CN101407786A - 一种立体增殖软骨细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种立体增殖软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：先将单层培养软骨细胞消化后加入海藻酸钠－氯化钠溶液中混合；再用吸尖将得到的混合液滴于氯化钙溶液中成凝胶；最后将得到的凝胶依次用氯化钠溶液和完全培养基洗，再在复合DMEM/HamF12培养基上培养。复合DMEM/HamF12培养基包括10ng/ml碱性成纤维生长因子、5μg/ml透明质酸、0.2μg/ml纤维连接蛋白，50μg/ml可溶性壳聚糖和1∶1的DMEM/HamF12。本发明的培养方法能在短时间内提高培养细胞的数量和质量，快速增殖软骨细胞，可长期培养并能保存细胞表型。

Description

一种立体增殖软骨细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其是涉及一种立体增殖软骨细胞的培养方法。

背景技术

软骨细胞组织工程种子细胞的来源受到了限制，体外单层贴壁培养时易出现去分化，反分化的潜能将逐渐消失，使软骨细胞逐渐改变形态、丧失表型及相关基因的表达，不能产生软骨特有的糖胺多糖和II型胶原，而产生I型和III型胶原，植入体内后主要形成纤维软骨，不能维持生物力学性能。

关节软骨损伤的修复与其组织结构特点及损伤的方式有关，而修复的持久性以及良好的负重关节面的维持则有赖于愈合组织的质量，但实际上修复常不完善，使损伤的关节面后期发生退行性改变。

表浅损伤的修复愈合依赖于关节软骨细胞的代谢活动，但其精确重建结构的能力有限，即使关节软骨细胞能够合成蛋白多糖和胶原分子，并能释放外基质，这些新合成的分子并未相互结合形成络合物，因此构建的结构并不完美，愈合组织的功能也较差。关节软骨缺损后，软骨细胞由于其部位的血管较少，难以再生或修复极为缓慢，限制了其修复的能力，后期易造成退行性关节炎。

组织工程为关节软骨缺损修复的临床提供了新的思路与途径。软骨组织工程的基本路线是在体外培养种子细胞，并以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性降解性的合适支架上，从而形成细胞-支架复合物，并将复合物植入生物体内组织缺损部位最终完成组织的修复和再造。但种子细胞、合适支架材料以及合适的体外培养系统还尚待明确。

体外软骨细胞单层培养到5代，易出现去分化，形态、细胞外基质分泌功能下降及表型改变，难以长期培养。目前解决的主要方法是骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成软骨细胞、短时间快速增殖并在合适的载体中立体培养。

1998年发现在海藻酸珠中软骨细胞的表型能保持较长时间，而且在70天里DNA、蛋白多糖(PG)的含量保持较高。把转移生长因子-1(TGF-1)加入软骨细胞的海藻酸珠中，使m-RNA表达增加400％，前胶原基因表达上调180％。1999年Lindenhayn发现单纯用海藻酸钠珠培养软骨细胞，其细胞数稍有增高，在海藻酸钠中加入透明质酸，其细胞数3天可以增加100％，而在这基础上加入纤维连接蛋白，其细胞数1天就可以增加100％。2000年Chubinskaya等教授研究较多的海藻酸珠用于保存软骨细胞存活可达8个月，同年国外学者徐虎等用单纯海藻酸制备凝胶，用藻酸钙/软骨细胞复合物用于动物体内4周时可见新生毛细血管和软骨陷窝形成，说明软骨细胞复合于藻酸钙可在异体动物体内生长增殖。也有学者以藻酸钙为载体作为可注射软骨，用于软骨组织工程的研究。但细胞在载体中增殖的量还不够。

在单纯的海藻酸珠中软骨细胞的表型能保持较长时间，但增殖的数量不够，单纯加入TGF-1生长因子，短时间使用容易失活，长时间使用易带来尚未确定的致瘤机会，虽然Lindenhayn的方法简单可行，细胞数目增殖较快，但细胞载体支架缺乏微动力，适当的调节可使之更接近体内细胞微环境。

发明内容

本发明的主要目的是为了解决上述技术问题，达到短期快速增殖软骨细胞，并且长期培养能保存细胞表型的目的，本发明提供了一种立体增殖软骨细胞的培养方法。

为了实现该目的，采用如下的技术方案：

一种立体增殖软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：

(1)将单层培养软骨细胞消化后加入海藻酸钠-氯化钠溶液中混合；

(2)用吸尖将步骤(1)得到的混合液滴于氯化钙(CaCl₂)溶液中，成凝胶；

(3)将步骤(2)得到的凝胶依次用氯化钠(NaCl)溶液和完全培养基洗，再在复合DMEM/HamF12培养基上培养。

其中，所述复合DMEM/HamF12培养基包括10ng/ml碱性成纤维生长因子、5μg/ml透明质酸、0.2μg/ml纤维连接蛋白，50μg/ml可溶性壳聚糖和1∶1的DMEM/HamF12。

