效的组合物和方法。本发明中用于改善抗生素对抗细菌及其耐药菌株功效的示意性方法和组合物包括施用多聚氨基酸以使细菌或抗生素抗性菌株对抗生素变得敏感，再服用抗生素从而杀死或抑制细菌。本文对本发明大致原理作了限定，并提供了可以大幅提高抗生素与消毒剂抗菌功效的方法。

更加特别地，单独施用或者与抗生素特别是与亲水性抗生素一起施用各种多聚氨基酸，出乎意料地发现其可以减小细菌对该抗生素的抗性，并杀死了抗性菌株，而且提高了该抗生素的功效。由于之前的研究已经表明天然多聚氨基酸(例如尸胺、亚精胺和精胺)不会使肠细菌对亲水性抗生素变得敏感并且天然多聚氨基酸既无细菌毒性也无敏化活性，由此现有技术并未关注过采用多聚氨基酸尤其是天然多聚氨基酸的方法来使细菌对抗生素变得敏感。在用各种抗生素(包括亲水性抗生素)和多聚氨基酸进行实验后发现多聚氨基酸可以使诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等细菌对抗生素和消毒剂变得敏感。

本发明的一个阐述性实施方式包括通过单独施用有效剂量的多聚氨基酸或者和其与抗生素一起被施用来治疗患者的细菌感染。在一个阐述性治疗中，可以对受治疗者同时施用多聚氨基酸和抗生素从而通过外源性补充来诱导它们各自处于适量的水平，以便多聚氨基酸可以使细菌对抗生素变得敏感从而抗生素则可以更好地杀死或抑制细菌。在另一个阐述性治疗过程中，可以在用抗生素治疗之前或治疗一段时间之后对受治疗者施用多聚氨基酸。在另一个阐述性治疗过程中，在施用多聚氨基酸之前先用抗生素进行治疗，随后在施用多聚氨基酸来使细菌或细菌的抗性菌株对抗生素变得敏感。这样，和抗生素同时、先于抗生素和/或在抗生素之后对受治疗者施用多聚氨基酸。

例如，如果施用一段时间的抗生素没有产生足够的效果，那就可以施用一段时间的多聚氨基酸来敏化细菌并提高抗生素的功效。类似地，在施用一段时间的抗生素后施用多聚氨基酸以便提高抗生素的功效。另一个实施例是，可以在施用一定时间抗生素的同时施加多聚氨基酸从而提高抗生素的功效。类似地，在被施用的受治疗者患有过敏症或者其它对不同的治疗中优选抗生素敏感的情况下，在施用一定时间抗生素被认为效果变差则可同时施加多聚氨基酸来提高抗生素的功效。另一个实施例中，可以在施用一段时间抗生素之前来施用多聚氨基酸以便预先使细菌对抗生素变得敏感。

本发明总体上所有的组合物中都包括有效治疗剂量的所选多聚氨基酸和抗生素。具体的多聚氨基酸和/或抗生素剂量取决于所用抗生素、所用多聚氨基酸、所治疗的疾病或感染(包括细菌感染或者及其抗性的严重程度)，受治疗者数量和状况、组合物排泄速率以及治疗的持续时间。剂量总体上会随这些因素而变化。优选剂量是多聚氨基酸和/或抗生素在治疗意义上有效的最低剂量。可以采用让医师或兽医参与到医疗判断过程中的方法以确定合理的剂量。多聚氨基酸以及抗生素的有效给药形式、施用方式以及剂量可以通过经验来确定，根据本领域公知技术可以对此作出判断。

由于一些抗生素的使用受到系统毒性或高成本的限制，而降低有效治疗所需的抗生素浓度则可以减小毒性和/或治疗成本，而且这样可以允许更广泛地使用抗生素和/或使用替代类型的抗生素。例如，和抗生素一起使用多聚氨基酸可以从实质上减少含抗生素和/或抗菌剂的治疗试剂的剂量从而避免某些抗生素和/或抗菌剂的副作用。由于缩短疗程、减小呆在加护病房或呆在医院的总体时间、以及所伴随的严重医院感染(在医院中感染)风险的降低，因而本发明同样可以用来提高生存质量。

