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CN101378781B - 制造免疫球蛋白的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供从诸如融合瘤的细胞或细胞系分离人类抗体cDNA的寡核苷酸。本发明也提供编码至少一个所提供的具有与炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原结合的人类单克隆抗体的重链或轻链CDR的cDNA；和编码至少一个所提供的具有与炭疽芽孢杆菌致死因子结合的人类单克隆抗体的重链或轻链CDR的cDNA。本发明进一步提供含有一个或一个以上根据本发明方法分离的cDNA的表达载体、表达一个或一个以上本发明cDNA的宿主细胞和表达一个或一个以上本发明cDNA的转基因植物和动物。在本发明的某些实施例中，表达系统是基于植物的表达系统。本发明进一步提供包含一种或一种以上通过在合适的表达系统中表达根据本发明方法分离的cDNA产生的抗体的抗体组合物。本发明另外涵盖含有一种或一种以上所提供组合物的试剂盒以及所提供组合物的制备和使用方法。

Description

制造免疫球蛋白的组合物和方法
相关申请案
本申请案主张2005年8月3日申请的美国临时申请案第60/705,653号的优先权和权利，因此，其内容整体以引用的方式并入本文中。 
技术领域
无 
背景技术
炭疽病是由产孢细菌炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的比较明确的传染病。这种疾病历史上与动物传染，尤其诸如奶牛、绵羊和山羊的食草动物传染相关联，且在人类中通常不可见。然而，与发生传染的畜产品一起工作的人处于传染炭疽病的危险中。中东和撒哈拉以南的非洲的一些地区是炭疽高发区，但在世界的许多区域通常可见这种生物体。这种疾病以三种不同的方式表现：皮肤炭疽病、胃肠炭疽病和吸入炭疽病，分别由开口创伤暴露于孢子、摄食受污染肉制品中的孢子或吸入孢子引起。虽然皮肤炭疽病的致死率高达25％，但胃肠炭疽病或吸入炭疽病产生将近100％的致死率。炭疽病传染的确诊通常太迟而不能提供复生性护理。 
炭疽芽孢杆菌的主要病毒性因子是这种生物体分泌的多组分毒素。毒素由三种命名为保护性抗原(protective antigen，PA)、致死因子(lethal factor，LF)和水肿因子(edemafactor，EF)的蛋白质组成，其分别由基因pag、lef和cya编码。PA是分子量为83kDa的735个氨基酸的蛋白质。其与哺乳动物细胞表面的炭疽毒素受体(anthrax toxinreceptor，ATR)结合，且接着经受弗林蛋白酶(furin)介导的裂解以产生63kDa受体结合产物。63kDa PA片段在细胞表面上形成能够与LF或EF相互作用的七聚体复合体(heptameric complex)，且接着使这一复合体内在化。LF是锌金属蛋白酶，其裂解MAP激酶激酶的数种同功异型物，从而破坏细胞内的信号转导事件，最终导致细胞死亡。LF视为会造成炭疽病传染的致死后果。EF是钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶，其引起细胞生理学反常，产生包括水肿的临床表现。PA和LF一起称为致死毒素。 
CDC列出作为A类病原因子的炭疽且估算出每100,000人暴露于炭疽攻击的成本超过260亿美元。目前，在美国唯一许可人类使用的疫苗Biothrax(原先的吸附炭疽疫苗(Anthrax vaccine adsorbed或AVA))是基于保护性抗原PA的氢氧化铝吸附性福尔马林 (formalin)处理的亚单位疫苗。其通过皮下注射传送且诱发抗由芽孢杆菌分泌的致死毒素的免疫性。疫苗由炭疽芽孢杆菌的V770-NP1-R菌株的过滤培养物上清液部分制得。制造过程复杂，在疫苗制备批次中批料与批料间存在偏差，且不能确定疫苗的精确组成。此外，因为明矾作为当前疫苗的佐剂包括在内，所以疫苗存储和分销期间必须维持冷藏链，增加不便和成本。疫苗通过注射投与，此可使集体治疗的后勤复杂化。因此，将希望具有能够对抗炭疽暴发或攻击的传染潜在性的其他试剂。 
出于多种治疗性以及诊断性、产业性和研究目的，单克隆抗体具有渐增的重要性。举例来说，数个动物研究已证明接种动物的炭疽毒素特异性抗体可被动式保护接受者免受传染的致死作用。然而，源自动物的血清具有阻止广泛用作治疗剂的明显缺点。由融合瘤产生的单克隆抗体必须从培养融合瘤的培养基中收集或从小鼠腹水中收集。令人遗憾地，这些制造系统昂贵、劳动密集且具有其他显著的缺点。出于这些原因和其他原因，将希望能够利用替代性单克隆抗体制造系统，诸如涉及重组DNA技术的制造系统。 