优选的，步骤(1)中的单层培养软骨细胞的浓度为1-6×10⁵/mL。

优选的，步骤(1)中的海藻酸钠的浓度为12g/L。

优选的，步骤(1)中的NaCl溶液的浓度为0.15mol/L。

优选的，步骤(2)中的CaCl₂溶液的浓度为102mmol/L。

优选的，步骤(2)中成凝胶的条件为37℃，5％CO₂，10min。

优选的，步骤(3)中的NaCl溶液的浓度为0.15mol/L。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的立体增殖软骨细胞的培养方法能在短时间内提高培养细胞的数量和质量，快速增殖软骨细胞，长期培养能保存细胞表型。

采用复合载体有以下优点：1.表面积/体积(S/V)大，因而单位体积培养液的细胞产率高，2.采用均匀的悬浮培养，把悬浮培养和贴壁培养结合一起，兼有两者优点，3.可用简单普通显微镜观察复合载体的细胞生长，4.培养基利用率高，5.与原代细胞分离相比，细胞收获过程简单。

本发明采用多因素实验设计方案，正交试验设计(Orthogonal experimentaldesign)是研究多因素多水平的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。用该法设计实验后建立海藻酸钠胶体立体培养软骨细胞体系，并能在短时间内提高数量和质量，因为平面培养最大问题是易发生去分化，细胞瓶长满细胞后易发生接触抑制，海藻酸钠胶体立体培养把平面培养立体化，胶体有微压力环境，细胞形态接近体内，大量增殖形成同源细胞团，其外围扩大，减少了接触抑制；选用的几种细胞外基质相关因素是模拟细胞生长内环境，有利于细胞生长。

模拟细胞体内微环境，选择了海藻酸钠作为细胞支架，适合细胞生长的外基质材料，用正交试验设计建立了复合DMEM/HamF12的体外培养，经正交试验及重复试验、验证试验，确定了各因素的有效浓度及配比方案，在复合DMEM/F12培养基的海藻酸钠载体支架中培养软骨细胞能快速增殖，细胞数48h就增殖3倍多，蕃红-O(Safranine O)进行氨基葡聚糖(GAG)染色显示传至P9仍然产生大量蛋白聚糖基质。乳酸脱氢酶(LDH)检测未见毒副作用。该复合载体具有良好的成形性和组织相容性。用于BMSCs诱导的软骨细胞也取得同样效果。

附图说明

图1是兔软骨细胞的海藻酸钠复合载体的形态的一个优选实施例的观察图片；

图2是用倒置显微镜观察7天软骨细胞聚集生长状态的一个优选实施例的图片；

图3是用相差显微镜镜观察7天单个细胞状态的一个优选实施例的图片；

图4是用激光共聚焦显微镜观察单层细胞状态的一个优选实施例的图片；

图5是用激光共聚焦显微镜多重光切并重组三维观察复合载体的软骨细胞同源细胞团在立体培养中的状态的一个优选实施例的图片；

图6是蕃红-O进行细胞外基质糖胺多糖染色的一个优选实施例的图片。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行说明。

实施例一：兔软骨细胞的分离和培养

无菌取4～5周龄的新西兰大白兔(广东省医学实验动物中心)膝关节软骨。以解剖刀切成1mm³左右的小碎片，分别用透明质酸酶，胰蛋白酶，II型胶原酶消化关节软骨碎片，获得软骨细胞悬液。25cm³培养瓶接种软骨细胞，加入含体积百分比为10％胎牛血清的DMEM/Ham′s F12培养液，置37℃，体积百分比为5％CO₂培养箱培养，待细胞贴壁后隔天换液，当软骨细胞铺满平瓶底后用质量百分比为0.02％EDTA冲洗，质量百分比为0.25％胰酶消化，离心收集软骨细胞，用以传代或实验。

实施例二：复合载体组分的选择

在96孔板中种植细胞数为5×10⁴/mL软骨细胞，分别加入系列质量浓度bFGF(0、1、5、10、50、100ng/mL)、透明质酸(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，纤维连接蛋白(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL)，可溶性壳聚糖(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)，用XTT_460nm比色法测定分析细胞数目的增殖情况，观察单一成分对细胞软骨的影响。