适用于本发明的多聚氨基酸包括天然多聚氨基酸，优选那些属于无毒天然化合物和/或以高水平存在于一般动物和/或人体中的多聚氨基酸。被选择用于本发明优选实施方式的多聚氨基酸为天然多聚氨基酸。这些天然多聚氨基酸包括例如尸胺、腐胺、亚精胺、精胺以及去甲亚精胺以及去甲精胺等。更优选的多聚氨基酸包括精胺和亚精胺，这些多聚氨基酸被发现可以比腐胺和尸胺更有效地敏化细菌。人工合成的类似物以及其它多聚氨基酸也适用于本发明并且无需依靠过度的实验即可获得。

可用于本发明的示意性多聚氨基酸是精胺，该多聚氨基酸表现出细菌减弱了对抗生素的抗性以及提高抗生素功效的最好功效。根据本文实施例所示，该多聚氨基酸可以敏化抗性细菌并且和各种抗生素一起来有效治疗细菌感染。而且由于该多聚氨基酸对人类无毒并天然地存在人体中，该多聚氨基酸可以安全的施用于人类患者。实施例的结果可以外推至其它多聚氨基酸。

适用于本发明的抗生素包括能够抑制微生物生长或杀死微生物的物质，其可以是合成的也可以是天然的。这类抗生素包括β-内酰胺抗生素、大环内酯类、单胺菌素、利福霉素类、四环素类、氯霉素类、氯林可霉素、林可霉素、梭链孢酸、新生霉素、磷霉素、梭链孢酸钠、卷曲霉素、粘菌素甲烷磺酸盐(colismethate)、短杆菌肽、二甲胺四环素、强力霉素、杆菌肽、红霉素、萘啶酸、万古霉素以及甲氧苄氨嘧啶。β-内酰胺抗生素的例子包括氨苄青霉素、阿洛西林、氨曲南、羧苄青霉素、头孢哌酮、头孢曲松、头孢利定头孢噻啶、头孢菌素噻吩、，邻氯青霉素、拉氧头孢、青霉素G、哌拉西林和替卡西林。其它抗生素包括阳离子肽也适用于本发明。

本发明所采用的抗生素进一步包括含一种或多种抗菌剂或抗生素的组合物或治疗方法。例如，在本发明中可以采用系列(一者在另一者之后)或平行(同时或组合)施用的第一和第二抗生素，其也包括在抗生素含义中。在一个实施方式中，第一和第二抗生素的组合可以是，例如，青霉素和诸如庆大霉素、万古霉素等氨基糖苷类。在优选实施方式中，抗生素组合物至少包括两种相互不同的抗生素且每种抗生素优选来自不同的抗生素类型。

本领域技术人员容易明白的是，可以采用已知和将来开发的治疗方法来施用多聚氨基酸和/或抗生素组合物。该组合物可以制成制剂以便通过多各种施用途径来施用。在优选方式中，抗生素产品被制成适合于口服形式，其包括各种形成丸状或颗粒状这样的剂型，丸或颗粒随后被制成整体的药物产品，例如，胶囊或包埋在药片中或者悬浮在口服液中。

另外，在制备口服系统中，各种剂型的抗生素和多聚氨基酸产品可被制成药片，各自的药片都放入胶囊中以生产整体的抗生素产品。这样，例如，抗生素产品可以包括即释型的第一剂型形式，也可以包括至少一种用来延缓释放抗生素的其它药片，其中抗生素和多聚氨基酸在不同时间从各自的药片中释放出来，从而实现在期望的时间期限内从抗生素产品中释放出全部抗生素。对于缓释，根据现有技术可知，其可通过控制包被层中抗生素的浓度和/或包被层的厚度来控制释放时间。

