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CN101389345A - 治疗黑素瘤的组合方法和组合物 - Google Patents

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CN101389345A
CN101389345A CNA2005800088191A CN200580008819A CN101389345A CN 101389345 A CN101389345 A CN 101389345A CN A2005800088191 A CNA2005800088191 A CN A2005800088191A CN 200580008819 A CN200580008819 A CN 200580008819A CN 101389345 A CN101389345 A CN 101389345A
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sirna
raf
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melanoma
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加文·P.·罗伯逊
马克·凯斯特
拉克什曼·桑迪拉塞加雷恩
阿拉蒂·夏尔马
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Penn State Research Foundation
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Abstract

本发明提供了未普遍用于治疗黑素瘤的组合靶向治疗与选择的化疗一种合理方法。本发明基于本发明人揭示了在黑素瘤中Akt3调节凋亡及V599EB－Raf调节生长和血管发生。本发明人首先认识到治疗黑素瘤的有效组合的靶向治疗。在一个实施方案中，本发明提供了一种通过降低Akt3活性而诱导黑素瘤肿瘤细胞中凋亡的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种诱导黑素瘤肿瘤细胞中凋亡的方法，包括将黑素瘤肿瘤细胞与降低Akt3活性的物质接触。因此，所述方法可以恢复对黑素瘤肿瘤细胞的正常凋亡敏感，从而可以给予低浓度的化疗剂从而对患者的毒性降低。本发明人揭示了一种治疗哺乳动物黑素瘤的方法，包括给予黑素瘤有效量的物质以诱导凋亡；给予黑素瘤有效量的物质以降低血管发生和细胞增殖。本发明还揭示了一种治疗哺乳动物黑素瘤的方法，包括给予哺乳动物黑素瘤有效量的降低Akt3活性的物质；给予哺乳动物黑素瘤有效量的降低V599EB－Raf活性的物质，从而治疗黑素瘤。另一方面，本发明提供了一种药物组合物以治疗黑素瘤，所述药物组合物包含降低Akt3活性的物质和载体。

Description

治疗黑素瘤的组合方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求申请日为2004年3月19日的临时申请系列号60/554,509的优先权，所述申请全文并入本文作参考。
资助
本申请由Foreman黑素瘤研究基金会和美国癌症协会提供支持(RSG-04-053-01-GMC)。
发明背景
在三种主要的皮肤癌症中，恶性黑素瘤由于转移而具有最高的死亡危险(Schalick et al.，Blackwell Science，Inc.Malden，MA 180-348(1998)；Jemal et al.，J.Nat.Cancer Inst.93:678-683(2001)；和Jemalet al.，Ca：a Cancer Journal for Clinicians 52:23-47(2002))。这种疾病晚期的患者的预后非常差，平均存活时间为6—10个月(Jemal et al.，Ca:A Cancer Journal for Clinicians 52:23-47(2002)；和Soengas et al.，Oncogen 22:3138-3151(2003))。目前尽管有许多测试从手术至免疫治疗、放疗和化疗等各种治疗方法效力的临床实验，但还没有有效的长期治疗这一癌症的晚期患者的方法(Soengas et al.，Oncogen22:3138-3151(2003)；Serrone et al.，Melanoma Res 9:51-58(1999)；Grossman et al.，Cancer Metastasis Rev 20:3-11(2001)；Helmbach et al.，Int J Cancer 93:617-622(2001)；Ballo et al.，Surgical Clinics North Am83:323-342(2003)；及Hersey，P.，Int Med J 33:33-43(2003))。缺少有效的治疗方案部分是由于缺少关于在黑素瘤发育期间发生改变的主要基因及特异性靶向校正这些缺陷的治疗方法的信息(Serrone et al.，JExp Clin Cancer Res 19:21-34(2000)；及Atkins et al.，Nature Rev.DrugDis 1:491-492(2002))。
患有转移性(IV期)恶性黑素瘤的患者的平均存活时间为大约1年(Balch et al.，1993；Koh，1991)。目前标准的治疗方法包括用一些药剂如顺铂、DTIC和BCNU组合化疗，并且伴有或不伴有细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)或者干扰素-α(IFN-α)(Balch et al.，1993；Koh，1991；Legha和Buzaid，1993)。据报道对化疗的应答率高如60％，但是无论治疗方案如何，只有5％的患者长期存活。常规的化疗是通过靶向快速生长的细胞而控制癌症的生长。然而，这一功能不是特异性的，因为许多正常细胞如骨髓细胞和肠上皮细胞也具有基础增殖水平。因此，机体的许多正常细胞也受到化疗的毒性作用的影响，常规的化疗可导致患者一定程度的发病率。显然，需要提供治疗转移的黑素瘤的新方法。
Akt蛋白激酶家族由三个成员组成：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ，它们呈现高度的结构相似性(Brazil et al.，Cell 111:293-303(2002)；及Nicholson et al.，Cell Signal 14:381-395(2002))。家族成员彼此呈现广泛的结构相似性，在氨基酸水平呈现高于80％的同源性(Nicholson KM，Anderson NG.Cell Signal.14(5):381-95(2002)，DattaSR et al.Genes Dev.13(22):2905-27(1999))。所有Akt同种型均呈现主要的结构特征，具有三个独特的功能域(Testa JR，Bellacosa.A.ProcNatl Acad Sci USA.98(20):10983-5(2001)，Nicholson KM，AndersonNG.Cell Signal.14(5):381-95(2002)，Scheid MP，Woodgett JR.Nat RevMol Cell Biol.2(10):760-8(2001)，Scheid MP，Woodgett JR.FEBS Lett.546(1):108-12(2003)，Bellacosa A et al.Cancer Biol Ther.3(3):268-75.Epub 2004(2004)，Brazil DP et al.Trends Biochem Sci.29(5):233-42(2004)，Brazil，D.P.et al.Cell 111:293-303(2002)，Brazil DP，Hemmings BA.Trends Biochem Sci.26(11):657-64(2001)，Datta SR etal.Genes Dev.13(22):2905-27(1999))。一个是氨基末端普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性结构域(PH)，其介导蛋白质—蛋白质和蛋白质—脂质之间的相互作用。这个结构域由大约100个氨基酸组成，类似其它信号传导分子中的三个磷酸肌醇结合结构域(Lietzke SE et al.MolCell.6(2):385-94(2000)，Ferguson KM et al.Mol Cell.6(2):373-84(2000))。第二个功能域是羧基末端激酶催化区，其介导底物蛋白的磷酸化。其示出与蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)中的那些结构域的高度相似性(Jones PF et al.Cell Regul.2(12):1001-9(1991)，Andjelkovic M，Jones PF，Grossniklaus U，Cron P，Schier AF，Dick M，Bilbe G，Hemmings BA.Developmental regulation of expression andactivity of multiple forms of the Drosophila RAC protein kinase.J BiolChem.270(8):4066-75(1995))。第三个功能域是具有重要调节作用的尾部区。这个区域有时称作尾或者调节结构域。在后两个区域中有丝氨酸和苏氨酸残基，其磷酸化是Akt激活所必需的。这些位点根据特定的Akt同种型而略有不同。在所有三个同种型上的第一个位点是分别在Akt1/2/3上的第308/309/305氨基酸位的苏氨酸。第二个位点是分别在Akt1/2/3的第473/474/472氨基酸位的疏水性C末端尾部内存在的丝氨酸。应答生长因子或者其它胞外刺激物而发生的这两个位点的磷酸化是最大程度激活Akt所必需的(Alessi DR，Andjelkovic M，Caudwell B，Cron P，Morrice N，Cohen P，Hemmings BA.Mechanismof activation of protein kinase B by insulin and IGF-1.EMBO J.15(23):6541-51(1996))。Akt也可以在其它残基磷酸化；然而这种磷酸化的功能意义有待持续研究(Alessi DR，Andjelkovic M，CaudwellB，Cron P，Morrice N，Cohen P，Hemmings BA.Mechanism of activationof protein kinase B by insulin and IGF-1.EMBO J.15(23):6541-51(1996))。同样，尽管已经鉴别了缺少第472位丝氨酸磷酸化位点的Akt3剪接变体，但是这个变体的细胞学作用还不清楚(Brodbeck D，Hill MM，Hemmings BA.J Biol Chem.276(31):29550-8.Epub 2001(2001))。这个变体在黑素瘤细胞中是否存在或者起何种作用也未知。
虽然所有同种型均可以在特定细胞类型中表达，但是只有某些同种型可以是活性的。另外看起来每个同种型可以在细胞中发挥独特和共同的功能(Brazil et al.，Cell 111:293-303(2002)；and Nicholson et al.，Cell Signal 14:381-395(2002)；Chen et al.，Genes Dev 15:2203-2208(2001)；及Cho et al.，Science 292:1728-1731(2001))。缺少Akt1的敲除小鼠生长延迟并且在睾丸和胸腺中自发凋亡的比率增加(Chen etal.，Genes Dev 15:2203-2208(2001)；Cho et al.，J Biol Chem 276：38349-38352(2001)；Peng et al.，Genes Dev 17:1352-1365(2003))。相反，Akt2敲除小鼠具有被削弱的胰岛素调节功能，由此由于胰岛素对肝脏和骨骼肌的作用的缺乏而导致降低血糖水平的能力不足(Choet al.，Science 292:1728-1731(2001)；Peng et al.，Genes Dev 17：1352-1365(2003))。目前还没有描述与Akt3敲除小鼠相关的表型的公开报道，因此关于Akt3的特异性功能或者其对于人类癌症的作用还了解的很少。
增加Akt1或Akt2表达的基因扩增已经在胃癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌中报道(Staal，S.P.，Proc Nat Acad Sciences USA 84：5034-5037(1987)；Cheng et al.，Proc Nat Acad Sciences USA 89：9267-9271(1992)；Cheng et al.，Proc Nat Acad Sciences USA 93：3636-3641(1996)；Lu et al.，Chung-Hua I Hsueh Tsa Chih[ChineseMedical Journal]75:679-682(1995)；Bellacosa et al.，Int J Cancer 64：280-285(1995)；及van Dekken et al.，Cancer Res 59:749-752(1999))。虽然在黑素瘤中未鉴别Akt的激活突变(Waldmann et al.，ArchDermatol Res 293:368-372(2001)；Waldmann et al.，Melanoma Res12:45-50(2002))，但是由(用P13K抑制剂Wortmarmin或者LY-294002)靶向P13K而阻断总Akt功能抑制细胞增殖并降低黑素瘤细胞对UV辐射的敏感性(Krasilnikov et al.，Mol Carcinogenesis 24:64-69(1999))。总的Akt活性也已经使用免疫组织化学方法在黑素瘤中测定，从而证实全部磷酸化的Akt的水平在严重的发育异常痣和转移的黑素瘤中与在正常或者中等发育异常的痣中相比是增加的(Dhawan et al.，Cancer Res 62:7335-7342(2002))。然而，在黑素瘤中各个Akt同种型发挥的作用及导致特定Akt同种型的失调的机制还未知。最近发现磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt信号传导途径在黑素瘤肿瘤发生中起关键作用(Stahl et al.，Cancer Res63:2891-2897(2003))。发现通过丧失PTEN磷酸酶(P13K/Akt信号传导的负调节物)而失调的Akt活性降低黑素瘤细胞的凋亡能力并从而调节黑素瘤肿瘤发生(Stahl et al.，CancerRes63:2891-2897(2003))。
Raf蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶家族由三个成员组成：A-Raf，B-Raf和C-Raf(Mercer et al.，Biochim Biophys Acta 1653:25-40(2003))。Raf家族成员在MAPK(Ras/Raf/MAPK激酶(MEK)/胞外信号调节的激酶(ERK)途径中是中间分子，这个途径是通过有序的一系列连续磷酸化事件将胞外信号从细胞膜传递至细胞核的信号转导途径(Mercer etal.，Biochim Biophys Acta 1653:25-40(2003)，Smalley.Int J Cancer104:527-32(2003))。典型地，胞外配体与其酪氨酸激酶受体结合，导致Ras激活和一系列磷酸化事件的开始(Mercer et al.，BiochimBiophys Acta 1653:25-40(2003)，Smalley.Int J Cancer 104：527-32(2003))。激活的Ras导致Raf的磷酸化和激活，接着磷酸化和激活MEK1和MEK2。MEK激酶接着磷酸化和激活ERK1和ERK2(Chong et al，Cell Signal 15:163-69(2003))，其磷酸化一些胞质和细胞核靶位，最后导致在细胞生长和存活中起重要作用的蛋白质的表达(Chang et al.，Int J Oncol 22:469-80(2003))。
导致B-Raf激活的突变在大多数散发黑素瘤中发现，在黑素瘤中主要是B-RAF是最突变的基因，突变率范围为60—90％(Davies etal.，Nature 417:949-54(2002)；Pollock et al.，Nat Genet 33:19-20(2003)；Brose et al.，Cancer Res 62:6997-7000(2002)；及Yazdi et al.，J Invest Dermatol 121:1160-62(2003))。大多数B-RAF突变是作为使第1796位核苷酸的T转变为A的单碱基错义取代的结果而发生，这样外显子15中密码子599的缬氨酸被取代为谷氨酸(V599E)(Davies etal.，Nature 417:949-54(2002))。这种突变增加了B-Raf的基础激酶活性，导致MAPK途径的超反应性，这可通过下游激酶MEK和ERK的水平组成型增加而表明(Davies et al.，Nature 417:949-54(2002))。B-RAF突变是获得性的、体细胞性的、合子后(post-zygotic)事件，在家族遗传的黑素瘤中未被鉴别(Lang et al.，Hum Mutat 21:327-30(2003)；Laud et al.，Cancer Res 63:3061-65(2003)；Meyer et al.，Int J Cancer106:78-80(2003))。
RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA实现的多核苷酸序列特异性的、转录后基因沉默机制，其导致特异性信使RNA(mRNA)降解，从而降低该mRNA编码的希望的靶多肽表达(见例如WO99/32619，WO01/75164，美国专利No.6506559，Fire et al.，Nature391:806-11(1998)；Sharp，Genes Dev.13:139-41(1999)；Elbashir et al.，Nature 411:494-98(2001)；Harborth et al.，J.Cell Sci.114:4557-65(2001))。RNAi是由双链多核苷酸介导的，所述双链多核苷酸如下文所描述，例如是具有相应于编码其表达被损害的多肽部分的外显子序列的序列的双链RNA(dsRNA)。据报道RNAi不由与内含子或者启动子序列具有序列相同性的双链RNA多核苷酸实现(Elbashir et al.，2001)。RNAi途径在果蝇和线虫(Caenorhabditis elegans)中已经充分鉴定，但是在高等真核动物如哺乳动物(包括人)中干扰特异性多肽表达的“小干扰RNA”(siRNA)多核苷酸也已经被考虑(例如，Tuschl，2001 Chem biochem.2:239-245；Sharp，2001 Genes Dev.15:485；Bernstein et al.，2001 RNA7:1509；Zamore，2002 Science296:1265；Plaster，2002 Science 296:1263；Zamore 2001 Nat.Struct.Biol.8:746；Matzke et al.，2001 Science 293:1080；Scadden et al.，2001 EMBORep.2:1107所述)。
根据目前的非限制性模型，RNAi途径是通过长dsRNA的ATP-依赖性进行性裂解成被称作小干扰RNA(siRNA)的长度为大约18—27(例如19、20、21、22、23、24、25、26等)个核苷酸碱基对的双链片段而启动的(参见Hutvagner et al.，Curr.Opin.Gen.Dev.12:225-32(2002)；Elbashir et al.，2001；Nyknen et al.，Cell107:309-21(2001)；Bass，Cell 101:235-38(2000))；Zamore et al.，Cell101:25-33(2000))。在果蝇中，称作“Dicer”的酶将较长的双链RNA切割成siRNA；Dicer属于dsRNA特异性核酸内切酶的RNaseIII家族(WO01/68836；Bernstein et al.，Nature 409:363-66(2001))。另外根据这个非限制性模型，siRNA双链被掺入到蛋白质复合物中，随后是ATP依赖性解旋siRNA，由此产生活性的RNA诱导的沉默复合物(RISC)(WO01/68836)。该复合物识别并切割与siRNA导链互补的靶RNA，因此干扰特异性蛋白质的表达(Hutvagner et al.，如前)。
在线虫和果蝇中，RNAi可以通过长的双链RNA多核苷酸介导(WO99/32619；WO01/75164；Fire et al.，1998；Clemens et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6499-6503(2000)；Kisielow et al.，Biochem.J.363:1-5(2002)；也见于WO01/92513(在酵母中RNAi介导的沉默)所述)。然而在哺乳动物细胞中，用长dsRNA多核苷酸(即大于30bp)转染导致非特异性序列应答激活，其全局阻断蛋白质合成并导致mRNA降解(Bass，Nature 411:428-29(2001))。用长度为大约18—27个核苷酸碱基对的双链RNA转染人及其它哺乳动物细胞以序列特异性方式干扰由含有相应核苷酸序列的信使RNA(mRNA)编码的特定多肽的表达(WO 01/75164；Elbashir et al.，2001；Elbashir et al.，GenesDev.15:188-200(2001))；Harborth et al.，J.Cell Sci.114:4557-65(2001)；Carthew et al.，Curr.Opin.Cell Biol.13:244-48(2001)；Mailand et al.，Nature CellBiol.Advance Online Publication(Mar.18，2002)；Mailand etal.2002 Nature Cell Biol.4:317)。
siRNA多核苷酸在序列特异性改变或者调节基因表达以产生变化水平的所编码的多肽产物中的应用中优于本领域已知的其它多核苷酸。这些优势包括相对于这些其它多核苷酸(例如反义核酶或者三链体多核苷酸)的降低的siRNA多核苷酸有效浓度、增强的siRNA多核苷酸稳定性及较短的siRNA多核苷酸长度。简而言之，“反义”多核苷酸以序列特异性方式结合靶核酸如mRNA或者DNA，以防止DNA转录或者mRNA翻译(见例如美国专利No.5,168,053；美国专利No.5,190,931；美国专利No.5,135,917；美国专利No.5,087,617；也见例如Clusel et al.，1993 Nucl.Acids Res.21:3405-11，其描述了“哑铃形”反义寡核苷酸)。“核酶”多核苷酸可靶向任何RNA转录物并且能催化裂解这些转录物，因此削弱mRNA的翻译(见例如美国专利No.5,272,262；美国专利No.5,144,019；及美国专利Nos.5,168,053，5,180,818，5,116,742和5,093,246；U.S.2002/193579)。“三链体”DNA分子是指单链DNA结合双链DNA形成的一种线性三链体分子，从而防止转录(见例如美国专利No.5,176,996，其描述了制备结合双链体DNA上的靶位点的合成寡核苷酸的方法)。这种三链体结构是不稳定的，并且仅在生理条件下短暂形成。因为单链多核苷酸不易于扩散进细胞中并因此易于被核酸酶消化，因此开发用于反义或者三链体技术的单链DNA通常需要化学修饰核苷酸以改良稳定性和被细胞吸收的能力。相反，siRNA易于被完整的细胞吸收，在低于反义或者核酶多核苷酸所需要的浓度几个数量级的浓度即可有效干扰特异性多肽的表达，并且不需要使用化学修饰的核苷酸。
恶性黑素瘤是一种皮肤癌，最主要发生在男性，由于发生转移而具有死亡的高度危险。发生率和死亡率逐年持续上升，目前还没有有效的长期治疗方法。这种情况部分反映出缺少关键基因的鉴别及靶向这些缺陷的特异性治疗。因此，本领域需要鉴别所涉及的关键基因及靶向纠正这些缺陷的特异性治疗方法及靶向降低被鉴别为PI3K/Akt和MEK/ERK信号传导途径中起关键作用的基因。鉴别作为选择性靶的基因为黑素瘤患者提供了新的治疗机会。
因此，本发明的主要目的、特征或者优势是改良现有技术状态。
本发明的另一目的、特征或者优势是提供降低癌细胞中Akt3活性、从而使癌细胞恢复正常凋亡敏感性的方法。
本发明的另一目的、特征或者优势是提供一种用降低Akt3活性的药剂诱导癌细胞中凋亡的方法。
本发明的另一目的、特征或者优势是提供一种治疗黑素瘤的组合方法，其通过使黑素瘤肿瘤细胞恢复正常凋亡敏感性、降低黑素瘤肿瘤细胞的增殖和生长以及抑制黑素瘤肿瘤细胞的血管形成而进行治疗。
本发明的另一目的、特征或者优势是提供一种治疗黑素瘤的方法，该方法与常规方法相比更有效地缩小肿瘤大小。
本发明的另一目的、特征或者优势是提供一种治疗黑素瘤的方法，该方法使用较低浓度的化疗剂，从而降低对患者的毒性。
这些及其它目的、特征或者优势通过如下本发明的描述将显而易见。
发明简述
本发明提供了一种将靶向治疗方法与选择的化疗剂进行组合的合理基础，其目前未用于治疗黑素瘤。本发明基于本发明人的如下发现：Akt3调节凋亡以及V599E B-Raf调节黑素瘤中的生长和血管发育。本发明人首先提出了用于治疗黑素瘤的有效组合靶向治疗。在一个实施方案中，本发明提供了一种通过降低Akt3活性在黑素瘤肿瘤细胞中诱导凋亡的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种在黑素瘤肿瘤细胞中诱导凋亡的方法，包括将黑素瘤肿瘤细胞与降低Akt3活性的药剂接触。因此，所提供的方法使黑素瘤肿瘤细胞恢复正常的凋亡敏感性，从而使得可以给予较低浓度的化疗剂，由此对患者的毒性降低。
本发明人提供了一种治疗哺乳动物黑素瘤肿瘤的方法，包括：将有效量的药剂给予黑素瘤肿瘤以诱导凋亡；将有效量的药剂给予黑素瘤肿瘤以降低血管发生和细胞增殖。
本发明还揭示了一种治疗哺乳动物中的黑素瘤的方法，包括：将有效量的降低Akt3活性的药剂给予哺乳动物中的黑素瘤肿瘤；将有效量的降低V599E B-Raf活性的药剂给予哺乳动物中的黑素瘤肿瘤，从而治疗黑素瘤肿瘤。
另一方面，本发明提供了一种治疗黑素瘤肿瘤的药物组合物，其包含一种降低Akt3活性的药剂及一种载体。
本发明的这些及其它实施方案通过参考如下详细描述将显而易见。本文示出的所有参考文献均以全文并入参考。
附图简述
图1示出了关于Akt3参与恶性黑素瘤的鉴别。A：黑素瘤细胞系UACC 903中Akt活性由PTEN调节。Western印迹分析示出磷酸化的Akt、总Akt、PTEN及α-烯醇化酶(加样对照)的表达。36A、29A和37A细胞系是从表达PTEN的UACC 903亲代细胞系中产生的遗传相关细胞系。衍生自36A细胞系的致瘤性回复体细胞系被认为是同基因的，仅在PTEN表达方面不同。黑素细胞被用作为正常细胞对照。图形表示来自3个独立的Western印迹的密度计量扫描以定量证实每个细胞系中磷酸化的Akt相对于总Akt的水平；条杆，±SEM；统计学，One-Way ANOVA，随后为相对于黑素细胞对照的Dunnet′s多重比较(Multiple Comparisons)，*P<0.5。B：针对每个Akt同种型的siRNA证实在UACC 903细胞系中每个异位表达的Akt同种型敲弱(knockdown)的特异性。表达标记的HA-Akt1、HA-Akt2或者HA-Akt3的构建体与特异于Akt1、Akt2或者Akt3的siRNA一起共核转染(co-nucleofect)进UACC 903细胞中。对照是未被核转染或者仅用载体核转染的细胞。Western印迹用HA的抗体探查以检测异位表达的蛋白质以及作为加样对照的a-烯醇化酶。C：siRNA介导的Akt3的敲弱而非Akt2或者Akt2的敲弱在黑素瘤细胞系UACC 903、WM1 15和SK-MEL-24中改变磷酸化Akt(活性)的水平。Western印迹分析示出在用50(左侧)或者100pmole(右侧)各自的siRNA转染后，磷酸化的Akt、Akt3、Akt2及α-烯醇化酶的表达。对照是未被核转染或者用混杂的siRNA核转染的细胞。数据是最少2个独立实验的代表。这些实验的加样对照是α-烯醇化酶。D：当UACC903(PTEN)致瘤模型中存在PTEN蛋白质时，磷酸化的Akt3减少。Akt3和Akt2从UACC 903(PTEN)致瘤模型的细胞系中免疫沉淀，通过用识别磷酸化Akt的抗体进行Western印迹而分析。表达PTEN的36A、29A和37A细胞系衍生自缺少PTEN蛋白的UACC 903亲代细胞系。两种致瘤性回复体细胞系衍生自36A细胞系中并且不再表达PTEN。图中示出了阴性抗原对照及Akt3和Akt2阳性和阴性对照。Akt3和Akt2的对照分别是未处理的(阳性)或者经LY-294002处理的(阴性)HEK298T或者LNCaP细胞，LY-294002是P13K的抑制剂。E.在UACC 903(PTEN)致瘤模型中Akt3活性在存在PTEN条件下降低。免疫沉淀的Akt3用于体外激酶分析，其中Crosstide被Akt3磷酸化以评估活性。图中示出在减去无抗原对照之后的活性；条杆，±SEM；统计学，One-Way ANOVA，随后为相对于黑素细胞对照的Dunnet′s多重比较，*P<0.05。
图2示出在黑素瘤肿瘤进展期间发生增加的Akt3表达和活性。A：在黑素瘤肿瘤进展模型中放射状生长期期间发生磷酸化(活性)Akt水平增加。Western印迹比较了黑素细胞中的磷酸化Akt的量与从处于放射生长期(WM35和WM3211)和垂直生长期(WM115、WM98.1和WM278)的原发肿瘤中建立的低代次黑素瘤细胞系中的磷酸化Akt的量。总Akt作为对照示出。B：在黑素瘤肿瘤进展模型中Akt3与Akt2表达比较。Western印迹示出Akt3和Akt2及作为加样对照的α-烯醇化酶的表达水平。C：与Akt2相比，Akt3在黑素瘤肿瘤进展模型的细胞系中优先被激活。将Akt3或者Akt2从每个细胞系中免疫沉淀并进行Western印迹分析以测定免疫沉淀物中磷酸化Akt的量。D：与黑素细胞相比，Akt3在人类患者的转移的黑素瘤中优先过表达。从衍生自31个肿瘤的转移的黑素瘤中测定Akt3和Akt2表达。将Akt3和Akt2表达根据α-烯醇化酶表达归化。该图定量比较了每个肿瘤与黑素细胞中Akt3或者Akt2的表达水平。条杆代表3个独立Western印迹的密度计量扫描的平均值。条杆，±SEM。数值上方代表比在黑素细胞中发生的表达增加的倍数；只有相差≥2倍的差异被认为是显著的。E：与在黑素细胞中相比，Akt3而非Akt2的表达和活性在黑素瘤患者的肿瘤中增加。活性通过免疫沉淀Akt3和Akt2，随后通过Western印迹分析而确定，Western印迹分析使用识别磷酸化Akt的抗体进行以确定其中可以检测到磷酸化(活性)Akt3或者Akt2的肿瘤的百分比；统计学，t-检验，*P<0.05。