关于试剂的充分需求和有限供应、产品成本和试剂纯度的问题突出对改进产品和试剂的迫切需要。因此，明确需要且迫切要求对抗潜在炭疽病传染的改进方法，以及诊断性检测的改时方法和适用于检查炭疽病传染机理的研究工具。此外，希望提供以合理的成本允许大量制造适用于这些应用的产品的制造方法。 
发明内容
本发明提供适用于制备重组系统中的抗体的核酸和蛋白质序列。具体来说，本发明提供适用于制备编码轻链抗体序列和重链抗体序列的核酸序列的寡核苷酸引物序列。本发明另外提供编码由至少一个重链多肽或其功能片段组成的多肽的抗体核酸序列；和编码至少一个轻链多肽或其功能片段的抗体核酸序列。本发明也提供重链和轻链多肽和其功能片段。本发明另外提供各自独立地包含至少一个CDR重链多肽和至少一个CDR轻链多肽的PA-1和LF-1抗体的抗体序列。本发明也提供各自独立地包含一个或一个以上具有至少一个氨基酸取代的CDR的PA-1和LF-1抗体的抗体序列，其中PA-1或LF-结合活性增强。本发明另外提供编码PA-1和LF-1重链和轻链的核酸以及编码PA-1和LF-1抗体的核酸。类似地，本发明提供这些编码核酸的功能片段。本文也提供所提供的组合物的制造和使用方法。 
附图说明
图1是展示PA和PANG(非糖基化)植物所产生抗体的SDS-PAGE分析的凝胶的照片。IgG标准物是经纯化的总人类IgG。由箭头指示重链(H)和轻链(L)的位置。 
图2是描绘植物所产生PA(PA)或PANG(PANG)、LF(LF)抗体的大鼠半衰期研究(大鼠中抗PA和抗LF人类单克隆抗体的半衰期研究)结果的曲线图。 
具体实施方式
定义 
术语“抗体”、“抗体链”、“可变区或可变域”、“恒定区或恒定域”、“γ链”、“κ链”、“λ链”、“重链”、“轻链”和其他与抗体有关的术语在本文中根据如(例如)Goldby，R.A.，Kuby Immunology，前述和/或Harlow，前述中所述的所属领域接受的含义使用。 
术语“cDNA”指与mRNA互补的单链DNA分子或指包含与mRNA互补的链的双链DNA分子。双链cDNA的另一条链将具有与mRNA相同的序列且因此将编码与mRNA相同的多肽。 
“表达载体”是含有足以驱动核酸片段转录的调控序列(例如，启动子和/或其他表达信号和视情况3′序列，诸如3′调控序列或终止信号的载体，所述调控序列可操作性连接所述核酸片段。表达载体也可包含适当转译核酸片段所需的可操作性连接的序列。核酸片段可能(但不必)是蛋白质编码序列。核酸片段可嵌合，意谓其包括超过一个具有不同起源的序列，这些序列通过重组DNA技术连接在一起，产生天然不存在的核苷酸序列。术语“表达载体”可指插入可操作性连接的核酸片段之前或之后的载体。某些表达载体使DNA在宿主之间穿梭，诸如细菌-酵母，或细菌-动物细胞，或细菌-真菌细胞，或细菌-无脊椎动物细胞，或细菌-植物细胞。典型的表达载体应含有用于在宿主细胞中自发复制的复制起源、一个或一个以上可选择标记、一个或一个以上(通常数个)适用限制酶位点、通常可能的高拷贝数目和一个或一个以上启动子。 
“一致性”指两个或两个以上核酸序列相同的程度。评估窗口范围内的第一与第二核酸之间的一致性百分率可通过使核酸比对，确定评估窗口内的与同一核苷酸相对的核苷酸数目，允许引入间隙以使一致性最大化，除以窗口中的核苷酸总数且乘以100来计算。当计算达成特定一致性％所需的同一核苷酸的数目时，分数近似为最接近的整数。当比较两个或两个以上序列时，其中任一个可视为参考序列。 
一致性百分率可使用所属领域中已知的多种计算机程序计算。举例来说，诸如BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST等的计算机程序产生比对且提供所关注的序列与任何多种公共数据库中的序列之间的一致性％。将如在Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877，1993中修改的Karlin和Altschul算法(Karlin和Altschul，Proc.Natl，Acad.Sci.USA 87：22264-2268，1990)并入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序 (Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)中。为获得用于比较目的的间隙性比对，利用如Altschul等人(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)所述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。参考URL为www.ncbi.nlm.nih.gov.的网站。可使用PAM250或BLOSUM62矩阵。 