实施例三：复合载体的制备

单层培养细胞2×10⁵/mL加入12g/L海藻酸钠-0.15mol/L NaCl，将混合液用吸尖(50μL/滴)，滴于102mmol/L CaCl₂，37℃，5％CO₂培养箱10min，在一定温度下成凝胶，用0.15mol/L NaCl洗3次，完全培养基(CCM)洗1次，10-15ml在复合F12/DMEM培养基培养，定期观察。

复合载体形态学观察结果：兔软骨细胞的海藻酸钠复合载体形态观察大体观察：载体直径约5mm，圆形，乳白色，半透明，有弹性，在培养基中悬浮生长，见图1；倒置显微镜下7d可见软骨细胞聚集生长，自成集落，见图2；相差显微镜镜7d可见单个细胞圆形，胞核清晰，胞膜完整，见图3；激光共聚焦显微镜观察：单层细胞用复合培养基培养，Acridine orange(AO)染色，细胞生长旺盛，细胞呈梭形状，核DNA呈亮绿色，而胞浆RNA呈橘红色，可见集落和核分裂相，见图4；复合载体的软骨细胞在立体培养中呈圆形或多角形，用激光共聚焦显微镜多重光切并重组3D观察，可见细胞分裂增殖，30d形成同源细胞团，见图5。

实施例四：两种因素对软骨细胞影响

以bFGF为主因素的系列浓度(0、1、5、10、50、100ng/mL)分别与透明质酸(100μg/mL)，纤维连接蛋白(0.1μg/mL)，可溶性壳聚糖(100μg/mL)作用于5×10⁴/mL软骨细胞进行比较，选取最佳协同点，排除负协同点。用XTT_460nm比色法测定分析细胞数目的增殖情况，观察细胞对两种材料的反应。

实施例五：正交试验的设计

选择bFGF，透明质酸(Hyaluronic)，纤维连接蛋白(Fibronectin)，可溶性壳聚糖(Chitosan)4个因素，每个因素3个水平，根据SPSS 13.0软件设计，Oryhogonal Design 3-Way交互作用分析，因素水平见表1，表1为正交试验的设计因素水平表，共做81次实验。经初步筛选后从中优选24组设A、B、C、D组合数据重复检测。正交试验设计结果分析见表2。

表1

表2

△与对照组(12，24组)比较，有统计学意义，F＝36.35 P＝0.000

△△结果与对照组比较细胞数48h增加2倍以上

根据SPSS 13.0软件设计，Oryhogonal Design 3-Way交互作用分析，根据81组实验交互结果平均值，优选重复24组，包括2组对照组。有18组结果与对照组比较有统计学意义，呈正向增殖，F＝36.36，P＜0.01，其中有6组优选结果与对照组比较细胞数48h增加2倍以上，见表2。

实施例六：验证试验

验证分四组，10ng/ml bFGF；5μg/ml Hyaluronic；10ng/ml bFGF+5μg/mlHyaluronic；10ng/ml bFGF+5μg/ml Hyaluronic+0.2μg/ml Fibronectin+50μg/ml Chitosan，各组以不加干预因素的软骨细胞为对照组，分别加入96孔板中，与5×10⁴/ml软骨细胞混合培养，4个复孔，验证细胞经正交试验优选的组分在同一条件下对单一和复合材料的反应，用XTT_460nm比色法测定分析细胞的增殖。再用复合载体承载细胞，放在用正交试验验证的复合培养液培养48h时间后，用解珠液(55mmol/L柠檬酸钠，0.15mmol/LNaCl)溶解胶体行细胞计数。统计学分析结果见表3。

表3

△与对照组(0)比较有统计学意义，P＜0.01

A：bFGF(ng/mL)F＝14.968，P＜0.005

B：bFGF(ng/mL)+Fibronectin 0.12μg/mL F＝31.267，P＜0.005

C：bFGF(ng/mL)+Hyaluronic 50μg/mL F＝43.300，P＜0.005

D：bFGF(ng/mL)+Chitosan 50μg/mL F＝33.935，P＜0.005

表3为bFGF为主因素的系列浓度分别与纤维连接蛋白，透明质酸和可溶性壳聚糖对软骨细胞的影响结果。根据SPSS13.0设计4因素3-Way全交互作用分析表；以bFGF为主因素的系列浓度与三种因素的相互作用，用ANOVAOne-way统计学分析；因素间的协同分析用多因素析因分析。bFGF分别与其他3种因素结合作用于软骨细胞都有促细胞增殖的作用，ANOVA统计学分析，P＜0.05，bFGF起主因素作用，见表3。