图3示出在恶性黑素瘤中失调的Akt3活性的机制。A：降低的PTEN表达(活性)在黑素细胞中特异性增加Akt3活性。B：放射生长期的WM35(放射生长期)细胞。图中示出了siRNA介导的PTEN的降低，单独siRNA(对照)或者与混杂的siRNA或者针对Akt1、Akt2或者Akt3的siRNA组合。Western印迹分析示出磷酸化的Akt、Akt3、Akt2及PTEN的表达。α-烯醇化酶作为加样对照。C.在人黑素细胞中Akt3的过表达增加磷酸化Akt的水平。野生型Akt3、失活的Akt3(无活性)或者肉豆蔻酰化的Akt3(活性)被核转染进黑素细胞中。Akt2的类似构建体作为对照(数据未示出)。Akt磷酸化(活性)通过Western印迹分析测定磷酸化的Akt的水平而测定。箭头(arrowhead)指示内源激活的Akt3的位置，箭号(arrow)指示异位表达的活性的HA标记的Akt3。
图4示出增加的Akt3活性通过降低凋亡率而促进黑素瘤肿瘤发育。A：PTEN-介导的Akt3活性降低抑制黑素瘤肿瘤发育。在注射进裸鼠10天后，测定亲代UACC 903黑素瘤细胞、同基因36A(保留PATEN)和回复体细胞系(缺少PTEN)形成的肿瘤的大小。数值是每个细胞系三只小鼠中最少6个注射部位的平均值，条杆，±SEM；统计学，One-Way ANOVA，随后为相对于UACC 903的Dunnet′s多重比较，*P<0.05。B：siRNA介导的Akt3减量调节降低UACC 903黑素瘤细胞的致瘤潜力。将针对Akt3、Akt2和Akt1的siRNA核转染进UACC 903细胞中，48小时后将细胞注射进裸鼠中。10天后测定肿瘤的大小。对照是仅用缓冲液或者混杂的siRNA核转染的UACC 903细胞。数值是每个细胞系三只小鼠中最少6个注射部位的平均值；条杆，±SEM；统计学，One-Way ANOVA，随后为针对UACC903的Dunnet′s多重比较，*P<0.05。C：D：E：F：PTEN或者siRNA介导的Akt3降低使在裸鼠中生长的肿瘤凋亡增加。对衍生自表达PTEN(36A)的或者用siAkt3和siAkt2的siRNA核转染的UACC903细胞的肿瘤块中TUNEL阳性细胞的量化(C，D)和照片(E，F)。条杆，±SEM；统计学，Kruskal-Wallis，随后为相对于UACC 903的Dunnet′s多重比较，*P<0.05。在将细胞注射进裸鼠中4天后，分析肿瘤；放大倍率，200X。对照是UACC 903细胞或者仅用缓冲液核转染的UACC 903细胞。白色核表示经历凋亡的细胞。
图5示出脂质体单独对黑素瘤细胞无毒的实证。加入各种浓度的脂质体均不降低存活细胞的数目。事实上，它们在所有浓度在48小时均增加细胞的存活力。方法：脂质体的毒性在1205Lu中在加入6.25、12.5、25和50μM浓度的脂质体之后24、48和72小时使用MTS分析评估。
图6示出黑素瘤细胞易于吸收脂质体的实证。方法：将标记的脂质体(绿色)加入在培养基中生长的AUCC 903黑素瘤细胞中。图中示出细胞核在左侧(用DAPI复染)，已经吸收标记的脂质体的细胞在右侧；放大倍率，40X。大约99％的细胞吸收脂质体。
图7示出黑素瘤细胞吸收的脂质体的量化。方法：将标记的脂质体或者含有标记的siRNA的脂质体以20nM浓度加入在培养基中生长的细胞中。1小时后，将细胞用5％多聚甲醛固定，用DAPI复染，计算吸收标记的产物的细胞百分比。
图8示出脂质体的大小一致性和大小分布。方法：左侧，扫描电子显微图示出脂质体的一致大小。右侧，通过光散射分析确定的脂质体大小分布。图中示出了脂质体的大小范围，平均大小为70—80nm。
图9示出脂质体将siRNA集合输送至黑素瘤细胞的实证。方法：将红色和绿色标记的siRNA加入在培养基中生长的黑素瘤细胞中。在吸收1小时后，将细胞在4％多聚甲醛中固定并用DAPI复染。左侧示出由红色siRNA和绿色siRNA染成蓝色的细胞核。最后一栏是拼接图像，放大倍率：40X。
图10示出在1205Lu黑素瘤细胞中Stealth siRNA敲弱的蛋白质表达的持续时间的实证。方法：由Invitrogen的Stealth siRNA所致的对蛋白质的敲弱的持续时间经确定为超过8天。将siRNA通过核转染转移进1205Lu黑素瘤细胞系中。间隔2天对B-Raf蛋白质水平进行Western印迹分析测定，直至第8天。抗C-Raf的siRNA作为对照。除了降低B-Raf表达之外，信号传导途径下游的pErk 1′/2活性也被降低8天时间。Erk-2作为蛋白质加样对照。
图11示出在脂质体介导的将siRNA输送至黑素瘤细胞中之后，蛋白质表达被敲弱的实证。靶向突变体B-Raf的siRNA脂质体复合物在200nM浓度可以敲弱50％的蛋白质表达。这表示一基线，更高的浓度将增加敲弱。方法：将siRNA脂质体复合物以100或200nM浓度加入细胞中。72小时后收集裂解物并通过Western印迹分析。
图12示出siRNA介导的突变体V599EB-Raf的降低在黑素瘤中降低下游MEK和ERK的活性。在黑素瘤细胞系UACC 903(A)、1205Lu(B)和C8161(C)中核转染之后24和48小时SiRNA介导的B-Raf和C-Raf的敲弱降低各自蛋白质的水平。混杂的siRNA用作对照，而核纤层蛋白A/C siRNA用作UACC 903细胞的额外对照。只有针对B-Raf的siRNA降低含有突变体V599EB-Raf的UACC 903和1205LU细胞中B-Raf下游的活性(磷酸化)MEK和ERK的水平。ERK2用作加样对照。
图13示出黑素瘤肿瘤发育被V599EB-Raf而非C-RAF的siRNA或者混杂的siRNA抑制。在核转染进在培养基中生长的UACC 903(A)和1205Lu(B)细胞系中之后，siRNA介导的B-Raf蛋白质的敲弱持续6—8天。观察到磷酸化ERK1/ERK2水平相应降低(B)。ERK2作为加样对照。siRNA介导的B-Raf降低导致UACC 903(C)和1205Lu(D)细胞的致瘤潜力下降。将针对B-Raf、C-Raf的siRNA和混杂的siRNA导入UAC 903或者1205Lu细胞中(白色箭头)，36小时后将细胞注射进裸鼠中(黑色箭头)。以2天间隔测定肿瘤大小。siRNA介导的B-Raf的减量调节降低了UACC 903和1205Lu黑素瘤细胞的致瘤潜力。对照细胞用缓冲液单独、混杂的siRNA或者针对C-Raf的siRNA核转染。数值是两个单独实验的6只小鼠中最少12个注射部位的平均值。条杆，±SE。
图14示出使用BAY 43-9005对B-Raf活性的药理学抑制可抑制黑素瘤肿瘤发育。A：BAY 43-9006既抑制野生型也抑制突变体V599EB-Raf活性。将HA标记的野生型或者突变体V599EB-Raf在暴露于5μmol/L BAY 43-9006或者DMSO载体的HEK293T细胞中表达。HA表明异位表达的B-Raf蛋白质。MAPK途径的激活或者抑制通过比较pMEK和pERK的水平确定，ERK2作为加样对照。B：BAY43-9006在含有突变体V599EB-Raf的UACC 903黑素瘤细胞中以剂量应答方式降低pMEK和PERK(活性)水平。经Western印迹分析随着增加浓度的BAY 43-9006，UACC 903细胞中pMEK和PERK水平的降低。加样对照是ERK2。C：用BAY 43-9006对小鼠预处理抑制黑素瘤肿瘤的发育。在注射5×108个UACC 903细胞之前4天，将小鼠每2天经腹膜内注射50mg/kg BAY 43-9006或者DMSO载体而进行预处理两次(箭头所指)。间隔2天示出肿瘤大小直至第22天。条杆，±SE。D：降低的肿瘤细胞增殖伴随siRNA-介导的黑素瘤肿瘤发育的抑制。在siRNA介导的B-Raf而非C-Raf或者混杂的siRNA抑制后，在溴脱氧尿苷阳性细胞中发生5—8倍的降低。*P<0.05。各栏：每个肿瘤4—6个视野计数的6个不同肿瘤的平均值；条杆，±SE。
图15示出使用BAY 43-9006抑制B-Raf活性可抑制黑素瘤肿瘤发育。图中示出了BAY 43-9006处理对UACC 903(A)和1205Lu(B)肿瘤发育的作用。将UACC 903和1205Lu细胞注射进裸鼠中，使肿瘤发育至第6天，此时每2天经腹膜内注射溶解于DMSO中的BAY43-9006(箭头所指)。对照条件是仅用DMSO处理。Raf激酶抑制剂BAY 43-9006在≥50mg/kg浓度降低含有突变体V599EB-Raf蛋白的黑素瘤细胞的致瘤潜力。C：在用BAY 43-9006处理后的那些细胞中观察到磷酸化(活性)ERK的量降低，而用载体处理的则否。对用50mg/kg BAY 43-9006(于DMSO中)或者只用DMSO载体处理的UACC 903肿瘤切片中pERK阳性细胞的数目进行免疫组织化学比较。在载体对照和BAY 43-9006处理的细胞之间检测到3倍的差异(D)。*.P<0.05。各栏：每个肿瘤4—6个视野计数的6个不同肿瘤的平均值；条杆，±SE。
图16示出在黑素瘤肿瘤中经药理学或者siRNA介导的突变体V599EB-Raf抑制后，黑素瘤肿瘤发育受到抑制的机制。图中示出了暴露于BAY 43-9006或者载体(DMSO)的时空匹配的肿瘤的血管发生(A)、凋亡(B)和增殖率(C)的比较。比较平行发育的大小和时间匹配的肿瘤，以鉴别B-Raf抑制对肿瘤发育的作用。在用BAY 43-9006对UACC 903肿瘤进行处理后，首先观察到血管发育方面的差异是显著差异(*，P<0.05)，随后观察到增加的凋亡(*，P<0.05)和降低的细胞增殖(*；P<0.05)。各栏：两个独立实验的平均值，每个实验4—6个视野的6个肿瘤被分析；条杆，±SE。
图17示出siRNA和药理学抑制V599EB-Raf降低黑素瘤细胞分泌VEGF。VEGF分泌是在用B-Raf或者VEGF siRNA(A)核转染后或者用增加浓度的BAY 43-9006(B)处理后，通过ELISA试验从在培养基中生长的UACC 903或者1205Lu细胞中测定。C-Raf和混杂的siRNA作为对照。条杆：±SD。图中示出了降低的VEGF表达对UACC 903(C)和1205Lu(D)肿瘤发育的作用。以2天间隔示出肿瘤大小直至第17.5天。VEGF表达降低以在V599EB-Raf表达降低后出现的方式抑制黑素瘤肿瘤发育。各点：6个不同肿瘤的平均值；条杆，±SE。
图18示出导致在黑素瘤中优先激活的Akt3区域。激活以磷酸化的水平测定，较黑的条带表示较高的活性。较靠下的条带表示内源Akt活性。将Akt3的结构域转换为Akt2的结构域，将含有这些嵌合构建体的构建体核转染进黑素瘤细胞系WM35中。肉豆蔻酰化的Akt3和Akt2作为阳性对照。无活性的Akt3(T305A/S472A)和Akt2(T309A/S474A)作为阴性对照。野生型Akt3的转移导致活性增加，而野生型Akt2不导致活性增加。其中来自Akt3的普列克底物蛋白同源性(PH)结构域(第1—110位氨基酸)被转换为来自Akt2的相应结构域的构建体被用于鉴别导致在黑素瘤细胞中激活的Akt3的区域。注意只有含有Akt3的催化和调节(C/R)结构域(第111—497位氨基酸)的构建体才导致激活。这样示出了第111—497位氨基酸区域对于人黑素瘤中Akt3的激活是关键的区域。这是特异性防止黑素瘤中Akt3激活的治疗性靶向关键的部位。方法：通过转换普列克底物蛋白同源性(PH)结构域(第1—110位氨基酸)和催化结构域(对于Akt3为第111—479位氨基酸，对于Akt2为第111—481位氨基酸)而制备HA标记的野生型构建体和嵌合构建体PH-Akt3-C/R-Akt2及PH-Akt2-C/R-Akt3。使用Amaxa NHEM-NEO核转染试剂将构建体核转染进WM35黑素瘤细胞系中，48小时后，通过Western印迹经Akt的ser-473的抗体探查进行分析。
优选的实施方案的详细描述
本发明部分涉及如下发现：Akt3是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并且在黑素瘤存活中起作用，由此使得黑素瘤肿瘤细胞对凋亡有抗性。使用了一种反映Akt在黑素瘤肿瘤生成中的重要性的黑素瘤模型鉴别Akt3是在黑素瘤肿瘤生成期间失调的主要同种型。如本文所证实的，Akt3而非Akt1或者Akt2的选择性敲弱降低总磷酸化Akt的水平，并且降低黑素瘤细胞的致瘤潜力。因此，Akt3提供了黑素瘤癌的治疗靶位。
本发明还部分涉及如下发现：V599E B-Raf在黑素瘤生长和增殖中起作用。现已发现B-Raf表达的抑制或者降低可以降低肿瘤细胞增殖和新血管形成(血管发生)。应注意由于错误的序列数据，在B-Raf中缬氨酸(V)被取代为谷氨酸(E)实际上相应于NCBI基因库登记号NT_007914所示的正确版本中的密码子600和第1799位核苷酸(非第1796位)(Kumar et al.，Clinical Cancer Research，9:3362-3368(2003))。然而，在本申请中，由于历史和熟知的原因，我们还是使用了不正确的核苷酸和密码子编号。
本发明人提出了治疗肿瘤细胞的组合治疗方法，包括诱导凋亡和降低细胞增殖和血管发生。在一个实施方案中，凋亡是通过降低Akt3活性和细胞增殖而诱导的，血管发生是通过降低V599E B-Raf活性而降低的。本发明人还提出了在肿瘤细胞中降低Akt3活性可降低肿瘤细胞尤其是黑素瘤细胞的凋亡阈值，使得可以应用比常规治疗剂量低得多的化疗剂剂量。因此，患者得以接受更有效的治疗及较少的毒性化疗药物的副作用。
为了帮助理解本说明书和权利要求书，提供了如下定义。
定义
如本文所用，术语“siRNA”是指：(i)双链RNA寡核苷酸或者多核苷酸，即长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个碱基对，并且能干扰Akt3多肽或者Akt3多肽的变体的表达和活性，其中siRNA的一个单链包含编码Akt3多肽、其变体的RNA多核苷酸序列的一部分或者其互补序列；(ii)单链寡核苷酸或多核苷酸，其长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个核苷酸，并且能干扰靶Akt3多肽或者Akt3多肽的变体的表达和/或活性，或者与互补序列退火而产生能干扰靶多肽表达的dsRNA，其中这种单链寡核苷酸包含编码PTP-1B多肽、其变体的RNA多核苷酸序列的一部分或者其互补序列；或者(iii)上述(i)或者(ii)任一的寡核苷酸或者多核苷酸，其中这种寡核苷酸或者多核苷酸中具有1、2、3或者4个核酸改变或者取代。
本文所用术语“核酸”或者“多核苷酸”是指含有嘌呤和嘧啶的任何长度的聚合物，可以是聚核糖核苷酸或者聚脱氧核糖核苷酸或者混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。这包括单链和双链的分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过碱基与氨基酸主链的缀合形成的“蛋白质核酸(PNA)”。这还包括含有修饰的碱基的核酸。
“基因”是指编码多肽的核苷酸的装配，包括cDNA和基因组DNA核酸。
“载体”是指将核酸转移至宿主细胞中的任何工具。载体可以是一种复制子，该复制子可附着另一个DNA节段以复制该附着的节段的复制子。“复制子”是在体内具有自发DNA复制单位功能的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即能在其自身控制下复制。术语“载体”包括将核酸于体外、离体(ex vivo)或者体内导入细胞中的病毒性和非病毒性工具。病毒载体包括反转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒和腺病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、脂质体、带电的脂质(cytofectins)、DNA-蛋白质复合物及双聚合物。除了核酸之外，载体也可以含有一或多个调节区域和/或用于选择、测定和监测核酸转移结果(转移至哪些组织、表达持续时间等等)的选择标记。
“盒”是指可以插入载体的特异性限制位点中的DNA节段。该DNA节段编码感兴趣的多肽，所述盒和限制位点设计为保证所述盒插入正确的读框中以进行转录和翻译。
当外源或异源的DNA被导入细胞内部时，则该细胞被这种DNA“转染”。当转染的DNA使得表型改变时，则该细胞被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可以整合(共价连接)进染色体DNA中，组成细胞的基因组。
“核酸分子”是指单链形式或者双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或者胞苷；“RNA分子”)或者脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或者脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或者其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯。双链的DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋形式是可能的。术语核酸分子、特别是DNA或者RNA分子，只是指该分子的初级和二级结构，不限制其于任何特定的三级形式。因此，这一术语包括在线性或者环形DNA分子(例如限制片段)、质粒和染色体中发现的双链DNA。在论述特定的双链DNA分子的结构时，序列是根据惯例以沿着DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向描述的。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。
本发明涵盖从黑素瘤中分离编码本发明的人Akt3蛋白或多肽的基因，包括Akt3的全长或者天然发生的形式及其任何人Akt3特异性抗原片段。如本文所用，“Akt3”是指Akt3多肽，“akt3”是指编码Akt3多肽的基因。
术语“Akt3”是指Akt3核酸(DNA和RNA)、蛋白质(或者多肽)、其多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物，它们具有(i)与如下登记号的核苷酸序列有相当大的核苷酸序列同源性：登记号AJ245709(Homo sapiens mRNA，编码丝氨酸/苏氨酸激酶Akt-3(Akt3基因)gi|5804885|emb|AJ245709.1|HSA245709[5804885])；登记号AF135794(Homo sapiens AKT3蛋白激酶mRNA，complete cdsgi|4574743|gb|AF135794.1|AF135794[4574743])；登记号NM_005465(Homo sapiens v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3(蛋白激酶B，γ)(AKT3)，转录变体1，mRNA gi|32307164|ref|NM_005465.3|[32307164])；登记号NM_181690(Homo sapiens v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3(蛋白激酶B，γ)(AKT3)，转录变体2，mRNAgi|32307162|ref|NM_181690.1|[32307162])；登记号AY005799(Homosapiens蛋白激酶B γ1(AKT3)mRNA，complete cds，可变剪接的gi|15072339|gb|AY005799.1|[15072339])；登记号AF124141(Homosapiens蛋白激酶Bγ mRNA，complete cdsgi|4757578|gb|AF124141.1|AF124141[4757578])；或者(ii)与如下登记号的编码氨基酸序列相当大的序列同源性：登记号CAB53537(Akt-3蛋白[Homo sapiens]gi|5804886|emb|CAB53537.1|[5804886])；登记号AAD24196(AKT3蛋白激酶[Homo sapiens]gi|4574744|gb|AAD24196.1|AF135794_1[4574744])；登记号AAF91073(蛋白激酶Bγ1[Homo sapiens]gi|15072340|gb|AAF91073.1|[15072340])；登记号AAD29089(蛋白激酶Bγ[Homo sapiens]gi|4757579|gb|AAD29089.1|AF124141_1[4757579])；登记号NP_005456(v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3同种型1；蛋白激酶Bγ，RAC-γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，Akt-3[Homo sapiens]gi|488549|ref|NP_005456.1|[4885549])；登记号NP_859029(v-akt鼠胸腺瘤病毒致癌基因同系物3同种型2；蛋白激酶Bγ；RAC-γ丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，Akt-3[Homo sapiens]gi|32307163|ref|NP_859029.1|[32307163])。
术语“B-Raf”是指B-Raf核酸(DNA和RNA)、蛋白质(或者多肽)、其多态性变体、等位基因、突变体和种间同系物，它们具有(i)与在Genbank(NM_004333)中发现的B-Raf的核苷酸序列Homosapiens v-raf鼠肉瘤病毒致癌基因同系物B1(BRAF)，mRNA，gi|33188458|ref|NM_00433.2|[33188458]相当大的核苷酸序列同源性。B-Raf的相关蛋白质序列是GenBank登记号P15056。
在GenBank中发现的一种B-Raf是M95712 Homo sapiens B-Raf蛋白(BRAF)mRNA，complete cdsgi|41387219|gb|M95712.2|HUMBRAF[41387219]。
“对照样本”是指健康的无癌症动物的生物学材料样本。希望的是，对照样本中Akt3或者B-Raf的水平或者编码相应基因拷贝数是同物种正常的无癌症对象的一般群体的典型水平或拷贝数。这种样本可以从用于本发明方法中的动物中收集，或者可以是为其它原因而获得但适于本发明方法使用的正常的无癌症动物的任何生物学材料。对照也可以得自患有或者怀疑患有癌症的动物的正常组织。对照样本也可以是预先基于正常无癌症对象的测量值而确定的给定水平的Akt3。或者，生物学对照样本可以是得自不同个体的样本或者是基于得自群体的基线数据标准化的数值。另外，对照样本可以由特定年龄、性别、种族或者其它种群统计学参数而限定。在一些情况中，对照是特定的测定内含的。一种内含对照的例子是其中当存在比正常无癌症对象典型水平高的水平时，检测方法只可检测Akt3或者相应基因拷贝数。基因的典型对照水平是每个细胞两个拷贝。另一个实例是在免疫组织化学分析背景下，其中分析的对照水平是已知的。这种对照的其它实例属于本领域技术人员知识范畴内。
在对照样本中“期望的”Akt3或B-Raf多肽或者多核苷酸的水平是典型的无癌症样本的代表性水平，从这个水平可以辨别Akt3多肽或多核苷酸的升高的或诊断性的存在。优选地，“期望的”水平受到哺乳动物的年龄、性别、病史等因素以及测试的特定生物学对象的影响。
术语“肿瘤细胞”是指对象中构成肿瘤成分的细胞，或者经确定趋于成为肿瘤成分的细胞，即是在对象癌前病变成分的细胞。
“cDNA”是指通过RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)的作用从RNA模板产生的互补或者拷贝DNA。因此，“cDNA克隆”是指在克隆载体中携带的或者PCR扩增的与感兴趣RNA分子互补的双链DNA序列。这个术语包括从中除去了间插序列的基因。
“克隆载体”是指能在宿主细胞中复制的质粒或噬菌体DNA或者其它DNA序列。克隆载体的特征在于一或多个核酸内切酶识别位点，在这些位点这类DNA序列可以以预定的方式被切割而不丧失DNA的基本生物学功能，其可以含有适用于鉴别转化的细胞的标记。
“表达载体”是指与克隆载体相似但是能在转化进宿主之后表达克隆进其中的核酸序列的运载体或载体。当核酸序列被转录产生mRNA序列时，则该序列被“表达”。在大多数情况中，这种转录物被翻译产生氨基酸序列。克隆的基因通常置于表达控制序列的控制下(即与表达控制序列可操纵地连接)。
“表达控制序列”或者“调节序列”是指当与结构基因可操纵地连接时控制或调节结构基因表达的核苷酸序列。这些包括例如lac系统、trp系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域，fd外壳蛋白的控制区及已知在原核或真核细胞中控制基因表达的其它序列。表达控制序列根据载体是否被设计为在原核或者真核宿主中表达可操纵地连接的基因而变化，并且含有转录元件如增强子元件、终止序列、组织特异性元件或者翻译起始和终止位点。
“可操纵地连接”是指启动子控制基因表达的起始。如果在导入宿主细胞中时启动子决定一最接近的DNA序列转录为一或多个物种的RNA，则启动子与该最接近的DNA序列是可操纵地连接的。如果启动子能起始一DNA序列的转录，则该启动子与该DNA序列是可操纵地连接的。
“宿主”是指真核细胞，该术语包括是可复制的表达载体受体的生物体或细胞。
通过本领域已知的任何方法包括本文描述的那些方法将核酸导入宿主细胞中称作“转化”。其中已经导入上述核酸的细胞也包括这种细胞的子代。
称作“分离的”核酸是指从其来源(例如存在于细胞或者核酸混合物如文库中)的基因组DNA或者细胞RNA的核酸中分离的并且可能已经被进一步加工的核酸。本文所用术语“分离的”是指不含有至少60％、优选至少75％、最优选至少90％的天然伴随的其它成分的核酸或者氨基酸序列。“分离的”核酸(多核苷酸)包括通过本文所述方法、类似的方法或者其它合适方法获得的核酸，包括实质上纯的核酸、通过化学合成产生的核酸、通过生物学和化学方法组合产生的核酸、及分离的重组核酸。在本文称作“重组”的核酸是通过重组DNA方法学产生的核酸，包括由基于人工复制的方法、如聚合酶链反应(PAL2)或者使用限制酶克隆进载体中而产生的那些核酸。“重组”核酸也包括那些得自重组事件的核酸，所述重组事件是通过细胞的天然机制发生的，但是被选择以便在将设计的核酸导入细胞之后可以产生希望的重组事件。编码具有一定功能的多肽的分离的核酸的部分可以通过例如Jasin，M.等的美国专利No.4,952,501所述方法鉴别和分离。
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”是同义的。“肽”是指多肽的片段或者部分，优选具有完整多肽序列的至少一种功能活性(例如蛋白酶解、粘附、融合，抗原性或者细胞内活性)的片段或部分。
术语“患者”或“对象(subject)”可互换使用，是指哺乳动物如人和非人灵长类动物，以及实验动物如兔，大鼠和小鼠，及其它动物。
本文所用术语“生物学样本”是指含有Akt3和/或B-Raf核酸或多肽的生物学组织或液体的样本，例如黑素瘤癌症蛋白、多核苷酸或转录物的样本。这种样本包括但不限于分离自人体的组织。生物学样本也包括组织如活检组织或尸检组织样本的切片、进行组织学分析的冷冻切片、血液、血浆、血清、唾液、粪便、泪液、粘液、毛发、皮肤，等等。生物学样本还包括外植体和得自患者组织的原始和/或转化的细胞培养物。生物学样本典型地得自真核生物，优选真核生物如真菌、植物、昆虫、原生动物、鸟类、鱼类、爬行动物，优选哺乳动物如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或者兔，最优选灵长类动物如黑猩猩或者人。
“癌症”或者“恶性肿瘤”是同义术语，是指特征在于细胞不受控制的异常增殖、病变细胞的局部传播或者通过血液和淋巴系统播散至机体其它部分(即转移)的能力以及许多特征性结构和/或分子学特征的任一种疾病。“癌症”或者“恶性肿瘤”细胞是指具有特异性结构性质、缺少分化并且能浸润和转移的细胞。癌症例如是皮肤癌，肾癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肝癌(见DeVita，V.et al.(eds.)，2001，Cancer Principles and Practice of Oncology，6th.Ed.，LippincottWilliams& Wilkins，Philadelphia，Pa.；这个参考文献在本文以其全文并入参考)。
术语“凋亡”和“编程性细胞死亡(PCD)”是同义术语，描述了导致受控细胞自身破坏的分子和形态学过程(见例如KerrJ.F.R.et al.，1972，BrJ Cancer.26:239-257)。凋亡性细胞死亡可以由许多刺激诱导，如细胞表面受体的连接、饥饿、生长因子/存活因子耗竭、热激、缺氧、DNA损伤、病毒感染和胞毒剂/化疗剂。凋亡过程参与胚胎发生，分化、增殖/稳态、缺陷的并因此有害的细胞的除去，特别是参与免疫系统的调节和功能。因此，凋亡程序的功能障碍或者失调牵涉许多病理状况，如免疫缺陷、自身免疫疾病、神经变性疾病和癌症。凋亡的细胞可以通过立体形态学改变而识别：细胞皱缩，变形及与相邻细胞接触松散。其染色质浓缩，最终细胞断裂成致密的膜包裹结构，称作“凋亡小体”，其含有胞质溶胶、浓缩的染色质和细胞器。凋亡小体由巨噬细胞吞噬，因此从组织中除去而不导致炎症应答。这与细胞死亡的坏死模式相反，在细胞坏死情况中，细胞受到大的损害，导致细胞膜的完整性丧失，细胞膨胀并且被破坏。在坏死期间，细胞内容物不受控制地释入细胞环境中，导致周围细胞损害及在相应的组织中产生强烈炎症应答。见例如Tomei L.D.and Cope F.O.，eds.，1991，Apoptosis：The Molecular Basis of Cell Death，Plainville，N.Y.:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Isaacs J.T.，1993，Environ HealthPerspect.101(supp15):27-33；所述文献在此均以其全文并入参考。本领域技术人员已知许多凋亡的测定方法(例如DNA片段化分析，放射性增殖分析，对处理的细胞的DNA阶梯分析，4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞测定的荧光显微镜镜检，等等)。