在该方式中，抗生素部分和多聚氨基酸部分可以同时释放或者在不同时间释放。例如，分别地，快速释放(首先释放)的药片既可以是抗生素也可以是多聚氨基酸而缓慢释放(第二释放)的药片可以是多聚氨基酸或抗生素。此外，也可以包括缓释(第三并大量释放)的药片，其包含所需的抗生素和/或多聚氨基酸。这种释放系统类型允许执业医师决定首先释放抗生素还是多聚氨基酸。可选择地，可以把抗生素和多聚氨基酸组合在单一的药片中，或者也可以存在于各自的药片中却同时释放。

另外，多聚氨基酸或多聚氨基酸和抗生素的组合物也可以被设计成以药膏形式和消毒剂的其它外用形式来施用。例如，多聚氨基酸和抗生素的组合物被制成抗菌洗剂的形式效果特别好。在一个实施例中，外用施用方式可以采用至少两种不同的剂型，每种剂型各自包含抗生素和多聚氨基酸，并可以通过在水包油散剂或油包水散剂来制备用于外用施用方式的剂型。在该剂型中，即释剂型形式处在连续相中，而缓释剂型则存在于非连续相中。也可制成以施加多种剂型形式的配方。例如，可以制成油包水-水包油的散剂，其中包含即释成分的油是连续相的而包含第一缓释剂型的水则分散在油中。药膏可以是乳脂状或者乳液状或者类似于那些用于外用施用方法中的其它非溶解剂型。诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、修饰的纤维素或修饰的矿物质也可以通过液体状载体来形成易于涂敷的糊状物、胶状物、膏状物、皂状物等等，以便直接用在使用者的皮肤上。

也可以通过在合适的溶剂中加入所需量的活性化合物，并根据需要加入各种上面所列举的经过滤除菌后的其它成分，由此制备无菌注射液。如果需要制备用于制造无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其可以生产出活性成分粉末，该粉末还具有前述过滤除菌溶液所存在的任何所需成分。该溶液可以是抗生素和多聚氨基酸的组合物。可选择地，可以以一定的顺序单独施用抗生素和多聚氨基酸注射液。该溶液可选择性地包含抗生素和多聚氨基酸的微球或纳米微球，其中微球或纳米微球在体内以一定的速率溶出活性物质。

除了体内应用外，可被预计合适的多聚氨基酸也可和抗生素一起在体外条件下使用。例如，在食品工业中多聚氨基酸可以和抗生素一起应用以使食品保存更久更新鲜。在这种应用中，多聚氨基酸可以帮助抗生素抑制导致食品腐烂的细菌，由此延长保质期。又比如，多聚氨基酸可以用于血液、细胞或组织以使这些物质具有较少的细菌或没有细菌。在这种应用中，多聚氨基酸有助于抗生素抑制导致血液、细胞或组织受污染的细菌，由此延长血液、细胞或组织的有效使用期限。

多聚氨基酸和抗生素一起作用或者增强抗生素抗性的机制仍尚未完全理解，而且这种作用也不能推至所有的多聚氨基酸。人们认为多聚氨基酸通过影响外排泵(eflux pump)而起作用。此外，可以相信多聚氨基酸可以通过影响青霉素结合蛋白来起作用。优选的抗生素是那些通过这些机制之一起而作用的抗生素。然而，多聚氨基酸能够影响抗药性治疗以及提高抗生素功效的确切机制并不重要。

实施例

在本部分中引用数据和例子来阐述抗生素功效可以因施用多聚氨基酸或者含多聚氨基酸的组合物而得以加强。更特别地，参照下列非限制性实施例来对本发明作进一步阐述。

大体的材料和方法

实验性生长条件

各种细菌菌株，包括铜绿假单胞菌和大肠杆菌(E.coli)，在Luria-Bertani(LB)琼脂糖/肉汤或Mueller-Hinton(MH)琼脂糖/肉汤培养基中生长。生长曲线由各种化学物质、多聚氨基酸和/或抗生素存在的条件下细菌的生长状况所决定。接种细菌随即在空气和温度可控的培养箱中进行培养。每四个小时抽取等份试样并在600nm下检测光密度。抗生素、化学物质和/或多聚氨基酸被溶解在双蒸水或者溶剂中并在此后用0.4μm的一次性膜过滤。