验证试验：细胞在同一条件下对单一和复合材料软骨细胞增殖的影响。检测在同一条件下单一和复合材料对软骨细胞增殖的影响，采用多因素析因分析，提示bFGF与透明质酸有共协同作用，bFGF能促进软骨细胞的生长，透明质酸对软骨细胞没有影响。bFGF(10ng/ml)联合透明质酸(50～100μg/ml)应用对软骨细胞增殖的作用大于单用bFGF(10ng/ml)，bFGF和HA交互作用有统计学意义(P＜0.01)，bFGF处于不同水平时(50-500ng/ml)，HA(10-50μg/ml)因素的作用是不同的，两药共同使用效果更好，有协同作用。同时用4种因素以最适比例配制复合培养液，细胞数48h就增殖3倍多，见表4。表4为复合因素对软骨细胞增殖的协同分析数据。

表4

△与对照组比较，有统计学意义，F＝1142.91 P＜0.005

实施例七：软骨细胞功能测定

用上述培养基培养软骨细胞，分别取第5、7、9代细胞爬片，采用SafranineO进行细胞外基质糖胺多糖染色，可见细胞合成分泌的糖胺多糖堆积在细胞周围基质中并染成红色，显示有大量蛋白聚糖基质产生，第九代仍有集落产生，见图6。

在DMEM/HAM`F12复合培养基的海藻酸钠载体中，模拟细胞体内微环境，选择了1.2％海藻酸钠作为细胞支架，适合细胞生长的外基质材料，用正交试验设计建立了复合DMEM/HamF12的体外培养，包括10ng/ml bFGF、5μg/ml Hyaluronic、0.2μg/ml Fibronectin(美国Sigma公司)，50μg/ml可溶性Chitosan，(上海奇胜生物有限公司)DMEM/HamF12 1∶1(美国Gibco公司)等主要成分，经正交试验及重复试验、验证试验，确定了各因素的有效浓度及配比方案，在复合DMEM/F₁₂培养基的海藻酸钠载体支架中培养软骨细胞能快速增殖，细胞数48h就增殖3倍多，Safranine O GAG染色显示传至P9仍然产生大量蛋白聚糖基质。LDH检测未见毒副作用。该复合载体具有良好的成形性和组织相容性。快速增殖并有利于维持软骨细胞表型及功能的表达。用于MSCs诱导的软骨细胞也取得同样效果。

实施例八：本发明的一个优选方案与K.Lindenhayn法细胞增殖数量比较

K.Lindenhayn是单纯用1.2％海藻酸钠珠培养软骨细胞，其细胞数稍有增高，在海藻酸钠中加入0.35％透明质酸，其细胞数3天可以增加100％，而在这基础上加入1.25％纤维连接蛋白，其细胞数1天就可以增加100％。

本方案用1.2％海藻酸钠，混合细胞悬液后加入102mmol/LCaCl₂制成胶体，再用以DMEM/F12 1∶1作为基础培养基，加入新鲜配置的10ng/ml碱性成纤维生长因子，5μg/ml透明质酸，0.2μg/ml纤维连接蛋白，50μg/ml可溶性壳聚糖，同法培养。最重要的是利用了碱性成纤维生长因子与透明质酸的共协同作用，加上纤维连接蛋白几乎与所有类型的胶原分子都能进行结合，但与软骨细胞分泌的II胶原分子之间具有更高的亲和力，促使细胞增殖数48h就增殖3倍多。

K.Lindenhayn法配制是1.2％海藻酸钠过程中，用102mmol/LCaCl₂交联液中，用55NIH维蛋白酶元+46IU/ml凝血酶经15-20min孵育生成纤维蛋白，使纤维蛋白包含在材料支架中，本方案直接用纯品纤维连接蛋白，可溶于水，对细胞作用效果明显。

K.Lindenhayn法的材料支架中是以1.2％海藻酸钠为主交联而成，生物力学不够，本方案是加入可溶性壳聚糖加以改善。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1、一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将单层培养软骨细胞消化后加入海藻酸钠-氯化钠溶液中混合；

(2)用吸尖将步骤(1)得到的混合液滴于氯化钙溶液中，成凝胶；

(3)将步骤(2)得到的凝胶依次用氯化钠溶液和完全培养基洗，再在复合DMEM/HamF12培养基上培养；

其中，所述复合DMEM/HamF12培养基包括10ng/ml碱性成纤维生长因子、5μg/ml透明质酸、0.2μg/ml纤维连接蛋白，50μg/ml可溶性壳聚糖和1∶1的DMEM/HamF12。

2、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的单层培养软骨细胞的浓度为1～6×10⁵/mL。

3、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的海藻酸钠的浓度为12g/L。

4、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的氯化钠的浓度为0.15mol/L。

5、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的氯化钙的浓度为102mmol/L。

6、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中成凝胶的条件为37℃，5％CO₂，10min。

7、如权利要求1所述的一种立体增殖软骨细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的氯化钠的浓度为0.15mol/L。

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