“保守修饰的变体”是针对氨基酸和核酸序列而言。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或者基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当所述核酸不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并，有大量功能相同的核酸编码任一给定的多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密码子限定的每个位置，该密码子均可以被改变为所述任何相应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默取代”或者“沉默变异”，其是保守修饰的变体的一种。除非特别指出，本文所述的编码多肽的每个多核苷酸序列也描述了每种可能的沉默变体。因此，沉默取代是编码氨基酸的每种核酸序列的一个暗含的特征。技术人员意识到核酸中的每个密码子(除了AUG之外，其通常仅是甲硫氨酸的密码子)均可以用标准技术修饰，产生功能相同的分子。在一些实施方案中，编码酶的核苷酸序列优选进行优化以在特定的宿主细胞(例如酵母、哺乳动物、植物、真菌，等等)中表达，用于产生所述酶。
对于氨基酸序列，技术人员意识到在所编码的序列中改变、添加或者缺失一个氨基酸或者少部分氨基酸的核酸、肽、多肽或者蛋白质序列中的各种取代、缺失或者添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致一个氨基酸由化学相似的另一个氨基酸取代。本领域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。见例如Davis et al.，Basic Methodsin Molecular Biology＂Appleton& Lange，Norwalk，Connecticut(1994)所述。这种保守修饰的变体不除外本发明的多态性变体、种间同系物及等位基因。
如下8组各含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(见例如Creighton，1984，Proteins)。
文中关于两或多个核酸或者多肽序列使用的术语“相同”或者“相同性百分比”，是指使用下述默认参数的BLAST或者BLAST2.0序列比较算法测定或者通过人工排列比较和观察，两或多个序列或者亚序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或者核苷酸是相同的(即在指定区域(例如黑素瘤相关的Akt3基因的序列)比较和比对比较窗或者指定区域的最大相应性时，具有大约70％相同性，优选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或者更高的相同性)。这种序列然后被称作是“实质上相同的”。这种定义也指测试序列的互补序列。这种定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所描述，优选的算法可考虑到缺口。优选地，在长度为至少大约25个氨基酸或者核苷酸的区域、更优选长度为大约50—100个氨基酸或者核苷酸的区域存在相同性。
为了进行序列比较，典型地将一个序列作为参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，测试和参考序列均输入计算机中，如果需要，指定亚序列坐标，指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定另外的参数。随后序列比较算法基于程序参数计算测试序列与参考序列的相同性百分比。
如本文所用术语“比较窗”包括参考选自20—600、常为大约50—200、更优选大约100—150个连续位置数目的节段，其中在将一个序列与参考序列优化排列后，可以与具有相同连续位置数目的参考序列比较。本领域熟知序列比对而进行比较的方法。序列优化排列的比较可例如通过Smith& Waterman的局部同源性算法(1991，Adv.Appi.Math.2:482)，通过Needleman & Wunsch的同源性比对算法(1970，J.Mol.Biol.48:443)，通过Pearson & Lipman的检索相似性方法(1988，Proc.NatI.Acad.Sci.USA85:2444)，通过这些算法的计算机执行程序(GAP，BESTFIT，PASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wis.)，或者通过人工比对和目测方法(见例如Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel et al.，eds.1995 supplement)进行。
适于确定序列相同性百分比和序列相似性的算法的另一实例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别由Altschul et al.，1977，Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215:403-410描述。进行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这个算法包括首先通过鉴别查询序列中短字长W以鉴别高分值的序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字比较时，这些HSP匹配或者满足一些阳性值的阈值T。T是指相邻字分值阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul et al.，如前)。这些最初的相邻word hit可作为种子以启动检索来寻找含有它们的较长的HSP。这些word hit沿着每个序列的两端延伸直至可以增加累积比对分值。累积分值对于核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基的奖分(reward score)；总是>0)和N(匹配残基的罚分(penalty score)；总是<0)计算。对于氨基酸序列，使用得分矩阵计算累积分值。当出现如下情况时停止每端word hit的延伸：累积比对分值从其最大获得数值降低了数量X；由于一或多个负得分残基比对的累积导致累积分值为0或之下；或者达到每个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认的字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4及双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认的字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff & Henikoff，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为109M＝5，N＝-4，双链比较。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(见例如Karlin& Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或者氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率指征。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于大约0.2、优选小于大约0.01、最优选小于大约0.001，则认为该核酸与参考序列是相似的。
两个核酸序列或者多肽是基本上相同的指征是由第一个核酸编码的多肽与针对第二个核酸编码的多肽的抗体免疫学交叉反应，如下所述。因此，在例如两个多肽仅是通过保守取代而有所不同的情况中，这两个多肽典型地是基本上相同的。两个核酸序列是基本上相同的另一个指征是这两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列是基本上相同的另一个指征是可以使用相同的引物扩增序列。
短语“选择性(或者特异性)杂交”是指当所述序列存在于复合混合物中(例如总细胞或者文库DNA或者RNA)时，一种分子仅与特定的核苷酸序列在严格杂交条件下结合、形成双链体或者杂交。
短语“严格杂交条件”是指在这种条件下探针与典型地在核酸的复合混合物中的其靶亚序列杂交但与其它序列不杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中而有所不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。关于核酸杂交的指导见Tijssen，1993，“Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays”inTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes所述。通常地，选择的严格条件是比在指定离子强度、pH下特定序列的热解链点(TM)低大约5—10℃的条件。TM是50％的与靶互补的探针与靶序列平衡杂交的温度(在指定离子强度，pH和核酸浓度)(由于靶序列过量存在，因此在TM下，50％的探针在平衡状态)。严格条件是其中盐浓度低于大约1.0M钠离子，典型为大约0.01—1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH 7.0—8.3，对于短探针(例如10—50个核苷酸)温度为至少大约30℃，对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少大约60℃。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。对于选择性或者特异性杂交，阳性信号为背景杂交的至少两倍，任选10倍。举例性严格杂交条件可以如下所示：50％甲酰胺，5×SSC，和1％SDS，在42℃保温，或者5×SSC，1％SDS，在65℃保温，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃洗涤。这类洗涤可以进行5、15、30、60、120或者更多分钟。对于PCR，大约36℃的温度典型地是用于低严格性扩增，当然退火温度根据引物长度可以在大约32—48℃之间变化。对于高严格性PCR扩增，大约62℃的温度是典型的，当然根据引物长度和特异性高严格退火温度可在大约50℃—65℃之间变化。对于高和低严格性扩增而言，典型的循环条件包括在90—95℃变性30秒—2分钟，退火持续30秒—2分钟，延伸是在大约72℃进行1—2分钟。
在严格条件下彼此不杂交的核酸如果其编码的多肽是相同的则其也是基本上相同的。这种情况在例如当核酸的拷贝数使用遗传密码许可的最大密码子简并时发生。在这种情况中，所述核酸典型在中等严格杂交条件下杂交。“中等严格杂交条件”例如包括在37℃在40％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS缓冲液中杂交，及在45℃在1×SSC中洗涤。这类洗涤可以进行5、15、30、60、120或更多分钟。阳性杂交是背景的至少两倍。技术人员易于意识到可以利用另外的杂交和洗涤条件以提供相似的严格条件。
关于重组DNA技术的一般原理的标准参考文献包括J.Sambrooket al.，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，CoId Spring Harbor，N.Y.；P.B.Kaufinanet al.，(eds)，1995，Handbook of Molecular and Cellular Methods inBiology and Medicine，CRC Press，Boca Raton；M.J.McPherson(ed)，1991，Directed Mutagenesis:A Practical Approach，IRL Press，Oxford；J.Jones，1992，Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford SciencePublications，Oxford；B.M.Austen and O.M.R.Westwood，199l，ProteinTargeting and Secretion，IRL Press，Oxford；D.N Glover(ed)，1985，DNA Cloning，Volumes I and II；M.J.Gait(ed)，1984，OligonucleotideSynthesis；B.D.Hames and S.J.Higgins(eds)，1984，Nucleic AcidHybridization；Wu and Grossman(eds)，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)，Vol.154 and Vol.155；Quirke and Taylor(eds)，1991，PCR-A Practical Approach；Hames and Higgins(eds)，1984，Transcription and Translation；R.I.Freshney(ed)，1986，Animal CellCulture；Immobilized Cells and Enzymes，1986，IRL Press；Perbal，1984，A Practical Guide to Molecular Cloning；J.H.Miller and M.P.Calos(eds)，1987，Gene Transfer Vectors for Mamalian Cells，ColdSpring Harbor Laboratory Press；M.J.Bishop(ed)，1998，Guide to HumanGenome Computing，2dEd.，Academic Press，San Diego，Calif.；L.FPeruski and A.H.Peruski，1997，The Internet and the New Biology：Toolsfor Genomic and Molecular Research，American Society forMicrobiology，Washington，D.C。
本文所用术语“降低Akt3活性”是指Akt3活性降低大约25％至大约100％。本发明涵盖了通过如下任何物质抑制Akt3：(a)一种物质，当其被给予细胞时降低Akt3 mRNA的水平或者Akt3蛋白的水平，或者(b)一种物质，当其被给予细胞时影响Akt3 mRNA或者蛋白质水平，通过PI3K/Akt信号转导途径导致Akt3 mRNA水平或者细胞产生的Akt3蛋白质的水平降低，或者(c)如通过磷酸化或者去磷酸化而降低Akt3活性的任何物质。这个术语还包括降低除去Akt3活性产物的下游途径的活性及降低提供Akt3的反应物的上游途径的活性的物质。Akt3活性的降低或变化可通过任何已知方法测定，包括但不限于激酶分析、Western印迹中的磷酸化状态、或者蛋白质表达水平。
本文所用术语“降低V599E B-Raf活性”是指B-Raf活性降低大约25％至大约100％。本发明涵盖了通过如下任何物质抑制B-Raf：(a)一种物质，当其被给予细胞时降低V599E B-Raf mRNA的水平或者V599E蛋白的水平，或者(b)一种物质，当其被给予细胞时影响B-Raf mRNA或者蛋白质水平，通过MAPK或者ERK信号转导途径导致V599E B-Raf mRNA水平或者细胞产生的V599E蛋白质的水平降低，或者(c)如通过磷酸化或者去磷酸化而降低B-Raf活性的任何物质。这个术语还包括降低除去V599E B-Raf活性产物的下游途径的活性及降低提供V599E B-Raf的反应物的上游途径的活性的物质。B-Raf活性的降低或变化可通过任何已知方法测定，包括但不限于激酶分析、Western印迹中的磷酸化状态、或者蛋白质表达水平。
本文所用术语“治疗黑素瘤”是指阻止、减轻、改善、停止、遏制、减缓或者逆转肿瘤进展，或者降低哺乳动物中的肿瘤发育和增加凋亡率，或者在肿瘤细胞中诱导凋亡。
如本文所用，术语“血管发生”当用于描述降低血管形成时，是指在一种物质的存在下发生的新血管形成的量低于不存在外源加入的物质时发生的血管形成的量。确定组织中血管形成的量的方法包括免疫组织化学方法为本领域所熟知，它们是通过量化CD-31抗原染色阳性的血管的数目或者肿瘤中由CD-31阳性血管占据的面积而确定。
Akt3和/或B-Raf核酸的检测
在本发明的一些实施方案中，使用编码衍生自黑素瘤细胞的Akt3或B-Raf多肽、包括全长Akt3或B-Raf蛋白或其任何衍生物、变体、同系物或者片段的核酸。这种核酸可用于多种应用中，包括用于产生Akt3或B-Raf蛋白、用于诊断分析、用于治疗性应用、用于Akt3-特异性或B-Raf-特异性探针、用于分析Akt3或B-Raf结合和/或调节化合物、用于从其它物种或者小鼠中鉴别和/或分离Akt3或B-Raf同系物，及其它应用。
A.通用重组DNA方法
本发明的多种应用包括克隆、合成、维持、诱变及其它核酸序列的操作，它们可以使用重组遗传学领域的常规技术进行。揭示本发明使用的常规方法的基础文献包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(2nEd.1989)；Kriegler，1990，Gene Transfer andExpression:a Laboratory Manual；及Current Protocols in MolecularBiology，1995，(Ausubel et al.，eds.)。
对于核酸，大小是以千碱基(kb)或者碱基对(bp)表示。这些是得自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序、或者公布的DNA序列中估计值。对于蛋白质，大小是以千道尔顿(kDa)或者氨基酸残基数目表示。蛋白质大小是从凝胶电泳、蛋白质测序、衍生的氨基酸序列，或者公布的蛋白质序列中估算的。
不可商购的寡核苷酸可以根据首先由Beaucage & Caruthers，1981，Tetrahedron Letts.22:1859-1862描述的固相phosphoramiditetriester方法使用自动合成仪化学合成，如Van Devanter et al.，1984，Nucleic Acids Res.12:6159-6168所述。寡核苷酸的纯化通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或者通过阴离子交换HPLC进行，如Pearson&Reanier，1983，J.Chrom.255:137-149描述。
克隆的基因和合成的寡核苷酸的序列可以使用例如Wallace etal.，1981，Gene16:21-26所述的用于双链模板测序的链终止方法核实。
B.分离和检测Akt3和/或B-Raf核苷酸序列
在本发明的一些实施方案中，使用重组方法分离和克隆Akt3和/或B-Raf核酸。这些实施方案用于例如分离Akt3和/或B-Raf多核苷酸以进行蛋白质表达，或者在变体、衍生物、表达盒或者衍生自Akt3和/或B-Raf的其它序列的产生期间，用于监测Akt3和/或B-Raf基因表达以确定各种物种中的Akt3和/或B-Raf序列，用于诊断患者，即检测Akt3和/或B-Raf中的突变，或者用于基因分型和/或法医应用。
与Akt3或B-Raf基因基本上相同的多态性变体、等位基因及种间同系物和核酸可以使用Akt3或B-Raf核酸探针和寡核苷酸在严格杂交条件下筛选文库而分离。或者，通过用针对Akt3或B-Raf多肽制备的也识别并选择性结合Akt3或B-Raf同系物的抗血清或纯化的抗体免疫学检测表达的同系物，表达文库可被用于克隆Akt3或B-Raf蛋白、多态性变体、等位基因和种间同系物。
为了产生Akt3 cDNA文库，应该选择富含Akt3 RNA的来源。为了产生B-Raf cDNA文库，应该选择富含B-Raf RNA的来源。然后使用逆转录酶将mRNA制成cDNA，连接进重组载体中，并转染进宿主中以进行增殖、筛选和克隆。产生和筛选cDNA文库的方法是本领域熟知的(见例如Gubler & Hoffman，1983，Gene 25:263-269；Sambrook et al.，如前；Ausubel et al.，如前)。
对于基因组文库，从组织中提取DNA，通过机械剪切或者酶促消化产生大约12—20kb的片段。然后将片段通过梯度离心从不希望的大小中分离出，并构建在噬菌体λ载体中。这些载体和噬菌体在体外包装。将重组噬菌体通过如Benton& Davis，1977，Science196:180-182所述的噬斑杂交分析。菌落杂交如Grunstein et al.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，72:3961-3965所述进行。
更远缘相关的Akt3或B-Raf同系物可以使用本领域熟知的任何方法鉴别，包括在中等严格条件下将Akt3探针或者B-Raf探针与基因组或cDNA文库杂交，或者在低严格条件下使用针对Akt3或者B-Raf选择的区域的探针，例如产生的针对C末端结构域的特异性探针。同样，远缘的同系物可以使用简并引物组从核酸文库中扩增，所述引物是特别基于一段高度保守的氨基酸序列掺入编码一给定的氨基酸序列的所有可能密码子的引物。这类引物为本领域技术人员所熟知，可利用多种程序例如从互联网上获得的程序设计简并引物。
在某些实施方案中，使用基于杂交的方法检测Akt3或B-Raf多核苷酸，以确定例如Akt3或B-Raf RNA水平，或者检测特定的DNA序列例如用于进行诊断。例如，Akt3和/或B-Raf的基因表达可以通过本领域已知的技术分析，例如mRNA Northern印迹，反转录和PCR扩增，包括使用实时PCR程序定量PCR分析mRNA水平(例如逆转录酶-TAQMAN扩增)，斑点印迹，原位杂交，RNase保护，探查DNA微芯片阵列等等。
在另一个实施方案中，可以使用高密度寡核苷酸分析技术(例如基因芯片)以鉴别Akt3和/或B-Raf的直向同源物、等位基因、保守修饰的变体和多态性变体，或者监测Akt3和/或B-Raf mRNA的水平。在同系物与已知疾病例如黑素瘤相关的情况中，它们可与GeneChipTM一起用作诊断工具，以在生物学样本中检测黑素瘤，见例如Gunthandet al.，1998，AIDS Res.Hum.Retroviruses 14:869-876；Kozal et al.，1996，Nat.Med.2:753-759；Matson et al.，1995，Anal.Biochem.224:110-106；Lockhart et al.，1996，Nat.Biotechnol.14:1675-1680；Gingeras et al.，1998，Genome Res.8:435-448；Hacia et al.，1998，Nucleic Acids Res.26:3865-3866所述。
Akt3和/或B-Raf多核苷酸和多肽的检测可包括所述多肽或多核苷酸的定量或定性检测，可以包括与对照值的真实比较，或者可以进行检测以便检测自身固有地表明Akt3和/或B-Raf增加的水平。
在某些实施方案中，例如在诊断黑素瘤中，对Akt3和/或B-Raf多核苷酸、多肽或者蛋白质活性进行量化。在这种实施方案中，增高的Akt3和/或B-Raf水平与正常对照水平之间的差异优选是统计学显著的。典型地，Akt3和/或B-Raf多肽或核酸的诊断存在即过表达或增加，代表所述生物学样本中Akt3和/或B-Raf多肽或多核苷酸水平与非癌样本中的水平相比增加至少大约1.5、2、3、5、10或更多倍。Akt3和/或B-Raf的检测可以在体外即在取自患者的生物学样本的细胞中进行或者在体内进行。在一个实施方案中，Akt3和/或B-Raf的水平增高分别用作Akt3和/或B-Raf诊断标记。如本文所用，“诊断存在”是指高于非癌样本中Akt3或B-Raf水平的任何水平。在一个实施方案中，在其中Akt3或B-Raf多肽或多核苷酸的正常水平(即非癌(无癌)样本中的水平)检测不到的条件下，对生物学样本中的Akt3或B-Raf多肽或者多核苷酸进行分析。因此，在这种分析中，生物学样本中检测到任何Akt3和/或B-Raf多肽或核酸均表示诊断存在或者水平增加。
如下所述，可以使用检测Akt3和/或B-Raf的任何方法。Akt3和/或B-Raf多核苷酸水平可以通过检测任何关连Akt3或B-Raf DNA或RNA、包括Akt3基因组DNA、mRNA和cDNA而检测。Akt3或B-Raf多肽可以通过检测Akt3和/或B-Raf多肽自身，或者通过检测Akt3和/或B-Raf蛋白质活性而进行检测。检测可包括量化Akt3和/或B-Raf的水平(例如基因组DNA、cDNA、mRNA或者蛋白质水平或者蛋白质活性)，或者可以定性评估Akt3和/或B-Raf水平或者其存在与否，特别是与对照水平进行比较。可以使用检测上述方面的任何方法。这些方法包括例如杂交、扩增及其它分析方法。
在某些实施方案中，检测细胞中水平增加或者诊断存在的能力用作在体内或者在体外检测癌细胞的标记，即监测患者癌细胞的数目或者定位。
典型地，本文检测的Akt3多核苷酸或多肽与天然发生的Akt3基因在一段至少大约50、100、200或更多个核苷酸或者20、50、100或更多个氨基酸的区域是至少大约70％相同的，优选75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的或更高相同性的。这些多核苷酸或多肽可以代表功能性或非功能性形式的Akt3或其任何变体、衍生物或片段。
1.拷贝数的检测
在一个例如诊断癌症存在与否的实施方案中，确定拷贝数、即细胞中Akt3基因的数目。通常地，对于给定的G常染色体基因，动物的每个基因均具有两个拷贝。然而，拷贝数可以通过基因扩增或者复制而增加，例如在癌细胞中，或者通过缺失而降低。确定特定基因拷贝数的方法为本领域技术人员所熟知，包括基于杂交和扩增的测定。
a)基于杂交的测定
可以使用任何基于杂交的测定以检测生物学样本的细胞中Akt3基因的拷贝数。一种这样的方法是Southern印迹。在Southern印迹中，典型地将基因组DNA片段化，经电泳分离，转移至膜上，随后与Akt3特异性探针杂交。为了确定拷贝数，将所述探针与靶区域的杂交信号与对照探针与正常基因组DNA(例如相同或相关细胞、组织、器官等的未扩增部分)的杂交信号进行比较，可以估计相对的Akt3拷贝数。Southern印迹方法学为本领域所熟知，在例如Ausubel et al.或者Sambrook et al.(如前述)中描述。
确定样本中Akt3基因拷贝数的另一种方法是原位杂交，例如荧光原位杂交或者FISH。原位杂交分析为本领域技术人员所熟知(例如Angerer，1987，Meth.Enzymol 152:649)。通常地，原位杂交方法包括如下主要步骤：(1)固定要分析的组织或者生物学结构；(2)对所述生物学结构进行预杂交处理以增加靶DNA的可及性及降低非特异性结合；(3)核酸混合物与生物学结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤以除去在杂交中未结合的核酸片段；(5)检测杂交的核酸片段。
这类应用中使用的探针典型地是标记的，例如用放射性同位素或者荧光报道基因标记。优选的探针是足够长的，例如长度为从大约50、100或200个核苷酸至大约1000或更多个核苷酸，以与靶核酸在严格条件下特异性杂交。
本发明涉及“比较探针”方法，例如比较基因组杂交(CGH)，用于检测Akt3基因扩增。在比较基因组杂交方法中，“测试”核酸的集合用第一种标记物标记，而第二个集合(例如来自健康细胞或组织)用第二种标记物标记。核酸的杂交率通过第一个和第二个标记物结合阵列中每个纤维的比率而确定。检测由在测试集合中基因扩增导致的来自两个标记物的信号比率的差异，该比率提供了一种测定Akt3基因拷贝数的方法。
适用于本发明的方法的杂交方案例如在Albertson，1984，EMBOJ.3:1227-1234；Pinkel，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9138-9142；EPO Pub.No.430，402；Methods in Molecular Biology，Vol.33:In SituHybridization Protocols，Choo，Ed.，1994，Humana Press，Totowa，N.J.等文献中描述。
b)基于扩增的测定
在另一个实施方案中，使用基于扩增的测定检测Akt3或者测定Akt3基因的拷贝数。在这类测定中，Akt3核酸序列在扩增反应中作为模板(例如聚合酶链反应或者PCR)。在定量扩增中，扩增产物的量与原始样本中模板的量成比例。与合适的对照相比提供了一种测定Akt3基因拷贝数的方法。定量扩增的方法为本领域技术人员所熟知。关于定量PCR的详细方案例如由Innis et al.，1990，PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.所提供。Akt3的核酸序列足以使得技术人员可以常规选择引物以扩增该基因的任何部分。
在一些实施方案中，使用基于TaqMan的测定量化Akt3多核苷酸。基于TaqMan的测定使用含有5’荧光染料和3’猝灭剂的产生荧光的寡核苷酸探针。所述探针与PCR产物杂交，但由于在3’末端的阻断剂而不能自身延伸。当PCR产物在随后的循环中被扩增时，聚合酶例如AmpliTaq的5’核酸酶活性导致TaqMan探针被裂解。这种裂解分离了5’荧光染料和3’猝灭剂，从而导致作为扩增的函数的荧光增加(见例如Perkin-Elmer提供的文献，例如www.perkin-elmer.com)。
本发明涵盖的其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)(见Wu and Wallace，1989，Genomics4:560，Landegren et al.，1988，Science 241:1077，and Barringer et al.，1990，Gene89:117)，转录扩增(Kwoh et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173)，自身持续序列复制(Guatelli et al.，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.USA87:1874)，dot PCR和接头衔接子PCR等等。
2.Akt3和/或B-Raf表达的检测
a)基于直接杂交的测定
使用核酸杂交技术检测和/或量化Akt3和/或B-Raf基因转录物(从中产生的mRNA或者cDNA)水平的方法为本领域技术人员所已知(见Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2D Ed.，Vols 1-3，Cold Spring Harbor Press，New York)。例如，一种评价Akt3cDNA的存在与否或者数量的方法包括Northern印迹。简而言之，在典型的实施方案中，从给定的生物学样本中分离mRNA，进行电泳以分离mRNA种类，并从凝胶中转移至硝基纤维素膜中。然后将标记的Akt3探针与该膜杂交以鉴别和/或量化mRNA。