术语“分离”意谓：1)与在自然界中通常与之相缔合的至少某些组分分离；2)由包括人手动的方法制备或纯化；和/或3)自然界中不存在。从自然界中可见的较大核酸(例如，染色体、游离体、病毒或细菌基因组)切除或扩增的核酸视为分离的。在一些实施例中，切除或扩增的核酸不再与非编码区连接(但可与原生调控区或其部分连接)，或不再与位于较大核酸中可见的分离核酸的上游或下游的其他基因连接。分离的核酸包括插入质粒、柯斯质粒(cosmid)、人造染色体、病毒载体等中的核酸，即，构成重组核酸构造体的一部分的核酸视为分离的。分离核酸可以是扩增产物(例如，PCR产物)、分离mRNA、cDNA、限制片段等。分离多肽可以是表达于异源表达系统中的多肽，即，由不表达自然界中的多肽的细胞表达。分离抗体可以是存在于不为血液或血清的组合物中的抗体。由分离的核酸所表达的抗体视为分离抗体。任何本发明的核酸、抗体链或抗体都可以分离形式提供。 
术语“核酸”、“聚核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中互换使用指具有至少3个核苷酸的聚合物。核苷包含与糖分子连接的含氮碱基。在聚核苷酸中，磷酸基与相邻核苷共价连接以形成聚合物。聚合物可包括天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物、化学修饰碱基、生物修饰碱基(例如，甲基化碱基)、嵌插碱基、修饰糖(例如，修饰嘌呤或嘧啶)。参见Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版(Freeman，San Francisco，1992)，Scheit，NucleotideAnalogs(John Wiley，New York，1980)和美国专利公开案第20040092470号和其中的参考文献用于进一步讨论可用于本文所述的聚核苷酸中的各种核苷酸、核苷和主链结构和其制造方法。诸如肽核酸、锁核酸(locked nucleic acid)等的类似物也在本发明的范畴内。聚核苷酸可具有任何尺寸或序列，且其可为单链或双链。寡核苷酸的长度通常小于100个核苷酸。本文所揭示的任何核酸可呈单链或双链形式。当本发明提供核酸序列时，也提供互补序列。此外，当提供呈DNA的序列时，也提供相应RNA序列(即，T经U置换的序列)。 
使用术语“核酸构造体”指经人手动修饰的核酸或源自于这种核酸的核酸。举例来说，核酸构造体相对于天然存在的核酸分子可含有突变、缺失或取代。核酸构造体可包含两个或两个以上源自或起源自诸如不同生物体的不同源的核酸片段，例如，重组聚核 苷酸。核酸构造体的一个或一个以上部分的序列可完全由人发明。 
如本文所使用的术语“核酸序列”可指核酸物质本身且不局限于生物化学表征特定核酸例如，DNA或RNA分子的序列信息(即，选自5个碱基字母A、G、C、T或U的字母的接续)。 
“可操作性连接”或“可操作性缔合”指两个核酸之间的功能关系，其中一个序列的表达、活性、定位等由另一核酸控制、引导、调控、调节等。这两个核酸视为可操作性连接或可操作性缔合。“可操作性连接”或“可操作性缔合”也指两个多肽之间的关系，其中一个多肽的表达由另一多肽控制、引导、调控、调节等。这两个核酸视为可操作性连接或可操作性缔合。举例来说，核酸的转录由可操作性连接的启动子引导；核酸的后转录加工由可操作性连接的加工序列引导；核酸的转译由诸如转译起始序列的可操作性连接的转译调控序列引导；核酸或多肽的运输、稳定或定位由诸如分泌信号序列的可操作性连接的运输或定位序列引导；且多肽的后转译加工由可操作性连接的加工序列引导。虽然与第二核酸序列可操作性连接的第一核酸序列或与第二多肽操作性连接的第一多肽优选与这一序列直接或间接共价连接，但任何有效的三维缔合是可接受的。所属领域的技术人员应了解，多个核酸或多个多肽可可操作性连接或缔合。 
术语“引物”指充当适当条件下(例如，在存在4种不同核苷三磷酸和诸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶的聚合剂的情况下)在含有任何必要辅因子的适当缓冲溶液中且在适当温度下的模板引导DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的适当长度取决于引物的预定用途，但通常在约10到约50个核苷酸的范围内。虽然引物不必与模板完全互补，但应充分互补以与之杂交。引物可以双链形式提供，即，与其补体杂交。 