致死时间分析

对各种细菌样品致死时间进行了分析。首先，使被测细菌在Mueller-Hinton培养基中生长至中间对数期。将细胞在室温下小心稀释到含有多聚氨基酸(例如精胺)的磷酸钠缓冲液中。作为对照组，细胞被稀释到不含任何其它化合物的磷酸钠中。以一定的时间间隔抽取等份试样并涂布在LB琼脂糖平板中并在37℃下培养过夜。确定存活的菌落相对于对照组的百分比。

最小抑制浓度(MIC)值

在Mueller-Hinton肉汤中采用标准琼脂二倍稀释法技术和肉汤稀释技术来确定经多聚氨基酸与抗生素所组成的各种组合物处理的菌株MIC值。未发现可视性混浊的最低药物浓度被确定为MIC。还采用抗生素扩散分析来对由琼脂稀释和肉汤稀释技术所得到的结果进行确证。

β-内酰胺酶分析

采用分光光度法对以头孢硝噻吩(nitrocefin)为基质的β-内酰胺酶活性作了确定。在将β-内酰胺酶从细胞中抽提出来后，采用20500的摩尔消光系数通过486nm下吸光度的改变来对β-内酰胺酶活性进行监测。水解程度是未受抑制的酶量的反映。

lacZ::ampC启动子融合物的构建和β-半乳糖苷酶分析

从例如铜绿假单胞菌PAO1等各种细菌中抽提基因组DNA并用于ampC(PA1110)启动子区域的PCR扩增，扩增引物对为5`-ggaagtcctccagccgcggcag-3`/5`-ggcgtcctttgtcgttggctgcatgagaaa-3`(500bps片段)。该500bps PCR片段经离心柱纯化并插入宽宿主范围转录融合载体，pQF50，其产生质粒pAU16R。所插入的DNA序列和位置通过核酸测序法来确定。

包含pAU16R的培养物在20mL含有或不含精胺(10mM和20mM)的MH肉汤培养基中被稀释100倍。培养物以350rpm在37℃下培养3h。往培养物中加入抗生素来诱导ampC基因，培养物在相同条件下额外培养一个小时。用离心法收集细胞，洗涤一次，并在磷酸缓冲液(pH7.0)中重悬。用8,000ib/in²的细胞破碎仪(French pressure)处理细胞来破坏细胞并制备可溶性细胞抽提物以测量μ-半乳糖苷酶活性。采用以牛血清白蛋白为标准的考马斯亮兰法(Brandford法)对蛋白质浓度进行测定。外部膜通透性分析

通过对染色体编码的β-内酰胺酶的释放进行检测来实现外部膜通透性分析。首先，将固定相细胞以1：59稀释到20mL预热的MMP肉汤培养基中并在培养箱中以350rpm在37℃下培养5h。在加入羧苄青霉素(20μg/mL)以对β-内酰胺酶进行诱导之后，该培养物再5h的额外培养。在5,000xg下离心10min收获细胞并用0.05mM pH7.2的磷酸钠缓冲液洗涤1次。该细胞球在5mL相同的缓冲液中进行重悬并分成1mL每等份试样。通过往每份试样中加入1、5、10、20mM EDTA、亚精胺、精胺以及精氨酸(作为对照)的方法来对外部膜通透性进行分析。该分析也可以通过往每等份试样中加入1、5、10、20μg/mL PMBN来进行。反应混合物在室温下培养5min，并立即全速离心(15000xg)20min，然后将上清液用作β-内酰胺酶的来源。按照如上所述采用300μL的上清液来确定β-内酰胺酶活性。

实施例1

组合使用多聚氨基酸和多种抗生素可以比单用抗生素更有效地对付铜绿假单胞菌细菌感染。这些结果表明多聚氨基酸与特定抗生素联合使用可以抑制细菌生长并具有协同增效作用，其中多聚氨基酸与特定抗生素的联合使用提高抗生素的功效。此外，这些结果表明可以选择特定多聚氨基酸的浓度来彻底抑制细菌抗性。