b)基于扩增的测定
在另一个实施方案中，Akt3和/或B-Raf转录物(例如Akt3 mRNA)使用基于扩增的方法检测(例如RT-PCR)。RT-PCR方法为本领域技术人员所熟知(见例如Ausubel et al.，如前)。优选地，使用定量RT-PCR，从而使得可以将样本中mRNA的水平与对照样本或对照值进行比较。
3.Akt3和/或B-Raf多肽表达的检测
除了使用核酸杂交技术检测Akt3和/或B-Raf基因和基因表达之外，Akt3和/或B-Raf水平也可以通过检测或量化多肽而检测和/或量化。Akt3或B-Raf多肽通过本领域技术人员熟知的任何方法检测和量化。这些方法包括分析生物化学方法例如电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析等等，或者各种免疫学方法例如液体或者凝胶沉淀反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定、Western印迹等等。Akt3多肽的检测如前所述。
C.在原核细胞和真核细胞中的表达
在一些实施方案中，使用重组技术产生Akt3和/或B-Raf多肽。为了获得克隆的基因或者核酸如编码Akt3或B-Raf多肽的cDNA的高水平表达，将Akt3或B-Raf序列典型地亚克隆进表达载体中，所述载体中含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子、及如果对于编码蛋白质的核酸则还含有翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域所熟知，例如由Sambrook等和Ausubel等描述。表达Akt3蛋白的细菌表达系统可例如在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌中获得(Palva et al.，1983，Gene 22:229-235；Mosbach et al.，1983，Nature 302:543-545)。这类表达系统的试剂盒可商购。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核细胞表达系统为本领域所熟知，并且也可以商购。在一个实施方案中，所述真核细胞表达载体是一种腺病毒载体、腺伴随病毒载体、或者反转录病毒载体。
对于治疗性应用，Akt3和/或B-Raf核酸用任何各种各样的方法在体外、体内或者离体导入细胞中，这些方法包括但不限于病毒载体感染、基于脂质体的方法、biolistic粒子加速器(基因枪)和裸DNA注射。这些治疗有益的核酸包括但不限于全长Akt3或B-Raf的编码序列、Akt3或B-Raf片段、结构域、衍生物或者变体的编码序列、Akt3或B-Raf反义序列、Akt3或B-Raf siRNA序列、及Akt3或B-Raf核酶。典型地，这些序列与启动子可操纵地连接，但是在许多应用中，被给予细胞的核酸其自身具有直接的治疗效力，例如某些反义核酸，siRNA，或者核酶分子。
用于指导异源核酸表达的启动子取决于特定的应用。所述启动子任选地位于距异源转录起始位点与其在其天然状态距转录起始位点相同距离的位置。然而，如本领域所已知，可以对这个距离进行一些改变而不丧失启动子功能。
除了启动子之外，表达载体典型地还含有转录单位或者表达盒，其含有Akt3编码核酸或者B-Raf编码核酸在宿主细胞中表达所需要的所有额外元件。因此典型的表达盒含有与编码Akt3或B-Raf多肽的核酸序列可操纵地连接的启动子、及转录物有效聚腺苷酸化所需要的信号、核糖体结合位点及翻译终止子。编码Akt3或B-Raf多肽的核酸序列可以与可裂解的信号肽序列连接，促进转染的细胞分泌编码的蛋白质。如果基因组DNA用作结构基因，则表达盒的额外元件可包括增强子及具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列之外，表达盒也应含有结构基因下游的转录终止区以提供有效的终止。所述终止区可以得自与启动子序列相同的基因或者可以得自不同的基因。
用于将遗传信息转运至细胞中的特定表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。有用的表达载体例如可由染色体、非染色体和合成DNA序列的节段组成。合适的载体包括SV40衍生物及已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒colE1，pCRI，pBR322，pMal-C2，pET，pGEX(Smith et al.，1988，Gene67:31-40)，pMB9及其衍生物，质粒如RP4；噬菌体DNAS，例如噬菌体1的众多衍生物，例如，NM989，及其它噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒如2m质粒或其衍生物；用于真核细胞中的载体，如用于昆虫或哺乳动物细胞中的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体，如已经被修饰以采用噬菌体DNA或者其它表达控制序列的质粒；等等。例如，本发明使用的哺乳动物表达载体包括具有诱导型启动子如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子的载体，例如具有DHFR表达载体的任何表达载体，或者DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，如pED(PstI，SalI，SbaI，SmaI和EcoRI克隆位点，表达克隆的基因和DHFR的载体；见Kaufman，Current Protocolsin Molecular Biology，16.12(1991)。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸sulfoximine共扩增载体，如pEE14(HindIII，XbaI，SmaI，SbaI，EcoRI，和BelI克隆位点，其中所述载体表达谷氨酰胺合成酶和克隆的基因；Celltech)。在另一个实施方案中，可以使用在埃博拉病毒(EBV)控制下指导附加型表达的载体，如pREP4(BamHl，SfiI，XhoI，NotI，NheI，HindIII，NheI，PvuII和KpnI克隆位点，组成型Rous肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子，潮霉素选择标记；Invitrogen)，pCEP4(BamHl，SfiI，XhoI，NotI，NheI，HindIII，NheI，PvuII和KpnI克隆位点，组成型人巨细胞病毒(hCMV)立即早期基因，潮霉素选择标记；Invitrogen)，pMEP4(KpnI，PvuI，NheI，HindIII，NotI，XhoI，SfiI，BamHI克隆位点，诱导型金属硫蛋白IIa基因启动子，潮霉素可选择标记:Invitrogen)，pREP8(BamHl，XhoI，NotI，HindIII，NheI和KpnI克隆位点，RSV-LTR启动子，组氨酸选择标记；Invitrogen)，pREP9(KpnI，NheI，HindIII，NotI，XhoI，SfiI和BamHI克隆位点，RSV-LTR启动子，G418选择标记；Invitrogen)，和pEBVHis(RSV-LTR启动子，潮霉素选择标记，通过ProBond树脂可纯化的及通过肠激酶可切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本发明的可选择的哺乳动物表达载体包括但不限于pRc/CMV(HindIII，BstXI，NotI，SbaI和ApaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)，pRc/RSV(HindIII，SpeI，BstXI，NotI，XbaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)及其它载体。本发明涵盖的痘苗病毒哺乳动物表达载体(见Kaufman，1991，如前)包括但不限于pSC11(SmaI克隆位点，TK-和beta.-gal选择)，pMJ601(SalI，SmaI，AflI，NarI，BspMII，BamHI，ApaI，NheI，SacII，KpnI和HindIII克隆位点；TK-和beta(β)-gal选择)和pTKgptF1S(EcoRI，PstI，SalI，AccI，HindII，SbaI，BamHII和Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)。
表达载体中典型包括的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子，编码抗生素抗性使得可以选择携带重组质粒的细菌的基因，及在质粒的非必需区域中使得可以插入真核细胞序列的独特限制位点。选择的特定的抗生素抗性基因不是关键的，本领域已知的任何抗性基因均是合适的。如果需要，任选地选择原核细胞序列，由此不干扰DNA在真核细胞中的复制。
一旦鉴别并分离了特定的重组DNA分子，可以使用本领域已知的一些方法使其增殖。一旦确立合适的宿主系统和生长条件，可以大量增殖和制备重组表达载体。可以使用的表达载体包括但不限于如下载体及其衍生物：人或动物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如λ噬菌体)，及质粒和粘粒DNA载体，等等，这些为本领域技术人员所已知。
另外，可以选择调节插入序列的表达或者以希望的特殊方式修饰和加工所述基因产物的宿主细胞菌株。不同的宿主细胞具有翻译和翻译后加工和蛋白质修饰的特征性和特异性机制。可以选择合适的细胞系或者宿主系统以保证表达的外源蛋白质得到希望的修饰和加工。在酵母中表达可以产生生物学活性的产物。在真核细胞中表达可增加“天然”折叠的可能性。另外，在哺乳动物细胞中表达可提供重建或者构成Akt3和/或B-Raf在黑素瘤中的活性的工具。另外，不同的载体/宿主表达系统可不同程度影响加工反应，如蛋白酶解。
使用标准转染方法产生表达大量Akt3或B-Raf蛋白的细菌、哺乳动物、酵母或者昆虫细胞系，这些蛋白然后使用标准技术纯化(见例如Colley et al.，1989，J.Biol.Chem.264:17619-17622；＂Guide toProtein Purification＂in Methods in Enzymology，Vol.182，1990(Deutscher，Ed.)。真核细胞和原核细胞的转化根据标准技术进行(见例如Morrison，1977，J.Bact.132:349-35l；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology 101:347-362，1983(Wu et al.，eds.)。
可以使用任何熟知的方法将外源核苷酸序列导入宿主细胞中。这些方法包括使用试剂如Superfect(Qiagen)，脂质体，磷酸钙转染，polybrene，原生质体融合，电穿孔，显微注射，质粒载体，病毒载体，biolistic粒子加速器(基因枪)，或者将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或者其它外源遗传物质导入宿主细胞中的其它熟知方法(见例如Sambrook et al.，如前)。
在表达载体被导入细胞中之后，在有利于Akt3和/或B-Raf多肽表达的条件下培养转染的细胞，使用下文标明的标准技术从培养物中回收所述多肽。培养原核细胞或者真核细胞的方法为本领域所熟知，并例如Ausubel et al.，Sambrook et al.，及Freshney，1993，Culture ofAnimal Cells，3.sup.rd.Ed.，A Wiley-Liss Publication所教导。
可以使用任何熟知的将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的方法将载体例如定向载体导入细胞中。可以使用任何熟知的将外源核苷酸序列导入宿主细胞中的方法。如前所述，本发明的核酸可以通过任何基因转移机制导入细胞中，例如通过病毒介导的基因输送，磷酸钙介导的基因输送，电穿孔，显微注射或者蛋白质脂质体进行。然后转导的细胞可以根据细胞或者组织类型通过标准方法注入(例如于药物可接受的载体中)或者等位(homotopically)移植进对象中。在对象中移植或者注入各种细胞的标准方法是已知的。
将核酸或者载体输送至细胞可以通过各种机制进行。例如，可以通过脂质体进行，使用可商购的脂质体制品如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersbuxg，Md.)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)，以及根据本领域标准方法产生的其它脂质体。另外，本发明的核酸或者载体可以在体内通过电穿孔输送，这个技术可得自Genetronics，Inc.(San Diego，Calif.)，以及利用SONOPORATION设备(marx Pharmaceutical Corp.，Tucson，Ariz.)进行输送。
例如，载体输送可通过病毒系统进行，如可包装重组反转录病毒基因组的反转录病毒载体系统(见例如62，63)。然后该重组反转录病毒可用于感染细胞并从而将核酸输送至感染的细胞。将核酸导入哺乳动物细胞的具体方法当然不限于使用反转录病毒载体。对于这个程序可利用的其它技术包括使用腺病毒载体，腺伴随病毒(AAV)载体，慢病毒载体，假型反转录病毒载体。也可以使用物理学转导技术，如脂质体输送和受体介导的及其它胞吞机制。本发明可以与任何这些或其它常用的基因转移方法联合应用。
通过降低细胞中Akt3活性水平在癌细胞中诱导凋亡
在一个实施方案中，本发明提供了在黑素瘤肿瘤细胞中通过将细胞与降低Akt3活性的物质接触而诱导凋亡的方法。在一个优选的实施方案中，所述物质是一种siRNA分子。
siRNA多核苷酸是一种介导RNA干扰作用(一种转录后基因沉默机制)的RNA核酸分子。siRNA多核苷酸优选包含双链的RNA(dsRNA)，但是不限于此，并可包括单链的RNA(见例如Martinez et al.Cell 110:563-74(2002))。siRNA多核苷酸可包含其它天然发生的重组或合成的单链或双链的核苷酸(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者这两者的组合)和/或本文提供的核苷酸类似物(例如寡核苷酸或者多核苷酸等等，典型地在5’至3’磷酸二酯键中)的聚合物。因此，应意识到鉴于充分确定的互补核苷酸碱基配对的原理，本发明作为能指导本发明siRNA多核苷酸转录的DNA序列而举例说明的某些序列也意在描述相应的RNA序列及其互补序列。siRNA可以使用含有RNA聚合酶启动子例如U6启动子或者H1 RNA聚合酶III启动子的模板DNA(基因组DNA，cDNA或者合成的DNA)转录，或者siRNA可以是合成产生的RNA分子。在某些实施方案中，本发明的siRNA多核苷酸可具有平端，即双链体的一个链中的每个核苷酸与相反链的核苷酸均完全互补(例如通过Watson-Crick碱基配对)。在本发明的某些其它实施方案中，本发明的siRNA多核苷酸的至少一个链具有在siRNA的一个链或者优选两个链的3’末端“突出”(即与相反链中互补碱基不配对)的至少一个、优选两个核苷酸。在本发明的某些其它实施方案中，siRNA多核苷酸双链体的每个链在3’末端均具有两个核苷酸突出，突出的这两个核苷酸优选是胸苷二核苷酸(TT)，但也可包括其它碱基，例如TC二核苷酸或者TG二核苷酸，或者其它二核苷酸。关于siRNA的3’末端的论述见例如WO 01/75164所述。
优选的siRNA多核苷酸包含大约18—30个核苷酸碱基对，优选大约18、19、20、21、22、23、24、25、26或者27个碱基对的双链寡聚核苷酸，在其它优选的实施方案中优选大约19、20、21、22或23个碱基对，或者大约27个碱基对，上述“大约”是指在某些实施方案中在一定条件下可产生能干扰选择的多肽表达的功能性siRNA多核苷酸的裂解步骤可能不是绝对有效的。因此，例如“大约”18、19、20、21、22、23、24或者25个碱基对的siRNA多核苷酸可包括(不限于)由于在加工、生物合成或者人工合成中的可变性而导致在长度上有1、2、3或4个碱基对不同(例如核苷酸插入或者缺失)的一或多个siRNA多核苷酸分子。本发明期望的siRNA多核苷酸也可包含这样的多核苷酸序列，其与特定序列有1、2、3或4个核苷酸不同(例如由于核苷酸取代，包括转换和颠换所致)而呈现出可变性，所示差异根据分子的长度、位于双链多核苷酸的有义还是反义链中而发生在特定siRNA多核苷酸序列的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或者19位的任何位置或者在siRNA多核苷酸序列的第20、21、22、23、24、25、26或者27位。核苷酸取代可仅见于双链多核苷酸的一条链中，例如在反义链中，取代的核苷酸与其形成氢键碱基配对的互补核苷酸在相应有义链中不需要取代。在优选的实施方案中，siRNA与特异的核苷酸序列同质。如本文所述，优选siRNA干扰本发明的Akt3多肽的表达。这些多核苷酸还可用作探针或引物。
作为本发明的siRNA多核苷酸的多核苷酸在某些实施方案中可衍生自单链多核苷酸，其包含单链寡核苷酸片段(例如大约18—30个核苷酸，应理解为包括18—30之间任一整数个核苷酸)及其反向互补序列，典型由间隔序列分隔开。根据某些这样的实施方案，间隔区的裂解提供单链寡核苷酸及其反向互补序列，由此它们可退火形成(任选组合可导致在一或这两条链的3’末端和/或5’末端添加或除去1、2、3或多个核苷酸的额外处理步骤)本发明的双链siRNA多核苷酸。在某些实施方案中，所述间隔区的长度是能使得在间隔区裂解(和任选地，可导致在一或这两条链的3’末端和/或5’末端添加或除去1、2、3、4或多个核苷酸的随后的处理步骤)之前片段与其反向互补序列退火并形成双链结构(例如发夹多核苷酸)的长度。因此所述间隔区序列可以是位于两个当退火为双链核酸时包含siRNA多核苷酸的互补多核苷酸序列区域之间的本文提供的任何多核苷酸序列。优选地，间隔区序列包含至少4个核苷酸，在某些实施方案中，间隔区可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21—25、26—30、31—40、41—50、51—70、71—90、91—110、111—150、151—200或更多个核苷酸。本领域已经描述了衍生自包含由间隔区分隔的两个互补核苷酸序列的一单核苷酸链的siRNA多核苷酸(例如Brummelkamp et al.，2002 Science 296:550；Paddison et al.，2002 Genes Develop.16:948；Paul et al.，Nat.Biotechnol.20:505-508(2002)；Grabarek et al.，BioTechniques 34:734-44(2003))。
多核苷酸变体可含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，由此siRNA多核苷酸的活性基本上未被消除，如上所述。对siRNA活性的作用通常可如本文所述或者使用常规方法确定。变体优选与编码天然Akt3的多核苷酸序列的一部分具有至少大约75％、78％、80％、85％、87％、88％或者89％相同性，更优选具有至少大约90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性。相同性百分比可易于通过将所述多核苷酸序列与全长Akt3多核苷酸的相应部分(如本领域已知及本文引用的那些)相比较而确定，这种确定使用任何方法，包括使用本领域技术人员熟知的计算机程序如Align或者BLAST算法(Altschul，J.Mol.Biol.219:555-565，1991；Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919，1992)，这些程序可在NCBI网站获得(见[online]Internet：<URL：http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)。可以使用默认参数。
某些siRNA多核苷酸变体与天然PTP1B基因的一部分基本上同源。(例如通过热变性)衍生自这类多核苷酸变体的单链核酸能在中等严格条件下与天然发生的编码Akt3多肽的DNA或者RNA序列(或其互补序列)杂交。在中等严格条件下杂交的多核苷酸可具有包括与特定多核苷酸互补的至少10个连续核苷酸，优选11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个连续核苷酸的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，这种序列(或其互补序列)是希望被干扰表达的Akt多肽所特有的，在某些其它实施方案中，所述序列(或其互补序列)可以是希望被干扰表达的Akt3和一或多种Akt同种型共有的。在某些优选的实施方案中，这种序列(或其互补序列)是希望被干扰表达的B-Raf多肽特有的，在某些其它实施方案中，所述序列(或其互补序列)可以是希望被干扰表达的B-Raf和一或多种Raf同种型共有的。
合适的中等严格条件包括例如在5×SSC，0.5％ SDS，1.0mMEDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50—70℃、5×SSC中杂交1—16小时(例如过夜)；随后在22—65℃用一或多种含有0.05-0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC每种洗涤20—40分钟，洗涤一或两次(washingonce or twice at 22-65℃ for 20-40minutes with one or more each of 2x，0.5x and 0.2x SSC containing 0.05-0.1％SDS)。对于额外的严格性，条件可包括在50—60℃在0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤15—40分钟。如本领域技术人员所已知，杂交条件严格性的变化可以通过改变用于预杂交、杂交和洗涤步骤的时间、温度和/或溶液浓度而实现。合适的条件也可部分依赖于所用探针、印迹的先证核酸样本的特定核苷酸序列。因此，当鉴别了探针的希望的选择性时，基于其与一或多个先证序列杂交而与某些其它先证序列不杂交的能力，可易于选择合适的严格条件而不用进行过度的实验。
本发明的序列特异性siRNA多核苷酸可以使用一或多种标准设计。例如，为设计具有与编码感兴趣的多肽(例如Akt3及本文所述其它多肽)的序列相同的19个连续核苷酸的siRNA多核苷酸，所述多核苷酸序列的开放读框被扫描以获取具有如下一或多个特征的21个碱基的序列：(1)A+T/G+C比率为大约1:1，但不高于2:1或者1:2；(2)AA二核苷酸或者CA二核苷酸在5’末端；(3)内部发夹环解链温度低于55℃；(4)同源二聚体解链温度低于37℃((3)和(4)所述的解链温度计算可使用本领域技术人员熟知的计算机软件确定)；(5)至少16个连续核苷酸的序列未被鉴别为在任何其它已知多核苷酸序列中存在(这种评估可使用技术人员可利用的计算机程序确定，例如使用BLAST检索公共数据库)。或者，可以使用购自各个商家的计算机软件(例如OligoEngine.TM.(Seattle，Wash.)；Dharmacon，Inc.(Lafayette，Colo.)；Ambion Inc.(Austin，Tex.)；QIAGEN，Inc.(Valencia，Calif.))设计及选择siRNA多核苷酸序列。(也见于Elbashiret al.，Gene & Development 15:188-200(2000)；Elbashir et al.，Nature411:494-98(2001)；[online]Internet：URL<http://www.mp-ibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/Tuschl-MIV2(3).sub.-2002.pdf.)。然后可以使用本领域已知的和本文所述的方法测试siRNA多核苷酸干扰靶多肽表达的能力。确定siRNA多核苷酸的效力不仅包括确认其干扰多肽表达的能力，还包括确认siRNA多核苷酸是否表现不希望的毒性作用，例如细胞的凋亡，这种细胞死亡不是RNA干扰所希望的作用(例如干扰细胞中Akt3的表达)。
本领域技术人员也易于意识到由于遗传密码简并的结果，本文所述的多肽可以由许多核苷酸序列编码。即一个氨基酸可以由一些不同的密码子之一编码，本领域技术人员可易于确定尽管一个特定核苷酸序列可与另一个序列不同(其可通过本文所述及本领域已知的比对方法确定)，但是所述序列可以编码具有相同氨基酸序列的多肽。例如，多肽中的亮氨酸可以由6个不同的密码子之一编码(TTA，TTG，CTT，CTC，CTA和CTG)，丝氨酸也如此(TCT，TCC，TCA，TCG，AGT和AGC)。其它氨基酸，如脯氨酸、丙氨酸和缬氨酸，可以由4个不同的密码子任一个编码(对于脯氨酸为CCT，CCC，CCA，CCG；对于丙氨酸为GCT，GCC，GCA，GCG；对于缬氨酸为GTT，GTC，GTA，GTG)。一些这样的多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。但是，本发明特别涵盖了由于密码子利用不同而不同的多核苷酸。
多核苷酸，包括靶多核苷酸(例如能编码感兴趣的靶多肽的多核苷酸)，可以使用各种技术制备，这些技术可用于制备特别希望的siRNA多核苷酸及用于鉴别和选择适合用于siRNA多核苷酸中的序列。例如，多核苷酸可以从合适类型的细胞或者组织中制备的cDNA中扩增。这类多核苷酸可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增。对于这种方法，可以基于本文提供的序列设计序列特异性引物，或者所述引物可以商购或者合成。扩增的部分可用于使用熟知技术从合适的文库(例如人黑素瘤cDNA)中分离全长基因或者其希望的一部分。在这类技术中，使用适于扩增的一或多种多核苷酸探针或者引物筛选文库(cDNA或基因组)。优选地，根据大小选择文库以包括较大的分子。也可以优选随机产生的文库以鉴别基因的5’和上游区域。优选基因组文库以获得内含子和延伸的5’序列。对于本发明涵盖的siRNA多核苷酸的合适序列也可选自siRNA多核苷酸序列的文库。
对于杂交技术，可以使用熟知的技术对部分序列进行标记(例如通过切口平移或者用32P末端标记)。然后可以通过将含有变性的细菌菌落(或者含有噬菌体噬斑的菌苔)的滤膜与标记的探针杂交而筛选细菌或者噬菌体文库(见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，N.Y.，2001)。选择杂交菌落或噬斑并扩增，分离DNA进行进一步分析。通过例如使用所述来自部分序列的引物和来自载体的引物进行PCR，对菌落进行分析以确定额外的序列的量。可以产生限制性图谱和部分序列以鉴别一或多个重叠克隆。全长cDNA分子可以通过使用熟知的技术连接合适的片段而产生。
或者，本领域已知许多从部分cDNA序列中获得全长编码序列的扩增技术。在这些技术中，扩增通常通过PCR进行。一种这样的技术称作“cDNA末端的快速扩增”或者RACE。这种技术包括使用内部引物和外部引物，其与聚A区域或者载体序列杂交，以鉴别已知序列的5’和3’序列。可以使用任何的可商购的试剂盒进行扩增步骤。引物可以使用例如本领域熟知的软件设计。引物(或者进行本发明期望的其它用途的寡核苷酸，包括例如探针和反义寡核苷酸)优选长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或者32个核苷酸，GC含量为至少40％并且在大约54—72℃与靶序列退火。扩增的区域可以如上述测序，重叠序列装配为连续序列。本发明一些实施方案中的某些寡核苷酸的长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33-35、35-40、41-45、46-50、56-60、61-70、71-80、81-90或者更多个核苷酸。
本文描述的核苷酸序列可以通过使用熟知的重组DNA技术而与各种其它核苷酸序列结合。例如，多核苷酸可以克隆进各种载体中，包括质粒、噬菌粒，λ噬菌体衍生物和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。通常地，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的一个复制起点，便利的限制性核酸内切酶位点，及一或多个选择标记(见例如WO01/96584；WO01/29058；美国专利No.6,326,193；U.S.2002/0007051)。其它元件取决于希望的用途，并且为本领域技术人员所显而易见。例如，本发明提供了siRNA多核苷酸序列在制备重组核酸构建体中的应用，所述重组构建体包括干扰希望的靶多肽如Akt3或B-Raf多肽在体内表达的载体；本发明还提供了siRNA转基因的或者“敲除”的动物和细胞(例如其中一或多个希望的多肽(例如靶多肽)的表达被完全或者部分损害的细胞、细胞克隆、细胞系或谱系，或者生物体)的产生。本发明提供的能干扰希望的多肽(例如靶多肽)表达的siRNA多核苷酸因此包括符合如下条件的任何siRNA多核苷酸，即当其与本发明提供的对象或者生物学来源在足以在无siRNA多核苷酸存在时发生靶多肽表达的条件下接触一定的时间时，导致可以检测到靶多肽的水平统计学显著地降低(或者称作表达“敲弱”)。优选地，使用本领域已知的及本发明提供的确定多肽表达的常规方法，相对于在没有siRNA的情况中检测到的多肽表达水平所述降低大于10％，更优选大于20％，更优选大于30％，更优选大于40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者98％。优选地，siRNA在细胞中的存在不导致或者引起任何不希望的毒性作用，例如在凋亡不是希望的RNA干扰作用的细胞中所述细胞的凋亡或者死亡。
本文揭示的Akt3 siRNA的19mer序列例如是人Akt3(NM005465)：Akt3 duplex 2:CUAUCUACAUUCCGGAAAG；Akt3 duplex 4：GAAUUUACAGCUCAGACUA；和Akt3 duplex 5：CAGCUCAGACUAUUACAAU。
本文揭示的Akt3siRNA的25mer序列如下所示：
Figure A200580008819D00621
本文所示的B-Raf siRNA的举例性25mer序列是针对人突变体B-Raf的序列:5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3′及针对人野生型B-Raf的序列:5’GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3’。
本发明还涉及病毒介导的策略的应用，其导致靶基因PTEN通过siRNA沉默。使用这个策略导致PTEN表达明显降低，从而导致总的磷酸化Akt增加。这种病毒介导的策略可用于鉴别黑素瘤中Akt3失调的机制，以建立该生物学过程的模型或者提供对这种癌症的治疗方法。
本发明还涉及包括或者编码本发明的siRNA多核苷酸的载体和构建体，特别涉及“重组核酸构建体”，其包括可被转录产生上述本发明的Akt3多核苷酸特异性siRNA多核苷酸的任何核酸，如DNA多核苷酸节段；本发明还涉及用本发明的载体和/或构建体遗传工程化的宿主细胞；本发明还涉及通过重组技术产生本发明的siRNA多核苷酸、多肽和/或融合蛋白或其片段或变体。本文作为RNA多核苷酸揭示的siRNA序列可以使用熟知的方法如本文所述方法工程化以产生相应的DNA序列。因此，例如DNA多核苷酸可以从本文所述的任何siRNA序列中产生，由此本发明的siRNA序列被认为也提供相应的DNA多核苷酸(及其互补序列)。这些DNA多核苷酸因此涵盖在本发明范围内，例如掺入本发明的重组核酸构建体中，从中siRNA可以被转录。
在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′CUAUCUACAUUCCGGAAAG3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′GAAUUUACAGCUCAGACUA3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′CAGCUCAGACUAUUACAAU3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC3′序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5’AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3’序列或其互补序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中所述siRNA分子包含具有5’AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3’序列或其互补序列的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，使用任何熟知的方法将所述物质与细胞接触，以将外源核苷酸序列导入宿主细胞中。这些包括脂质体、纳米脂质体(nanoliposome)、含有神经酰胺的脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒(nanoparticulate)、磷硅酸钙(calcium phosphor-silicate)纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒(nanocrystaline particulate)、半导体纳米颗粒、纳米树状物(nanodendrimer)、病毒、磷酸钙介导的核苷酸输送、聚(D-精氨酸)、电穿孔和显微注射。纳米脂质体、纳米颗粒、纳米树状物将物质输送至细胞中的应用在图5—11中表明，并进一步在2004年4月26日申请的专利申请系列No.10/835,520中进一步描述，在此并入参考。
反义多核苷酸
在另一个实施方案中，所述物质是一种反义多核苷酸。
本发明特别涉及的实施方案涉及通过使用反义多核苷酸减量调节Akt3活性，所述反义多核苷酸是互补于并且优选能与编码mRNA核酸序列例如Akt3 mRNA或者其亚序列特异性杂交的核酸。反义核苷酸与Akt3 mRNA的结合降低Akt3或者B-Raf mRNA的翻译和/或稳定性。
在本发明中，反义多核苷酸可包含天然发生的核苷酸，或者从天然发生的亚单位或其密切相关的同系物中形成的合成形式的核苷酸。反义多核苷酸也可以具有改变的糖组分或者糖间键。这些例如是本领域熟知的硫代磷酸酯及其它含硫化合物。只要它们发挥有效杂交Akt3或B-Raf mRNA的功能，所有这些类似物均包含在本发明中。这方面的综述见例如Jack Cohen，Oligodeoxynucleotides，Antisense Inhibitorsof Gene Expression，CRC Press，1989；和Synthesis 1:1-5(1988)所述。
拮抗剂
本发明还涉及一个实施方案，其中降低Akt3活性的物质是一种反义多核苷酸。本发明还涉及作为Akt3拮抗剂的Akt3蛋白的变体。Akt3蛋白的变体可以通过诱变产生(例如定点诱变或者Akt3蛋白的截短)。通过例如竞争性结合包括Akt3蛋白的细胞信号传导级联的上游或者下游成员，Akt3蛋白的拮抗剂可以抑制天然发生的Akt3蛋白的一或多种活性。因此，特异性生物学作用可以通过用有限功能的变体处理而激发。本发明预期用具有一亚集合的天然发生的蛋白质的生物学活性的变体处理对象与用天然发生的Akt3蛋白处理对象相比，在所述对象中具有较少的副作用。具有Akt3拮抗剂功能的Akt3蛋白的变体可以通过筛选组合的Akt3蛋白突变体(例如截短突变体)文库的Akt3拮抗剂活性而鉴别。本发明预期Akt3变体的多样化文库是通过在核酸水平的组合诱变产生的，并且是由多样化基因文库编码的。Akt3变体的多样化文库可以如下产生，例如将合成的寡核苷酸混合物经酶促连接进基因序列中，由此简并的潜在Akt3序列集合可以表达为各个多肽，或者表达为含有Akt3序列的较大融合蛋白的集合(例如用于噬菌体展示)。有许多方法可用于从简并的寡核苷酸序列中产生潜在的Akt3变体的文库。简并的基因序列的化学合成可以在自动化DNA合成仪中进行，然后合成的基因被连接进合适的表达载体中。使用简并的基因集合使得可以在一种混合物中提供编码希望的潜在Akt3序列集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域所熟知。见例如Narang，1983.Tetrahedron39:3；Itakura，et al.，1984.Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura，et al.，1984.Science 198:1056；Ike，et al.，1983.Nucl.Acids Res.11:477。
核酶
在另一个实施方案中，所述物质是一种核酶。核酶可用于靶向及抑制Akt3的转录。核酶是一种RNA分子，其催化裂解其它RNA分子。已经描述了不同性质的核酶，包括I组核酶，锤头状核酶，发夹核酶，RNAase P，及axhead核酶(核酶的性质的综述参见例如Castanotto et al.1994，Adv.In Pharmacology 25:289-317)。
发夹核酶的一般特征在例如Hampel et al.，1990，Nucl.AcidsRes.，18:299-304；Hampel et al.，1990，欧洲专利出版物No.0 360 257；美国专利No.5，254，678中描述。制备方法为本领域技术人员所熟知(见例如Wong-Staal et al.，WO 94/26877；Ojwang et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6340-6344；Yamada et al.，1994，Human GeneTherapy 1:39-45；Leavitt et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92:699-703；Leavitt et al.，1994，Human Gene Therapy 5:1151-120；及Yamada et al.，1994，Virology 205:121-126)。
Akt3多肽活性的抑制剂
在另一个实施方案中，Akt3活性被Akt3多肽的抑制剂这种物质降低。这个结果可以通过多种方式实现，包括提供一种显性阴性Akt3多肽，例如其自身无活性但与功能性Akt3存在于同一细胞中时可以降低或消除功能性Akt3的Akt3活性的一种Akt3形式。显性阴性形式的设计为本领域技术人员所熟知，例如Herskowitz，1987，Nature，329:219-22所述。另外，例如通过筛选抑制Akt3活性的能力，也可以使用失活的多肽变体(突变蛋白)。产生突变蛋白的方法为本领域所熟知(见例如美国专利No.5,486,463，5,422,260，5,116,943，4,752,585，4,518,504)。另外，可以筛选任何小分子例如任何肽、氨基酸、核苷酸、脂质、碳水化合物，或者任何其它有机或无机分子结合或者抑制Akt3活性的能力。
肽
在另一个实施方案中，相应于普列克底物蛋白同源性结构域或者Akt3的催化或者调节结构域的连续氨基酸序列的肽这种物质降低Akt3活性。不希望受这种理论的限制，所述肽预期作为假底物或者竞争性抑制剂起作用，从而抑制Akt3活性。在另一个实施方案中，所述肽作为Akt3催化或者调节(尾部)结构域的假底物而起作用。在另一个实施方案中，所述肽作为Akt3的催化结构域的竞争性抑制剂起作用。本发明人还预期所述肽作为普列克底物蛋白Akt3同源性结构域的竞争性抑制剂起作用。在另一个实施方案中，肽作为Akt3调节结构域的竞争性抑制剂起作用。技术人员可易于设计和确定一种肽是否降低Akt3的活性。Obata T et al.J Biol Chem.275(46):36108-15(2000)，Niv MY et al.J Biol Chem.279(2):1242-55.Epub 2003(2004)，Luo Y et al.Biochemistry.43(5):1254-63(2004)。
例如，将细胞与肽在适于测定Akt3活性的条件下保温。评估Akt3的活性并与合适对照物(例如在没有所述肽或混杂的肽的情况下在相同条件下保温的相同细胞的活性)比较，使用识别苏氨酸305或者丝氨酸472的抗体进行Western印迹分析进行这种评估和比较。识别Akt3的抗体可购自许多公司，包括Stratagene(La Jolla，CA)和IGeneX，Inc.(Palo Alto)。或者，Akt3活性可以通过免疫沉淀Akt3并使用免疫沉淀物在体外激酶测定中进行评估，其中Crosstide(Akt3的一种合成的肽底物，购自Discover Rx Corporation，Fremont，CA)通过Akt3磷酸化而评估活性。与对照相比较高或者较低的磷酸化活性表明测试肽降低所述Akt3的活性。
肽包含大约5—30个氨基酸残基，优选10—20个氨基酸残基。本发明的肽序列可以通过固相肽合成(例如BOC或FMOC)方法，通过液相合成方法，或者通过其它合适技术包括组合前述方法合成。已经确立并广泛使用的BOC和FMOC方法由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.88:2149(1963)；Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，C.H.Li，Ed.，Academic Press，1983，pp.48-267；及Barany andMerrifield，in The Peptides，E.Gross andJ.Meienhofer，Eds.，Academic Press，New York，1980，pp.3-285描述。固相肽合成方法在Merrifield，R.B.，Science，232:341(1986)；Carpino，L.A.and Han，G.Y.，J.Org.Chem.，37:3404(1972)；和Gauspohl，H.et al.，Synthesis，5:315(1992))中描述。这些参考文献的教导在此并入参考。
小分子
本发明还涉及一个实施方案，其中降低Akt3活性的物质是一种小分子。小分子也可以用于调节例如所揭示的激酶、激酶受体、与激酶受体相互作用的分子及激酶受体信号传导途径中的分子的功能。本领域技术人员已知怎样产生这种类型的小分子、文库及分离小分子调节物的方法。如本文所用，术语“小分子”优选结合Akt3和/或B-Raf并抑制其至少一种功能。
调节物和结合化合物
作为Akt3和/或B-Raf蛋白的调节物测试的化合物可以是任何小化合物，或者生物学实体，如蛋白质、糖、核酸或者脂质。典型地，测试化合物是小化学分子和肽。基本上任何化合物在本发明的分析试验中均可用作潜在的调节物或者结合化合物，尽管通常大多数化合物可以溶解在水或有机(尤其是基于DMSO的)溶液中。设计测定以通过自动进行分析步骤及将任何常规来源的化合物提供给测定来筛选大的化学文库，典型地平行进行试验(例如呈在自动化测定中的微滴板上微滴定的格式)。应意识到有许多化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，Mo.)，Aldrich(St.Louis，Mo.)，Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)，Fluka Chemika-Biochemica Analytik(Buchs，Switzerland)等等。
本发明涉及高通量筛选方法，包括提供含有大量潜在治疗性化合物(潜在的调节或结合化合物)的组合化学或肽文库。然后以本文所述的一或多种测定筛选这种“组合化学文库”，以鉴别具有希望的特有活性的那些文库成员(特定化学种类或亚类)。由此鉴别的化合物可作为常规的“先导化合物”或者其自身即可用作潜在的或者实际的治疗剂。
组合化学文库是通过化学合成或者生物学合成，通过组合许多化学“构建模块”如试剂而产生的不同化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库是通过以给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)的每种可能方式组合一系列化学构建模块(氨基酸)形成的。通过这种组合混合化学构建模块可以合成数百万个化合物。
组合化学文库的制备和筛选为本领域技术人员所已知。这种组合化学文库包括但不限于肽文库(见例如美国专利No.5,010,175，Furka，1991，Int.J.Pept.Prot.Res.37:487-493和Houghton et al.，1991，Nature354:84-88)。也可以使用产生化学多样性文库的其它化学。这种化学包括但不限于：肽(例如PCT出版物No.WO91/19735)，编码的肽(例如PCT出版物No.WO93/20242)，随机的生物寡聚体(例如PCT出版物No.WO92/00091)，苯二氮卓类(benzodiazepines)(例如美国专利No.5,288,514)，diversomers如乙内酰脲、苯二氮卓和二肽(Hobbs et al.，1993，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909-6913)，vinylogous多肽(Hagihara et al.，1992，J.Amer.Chem.Soc.114:6568)，具有葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(Hirschmann et al.，1992，J.Amer.Chem.Soc.114:9217-9218)，小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，1994，J.Amer.Chem.Soc.116:2661)，寡氨基甲酸酯(Cho et al.，1993，Science261:1303)，和/或肽基膦酸酯(Campbell et al.，1994，J.Org.Chem.59:658)，核酸文库(见Ausubel，Berger and Sambrook，如前)，肽核酸文库(见例如美国专利No.5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughn et al.，1996，Nature Biotechnology，14:309-314和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如Liang et al.，1996，Science，274:1520-1522和U.S.Pat.No.5，593，853)，小的有机分子文库(见例如苯二氮，Baum，1993，C&EN，January 18，page 33；类异戊二烯，美国专利No.5,569,588；thiazolidinones和metathiazanones，美国专利No.5,549,974；吡咯烷，美国专利No.5,525,735和5,519,134；morpholino化合物，美国专利No.5,506,337；苯二氮，美国专利No.5,288,514，等等)。
制备组合文库的设备可商购(见例如357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Sky.，Symphony，Rainin，Woburn，Mass.，433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.，9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。另外，许多组合文库可商购(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，1C.9St.Louis，Mo.，3DPharmaceuticals，Exton，Pa.，Martek Biosciences，Columbia，Md.，etc.)。
化疗剂
在另一个实施方案中，凋亡是通过降低Akt3活性联合化疗剂诱导的。如本文所用，化疗包括用单一的化疗剂或者用组合的药剂治疗。本发明可以使用的化疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗生素、天然产物或者植物衍生的产物、激素和类固醇(包括合成类似物)，及铂制剂，如Soengas MS，Lowe SW.Apoptosis and MelanomaChemoresistance.Oncogene.2003 May 19；22(20):3138-51所述。这些种类的药剂实例在下文示出。烷化剂包括但不限于例如亚硝基脲、氮芥和三氮烯。亚硝基脲包括但不限于例如卡氮芥，洛莫司汀(lomustine)和司莫司汀(semustine)。氮芥包括但不限于例如环磷酰胺。三氮烯包括但不限于例如达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide)。FDA已经许可达卡巴嗪用于治疗黑素瘤。抗代谢物包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂：氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、pentostatine和吉西他滨(gemcitabine)。本发明可以使用的抗生素包括但不限于蒽环类。蒽环类包括但不限于阿霉素。本发明可使用的天然或者植物衍生的产物包括但不限于例如长春花属生物碱(vinca alkaloid)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、taxanes。长春花属生物碱例如包括但不限于长春新碱和长春碱。表鬼臼毒素例如包括包括但不限于topside。Taxanes例如包括但不限于taxol、paclitaxel和docetaxel。本发明可以使用的激素类似物和类固醇例如包括但不限于抗雌激素、17-α-炔雌醇(Ethinylestradiol)、二乙基已烯雌酚、睾酮、强的松、氟羚甲基睾丸素、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、睾内酯(testolactone)、甲地孕酮(megestrolacetate)、三苯氧胺、甲基强的松龙、甲基睾酮、脱氢皮质(甾)醇、氟羟脱氢皮质甾醇、三对甲氧苯氯乙烯、羟基孕酮、氨苯哌酮(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林(leuprolide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、诺雷德(zoladex)。本发明可以使用的铂制剂药物例如包括但不限于顺铂、卡铂(carboplatin)、羟基脲、安吖啶(amsacrine)、甲基苄肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、左旋咪唑、和六甲基三聚氰胺。
安全及有效地给予大多数这些化疗剂的方法为本领域技术人员所已知。另外，这些化疗剂的给予在标准文献中描述。例如，许多化疗剂的给予方法在例如Physicians′Desk Reference(PDR)，1996版本(Medical Economics Company，Montvale，N.J.07645-1742，USA)中描述；在此并入参考。
放射
放射可任选加入本发明的治疗方案中。如本文所用，术语“放射”具有其常规的含义，并且仅限于X射线具有足够的能量穿透机体并且能诱导肿瘤特异性抗原在体内释放的程度。本领域技术人员已知破坏特定类型肿瘤的最佳放射强度。
凋亡
本领域技术人员已知使用各种方法怎样检测和/或测定凋亡，例如使用Dengler et al.，(1995)Anticancer Drugs.6:522-32所述的碘化丙啶(propidium iodide)流式细胞计量分析，或者Gorozyva，(1993)Cancer Res 53:1945-51所述的原位末端脱氧核苷酸转移酶和切口平移分析(TUNEL分析)。
治疗黑素瘤肿瘤
本发明部分基于本发明人的观察结果，即Akt3调节凋亡并且V599EB-Raf调节生长和血管发育。这是一个有意义的发现，因为其首次鉴别了有效的组合靶向治疗黑素瘤的方法。如前所述，降低Akt3活性可增加黑素瘤细胞对凋亡的敏感性；因此，当黑素瘤中Akt3活性被降低时，通过凋亡起作用的物质如常规的化疗剂是更有效的。在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗哺乳动物黑素瘤的方法，包括将有效量的降低V599EB-Raf活性的物质给予肿瘤；将有效量的降低Akt3活性的物质给予肿瘤，从而缩小肿瘤大小。
在一个优选的实施方案中，降低Akt3活性的物质是一种siRNA分子。在另一个优选的实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中降低Akt3活性的siRNA分子包含一种具有如下序列的多核苷酸：
5’GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′，
5′CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′，
5′GAAUUUACAGCUCAGACUA 3′，
5′CAGCUCAGACUAUUACAAU 3′，
5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3′，
5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3′，
5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3′，
5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3′，
5′AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3′，
5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3′或者其互补序列。
在一个实施方案中，降低B-Raf活性的物质是一种siRNA分子。在一个优选的实施方案中，所述物质是一种siRNA分子，其中降低B-Raf活性的siRNA分子包含一种具有如下序列的多核苷酸：
5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′，和/或
5′GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3′。
在一个优选的实施方案中，使用熟知的方法将降低Akt3活性的物质与细胞接触以将外源核苷酸序列导入宿主细胞中。这些包括脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、纳米树状物、病毒、磷酸钙介导的核苷酸输送、聚(D-精氨酸)、电穿孔和显微注射。纳米脂质体、纳米颗粒、纳米树状物将物质输送至细胞中的应用在图5—11中表明，并进一步在2004年4月26日提请的专利申请系列No.10/835,520中描述，该申请在此并入参考。
在一个优选的实施方案中，使用任何熟知的方法将降低B-Raf活性的物质与细胞接触，以将外源核苷酸序列导入宿主细胞。这些包括脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、纳米树状物、病毒、磷酸钙介导的核苷酸输送、聚(D-精氨酸)、电穿孔和显微注射。纳米脂质体、纳米颗粒、纳米树状物将物质输送至细胞中的应用在图5—11中表明，在2004年4月26日提请的专利申请系列No.10/835520中进一步阐述，该申请在此并入参考。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种使用纳米技术给予多种物质以抑制黑素瘤肿瘤发育及增加或者诱导凋亡的方法。将Akt3肽的组合；Akt3 siRNA，V599E B-Raf siRNA，Paclitaxel，卡铂，亚硝脲氮芥，达卡巴嗪或者长春碱同时装载在非毒性脂质体中。这些脂质体有效地将这些装载物输送至培养生长的黑素瘤细胞中。这是首次证实了使用单一的输送剂将不同的治疗剂同时输送至癌细胞中。携带组合治疗剂的脂质体在血液中行进，进入肿瘤血管中，由暴露的黑素瘤细胞吸收。这样导致靶向杀死黑素瘤细胞，使得肿瘤衰减。这种方法的临床效用是将组合的治疗剂输送至肿瘤中。抗CD63抗体与从所述脂质体伸出的pegalation节段的共价连接导致被黑素瘤细胞优先吸收。因此，基质组织吸收很少的或者不吸收脂质体，表明脂质体的靶向输送。相对于吸收进对照基质组织中，所述免疫脂质体可以增强吸收进黑素瘤肿瘤细胞中。
在另一个实施方案中，降低Akt3活性的物质是一种反义多核苷酸。在一个实施方案中，降低B-Raf活性的物质是一种反义多核苷酸。
在另一个实施方案中，降低Akt3活性的物质是一种核酶。在另一个实施方案中，降低B-Raf活性的物质是一种核酶。核酶可用于靶向及抑制Akt3、B—Raf或者这两者的转录。
在另一个实施方案中，Akt3活性是通过Akt3多肽抑制剂降低的。这可以通过许多方式实现，包括提供显性阴性的Akt3多肽，例如自身无活性但当与功能性Akt3存在于同一细胞中时降低或者消除功能性Akt3的活性的一种Akt3形式。在另一个实施方案中，B-Raf活性是通过B-Raf多肽的抑制剂降低的。在一个优选的实施方案中，B-Raf抑制剂是BAY43-9006。B-Raf的抑制剂包括但不限于BAY43-9006(可商购自BAYER)或者其它可商购的B-Raf抑制剂。B-Raf的抑制剂可另外包括竞争性和非竞争性B-Raf抑制剂。竞争性B-Raf抑制剂是以相互专有的底物结合的方式结合B-Raf酶的分子。典型地，B-Raf的竞争性抑制剂结合活性位点。非竞争性B-Raf抑制剂可以是抑制B-Raf合成，但其与所述酶的结合不是相互专有的底物结合。本发明涉及的B-Raf抑制剂是至少在相当浓度降低动物细胞中B-Raf活性而对其它细胞活性无任何明显作用的化合物。然而，这种抑制可以通过各种方式实现，包括提供显性阴性B-Raf多肽，例如其自身无活性但是当与功能性B-Raf存在于同一细胞中时降低或消除功能性B-Raf的活性的一种B-Raf形式。
在另一个实施方案中，降低Akt3活性的物质是相应于Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域或者催化或调节结构域的连续氨基酸序列的肽。
本发明还涉及其中降低Akt3活性的物质是小分子的实施方案。在另一个实施方案中，本发明还涉及其中降低B-Raf活性的物质是小分子的实施方案。
在另一个实施方案中，治疗黑素瘤的方法包括给予化疗剂。如本文所用，化疗包括用单一的化疗剂治疗或者组合多种药剂治疗。可用于本发明的化疗剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、抗生素、天然或者植物衍生的产物、激素和类固醇(包括合成的类似物)及铂药剂。
在另一个实施方案中，治疗哺乳动物黑素瘤的方法包括放射疗法。
在优选的实施方案中，本发明的方法可通过对细胞死亡(例如通过凋亡)以及增殖和血管发生具有显著作用而用于治疗黑素瘤。本领域技术人员熟知测定肿瘤大小以测定例如肿瘤大小的退化或缩减、血管发生和凋亡的方法。有益地，化疗剂可以相对低的剂量(和/或较低的频率)给予，以使得对正常的未转化细胞的毒副作用最小。
因此，本发明还提供了在黑素瘤患者中诱导显著水平的癌细胞死亡(例如凋亡)及抑制黑素瘤肿瘤发育的方法，所述方法包括同时或者相继给予有效量的降低Akt3活性的物质及降低B-Raf活性的物质。如本文所用，术语“同时”是指在同一时间，或者在一通用治疗计划期间的不同时间；“相继”是给予降低Akt3或B-Raf活性的物质之一，再给予降低B-Raf或Akt3活性的另一种物质，其中第二种物质可以在给予第一种物质之后立即给予，或者第二种物质可以在给予第一种物质有效时间之后再给予；所述有效时间是给予第一种物质后实现最大益处的时间量。
靶向Akt3与突变体V599EB-Raf及选择的化疗方法与单独的靶向方法比较具有增效、更强力和延长的作用。这提供了组合靶向治疗与选择的化疗方法的理论基础，这种组合方法目前还未用于黑素瘤的治疗中。
Akt3和/或B-Raf蛋白及Akt3相关和/或/B-Raf相关的蛋白质的应用
本发明的蛋白质具有许多特别的用途。Akt3和B-Raf均是造成黑素瘤发育的关键蛋白质。Akt3和/或B-Raf蛋白及Akt3或B-Raf相关蛋白用于评定正常组织和癌组织中Akt3和/或B-Raf基因产物的状态，从而阐明恶性肿瘤的表型。典型地，来自Akt3或B-Raf蛋白特定区域的多肽可用于评定那些区域(如含有一或多个基序的区域)中干扰的存在情况(如缺失、插入、点突变等等)。非限制性实例包括使用靶向Akt3和/或B-Raf蛋白和分别含有Akt3和/或B-Raf蛋白质序列内所含的一或多个生物学基序的氨基酸残基的Akt3相关和/或B-Raf相关蛋白质的抗体，以评估正常组织与癌组织中这个区域的特征或者激发对表位的免疫应答。或者，分别含有Akt3和/或B-Raf蛋白质中一或多个生物学基序的氨基酸残基的Akt3相关和/或B-Raf相关蛋白质用于筛选与Akt3和/或B-Raf的该区域相互作用的因子。