图1显示多聚氨基酸能够敏化铜绿假单胞菌的抗性菌株(P.aeurginosaPAO1)。总的来说，20mM亚精胺、腐胺、尸胺以及1mM的精胺能够使铜绿假单胞菌对14β-内酰胺类、氯霉素、萘啶酸以及甲氧苄氨嘧啶变得敏感。在各种多聚氨基酸(亚精胺、精胺、腐胺和尸胺)存在的情况下，对所有的β-内酰胺类抗生素、氯霉素、萘啶酸以及甲氧苄氨嘧啶的MIC值都明显降低(2-64倍)。在本实施例所使用的浓度下亚精胺和精胺比腐胺和尸胺有着更好的敏化作用。存在或不存在多聚氨基酸的情况下，对亲水性抗生素(红霉素、新生霉素以及梭链孢酸)的MIC值不变。另外，多聚氨基酸也可以使环丙沙星抗性菌株对羧苄青霉素、氯霉素和萘啶酸变得敏感。

由于具有很高MIC值的变异菌株在多聚氨基酸存在的情况下对抗生素变得敏感，该实施例显示可以通过联合使用诸如环丙沙星、β???-内酰胺类、氯霉素、萘啶酸以及甲氧苄氨嘧啶等抗生素和多聚氨基酸以便更有效地对付铜绿假单胞菌。

实施例2

较高浓度多聚氨基酸的添加可以进一步提高细菌敏化程度和抗生素功效。为了进一步检测多聚氨基酸对抗生素MIC值的影响，采用不同浓度的多聚氨基酸来确定对羧苄青霉素的MIC值。表1揭示了较高浓度的多聚氨基酸可以降低较高水平的MIC值。表中的MIC值被重复了3次且都得到相同值。所有的MIC结果，无论降低或不变，都经抗生素抑制带的检测。

表1.不同浓度多聚氨基酸的情况下铜绿假单胞菌PAO1对羧苄青霉素的MIC值

实施例3

铜绿假单胞菌(或临床分离菌)的抗性菌株通过抗生素和多聚氨基酸的多种组合而变得敏感。参考菌株铜绿假单胞菌PAO1对羧苄青霉素、氯霉素以及萘啶酸的MIC值都被证明与前述的相同。在多聚氨基酸存在的情况下，除了菌株T6268对羧苄青霉素外，临床分离菌对羧苄青霉素、萘啶酸的MIC值都比参考菌株PAO1要高得多。

尤其特别地，如图2所示，临床分离菌对羧苄青霉素、氯霉素以及萘啶酸的MIC值相比于不采用多聚氨基酸得到的值要低2-32倍。出乎意料之外的是，参考菌株PAO1对氯霉素的MIC值要比临床分离菌的MIC值高得多，高出的范围在4-16倍之间(图2)。在多聚氨基酸存在的情况下，临床分离菌对环丙沙星、庆大霉素和多粘菌素B的MIC值是差不多的或者高出4倍。该实施例证实了多聚氨基酸和抗生素的组合能够降低不同菌株的MIC值。

实施例4

多聚氨基酸和抗生素的组合使用能够敏化E.coli菌株和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuium)菌株。多种E.coli菌株(例如从europathogenic患者中分离到的K10、K12和C921-61)和鼠伤寒沙门氏菌LT2(S.typhimurium LT2)显示出对β-内酰胺类(氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林以及替卡西林)和7种其它抗生素(氯霉素、红霉素、梭链孢酸、卡那霉素、新生霉素、壮观霉素以及四环素)的敏感性增强。

如图3所示，在多聚氨基酸存在的情况下E.coli菌株和沙门氏菌(S.typhimurium)对多数β-内酰胺类抗生素的敏感性要比不使用多聚氨基酸的情况强4倍。类似地，在多聚氨基酸存在的情况下E.coli菌株(K10和K12)对多数其它抗生素的敏感性也会强4倍。基于此，该实施例显示多聚氨基酸和抗生素的组合能够降低不同细菌的MIC值。