Akt3和B-Raf蛋白片段/亚序列特别有用于产生和鉴定结构域特异性抗体(例如识别Akt3或B-Raf蛋白的胞外或者胞内表位的抗体)，用于鉴别结合Akt3或B-Raf或者其特定结构域的物质或细胞因子，及用于各种治疗和诊断、包括但不限于诊断测定、癌症疫苗和制备这些疫苗的方法中。
由Akt3和/或B-Raf基因或其类似物、同系物或者片段编码的蛋白质具有许多用途，包括但不限于产生抗体及用于鉴别结合Akt3和/或B-Raf基因产物的配体和其它物质和细胞组分的方法中。针对Akt3或B-Raf蛋白质或其片段产生的抗体可用于控制特征在于Akt3或B-Raf蛋白表达的人黑素瘤的诊断和预后测定及成像方法学中。
可以使用用于检测Akt3和/或B-Raf蛋白的各种免疫学测定，包括但不限于各种类型的放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫荧光测定(ELIFA)、免疫细胞化学方法，等等。抗体可以加以标记并用作能检测Akt3或B-Raf表达细胞的免疫学成像试剂。
黑素瘤中Akt3和/或B-Raf的抗体
根据本发明，在黑素瘤中发现的分别由Akt3同种型或者B-Raf同种型编码的Akt3和/或B-Raf多肽包括其片段，包括融合蛋白，可以用作抗原或者免疫原以产生抗体。优选地，抗体特异性结合人Akt3同种型，但不结合其它形式的Akt。优选地，抗体特异性结合人B-Raf同种型，但不结合其它形式的B-Raf。
当分子能与免疫系统的抗原识别分子如免疫球蛋白(抗体)或者T细胞抗原受体特异性相互作用时，该分子是“抗原性的”。抗原性多肽或肽含有至少大约5个、优选至少大约10个氨基酸。分子的抗原性部分可以是对于抗体或者T细胞受体识别免疫显性的部分，或者可以是通过将该抗原性部分与载体分子缀合进行免疫而用于产生该分子的抗体的那部分。抗原性分子不需要自身是免疫原性的，免疫原性是指能不用载体即能激发免疫应答。
这类抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。本发明的抗Akt3抗体可以是交叉反应性的，例如它们可以识别不同物种的Akt3。相似地，本发明的抗B-Raf抗体可以是交叉反应性的，例如它们可以识别不同物种的B-Raf。多克隆抗体具有较高的交叉反应可能性。或者，本发明的抗体可以特异于单链形式的Akt3或B-Raf。优选地，这种抗体特异于人黑素瘤Akt3或B-Raf。
可以使用本领域已知的各种方法产生多克隆抗体。对于抗体的产生，可以将各种宿主动物通过注射Akt3或B-Raf多肽或其衍生物(例如片段或者融合蛋白)而进行免疫，宿主动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等等。在一个实施方案中，Akt3或B-Raf多肽或其片段可以与一种免疫原性载体缀合，例如与牛血清白蛋白(BSA)或者匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)缀合。根据宿主物种可以使用各种佐剂以增加免疫学应答，佐剂包括但不限于弗式佐剂(完全和不完全佐剂)、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔嘁血蓝蛋白、二硝基酚及潜在有用的人的佐剂如BCG(bacille Calmette-Guerin)和短小棒杆菌。
为了制备Akt3或B-Raf多肽的单克隆抗体、其片段、类似物或者衍生物，可以使用连续培养细胞系产生抗体的任何技术。这些技术包括但不限于最初由Kahler和Milstein揭示的杂交瘤技术(Nature256:495-497(1975)，以及trioma技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozboret al.，Immunology Today 4:721983；Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030(1983))，及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole et al.，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss，Inc.，pp77-96(1985))。在本发明的另一个实施方案中，单克隆抗体可以在无菌动物中产生(国际专利出版物No.WO89/12690，1989年12月28日公布)。事实上根据本发明可以使用用于通过剪接来自特异于Akt3多肽的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物学活性的人抗体分子的基因而生产“嵌合抗体”而开发的技术[Morrison et al.，J.Bcateriol159:870(1984)；Neuberger et al.，Nature 312:604-608(1984)；Takeda etal.，Nature 314:452-454(1985)]；这类抗体在本发明的范围内。这类人或人源化的嵌合抗体优选用于治疗人类疾病(如下所述)，因为人或人源化抗体与异种抗体相比自身诱导免疫应答、特别是变态反应应答的可能性低得多。
可以调整用于单链Fv(scFv)抗体产生的技术[Huston的美国专利No.5,476,786和5,132,405；美国专利No.4,946,778]而用于产生Akt3多肽特异性单链抗体。本发明的另一个实施方案利用用于构建Fab表达文库的技术[Huse et al.，Science 246:1275-1281(1989)]，以快速和简便地鉴别具有对Akt3多肽或其衍生物或类似物的希望的特异性的单克隆Fab片段。
含有抗体分子的独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这种片段包括但不限于：F(ab′)2片段，其可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子而产生；Fab′片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生；Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生。
在抗体的产生中，筛选希望的抗体可以通过本领域已知的技术完成，例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或者放射性同位素标记)、Western印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血凝集测定)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定、及免疫电泳测定，等等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测初级抗体上的标记而检测。在另一个实施方案中，初级抗体是通过检测二级抗体或者试剂与初级抗体的结合而检测。在另一个实施方案中，二级抗体是标记的。本领域已知许多方式在免疫测定中检测结合，这些都在本发明的范围内。例如，为了选择识别Akt3或者B-Raf多肽或肽的特异性表位的抗体，可以测定产生的杂交瘤的结合含有这种表位的Akt3或B-Raf多肽片段的产物。为了选择特异于来自一特定物种动物的Akt3或B-Raf多肽的抗体，可以基于与由所述物种动物的细胞表达的或者分离自其中的Akt3或B-Raf多肽或肽的阳性结合而进行选择。
与Akt3或者B-Raf相互作用的分子的鉴别
在黑素瘤中发现的Akt3和B-Raf蛋白质和核酸序列使得技术人员可以鉴别与Akt3或者B-Raf相互作用的蛋白质、小分子及其它物质，以及由Akt3或者B-Raf通过任一种公认的方案激活的途径。例如，技术人员可利用一种所谓的相互作用捕获系统(也称作“双杂交测定”)。在这种系统中，分子相互作用并重建一种转录因子，其指导报道基因的表达，基于此测定报道基因的表达。其它系统通过重建真核细胞转录激活物而鉴别体内蛋白质—蛋白质相互作用，见例如1999年9月21日授权的美国专利No.5,955,280，1999年7月20日授权的美国专利No.5,925,523，1998年12月8日授权的美国专利No.5,846,722及1999年12月21日授权的美国专利No.6,004,746所述。基于基因组推测蛋白质功能的算法在本领域也可获得(见例如Marcotte，et al.，Nature 402:4 November 1999，83-86所述)。
或者，可以筛选肽文库以鉴别与Akt3或者B-Raf蛋白质序列相互作用的分子。在这种方法中，与Akt3或者B-Raf结合的肽通过筛选编码随机或者受控的氨基酸集合的文库而鉴别。由所述文库编码的肽作为噬菌体外壳蛋白的融合蛋白而表达，然后分别针对Akt3或者B-Raf蛋白筛选噬菌体颗粒。
因此，不需要任何先前的关于预期的配体或者受体分子的结构信息，就鉴别了具有广泛用途如用作治疗、预测或诊断试剂的肽。
药物组合物
在一个实施方案中，治疗黑素瘤的药物组合物包含一种降低Akt3活性的物质及一种载体。适用于本发明的载体为本领域技术人员所已知。这些载体包括但不限于脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白质脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树状物、病毒、及磷酸钙介导的核苷酸输送。
在另一个实施方案中，药物组合物包含一种物质，其包括但不限于siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽及小分子。在其它实施方案中，小干扰RNA(siRNA)分子包括如下多核苷酸：
5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′，
5′CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′，
5′GAAUUUACAGCUCAGACUA 3′，
5′CAGCUCAGACUAUUACAAU3′，
5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG3′，
5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3′，
5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3′，
5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3′，
5′AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU3′，
5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU3′或者其互补序列。在另一个实施方案中，药物组合物包含一种物质，其是作为Akt3的假底物的肽。在另一个实施方案中，所述肽作为Akt3的催化结构域的假底物。
在另一个实施方案中，降低Akt3活性的物质是作为Akt3竞争性抑制剂的一种肽。所述肽可作为Akt3的催化结构域、Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域和/或Akt3的调节结构域的竞争性抑制剂。在另一个实施方案中，药物组合物包括降低B-Raf活性的物质。所述物质包括siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、肽、及小分子。在另一个实施方案中，降低B-Raf活性的物质是小干扰RNA(siRNA)分子，其包含：多核苷酸5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU3′或者其互补序列，或者多核苷酸5′GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU3′或者其互补序列。
如下实施例只是例证了本发明而无限制本发明之意。
关于Akt3的实施例
材料和方法
实施例1：siRNA介导的Akt同种型的下调
为了证实针对Akt1、Akt2和Akt3(Dharmacon)的siRNA在UACC903细胞中的特异性，将HA-标记的Akt1、Akt2或者Akt3构建体与各自的siRNA一起共核转染(co-nucleofected)。用于这些研究的Akt构建体先前已经描述(Sun et al.，Am J Path 159:431-437(2001)；Mitsuuchi et al.，J Cellular Biochem 70:433-441(1998)；及Brodbeck etal.，J Biol Chem 274:9133-9136(1999))。将每种构建体(5μg)，单独或与100pmol或200pmol各自siRNA组合，使用Amaxa Nucleofector通过核转染导入7×105UACC 903细胞中。使用表达GFO的构建体的所得转染效率>60％。72小时后收获蛋白质裂解物，如前所述进行Western印迹分析(Stahl et al.，Cancer Res 63:2891-2897(2003))。还使用siRNA核转染以敲弱Akt同种型和/或PTEN(Dharmacon)在黑素细胞和黑素瘤细胞系UACC 903、SK-MEL-24、WM115和WM35中的内源表达。对于WM35使用Amaxa核转染试剂和黑素细胞核转染方案，而其它细胞系使用Amaxa溶液R/程序K-17进行核转染。这些细胞系的生长条件先前已经描述(Stahl et al.，Cancer Res 63:2891-2897(2003)；Hsu et al.，In Human Cell Culture，J.R.W.M.a.B.Palsson，editor.Great Britain:Kluwer Academic Publishers.259-274(1999))。
实施例2：Western印迹、免疫沉淀和激酶分析
Western印迹方法和使用的抗体，除了Akt2(Santa Cruz)和Akt3(Upstate Biotech)之外，先前均已报道(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。对于免疫沉淀，在向细胞平板中加入蛋白质裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，0.1％ Triton X-100，1mM EDTA，1mMEGTA，50mM NaCl，10mM β甘油磷酸钠，5mM焦磷酸钠，1mM原钒酸钠，0.1％ 2-巯基乙醇和0.5％蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))之后收集蛋白质，随后在液氮中速冻。细胞碎片通过离心(≥10,000×g)裂解物沉淀，使用BioRad BCA蛋白质分析量化蛋白质浓度。将免疫沉淀的蛋白质(100μg)与2μg的Akt2或者5μl的Akt3抗体在4℃持续混合保温过夜。接着，将15μl平衡的GammaBind G琼脂糖珠(Amersham Biosciences)加入每个试管中，在4℃持续混合保温2小时。将沉淀的珠用裂解缓冲液洗涤两次以除去未结合的抗体和蛋白质。然后将样品重悬及根据Invitrogen Life Technologies提供的方案使用NuPage Gel System在还原条件下电泳。Western印迹用磷-Akt探查并通过如前所述密度计量方法量化(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。
对于Akt激酶分析，将15μl平衡的GammaBind G琼脂糖珠用200μl裂解缓冲液洗涤，然后与2μg Akt2或者5μl Akt3抗体在400μl体积中在4℃持续混合保温≥2小时。将MP Biomedicals的微囊藻素(1μM)加入裂解缓冲液中以保证细胞PP1和PP2磷酸酶完全失活。将抗体/琼脂糖复合物用750μl裂解缓冲液洗涤两次，然后与100μg蛋白质在400μl体积中在4℃持续混合保温≥1.5h小时。将该复合物用500μl裂解缓冲液洗涤(3×)，然后用500μl的分析稀释缓冲液(20mMMOPS，pH7.2，25mM μ-磷酸甘油，1mM原钒酸钠和1mM DTT)洗一次。向试管中加入Santa Cruz的于分析稀释缓冲液中的PKA抑制剂肽(10μM)、37.5μM ATP、17mM MgCl2、0.25μCi/μl γ-32P-ATP和90μM Akt特异性底物Crosstide(得自UIpstate Biotechnology)，在35℃持续混合保温10分钟。接着，将20μl液体移至磷酸纤维素纸上，其用40ml 0.75％磷酸洗涤3次5分钟。随后用丙酮洗涤5分钟，将磷酸纤维素干燥，移至具有5ml Amersham Biosciences闪烁液的闪烁瓶中，在Beckman Coulter LS3801液体闪烁系统中测定cpm。
实施例3：肿瘤研究及凋亡测定
根据Penn State Human Subjects Protection Office，the Dana-FarberCancer Institute Protocol Administration Office及Cooperative HumanTissue Network许可的方案从病人收集黑素瘤肿瘤。使用经福尔马林固定、石蜡包埋的归档黑素瘤样本进行免疫组织化学分析，以测定磷酸化的Akt。使用63个福尔马林固定、石蜡包埋的归档的黑素细胞损害样本进行免疫组织化学实验，使用磷-Akt(Ser473)单克隆抗体(Cell Signaling Technology)以1:50效价根据厂商推荐的方案进行。通过定性比较每个样本中存在的内部血管内皮、鳞状上皮或者平滑肌控制，确定染色的特异性和密度。
通过使用在液氮中冷却的研钵和研杵研磨由>60％肿瘤材料组成的、在液氮中速冻的肿瘤样本，收集用于进行Western印迹或者免疫沉淀的肿瘤蛋白质。向每200mg组织粉末中加入1ml蛋白质裂解缓冲液，在充满冰的超声器中超声2分钟(间隔15秒)。样本在4℃离心(～12，000×g)10分钟。将上清移至干净的试管中，使用BioRad BCA蛋白质分析进行量化。
根据Pennsylvania State College of Medicine的Institutional AnimalCare and Use Committee许可的方案进行动物实验。无胸腺雌性裸鼠购自Harlan Sprague Dawley，通过在4—6周龄裸鼠小鼠的左侧和右侧胸腔上部sc注射于含有10％ FBS的0.2ml DMEM中1×106个细胞来测定肿瘤动力学。为了进行涉及siRNA的动物实验，将1×106UACC903细胞用Akt同种型的siRNA核转染，48小时后将于含有10％ FBS的0.2ml DMEM中的核转染细胞sc注射至裸鼠小鼠的左侧和右侧胸腔上部。使用测径器隔天测定发生的肿瘤的直径。当测定凋亡时，每个部位注射5×106细胞，4天后收获4—6个肿瘤。使用如前所述的Roche TUNEL TMR Red凋亡试剂盒(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))对福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片进行凋亡测定。从三或四个不同的肿瘤切片中计数最少8个视野，TUNNEL阳性细胞的数目以凋亡细胞的百分比表示。
实施例4：统计学
为了进行统计学分析，使用Student′s t-检验进行成对比较及使用One-way ANOVA或者Kruskal Wallis ANOVA on Rank进行成组比较，随后进行合适的后续检验(Dunnett′s或者Dunn′s)。当P值为0.05时认为结果是显著的。
表1：在黑素瘤患者的普通痣、发育异常的痣、原发黑素瘤和转移黑素瘤中p-Akt染色的相对密度
 
种类(样品数目) p-Akt染色密度(％)中等至弱1           强2
普通痣(14)发育异常痣(25)原发黑素瘤(15)转移黑素瘤(9) 100                 0a88                  12b47                  53c33                  67d
1肿瘤细胞染色为与肿瘤切片中血管邻近的周细胞中的密度相似的密度。
2肿瘤细胞染色为高于肿瘤切片中血管邻近的周细胞中的密度。
统计学，对于a与c、d及b与d，P<0.5。
实验结果
实施例5：同种型特异性siRNA鉴别Akt3参与黑素瘤
在最近描述的实验性遗传黑素瘤模型中(Stahl et al.，Cancer Res63：2891-2897(2003))，证实了失调的Akt活性(通过PTEN丧失)在黑素瘤肿瘤发生中通过降低黑素瘤细胞的凋亡能力而起重要作用(Stahlet al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。我们推论既然这个模型反映了Akt在黑素瘤肿瘤发生中的重要性，则该模型可由于鉴别其失调的活性控制黑素瘤肿瘤发育的特异性Akt同种型。先前的结果(Stahl etal.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))确认亲代UACC 903(-PATEN)细胞具有增高的全部磷酸化的Akt表达(活性测定)(图1A)。PTEN在UACC 903细胞中的表达在三个独立衍生的细胞系(36A、29A和37A)中均导致Akt活性降低，其表达在肿瘤发生期间在丧失功能性PTEN活性的回复细胞系(36A回复体)中则相反
为了鉴别在黑素瘤中有活性的主要Akt同种型，我们使用特异于每个Akt同种型的siRNA以确定每个同种型使亲代UACC 903(-PTEN)细胞系中磷酸化(活性)Akt的量降低的程度。在UACC 903细胞中每个对于每个Akt同种型的敲弱表达的特异性通过共核转染表达标记的HA-Akt1、HA-Akt2或者HA-Akt3的构建体与特异于每个同种型的siRNA而确定。经证实是特异性，发现每个Akt siRNA仅降低其相应的Akt同种型的表达，如图1B所示。接着，将每个Akt同种型的siRNA核转染进UACC 903细胞系以及两个额外独立衍生的黑素瘤细胞系(WM115和SK-MEL-24)中，以确定哪个siRNA降低这些细胞中磷酸化(活性)Akt的水平(图1C)。虽然Akt1或Akt2的siRNA仅具有可忽略不计的无意义的作用，但是Akt3的siRNA显著降低总的磷酸化Akt的水平，提示在UACC903(PTEN)模型中Akt3是调节肿瘤发育的同种型(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。由于所有3个独立衍生的黑素瘤细胞系均表明Akt3在黑素瘤中是主要的活性同种型，因此随后的实验针对检测Akt3的失调，使用Akt2作为对比对照，因为据报道其在多种类型的癌症中是扩增的(Chen et al.，Proc Nat Acad Sciences USA 89：9267-9271(1992)；Cheng et al.，ProcNat Acad Sciences USA 93:3636-3641(1996)；Lu et al.，Chung-OHua IHsueh Tsa Chin[Chinese Medical Journal]75:679-682(1995)；Bellacosa etal.，Int J Cancer 64：280-285(1995)；及van Dekken et al.，Cancer Res 59：748-752(1999))。
为了进一步证实Akt3是在UACC 903(PATEN)肿瘤发生模型中活性被PTEN特异性降低的主要同种型，通过从细胞裂解物中免疫沉淀全部Akt3或者Akt2、随后通过Western印迹评估免疫沉淀的磷酸化(活性)Akt的量来测定Akt3的活性(图1D)。是磷酸化Akt3而非Akt2的水平在亲代UACC 903细胞系以及没有PTEN的两种肿瘤发生回复体36A细胞系中是增高的。相反，在具有低水平Akt活性的36A、29A或者37A细胞系中几乎观察不到能检测到的磷酸化Akt3水平，表面上看来是由于PTEN表达所致(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。为了证实磷酸化Akt3的水平反映活性Akt，将免疫沉淀的Akt3和Akt2在体外激酶分析中分析，Akt3的分析结果示于图1E。与表达PTEN的细胞比较，在回复体(-PATEN)中鉴别到Akt3(图1E)而非Akt2(数据未示出)活性存在统计学显著差异(P<0.05)。总之，这些结果表明Akt3活性在UACC903(PATEN)肿瘤发生模型中是由PTEN特异性调节的。
实施例6：在黑素瘤肿瘤进展期间早期出现Akt3活性增加
认为黑素细胞能直接转化进黑素瘤中(Herlyn，M.，Molecular andcellular biology of melanoma：Austin:R.G.Landes Co.(1993))。或者，黑素细胞可以符合一个肿瘤进展模型，其中它们可以从普通痣、非典型痣逐步原位进化为黑素瘤(径向及垂直生长期(Radial and verticalgrowth phases))，最后形成转移黑素瘤(Herlyn，M.，Molecular andcellular biology of melanoma：Austin:R.G.Landes Co.(1993))。无论过程如何，更具侵润性的肿瘤细胞的进化需要积累影响肿瘤抑制基因和致癌基因的改变。这样产生更加具有选择性生长或存活优势的细胞亚群，促进肿瘤发生进程。
为了提供在黑素瘤肿瘤进展期间选择性涉及Akt3的证据，在黑素瘤肿瘤进展模型中测定Akt3和Akt2表达和活性(由Dr.MeenhardHerlyn惠赠)(Herlyn，M.，Molecular and cellular biology of melanoma：Austin:R.G.Landes Co.(1993)；Hsu et al.，In Human Cell CultureJ.R.W.M.a.B.Palsson，editor.Great Britain：Kluwer Academic Publishers.259-274(1999))。在这个进展模型中，将黑素细胞与从原发黑素瘤肿瘤中在径向(WM35和WM3211)和垂直生长期(WM115、WM98.1和WM278)中建立的低传代细胞系比较。在与黑素细胞的比较中，图2A示出两个径向生长期之一和所有三个垂直生长期细胞系具有增高的磷酸化Akt，提示Akt活性在原发黑素瘤发生早期在径向生长期既已增加。接着，通过Western印迹检测Akt3同种型的表达，并与Akt2在这些细胞系中的表达相比较(图2B)。发现与黑素细胞比较，Akt3表达在除了WM98.1径向生长期细胞系之外的所有细胞系中均增高。由于表达不必需反映活性，通过对Akt3或者Akt2进行免疫沉淀、随后通过Western印迹分析测定免疫沉淀物中磷酸化Akt的水平来检测活性Akt3的量。与黑素细胞相比较，Akt3活性在除了WM35径向生长期细胞系之外的所有细胞系中均增高(图2C)。注意即使在WM98.1垂直生长期细胞系中Akt3蛋白表达与在黑素细胞中观察到的表达相似，但是Akt3活性显著较高。与Akt3的结果相反，与黑素细胞比较Akt2表达仅在径向生长期细胞系中增高(图2C)。然而，与黑素细胞比较时，仅仅WM3211径向生长期细胞系具有相应增加的Akt2活性，但是也具有增高的Akt3活性。这些数据提示Atk3是在黑素瘤肿瘤进展模型中主要涉及的活性Akt同种型。
实施例7：在黑素瘤患者肿瘤中Akt3失调的频率
由于前述实验鉴别了Akt3在UACC 903(PTEN)肿瘤发生和黑素瘤肿瘤进展模型中是主要的活性Akt同种型，接着在体内研究中针对确定黑素瘤患者肿瘤中Akt3失调的频率。首先通过免疫组织化学分析普通痣、发育异常的痣、黑素瘤患者的原发黑素瘤和转移瘤估定在黑素细胞损害处总磷酸化Akt的相对密度以确定Akt激活的频率(表1)。在100％的普通痣中检测到中等水平的染色，在12％的发育异常痣、53％的原发黑素瘤和67％的转移黑素瘤中观察到强染色。这些结果提示Akt活性在痣的发展中可以发挥一些未经确认的作用，失调的Akt活性是在晚期阶段的黑素瘤中起更重要作用的指征。
从公布的报道(Bastian et al.，Cancer Res 58：2170-2175(1998))中对含有Akt1、Akt2和Akt3基因的基因组区域的分析未发现扩增。然而，含有Akt3的1q43-44区域经历拷贝数增加(Bastian et al.，CancerRes 58：2170-2175(1998)；Thomson et al.，Cancer Genet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57：2765-2780(1997))，这提示过表达是造成黑素瘤中Akt3活性增加的机制。相反，含有Akt1的14q32区域和含有Akt2的19q13区域保持无改变或者趋于丧失(Bastian et al.，Cancer Res 58：2170-2175(1998)；Thomson et al.，CancerGenet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57：2765-2780(1997))。为了确定增加的Akt3表达是否是导致活性增加的一个选择性机制，从黑素瘤患者肿瘤提取蛋白质裂解物以比较Akt3和Akt2的表达和活性水平。从31个转移黑素瘤中提取蛋白质并通过Western印迹分析以确定肿瘤材料中Akt3和Akt2的表达和活性水平。
使用三个独立的Western印迹量化每个样品中的表达，然后与在黑素细胞中的表达相比较(图2D)。总的来说，61％(19/31)的肿瘤具有增高的Akt3蛋白质表达，与Akt2的10％(3/31)相比，其比在黑素细胞中观察到的表达水平增加～2—9倍。这些结果与文献报道的在黑素瘤肿瘤中发生的、含有Akt3基因的染色体1q43—44区域拷贝数增加的类型一致(Bastian et al.Cancer Res 58:2170-2175；Thomson et al.，Cancer Genter Cytogenet 83:93-104(1995)；和Mertens et al.，Cancer Res57：2765-2780(1997))。大约55％(6/11)的原发部位黑素瘤和65％(13/20)转移黑素瘤具有增加的Akt3表达。相反，当比较肿瘤与黑素细胞中Akt2的表达时，仅观察到可忽略不计的波动(图2D)。接着，通过量化在Akt3或者Akt2免疫沉淀中磷酸化的Akt测定活性水平。惊人地，磷酸化的(活性)Akt3在62±0.02％(SE)的样品中检测到(图2E)。相反，在这些肿瘤中检测非磷酸化的Akt2(除了阳性对照之外)。另外，与培养生长的黑素细胞比较，大约35％的肿瘤具有增高的Akt3活性。这些数据证实>60％的晚期阶段的黑素瘤患者的肿瘤中涉及Akt3失调，提示增加的表达是造成黑素瘤中Akt3活性失调的机制之一。
实施例8：黑素瘤中Akt3失调的机制
前述实验鉴别了Akt3在体外细胞培养模型和体内患者肿瘤中是主要的活性同种型。因此，我们接下来针对确定在黑素瘤中导致失调的Akt3活性的机制。由于最初的UACC 903(PTEN)肿瘤发生模型提示PTEN在调节黑素瘤中Akt活性中起重要作用，我们检测了降低PTEN表达是否直接及特异性增加Akt3活性。为了达到这个目的，在黑素细胞和径向生长期原代黑素瘤细胞(WM35)中通过siRNA敲弱PTEN表达(活性)，以测定对磷酸化Akt水平的影响。选择WM35细胞系是因为这些细胞具有可忽略不计的基本Akt3活性并且表达PTEN蛋白(见图1C)。正如所预测的，图3A和图3B示出siRNA-介导的对PTEN的下调导致总的磷酸化Akt4增加(泳道4和11)，而混杂的siRNA对照组呈现可忽略不计的无意义的作用(泳道2和9)。在PTEN下调后激活的主要Akt同种型通过用针对PTEN的siRNA与Akt1(泳道5和12)、Akt2(泳道6和13)或者Akt3(泳道7和14)的siRNA一起共核转染而确定。只有针对Akt3的siRNA(泳道7和14)将磷酸化Akt的水平降低至在非核转染细胞(泳道1和8)或者只用混杂的siRNA核转染的细胞(泳道2和9)中观察到的水平。相反，Akt1或者Akt2蛋白水平的降低不降低磷酸化Akt的量。再一次证明Akt3失调的选择性。因此，通过PTEN对Akt3活性的选择性调节是在黑素瘤中激活Akt3的主要机制。因为PTEN的丧失可以增加Akt3的活性而不用过表达。因此，PTEN降低会导致细胞PIP3(磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸)浓度增加，这可以在黑素瘤中有效地特异性增加Akt3活性。这种特异性的机制目前还未知。
来自黑素瘤患者的肿瘤材料的研究表明增加的Akt3表达在黑素瘤中可能也起增强Akt3活性的重要作用。为了研究这种可能性，将Akt3在表达PTEN蛋白的黑素细胞和WM35细胞(未示出)中过表达。将HA-标记的野生型Akt3在黑素细胞中过表达(图3C)，其是Akt3T305A/S472A(失活))或者豆蔻酰化的Akt3(活性)的失活形式。然后将细胞断绝生长因子24小时，补充完全培养基，10分钟后收获裂解物。Akt2的相等构建体用作对照(数据未示出)。与载体或者用激酶失活的Akt3核转染的细胞比较，野生型Akt3和豆蔻酰化的Akt3的过表达导致总体磷酸化的Akt水平增加。另外，与单独野生型Akt3表达比较(数据未示出)，siRNA-介导的PTEN敲弱与Akt3的过表达一起导致较高的磷酸化Akt水平。因此，单独Akt3的过表达或者组合PTEN丧失是在黑素瘤中导致增加Akt3活性的另一种机制。
实施例9：增加的Akt3活性通过降低凋亡促进黑素瘤肿瘤发生
由于在黑素瘤肿瘤中一致观察到失调的Akt3活性，因此随后的研究针对确定增加的Akt3活性促进肿瘤发生的机制。使用UACC903(PTEN)肿瘤发生模型细胞系证实在裸鼠模型中增加的Akt3活性促进黑素瘤肿瘤发生。将亲代UACC 903(-PTEN)、36A(+PATEN)或者36A回复体(-PTEN)细胞系的一百万个细胞注射进4—6周龄雌性裸鼠的皮下，10天后测定形成的肿瘤大小。图4A示出具有降低的Akt3活性的36A细胞与具有增高的Akt3活性的亲代UACC 903和回复体36A细胞比较是非致肿瘤发生的(P<0.5)。虽然36A回复体细胞与36A细胞比较肿瘤发生潜力显著增加，但由于用于产生这个模型的染色体10上的另一个黑素瘤阻抑基因的保持而导致肿瘤发育迟缓(Robertson et al.，Cancer Res 59：3596-3601(1999))。为了证实这些观察结果并证实Akt3参与黑素瘤肿瘤发生的特异性，我们使用siRNA产生UACC 903(Akt)模型。图4B所示与仅用缓冲液、混杂的siRNA或者针对Akt2或Akt1的siRNA核转染的细胞比较，在UACC 903细胞中siRNA-介导的Akt3表达(活性)明显减慢肿瘤发育(P<0.05)。因此，使用针对Akt3的siRNA特异性降低Akt3活性(图4B)或者增加PTEN表达(图4A)在裸鼠中均抑制黑素瘤肿瘤发育。
为了确定增加的凋亡是否是在Akt活性降低后在体内抑制肿瘤的主要机制(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))，在Akt3活性不同的UACC 903(PATEN)(图4C、4E)和UACC 903(Akt)(图4D、4F)模型中检测凋亡。将非致肿瘤发生的36A和致肿瘤发生的UACC903和36A回复体细胞系皮下注射进裸鼠中，4天后收获每个细胞类型的平行组中产生的时间和空间匹配的肿瘤实体，通过TUNNEL评估比较凋亡的程度(Stahl et al.，Cancer Res 63：2891-2897(2003))。与具有高Akt3活性的亲代UACC 903(-PATEN)或者36A回复体(-PATEN)细胞系形成的肿瘤比较，在具有低Akt3活性的36A(+PTEN)肿瘤实体中观察到明显较大数目的凋亡细胞(图4C，4E)(P<0.05)。在其中针对Akt3的siRNA用于降低Akt3表达(活性)的UACC903细胞中观察到相似结果。用缓冲液或者针对Akt2的siRNA核转染的细胞与用针对Akt3的siRNA处理的UACC 903细胞比较具有低大约5—7倍的凋亡细胞(图4D，4F)(P<0.05)。因此，这些结果表明Akt3活性优先调节凋亡的程度，从而有助于黑素瘤细胞存活并促进肿瘤发生。
对于Akt3的实验讨论
在本发明中，本发明人证实了Akt3是一种重要的存活激酶，部分与黑素瘤发育相关。使用反映Akt在黑素瘤肿瘤发生中重要性的UACC 903(PTEN)黑素瘤模型鉴别Akt3是在黑素瘤肿瘤发生期间失调的主要同种型。使用siRNA证实Akt3而非Akt1或者Akt2的选择性敲弱较低总体磷酸化的Akt水平及降低黑素瘤细胞的肿瘤发生潜力。在两个独立衍生的黑素瘤细胞系(WM115和SK-MEL-24)中发现相似的结果，进一步支持了这种发现的重要性。这个观察结果的临床实用性通过证实选择性抑制Akt3表达(通过siRNA敲弱)或者活性(通过PTEN表达)显著降低黑素瘤肿瘤发育而验证。
在这项研究中鉴别了导致黑素瘤中Akt3激活的两种独特机制。第一种机制依赖于结构正常的Akt3蛋白的过表达。对处于晚期阶段的黑素瘤病人进行分析示出在>60％的情况中Akt3表达增加。黑素细胞和WM35细胞中Akt3的过表达导致活性增加，证实人体肿瘤结果。Akt的过表达不是黑素瘤特有的，在报道Akt同种型的扩增的许多研究中在一些人体癌症中也已经报道。Akt1的扩增在胃癌中报道(Staal，S.O.，Proc Nat Acad Sciences USA 84:5034-5037(1987))，而Akt2基因扩增在卵巢、胰腺、胃和乳腺癌中报道(Cheng et al.，Proc Nat AadSciences USA 89:9267-9271(1992)；Ghent et al.，Proc NatAcad SciencesUSA 93:3636-3641(1996)；Lu et al.，Chung-Hua I Hsueh Tsa Chih[Chinese Medical Journal]75:679-682(1995)；Bellacosa et al.，Int JCancer 64：280-285(1995)；van Dekken et al.，Cancer Res 59：748-752(1999))。含有Akt基因的基因组区域的扩增在黑素瘤中无报道，一些报道描述了含有Akt3基因的染色体1的长臂拷贝数增加(Bastian et al.，Cancer Res 58:2170-2175(1998)；Thomson et al.，CancerGenet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57：2765-2780(1997))。相反，分别含有Akt1和Akt2基因的染色体14和染色体19的长臂趋于无改变或者丧失(Bastian et al.，Cancer Res 58：2170-2175(1998)；Thomson et al.，Cancer Genet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57：2765-2780(1997))。因此，Akt3基因的拷贝数增加是在黑素瘤发育中Akt3的表达和活性增加的机制之一。
第二种机制鉴别了在UACC 903(PTEN)模型中选择性Akt3激活部分是由于降低的PTEN活性所致。在黑素细胞和保持PTEN表达表达的原代黑素瘤细胞(WM35)中的相关观察结果示出siRNA-介导的PTEN降低特异性增加Akt3磷酸化(活性)，进一步巩固了Akt3参与黑素瘤发生的意义。鉴定了在得自黑素瘤患者的肿瘤材料中发生的遗传改变的公开研究提供了对于降低的PTEN表达在早期黑素瘤发生中起重要作用的额外支持(Bastian et al.，Cancer Res 58：2170-2175(1998)；Thomson et al.，Cancer Genet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57：2765-2780(1997)；Parmiter et l.，CancerGenet Cytogenet 30：313-317(1988))。特别地，在早期黑素瘤中由于染色体10的全部拷贝的丧失通常发生PTEN的一个等位基因丧失或者PTEN单倍体不足(haploinsufficiency)(Bastian et al.，Cancer Res 58：2170-2175(1998)；Thomson et al.，Cancer Genet Cytogenet 83：93-104(1995)；Mertens et al.，Cancer Res 57:2765-2780(1997)；Parmiter et al.，Cancer Genet Cytogenet 30:313-317(1988))。在这种情况下，推测染色体10的丧失在进展的黑素瘤细胞的一个亚群中降低PTEN表达，导致Akt3激活增加，为这些细胞提供选择性生长和存活优势。因此，由于黑素瘤中PTEN的单倍体不足或者活性丧失所致的表达降低在黑素瘤肿瘤进展中通过特异性增加Akt3活性而起重要作用。
在黑素瘤中PTEN表达降低之后Akt3而非Akt1和Art2的选择性激活的分子基础还未知。然而，我们推测导致这种特异性的机制涉及PIP3或者其它蛋白质与普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)结构域的优先相互作用。氨基末端PH结构域介导蛋白质—蛋白质及PIP3脂质—蛋白质之间的相互作用。人Akt3的PH结构域长度为大约104个氨基酸(NCBI登记号:NP_005456)，与Akt1和Akt2的相同性分别为84％和78％(Brazil et al.，Cell 111:293-303(2002)；Nicholson et al.，Cell Signal 14:381-395(2002))。另外，PH结构域中磷酸化位点在Akt同种型之间不同，还未鉴定其功能。例如，在第34位苏氨酸(在PH结构域内)的神经酰胺诱导的、PKC zeta-依赖性磷酸化位点通过阻止与PIP3结合而导致Akt1失活(Powell et al.，Mol Cell Biol 23：7794-7808(2003))。另一方面，Akt2和Akt3在这个位置是丝氨酸，其可以被磷酸化及不同调节。我们对三个Akt同种型的PH结构域中其它潜在磷酸化位点的分析鉴别了三个潜在的独特Akt3位点。Akt3的第21位残基是天冬酰胺，而Akt1和Akt2的等同位点上是苏氨酸。另外，还发现Akt3的第31位苏氨酸和第49位酪氨酸与其它两个Akt同种型不同(Akt1和Akt2分别为Asn31和Ser31；Akt1和Akt2分别为Ala50和Pro50)。因此，对于PIP3脂质结合PH结构域中推定的磷酸化位点的差别调节可为黑素瘤中Akt3激活的特异性提供基础。可能已知致癌基因之间的未为人知的相互作用可以选择性调节黑素瘤中Akt同种型的激活。例如，已经示出TCL1选择性结合Akt3 PH结构域并且促进Akt1与Akt3的异源寡聚化，导致Akt分子在白血病发生中的转磷酸作用(Laine et al.，J Biol Chem 277:3743-3751(2002))。黑素瘤细胞中TCL1或者其它未鉴定的因子可以相似方式促进选择性Akt3激活。
增加的Akt3激活在进展的至晚期侵润性的肿瘤中也起显著作用。在转移黑素瘤中Akt3表达和活性的检测表明在>60％的晚期阶段转移黑素瘤中出现Akt3表达或活性失常。然而，目前还未知升高的Akt3活性是否可预测疾病预后或者治疗方案的结果。在黑素瘤中Akt3激活的测定提供了作为一种新的、更精确的疾病预后指标的希望，这种指标优于目前使用的组织病理学测定如Breslow深度(即从粒细胞层至最深的肿瘤细胞的以毫米测定的距离)和溃疡(即丧失覆盖黑素瘤的表皮)。评定黑素细胞损害中Akt3的激活状态的一种基于分子的测试比组织学评估可以更敏感并且主观性较低。这种方法也可用于选择合适的患者以利用设计为靶向激活的Akt3或者这个信号传导途径其它成员的药物进行临床实验。
这项研究示出使用siRNA或者表达PTEN降低Akt3活性可以通过改变凋亡敏感性而有效地降低黑素瘤细胞的肿瘤发生潜力。因此，具有高水平Akt3活性的黑素瘤细胞更适于在体内肿瘤环境中存活，并且直接抑制或者通过干扰其上游调节子抑制Akt3活性很可能是对黑素瘤患者的一种有效的抗癌策略(Soengas et al.，Oncogen 22：3138-3151(2003)；Johnstone et al.，Cell 108：153-164(2002))。事实上，大多数化疗药物是通过诱导凋亡而起作用的，因此可推测抑制Akt3可降低有效的化疗或放疗所需要的药物或者放射的阈值剂量，这提供了一种选择性靶向黑素瘤细胞的机制(Soengas et al.，Oncogen 22：3138-3151(2003))。因此，单独或者组合化疗药物治疗性靶向Akt3活性对于黑素瘤患者可以是一种潜在的重要治疗方法(Soengas et al.，Oncogen 22:3138-3151(2003))。总之，我们已经鉴别了Akt3是一种特异性促存活激酶，其在黑素瘤肿瘤中增加的活性与肿瘤进展相关，并且提供了对于增殖和存活环境应激具有选择性优势的细胞。
B-RAF实施例
材料和方法
实施例10：细胞系、培养条件和B-Raf突变状况
将人黑素瘤细胞系UACC 903、1205Lu和C8161以及HEK293T细胞在补加了10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中维持。如先前所述在UACC 903和C8161细胞系中确定T1796A B-RAF突变的存在与否(Miller CJ et al.J Invest Dermatol.123:990-2(2004))。另外，先前已经报道了在UACC 903和1205Lu细胞中存在这种突变(Miller CJ et al.J Invest Dermatol.123：990-2(2004)，Tsao H et al.J Invest Dermatol.122:337-41(2004)，Krasilnikov M et al.Oncogene.22:4092-101(2003))。
实施例11：体外siRNA研究
将siRNA(100pmol)导入经Amaxa Nucleofector(Koeln，Germany)核转染的1×106UACC 903、1205Lu或者C8161细胞中，使用如参考文献(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004))所述方案R/程序K-17进行。所得核转染效力>90％。在核转染后，将细胞再铺板24—48小时，之后收获蛋白质裂解物进行Western印迹分析。为了测定siRNA敲弱的持续时间，在用B-Raf或者C-Raf的siRNA核转染后第0、2、4、6和8天收获细胞，进行Western印迹分析。这些研究使用Duplexe Stealth siRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根据参考文献(Hingorani SR et al.Cancer Res.；63:5198-202(2003))修饰B-Raf序列。使用的siRNA序列如下：WTB-RAF(COM4或4)-GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU；MUTB-RAF(MuA或A)-GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU；CRAF-GGUCAAUGUGCGAAAUGGAAUGAGC；LAMINA/C-GAGGAACUGGACUUCCAGAAGAACA；及VEGF-GCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTA。
实施例12：Western印迹分析
为了进行Western印迹分析，通过加入含有如下成分的裂解缓冲液在培养皿中收获细胞裂解物：50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、10mM EDTA、10％甘油、1％ Triton X-100、1mM原钒酸钠、0.1mM钼酸钠、1mM苯甲基磺酰氟、20μg/ml的抑酶肽及5μg/ml的亮抑蛋白酶肽。将全部细胞裂解物在4℃离心(≥10,000×g)10分钟以除去细胞碎片。蛋白质使用Pierce(Rockford，IL)的BCA分析量化，将30μg裂解物/泳道加样于NuPage Gel Life Technologies，Inc.(Carlsbad，CA)上。在电泳之后，将样品移至聚偏二氟乙烯膜(Pall Corporation，Pensacola，FL)。根据每个供应商的推荐用抗体探查印迹：抗-pErk和抗-pMek来自Cell Signaling Technologies(Beverly，MA)；B-Raf、C-Raf、Erk2和α-烯醇化酶的抗体来自Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz，CA)；及Lamin A/C的抗体来自Biomeda Corp(Foster City，CA)。将二级抗体与辣根过氧化物酶缀合，所述抗体得自Santa CruzBiotechnology。使用增强的化学发光检测系统(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)显色免疫印迹。
实施例13：体内SiRNA研究
根据Institutional Animal Care and Use Committee许可的方案在The Pennsylvania State University College of Medicine进行动物实验。通过在6只4—6周龄裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianopolis.IN)的左侧和右侧胸腔皮下注射用siRNA核转染的、于补加了10％ FBS的0.2ml DMEM中的1×106UACC 903或者1205Lu细胞来测定肿瘤动力学。发育肿瘤的直径使用测径器隔天测定。为进行机制研究，将用siRNA核转染的5×106UACC 903细胞注射进小鼠并在注射细胞4天后收获肿瘤以测定细胞增殖和凋亡的变化，如前述(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004)，Stahl JM et al.Cancer Res.63:2881-90(2003))。
施例14：体外和体内BAY 43-9006研究
用于这些研究的BAY 43-9006化合物如参考文献(Bankston D etal.Organic Process Res Dev.6:777-81(2002))所述合成。为了评价BAY43-9006对野生型和突变体B-Raf的抑制作用，将HEK293T细胞用HA标记的野生型B-RAF、突变体V599EB-RAF或者载体(pcDNA3)转染，使用如前述磷酸钙进行(Robertson GP et al.Proc Natl Acad SciUSA.95:9418-23(1998))。在转染后(72小时)，将培养基用补加了10％FBS和5μM BAY 43-9006或者DMSO载体的DMEM培养基更换。2小时后，收集蛋白质裂解物进行Western印迹分析。磷酸化的Mek和Erk的水平从3个独立的印迹中量化，在不同条件下的折叠差异在针对Erk2加样对照标准化之后评估。
BAY 43-9006对肿瘤发育的作用通过将5×106UACC 903或者1×1061205Lu细胞皮下注射进裸鼠中而测定。6天后当小肿瘤(50—100mm3)产生时，隔天为小鼠腹膜内注射50μl载体(DMSO)或者药物BAY 43-9006，对于UACC 903细胞浓度为10、50或者100mg/kg体重，对于1205Lu细胞浓度为50mg/kg体重。为了进行涉及用BAY43-9006预处理的研究，在皮下注射UACC 903或者1205Lu细胞之前，经腹膜内注射两次50mg/kg体重的药物(前4天和前2天)。药理学抑制突变体V599EB-Raf可延迟肿瘤发育的机制通过比较平行实验组中产生的相同大小的肿瘤而鉴别。这是通过皮下注射5×106UACC903细胞，随后从第6天每2天经腹膜内注射50mg/kg的BAY43-9006而实现。为了对照组DMSO与药物处理的肿瘤的时间和空间上的匹配，皮下注射1×106、2.5×106或者5×106个UACC 903细胞并从第6天开始每2天腹膜内注射DMSO载体进行处理。在第9、11、13和15天收获平行实验组中产生的相同大小的经药物或者载体处理的肿瘤进行比较。在每个时间点收获经载体或者药物处理的小鼠的肿瘤分析细胞增殖、凋亡和血管发生情况，如前述(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004)，Stahl JM et al.Cancer Res.63：2881-90(2003))。
实施例15：肿瘤中凋亡、细胞增殖和血管密度测定
使用Roche公司(Manheim，Germany)的TUNEL TMR RedApoptosis试剂盒对福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片进行凋亡测定，如前述(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004)，Stahl JM etal.Cancer Res.63:2881-90(2003))。在福尔马林固定的肿瘤切片中细胞增殖率使用RPN20细胞增殖试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)测定，其利用BrdU掺入和免疫细胞化学方法进行。在处死之前2小时，将0.2ml BrdU经腹膜内注射进小鼠中并根据增殖试剂盒的使用说明处理肿瘤。计算BrdU染色的细胞的数目占用BAY 43-9006或者载体(DMSO)处理的全部肿瘤细胞的百分比。如前述使用纯化的大鼠抗小鼠CD31(PECAM-1)单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)量化血管密度(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004)，Stahl JM et al.Cancer Res.63:2881-90(2003))。使用IP Labimaging软件程序计算整个区域中血管占据肿瘤的区域的比例。对于所有肿瘤分析，均使用4—6个视野/肿瘤分析最少6个不同的肿瘤，结果以平均值±SEM表示。
实施例16：体内pErk测定
为了量化在福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片中pErk水平的变化，在95℃水浴中用0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)进行20分钟抗原挽回(antigen retrieval)。将载玻片冷却20分钟，在PBS中漂洗，然后在3％H2O2中保温10分钟以猝灭内源过氧化物酶活性。接着，将切片用1％ BSA封闭30分钟，与1:100稀释的抗pERK抗体(Cell Signaling Technologies，Beverly，MA)在4℃保温过夜。在PBS中漂洗后，将切片与生物素酰化的抗兔IgG保温1小时，再次在PBS中漂洗，与过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白保温30分钟。使用AEC(氨乙基咔唑)底物试剂盒显色5—10分钟(Zymed laboratoriesInc.，South San Francisco，CA)，在使用水相封固溶液对盖玻片封固之前用苏木精复染核。用4—6视野/肿瘤从最少6个不同肿瘤中计数pErk染色阳性的细胞±SEM的平均百分比。
实施例17：体外倍增时间和体内肿瘤潜伏期
用siRNA核转染的UACC 903细胞的体外倍增时间通过将5×103个细胞/孔铺板于5个96孔平板的多排孔(补加了10％ FBS的200μl DMEM)中进行估计。使用Sulforhodamine B(SRB)结合分析(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)每天通过进行比色法分析对一个平板每24小时测定一次生长情况，共测定5天，倍增时间如前述计算(Stahl JM et al.Cancer Res.63:2881-90(2003))。体内肿瘤潜伏期通过估计平均肿瘤大小达到10mm3需要的天数而测定。
实施例18：BAY 43-9006生长抑制/UACC 903黑素瘤细胞的IC-50
为了测定BAY 43-9006对UACC 903细胞的生长抑制作用或者IC-50，将5×103个细胞/孔铺板于96孔平板中。24小时后，向平板中8条孔中一式两份加入不同浓度的BAY 43-9006(0、0.02、0.1、0.4、1.6、6.3、25或者100μM)。在37℃在5％CO2湿润环境中生长72小时后，弃去培养基并将细胞固定在10％三氯乙酸中。在每种浓度药物中存活的细胞使用SRB结合分析(Stahl JM et al.Cancer Res.63：2881-90(2003))计算。使用Western印迹分析证实在暴露于药物2小时后，增加浓度的BAY 43-9006(5、10、15或者20μM)对UACC 903细胞中Mek1/2和Erk1/2磷酸化水平的作用。
实施例19：VEGF表达分析
为了确定在siRNA介导的B-Raf蛋白敲弱之后或者在用BAY43-9006处理之后细胞分泌的VEGF的量，使用人VEGF Quantikine试剂盒(DVE00)(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)。将用不同siRNA核转染的UACC 903或者1205Lu细胞(5×105)铺板在60mm有盖培养皿中，24小时后将培养基用含有2％ FBS的DMEM更换。再过24小时后，将培养基再次更换，在24和48小时后收集进行ELISA分析的条件培养基。为了进行BAY 43-9006研究，将3×105的UACC 903或者1205Lu细胞铺板于60mm有盖培养皿中，24小时后将培养基更换为含有2％FBS的DMEM。再过24小时后，将培养基用只补加2％ FBS或者组合了BAY 43-9006(5、10、15μM)或DMSO载体的DMEM更换。12或者24小时后，收集条件培养基进行ELISA分析。培养基通过以14，000rpm(4℃)离心5分钟而澄清，在—80℃贮存。在一式两份实验中根据厂商指导一式三份进行VEGFELISA分析。
实施例20：统计学
为了进行统计学分析，使用Student′s t-检验进行成对比较及使用One-way Analysis of Variance(ANOVA)或者使用Kruskal-Wallis检验进行成组分析，随后进行适当的事后检验(Dunnett′s，Tukey′s或者Dunn′s)。在P值<0.05时认为结果是显著的。
实验结果
实施例21：SiRNA介导的靶向突变体V599EB-Raf抑制黑素瘤肿瘤发育
表2、用针对B-Raf、C-Raf的siRNA或者混杂的siRNA处理的UACC 903细胞的生长性质
Figure A200580008819D01041
1肿瘤形成潜伏期定义为平均肿瘤大小达到10mm3所需的天数
目前还未知突变体V599EB-Raf在黑素瘤肿瘤发生中的作用。为了解决这个问题，我们认为突变体V599EB-Raf蛋白的表达或者活性的抑制可用于鉴别这个蛋白质在黑素瘤肿瘤发生中的作用。使用siRNA介导的方法在含有突变蛋白的UACC 903和1205Lu细胞系中敲弱突变体V599EB-Raf的表达或者在没有T1796A突变的C8161细胞系中敲弱B-Raf的表达。设计MuA或者A siRNA以降低野生型和突变蛋白的表达，而Com4或者4siRNA仅降低突变蛋白的表达，如前述(Hingorani SR et al.Cancer Res.；63:5198-202(2003))。将这些研究中的siRNA通过核转染导入所述细胞系中，转染效率>90％(数据未示出)(Stahl JM et al.Cancer Res.64:7002-10(2004))。核转染后siRNA在UACC 903(图12A)、1205Lu(图12B)和C8161(图12C)细胞中降低B-Raf和C-Raf蛋白表达的效力通过Western印迹分析测定。在核转染24和48小时后，每种siRNA只降低其针对而产生的蛋白质的表达，从而表明siRNA敲弱在这些每个细胞系中每一种中的特异性和效力。在UACC 903和1205Lu细胞中，只有B-Raf的siRNA降低下游靶Mek和Erk的磷酸化(活性)水平，而混杂的siRNA或者C-Raf的siRNA对这些蛋白质无作用(图12A和图12B)。在核转染48小时后在UACC 903和1205Lu细胞中观察到最大的Mek和Erk磷酸化(活性)水平降低。相反，在C8161细胞中降低的B-Raf或者C-Raf表达对磷酸化的Mek和Erk的水平具有可忽略的不显著作用(图12C)。因此，含有突变蛋白的黑素瘤细胞系中V599EB-Raf表达的抑制导致Mek和Erk的活性降低，而在没有T1796A突变的黑素瘤细胞中降低B-Raf蛋白的表达对下游靶的活性无影响。