实施例5

多聚氨基酸和抗生素的组合能够使抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)(MRSA)对β-内酰胺类变得敏感。MRSA临床分离菌，金黄色葡萄球菌Mu5，显示出对β-内酰胺类有较高的抗性，以及对万古霉素的中等抗性。尤其特别地，表2显示外源精胺(1mM以及更少)可以使金黄色葡萄球菌Mu50重新对β-内酰胺类变得敏感(例如，苯唑西林MIC值的降低超过100倍)。已知金黄色葡萄球菌Mu5会表达由mecA所编码的高水平青霉素结合蛋白2A，这是甲氧苯青霉素抗性产生的分子机制。由于糖肽抗生素类(例如万古霉素)被认为是MRSA的最后防线而万古霉素的临床使用则导致了万古霉素/甲氧苯青霉素双重抗性菌株的出现，该实施例表明多聚氨基酸和多种抗生素的组合能够对付这些超级抗性菌。

表2.精胺对抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)Mu50对抗生素敏感性的影响

实施例6

多聚氨基酸能够使细菌对人血清中的抗生素变得敏感。图4显示了人血清中多聚氨基酸介导的β-内酰胺类敏感性测试结果。单独存在于人血清中的多聚氨基酸能够在不存在任何外源性抗生素的情况下24h内杀死超过99％的两种E.coli菌株(K10和K12)；然而，铜绿假单胞菌PAO1和鼠伤寒沙门氏菌LT2在相同条件下仍旧生长良好(数据未示出)。

如图4所示，无论存在或不存在2mM精胺，人血清中铜绿假单胞菌PAO1的生长不会受到影响。另外，而往血清中单独加入16μg/mL的羧苄青霉素则导致了初始抑制，这种抑制会伴随着生长的完全恢复。然而，当和16μg/mL的羧苄青霉素一起加入2mM的精胺时，则超过99％的接种菌都在24h内被杀死。类似的结果也可以用鼠伤寒沙门氏菌LT2获得(数据未示出)。

这些人体血清阳性结果较好的支持了多聚氨基酸和抗生素组合会在人体中产生预期效果的结论。

实施例7

该实施例表明细胞多聚氨基酸不会改变外膜的通透性或者使细胞或外膜破裂。采用对游离细胞滤出液或全细胞中β-内酰胺酶活性进行测量来评估外膜细胞屏障是否会随着抗生素敏感性的升高而改变。如果用多粘菌素B进行处理，已经认识到阳离子肽抗生素会提高外膜的通透性，当往细胞悬浮液中施加100μg/mL的抗生素时能够检测到明显的全细胞β???-内酰胺酶活性。

图5显示当往细胞悬浮液中施加100μg/mL的抗生素时，经多粘菌素B处理的细胞会表现出显著的全细胞β-内酰胺酶活性。图6显示在加入0.5mM EDTA后可以检测到由于外膜破裂而导致的周质β-内酰胺酶(periplasmic β-lactamase)释放入悬液中，并且从整细胞中所测的活性可以证明在加入1mM EDTA之后释放的酶增加了，且外部膜的通透性也随之增大了。图7表明在加入20mM亚精胺或者精胺(数据未示出)之后仅检测到低水平的β-内酰胺酶活性。这些结果表明多聚氨基酸很有可能不是通过破裂细胞外膜或通过改变外膜通透性来发挥作用的。

实施例8

多聚氨基酸介导的抗生素敏感性不会受到二价离子或者盐的影响。由于之前的研究已经表明二价离子或盐的生理浓度会对某些类型抗生素的抗菌敏感性产生影响，对不同浓度二价离子或盐作用下的多聚氨基酸和抗生素组合物进行了测定。

如表3所示，二价离子或盐浓度的升高不会对基于多聚氨基酸的细菌敏感性造成显著的影响。例如，该实施例表明在10mM亚精胺存在的情况下，精胺和亚精胺的组合物仍保持其活性。二价离子或盐浓度的升高不会对10mM亚精胺存在情况下的羧苄青霉素敏感性产生显著影响。类似的结果也可以在铜绿假单胞菌，沙门氏菌，伤寒沙门氏菌以及抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌Mu50(MRSA)上观测到。