为了测定降低的V599EB-Raf表达(活性)对黑素瘤肿瘤发育的作用，通过皮下注射小鼠使用瞬时敲弱方法将UACC 903和1205Lu细胞系中V599EB-Raf表达用siRNA抑制，如前述(Stahl JM et al.CancerRes.64:7002-10(2004))。SiRNA介导的蛋白质表达的敲弱在UACC903(图13A)和1205Lu(图13B)细胞中持续最少8天。另外，在相同时期还观察到pErk水平相应降低(图13B)。隔天测定产生的肿瘤的大小直至核转染后第17.5天，确定B-Raf敲弱对黑素瘤肿瘤发生的作用。在其中突变体V599EB-Raf表达已经敲弱的UACC 903(图13C)和1205Lu(图13D)细胞中均观察到肿瘤发育降低。相反，siRNA介导的C-Raf抑制，混杂的siRNA或者缓冲液对照组不改变肿瘤发育。在敲弱C-Raf之后无作用，提示通过V599EB-Raf的信号传导是肿瘤发育特异需要的。因此，在注射小鼠之前siRNA-介导的黑素瘤细胞中V599EB-Raf表达(活性)的降低抑制肿瘤发生。
使用称作BAY 43-9006的Raf激酶抑制剂进行相似的实验，以抑制UACC 903、1205Lu或者C8161细胞中B-Raf蛋白的活性。这种化合物最初是在筛选Raf激酶抑制剂中鉴别的，其有效抑制野生型B-Raf蛋白的活性(Lowinger TB et al.Curr Pharm Des.8：2269-78(2002)，Lyons JF et al.Endocr Relat Cancer.8:219-25(2001))。最初我们确定了BAY 43-9006使UACC 903细胞存活率降低一半(也称作IC50)的浓度，发现该浓度为5—6μM(数据未示出)。因此，选择5μM浓度进行随后的体外研究。接着，我们通过在HEK293T细胞中表达HA标记的野生型或者突变体V599EB-Raf构建体而证实了BAY43-9006以相似程度抑制突变体和野生型B-Raf蛋白的活性(图14A)。如前述，我们观察到磷酸化的(活性)Erk或者Mek在表达V599EB-Raf的细胞中的水平比在仅用野生型B-RAF转染的细胞中的水平高5—7倍(Davies H et al.Nature.417:949-54(2002))。然后将表达野生型或者突变体V599EB-Raf蛋白的HEK 293T细胞暴露于5μM的BAY 43-9006有2小时，检测对信号传导途径的活性的作用。暴露于BAY 43-9006分别使表达野生型或者突变体V599EB-Raf蛋白的细胞中磷酸化的Mek和Erk的水平降低5—6倍和3—4倍(图14A)。因此，BAY 43-9006抑制野生型和突变体B-Raf的活性。
为了证实BAY 43-9006抑制突变体V599EB-Raf蛋白在UACC 903细胞中的信号传导，将体外培养物暴露于增加浓度的BAY43-9006有2小时。BAY 43-9006在UACC 903细胞中以剂量应答方式降低磷酸化的(活性)Mek和Erk的水平(图14B)。在UACC 903和1205Lu细胞系中BAY43-9006对MAP激酶信号传导的抑制作用持续至少2—3天(数据未示出)。我们接着评价在皮下注射UACC 903或者1205Lu细胞之前用BAY 43-9006对动物进行预处理的作用。对于这些实验，将小鼠暴露于50mg/kg BAY 43-9006共4天，之后皮下注射5×106个细胞，随后每2或3天经腹膜内注射药物直至22天。UACC 903(图14C)和1205Lu(未示出)肿瘤发育均被明显抑制(Student′s t-检验；p<0.05)，大小匹配的UACC 903肿瘤的比较表明与载体处理的对照组(未示出)比较在BAY 43-9006处理的肿瘤中增殖降低及血管发生减少。另外，肿瘤大小缓慢增加至第8天，之后稳定，在随后的肿瘤测定中无统计学差异(ANOVA；P>0.05)。因此，通过用BAY 43-9006对宿主动物进行预处理而对突变体V599EB-Raf活性的药理学抑制作用显著降低表达突变体V599EB-Raf的黑素瘤细胞的肿瘤发生潜力。
为了鉴别在用siRNA预处理以敲弱V599EB-Raf活性的细胞中导致肿瘤抑制的机制，在皮下注射4天后在UACC 903肿瘤中测定肿瘤细胞增殖和凋亡率。使用TUNNEL分析检测到凋亡率(1—2％)无差异(数据未示出)。然而，用针对B-Raf的siRNA处理的UACC 003细胞与仅用缓冲液、混杂的siRNA或者C-RAF siRNA核转染的对照细胞比较，增殖细胞低5—6倍(图14D)。接着，比较UACC 903细胞系的体外倍增时间、体内增殖速度和肿瘤潜伏期以确定降低的生长是否是肿瘤发育延迟的原因(表2)。用C-RAF的siRNA或者混杂的siRNA核转染的UACC 903细胞在体外每1.2天(或者～29小时)数目倍增一次，而用针对B-RAF的siRNA核转染的细胞每1.65天(或者～40小时)倍增一次，延迟大约38％。相反，与用针对B-Raf的siRNA核转染的肿瘤细胞(具有2—3％增殖细胞)比较，肿瘤中增殖细胞分析示出用C-Raf的siRNA或者混杂的siRNA核转染的对照肿瘤(具有10-15％增殖细胞)之间具有显著差异(ANOVA；p<0.05)。用B-RAFsiRNA核转染的细胞的增殖能力降低大约82％可以是造成肿瘤发育潜伏期延长的原因。因此，对于在第5天与对照组相同大小的肿瘤，用针对B-RAF的siRNA核转染的细胞需要再过10天才可以形成相同大小的肿瘤(表2)。由于肿瘤发育被延迟>200％，因此在体外和体内观察到的降低的生长速度可以是造成这些细胞肿瘤发生潜力降低的原因。因此，在肿瘤形成之前在黑素瘤细胞中抑制突变体V599EB-Raf表达(活性)显著降低细胞的体内生长潜力，从而延迟肿瘤发生。
实施例22：通过在预先存在的肿瘤中靶向突变体V599EB-Raf而抑制黑素瘤肿瘤发育
目前还未知在确定已经存在的黑素瘤肿瘤中靶向突变体V599EB-Raf是否可以延迟肿瘤发育，如果是这样，也未知该机制与在肿瘤形成之前靶向细胞中V599EB-Raf时的机制是否相同。因此，我们接着检测了在已经存在的黑素瘤肿瘤中药理学靶向B-Raf是否可通过相似机制抑制肿瘤发育。将5百万个UACC 903细胞、1百万个1205Lu细胞或者5百万个C8161细胞经皮下注射进4—6周龄的雌性裸鼠中。在第6天，每48小时通过腹膜内注射给予小鼠载体(DMSO)或者溶解于载体中的BAY 43-9006化合物(10、50或者100mg/kg)。选择给予药物之间间隔48小时是因为这是在UACC 903、1205Lu和C8161细胞中对MAP激酶信号传导途径的抑制作用持续的最少时间(数据未示出)。发生的肿瘤的大小使用测径器隔天测定，对于UACC903细胞的结果示于图4A，对于1205Lu细胞的结果示于图15B。虽然所有浓度的BAY 43-9006化合物均减缓UACC 903肿瘤发育，但是只有≥50mg/kg浓度使得肿瘤在开始处理7天后进入平台期(图4B)。用10mg/kg的BAY 43-9006处理的小鼠中肿瘤发育延迟～1周，但是UACC 903肿瘤的大小不断增加，在第27天当肿瘤达到>2,400mm3时对小鼠行安乐死。对于UACC 903细胞，直至第13天肿瘤大小还略有增加，然而在药物处理1周后，肿瘤大小稳定并且在第13—31天肿瘤大小无统计学显著的增加(图15A)(ANOVA；P>0.05)。用50mg/kg BAY 43-9006处理1205Lu肿瘤在第17—31天也以使得肿瘤大小进入平台期的相似方式降低肿瘤发育(图15B))(ANOVA；P＝0.12)。相反，虽然BAY43-9006在C8161细胞中抑制pMek和pErk水平，但是在肿瘤形成的动力学中观察到无差异(数据未示出)。因此，对突变体V599EB-Raf活性的药理学抑制在已经存在的黑素瘤肿瘤中延迟肿瘤发育，但是不导致肿瘤消退。相反，在没有T1796A突变的黑素瘤细胞中抑制B-Raf看起来不改变肿瘤发生潜力。
为了证实BAY 43-9006化合物影响肿瘤中突变体V599EB-Raf信号传导途径的活性，在用载体(DMSO)或者含有50mg/kg BAY 43-9006的载体开始处理9天后，为小鼠肿瘤中磷酸化的Erk表达水平增加的细胞百分比评分(图15C)。对pErk阳性细胞数目进行量化，示出BAY43-9006处理的肿瘤比对照载体处理的肿瘤少～3倍的pErk阳性细胞(图15D)(Student′s t-检验；P<0.05)。在载体处理的肿瘤中显著较多的磷酸化Erk阳性细胞的数目表明BAY 43-9006在体内抑制突变体V599EB-Raf信号传导途径的活性。因此，这些结果表明用BAY 43-9006对突变体V599EB-Raf进行药理学抑制降低肿瘤中MAP激酶途径信号传导，从而介导肿瘤抑制作用。
实施例23：从机制上，BAY 43-9006抑制预先存在的黑素瘤肿瘤的血管发生，导致凋亡增加
前述的实验示出突变体V599EB-Raf活性的抑制与降低的肿瘤发育之间的一致关系，因此，随后的研究集中在鉴别这种现象在已经存在的黑素瘤中发生的机制方面。在这些研究中，对暴露于载体或者BAY43-9006的时空匹配的UACC 903肿瘤分析其血管发生情况以及凋亡和增殖率，以鉴别延迟已确定存在的肿瘤生长的关键事件。从第9天开始至第15天结束，每两天收获匹配的肿瘤，比较每个时间点的凋亡、生长和血管发生率(图16)。在第9天观察到在载体和BAY43-9006处理的肿瘤之间血管发生的统计学显著差异(图5A)(Student′s t-检验；P<0.05)。相反，在对照和BAY 43-9006处理的肿瘤之间，在第9天检测到在肿瘤块中增殖细胞的数目(Student′s t-检验；P＝0.61)或者凋亡面积(Student′s t-检验；P＝0.15)方面无统计学显著的差异(图16B和图16C)。然而，对于从第11天起的所有分析，在对照和药物处理的肿瘤之间均观察到统计学显著的差异(Student′st-检验；P<0.05)。总之，这些数据提示在BAY 43-9006处理的肿瘤中在第9天观察到的显著降低的血管发生是导致肿瘤生长延迟的始发事件。在BAY 43-9006处理的肿瘤中凋亡在第11天变得明显，在第15天占肿瘤面积的高达25％(图16B)。在第20天，大约50％的肿瘤面积正经历凋亡(数据未示出)。BAY43-9006还影响预先存在的肿瘤的肿瘤细胞增殖，导致增殖细胞的百分比降低32—57％(图16C)。总之，根据这些数据可以得出结论：血管发生的抑制是导致预先存在的黑素瘤肿瘤的生长抑制的关键事件。
由于肿瘤中血管发生通过血管发生机制或者从周围血管床中生长新的血管而产生，并且由肿瘤细胞分泌的血管发生因子触发(Carmeliet P，Jain RK.Nature.407:249-57(2000))，因此我们推测BAY43-9006和siRNA介导的V599EB-Raf抑制降低关键性血管发生因子的活性，从而降低血管发育(Kranenburg O et al.Biochim Biophys Acta.1654:23-37(2004)，Jain RK.Semin Oncol.29:3-9(2002))。为了检查这种可能性，使用ELISA分析确定在V599EB-RAF抑制后VEGF分泌是否降低。最初检查了其中V599EB-Raf表达用siRNA抑制的UACC 903和1205Lu细胞，并揭示与对照比较VEGF分泌显著降低(图17A)。接着，检查V599EB-Raf UACC 903和1205Lu细胞的BAY 43-9006介导的抑制作用，也发现以剂量依赖性方式降低VEGF分泌(图17B)。为了确定siRNA介导的VEGF降低是否导致与V599EB-Raf抑制后相似的肿瘤抑制，将针对VEGF的siRNA核转染进UACC 903或者1205Lu细胞中。使用VEGF特异性siRNA观察到降低的VEGF表达(图17A)，其以与V599EB-Raf表达降低后一致的方式降低UACC 903(图17C)和1205Lu(图17D)细胞的致肿瘤发育潜力。因此，由降低的V599EB-Raf活性介导的降低的VEGF分泌导致血管发育受抑制，随之影响黑素瘤肿瘤的发育。
对B-Raf的实验讨论
这项研究证实使用siRNA抑制或者药理学抑制突变体V599EB-Raf表达(活性)可以通过降低肿瘤细胞的增殖和/或血管生成能力而有效降低黑素瘤细胞的致肿瘤发育潜力。由此，具有突变体V599EB-Raf的黑素瘤更适于在体内肿瘤环境中增殖。我们揭示了在肿瘤发育之前黑素瘤细胞中V599EB-Raf表达(活性)的靶向降低显著降低了黑素瘤细胞的生长潜力，从而抑制肿瘤发育。相反，凋亡在这个过程中无明显作用。另外，肿瘤发育的抑制仅在突变体V599EB-Raf表达已经被敲弱的细胞中观察到，而在敲弱C-Raf之后或在缺少T1796A B-RAF突变的黑素瘤细胞中敲弱B-Raf之后未观察到如此结果。因此，显然通过V599EB-Raf的信号传导是黑素瘤肿瘤发育所特别需要的。这些数据与我们先前证实在WM793黑素瘤细胞中siRNA介导的V599EB-Raf的抑制降低这些细胞的体外生长潜力的研究结果一致(Hingorani SR etal.Cancer Res.；63:5198-202(2003))。与使用UACC 903细胞的体外研究相似，这篇报道进一步证实这些早期的观察结果。突变体V599EB-Raf表达(活性)的敲弱还特异性降低组成型Erk信号传导，导致生长降低，这种情况在敲弱C-Raf后未出现。因此，突变体V599EB-Raf在体外和体内均促进黑素瘤细胞的生长，另外，在肿瘤发育之前的靶向抑制通过肿瘤细胞生长降低而抑制肿瘤发育。
在预先存在的肿瘤中靶向突变体V599EB-Raf使得肿瘤生长减缓，然而在这个过程中生长抑制仅起部分作用。更明显地，大小与时间匹配的肿瘤的比较表明血管发育的抑制在延迟肿瘤生长中起启动作用。在所有实体瘤中，血管发育是通过血管发生机制产生的，其中新血管从周围血管床的生长是由肿瘤细胞分泌的血管发生因子驱动的(CarmelietP，JainRK.Nature.407:249-57(2000))。在这个研究中，我们发现V599EB-Raf的抑制降低了UACC 903和1205Lu黑素瘤细胞分泌VEGF。据报道B-Raf在胚胎血管发育中起重要作用，因为B-RAF敲除小鼠呈现明显的内皮细胞死亡，导致出血和胚胎死亡(WojnowskiL et al.Nat Genet；16:293-7(1997))。然而，我们观察到在预先存在的肿瘤血管中在使用BAY43-9006抑制V599EB-Raf之后没有明显的内皮细胞死亡。更确切地，对V599EB-Raf的抑制通过肿瘤细胞分泌VEGF减少而介导抑制血管发生(Kranenburg O et al.BiochimBiophys Acta.1654:23-37(2004)，Jain RK.Semin Oncol.29:3-9(2002))。这个观察结果得到了公开的证据支持，所述证据中降低的VEGF分泌导致降低的血管发生，从而抑制癌细胞的致肿瘤发育潜力(Heidenreich R et al.Int J Cancer.111:348-57(2004)，Inai T et al.Am JPatrol.165:35-52(2004))。因此，由突变体V599EB-Raf信号传导降低介导的VEGF分泌的降低导致血管发生的抑制，使得先前存在的黑素瘤肿瘤生长停止。
我们的研究还示出BAY 43-9006在体外和体内均抑制V599EB-Raf的活性，导致下游靶位Mek和Erk的磷酸化降低，由此减慢黑素瘤肿瘤发育。我们观察到用BAY 43-9006对动物进行预处理以与siRNA介导的抑制作用相似的方式降低了黑素瘤肿瘤发育。然而，BAY43-9006处理仅仅通过破坏肿瘤血管的发育而延迟已建立的肿瘤的发展。在处理后肿瘤未完全消退，而是肿瘤大小变得相对稳定。这个观察结果与得自临床实验的初步数据一致，临床实验数据示出BAY43-9006单一治疗对于治疗晚期黑素瘤患者相对无效(TuvesonDA et al.Cancer Cell.4:95-8(2003)，Ahmad T et al.Proc Am Soc ClinOncol.23:708(2004))。然而，与传统的化疗(paclitaxel和carboplatinum)组合，在患者中产生50％的应答率(Tuveson DA et al.Cancer Cell.4:95-8(2003)，Flaherty K et al.Proc Am Soc Clin Oncol.23:708(2004))。因此，尽管BAY 43-9006减慢肿瘤发育，很可能所述药物需要与其它协同治疗剂组合以使得已建立的预先存在的肿瘤衰退(Tuveson DA etal.Cancer Cell.4:95-8(2003)，Bollag G et al.Curr Opin Investig Drugs.4:1436-41(2003)，Lyons JF et al.Endocr Relat Cancer.8:219-25(2001))。可能的是药物给予途径也可以改变BAY 43-9006在黑素瘤患者中的效力。虽然临床实验包括口服给予所述药物，但我们的研究是通过每2—3天经腹膜内注射给予药物。通过增加药物的局部生物利用率的替代的给药途径可能更有效(Sparreboom A et al.Proc Natl Acad Sci US A.94:2031-5(1997)，Bardelmeijer HA et al.Cancer Research.62:6158-64(2002)，Hale JT et al.Biocl Pharm.64:1493-502(2002)，KimuraY et al.Cancer Chemother Pharm.49:322-8(2002))。因此，治疗性靶向V599EB-Rafr活性与化疗剂组合可以提供一种缩小含有这种突变蛋白的确定的黑素瘤肿瘤的有效方案。
总之，我们鉴别了突变体V599EB-Raf促进黑素瘤肿瘤发育的机制，并示出了这种突变是如何使得黑素瘤细胞具有在肿瘤环境中选择性生长和血管发生的优势。
实施例24：Akt3结构域交换实验，结果和讨论
Akt同种型之间的结构域交换鉴别了导致在黑素瘤中优先激活Akt3而非Akt1或Akt2的Akt3区域。激活是作为在Akt3上第308位苏氨酸或者第472位丝氨酸的磷酸化水平而测定的；或者通过Akt3的免疫沉淀随后进行体外激酶分析而测定，其中Crosstide被Akt3磷酸化以评估活性。Akt3的结构域用Akt2或者Akt1的结构域交换，含有嵌合基因的构建体被核核转染进黑素瘤细胞系WM35或者UACC903中。豆蔻酰化的Akt3和Akt2作为阳性对照，失效的Akt3(T305A/S472A)和Akt2(T309A/S474A)作为阴性对照。野生型Akt3的转移导致活性增加，野生型Akt2不导致活性增加，这表明在黑素瘤细胞中Akt3激活的特异性。其中来自Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域(氨基酸1—110)与Akt2的催化-调节结构域连接的构建体不导致激活。相反，其中来自Akt2的普列克底物蛋白同源性结构域(氨基酸1—110)与来自Akt3的催化-调节结构域(氨基酸111—497)连接的构建体是激活的。这说明导致黑素瘤中Akt3优先激活的关键区域是氨基酸111—497。这是治疗剂可以靶向的区域从而特异性防止Akt3在黑素瘤中激活。
本发明结合上述特异性实施方案已经加以描述，本领域技术人员显而易见对其的许多替代、修改和变化方案。所有这种替代、修改和变化均在本发明的精神和范围内。本文引用的所有文献(例如出版物和专利申请)均以全文并入作参考。
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Claims (59)

1.一种在黑素瘤肿瘤细胞中诱导凋亡的方法，所述方法包括降低Akt3活性。
2.权利要求1的方法，其中所述降低是通过将黑素瘤肿瘤细胞与降低Akt3活性的物质接触而进行。
3.权利要求2的方法，其中所述物质选自siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽、和小分子。
4.权利要求3的方法，其中所述物质是siRNA分子，其包含选自具有如下序列的一种多核苷酸：
5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′、
5′CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′、
5′GAAUUUACAGCUCAGACUA 3′、
5′CAGCUCAGACUAUUACAAU 3′、
5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′、
5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3′、
5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3′、
5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3′、
5′AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3′、
5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3′
及其互补序列。
5.权利要求2的方法，其中所述黑素瘤肿瘤细胞的所述接触包括使用脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树状物、病毒、磷酸钙核苷酸介导的核苷酸输送、电穿孔及显微注射。
6.权利要求3的方法，其中所述物质是作为Akt3假底物的肽。
7.权利要求6的方法，其中所述肽作为Akt3的催化结构域或者调节结构域的假底物。
8.权利要求3的方法，其中所述物质是作为Akt3竞争性抑制剂的肽。
9.权利要求8的方法，其中所述肽作为Akt3的催化结构域的竞争性抑制剂。
10.权利要求8的方法，其中所述肽作为Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域的竞争性抑制剂。
11.权利要求8的方法，其中所述肽作为Akt3的调节结构域的竞争性抑制剂。
12.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括给予选自烷化剂、抗代谢物、抗生素、天然产物或植物衍生的产物、激素和类固醇及铂制剂药物的化疗剂。
13.权利要求的12的方法，其中所述化疗剂是达卡巴嗪。
14.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括给予放射治疗。
15.一种治疗哺乳动物中黑素瘤肿瘤的方法，包括给予黑素瘤肿瘤有效量的物质以诱导凋亡，及给予黑素瘤肿瘤有效量的物质以降低血管发生和细胞增殖。
16.权利要求15的方法，其中诱导凋亡的所述物质是降低Akt3活性的物质。
17.权利要求15的方法，其中降低血管发生和细胞增殖的所述物质是降低V599E B-Raf活性从而治疗黑素瘤肿瘤的物质。
18.权利要求16的方法，其中降低Akt3活性的所述物质选自siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽和小分子。
19.权利要求18的方法，其中降低Akt3活性的所述物质是siRNA分子，其包含具有选自如下序列的多核苷酸：
5’GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3’、
5’CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3’、
5’GAAUUUACAGCUCAGACUA 3’、
5’CAGCUCAGACUAUUACAAU 3’、
5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′、
5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3′、
5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3′、
5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3′、
5′AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3′、
5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3′
及其互补序列。
20.权利要求16的方法，其中降低Akt3活性的物质使用如下方式导入所述黑素瘤肿瘤中：脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树状物、病毒、磷酸钙核苷酸介导的核苷酸输送、电穿孔和显微注射。
21.权利要求18的方法，其中所述物质是作为Akt3假底物的肽。
22.权利要求21的方法，其中所述肽作为Akt3的催化结构域或者调节结构域的假底物。
23.权利要求18的方法，其中所述物质是作为Akt3的竞争性抑制剂的肽。
24.权利要求23的方法，其中所述肽作为Akt3的催化结构域的竞争性抑制剂。
25.权利要求23的方法，其中所述肽作为Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域的竞争性抑制剂。
26.权利要求23的方法，其中所述肽作为Akt3的调节结构域的竞争性抑制剂。
27.权利要求15的方法，其中所述方法进一步包括给予选自烷化剂、抗代谢物、抗生素、天然产物或者衍生自植物的产物、激素和类固醇、及铂制剂药物的化疗剂。
28.权利要求15的方法，其中所述方法进一步包括给予放射治疗。
29.权利要求17的方法，其中降低V599E B-Raf活性的物质选自siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽、及小分子。
30.权利要求17的方法，其中降低V599E B-Raf活性的物质通过使用如下方式导入所述黑素瘤肿瘤中：脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树状物、病毒、磷酸钙核苷酸介导的核苷酸输送、电穿孔和显微注射。
31.权利要求29的方法，其中降低V599E B-Raf活性的siRNA分子包含：具有序列5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′的多核苷酸。
32.权利要求29的方法，其中降低B-Raf活性的siRNA分子包含：具有序列5′GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3′的多核苷酸。
33.权利要求29的方法，其中降低V599E B-Raf活性的物质是B-Raf抑制剂。
34.权利要求33的方法，其中B-Raf抑制剂是BAY 43-9006。
35.权利要求15的方法，其中所述治疗包括：同时或者相继给予有效量的降低Akt3活性的物质及降低V599E B-Raf活性的物质。
36.一种治疗黑素瘤肿瘤的药物组合物，其包含降低Akt3活性的物质和载体。
37.权利要求36的药物组合物，其中所述载体选自脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米结晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树状物、病毒和磷酸钙核苷酸介导的核苷酸输送。
38.权利要求36的药物组合物，其中所述物质选自siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽、及小分子。
39.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′或其互补序列。
40.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含5′CUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′或其互补序列。
41.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′GAAUUUACAGCUCAGACUA 3′或其互补序列。
42.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′CAGCUCAGACUAUUACAAU 3′或其互补序列。
43.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′CUUGGACUAUCUACAUUCCGGAAAG 3′或其互补序列。
44.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′CUUUCCGGAAUGUAGAUAGUCCAAG 3′或其互补序列。
45.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′GAUGAAGAAUUUACAGCUCAGACUA 3′或其互补序列。
46.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′UAGUCUGAGCUGUAAAUUCUUCAUC 3′或其互补序列。
47.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′AAUUUACAGCUCAGACUAUUACAAU 3′或其互补序列。
48.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3′或其互补序列。
49.权利要求38的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′AUUGUAAUAGUCUGAGCUGUAAAUU 3′或其互补序列。
53.权利要求38的药物组合物，其中所述物质是作为Akt3的假底物的肽。
54.权利要求53的药物组合物，其中所述肽作为Akt3的催化结构域或者调节结构域的假底物。
55.权利要求38的药物组合物，其中所述物质是作为Akt3的竞争性抑制剂的肽。
56.权利要求55的药物组合物，其中所述肽作为Akt3的催化结构域的竞争性抑制剂。
57.权利要求55的药物组合物，其中所述肽作为Akt3的普列克底物蛋白同源性结构域的竞争性抑制剂。
58.权利要求55的药物组合物，其中所述肽作为Akt3的调节结构域的竞争性抑制剂。
59.权利要求36的药物组合物，其中所述组合物进一步包含降低B-Raf活性的物质。
60.权利要求60的药物组合物，其中所述物质选自：siRNA分子、反义分子、拮抗剂、核酶、抑制剂、肽和小分子。
61.权利要求60的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′GGUCUAGCUACAGAGAAAUCUCGAU 3′或其互补序列。
62.权利要求60的药物组合物，其中所述小干扰RNA(siRNA)分子包含多核苷酸5′GGACAAAGAAUUGGAUCUGGAUCAU 3′或其互补序列。
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