表3.氯化镁、氯化钙和氯化钠对E.coli K10对羧苄青霉素敏感性的影响

实施例9

多聚氨基酸和多种抗生素的组合物提高了对多种E.coli的抗性菌株的功效。如图8所示，多聚氨基酸提高了多种E.coli抗性菌株对多种抗生素的敏感性。如图8所示，随着外源性多聚氨基酸的加入MIC值减小了3倍。

实施例10

多聚氨基酸和多种抗生素的组合物提高了对鼠伤寒沙门氏菌抗性菌株的功效。在该实施例中，多聚氨基酸提高了鼠伤寒沙门氏菌抗性菌株对多种抗生素的抗菌敏感性。如表4所示，MIC值减小了3倍。

表4.多聚氨基酸对鼠伤寒沙门氏菌LT2抗生素敏感性的影响

实施例11

多聚氨基酸和多种抗生素的组合提高了对金黄色葡萄球菌700699抗性菌株的功效。在该实施例中，多聚氨基酸增强了金黄色葡萄球菌700699对多种抗生素的抗菌敏感性。如表5所示，MIC值减小了3倍。

表5.多聚氨基酸对MRSA金黄色葡萄球菌700699对抗生素敏感性的影响

对前述优选实施方式的具体描述和附图仅是出于阐述性和说明目而并非穷尽性的，也不是用来限制本发明的范围和精神。对实施方式的选择和描述是为了最大限度地解释发明的原理及其实际应用。本领域技术人员能够认识到可以在不脱离本发明范围和精神的情况下对说明书所述的发明实施多种变型。

Claims (27)

1、一种用于提高抗生素在受治疗者中的功效的方法，其包括如下步骤：

a)对受治疗者施用至少一种多聚氨基酸；并

b)对该受治疗者施用至少一种抗生素。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述至少一种多聚氨基酸组合的所述至少一种抗生素的功效比单独的所述至少一种抗生素的功效要好。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过对受治疗者施用所述至少一种多聚氨基酸，从而减少用于抑制受治疗者细菌感染所需的所述至少一种抗生素的量。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素是亲水性的。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素是β-内酰胺。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素选自由青霉素、头孢菌素、单胺菌素，及其组合物所构成的组。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸包括天然生成的多聚氨基酸。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸选自由尸胺、腐胺、亚精胺、精胺、去甲亚精胺以及去甲精胺、及其组合物所构成的组。

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸包括经化学修饰的天然生成的多聚氨基酸。

10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸包括源自腐胺的多聚氨基酸。

11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素和所述至少一种多聚氨基酸组合使用具有比单独使用所述至少一种抗生素时对付细菌抗性的功效要好。

12、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在使用所述至少一种抗生素之前施用所述至少一种多聚氨基酸。

13、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在施加所述至少一种抗生素的之后再施用所述至少一种多聚氨基酸。

14、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，把所述至少一种抗生素和所述至少一种多聚氨基酸一起施用于受治疗者。

15、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素包括多种抗菌剂。

16、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸是天然产生的多聚氨基酸的人工类似物。

17、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗生素以口服剂型服用。

18、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸以口服剂型服用。

19、一种用于处理细菌的发明的组合物包括：

a)至少一种多聚氨基酸；

b)至少一种抗生素；以及

c)药物学上可接受的载体。

20、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸源自腐胺。

21、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种多聚氨基酸选自一组物质，该组包括：β-内酰胺抗生素、氨基糖胺类、大环内酯类、单胺菌素、利福霉素类、四环素类、氯霉素、氯林可霉素、林可霉素、亚胺培南、梭链孢酸、新生霉素、磷霉素、梭链孢酸钠、新霉素、多粘菌素、卷曲霉素、粘菌素甲烷磺酸盐、粘菌素、短杆菌肽、二甲胺四环素、强力霉素、万古霉素、杆菌肽、卡那霉素、萘啶酸以及甲氧苄氨嘧啶。

22、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素是亲水性的。

23、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素是β-内酰胺。

24、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素包括不同抗生素的组合。

25、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素包括不同类型的抗生素的组合。

26、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素通过影响细菌的外排泵来作用于细菌。

27、根据权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述至少一种抗生素会对青霉素结合蛋白产生作用。

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