如本文所使用的“纯化”意谓使实体或物质与一个或一个以上纯化之前先前可见其的其他实体或物质分离。实体或物质可部分经纯化，大体上经纯化或是纯的。当将诸如核酸或多肽的物质或实体从大体上所有不为溶剂和溶剂中所含的任何离子的其他化合物或实体移出时，其视为纯的，即，其构成组合物的干重的至少约90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％。部分或大体上纯化的诸如核酸或多肽的化合物或实体可从天然可见(例如)诸如细胞蛋白和/或核酸的细胞物质的物质的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％中移出。在某些实施例中，纯化核酸或多肽以干重计分别构成组合物中的总核酸或多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至更高。评定纯度的方法在所属领域中是已知的且包括色谱法、免疫学法、电泳法等。 
关于核酸的术语“调控元件”或“调控序列”在本文中通常用于描述引导或控制与 之操作性连接的核酸序列的表达中的一个或一个以上步骤(尤其转录，但在一些情况下，诸如剪接或其他加工的其他事件)的核酸部分。术语包括启动子且也可指增强子、沉默子(silencer)和其他转录控制元件。启动子是包括转录起始之前与RNA聚合酶结合的位点且为出现均匀转录基底水平通常所必需的核酸区。这些元件通常包含TATA盒。增强子是涵盖蛋白质结合位点的核酸区，其提升位于附近或远处的启动子的转录活性，通常在一定程度上高于在不存在增强子的情况下将存在的表达基底水平。在本发明的一些实施例中，调控序列可引导核苷酸序列的组成性表达，例如，表达可在大部分或所有细胞类型中和/或在大部分或所有条件下出现；在其他实施例中，调控序列可引导细胞或组织特异性和/或可诱导表达。举例来说，表达可通过存在或添加诸如激素或其他小分子的诱导剂或通过增加温度等来诱导。调控元件也可抑制或降低操作性连接的核酸的表达。以此方式表现的调控元件在本文中将称为“负调控元件(negative regulatory element)”。 
表达水平通常可使用测量mRNA或蛋白质的标准技术来测定。这些方法包括Northern印迹(Northern blotting)、原位杂交、RT-PCR、定序、免疫学法(诸如免疫印迹、免疫检测或用荧光标记抗体染色后的荧光检测)、寡核苷酸或cDNA微阵列或膜阵列、蛋白质阵列分析、质谱等。测定表达水平的简便方法是以与调控元件可操作缔合的方式将编码容易可检测的标记(例如，荧光或发光蛋白质，诸如绿色荧光蛋白质或荧光素酶；酶，诸如碱性磷酸酶等)的核酸放置在表达载体中，将载体引入到所关注的细胞类型中或生物体中，将细胞或生物体维持一段时间，然后利用任何使标记变得容易可检测的性质(例如，荧光、发光、底物光学性质的变化等)测量容易可检测的标记的表达。比较不存在或存在调控元件情况下的表达指示调控元件影响操作性连接序列的表达的程度。 
“特异性结合”泛指靶多肽(或更一般地说，靶分子)与诸如抗体或配体的结合分子之间的物理性缔合。缔合通常取决于由结合分子识别的诸如抗原决定子或抗原決定基的靶的特定结构特征的存在。举例来说，如果抗体对抗原決定基A具有特异性，那么含有游离的标记A和与其结合的结合分子的反应中含有抗原決定基A的多肽的存在或游离的未标记A的存在将减少与结合分子结合的标记A的量。应理解，特异性不必是绝对的，而是泛指出现结合的情况。举例来说，所属领域中熟知许多抗体与除靶分子中所存在的抗原決定基以外的其他抗原決定基交叉反应。视待使用抗体的应用而定，这种交叉反应性可能是可接受的。所属领域的技术人员应能够选择具有在任何给定应用(例如，检测靶分子，治疗目的等)中适当运行的足够特异性度的抗体或配体。同时应理解，特异性可在结合分子对靶的亲和力相对结合分子对其他靶(例如，竞争者)的亲和力的附 加因素的情况下评估。如果结合分子展示对于想要检测的靶分子的高亲和力和对非靶分子的低亲和力，那么抗体将可能是可接受的试剂。一旦在一种或一种以上情况下建立结合分子的特异性，就可应用于其他、优选类似情况下而不必再评估其特异性。如果在测试条件下，例如在生理条件下，亲和力(平衡解离常数，Kd)为至少10-3M，优选10-4 M，更优选10-5M，例如10-6M、10-7M、10-8M或10-9M，那么两个或两个以上分子的结合可视具有特异性。 
如本文所使用的“个体”指(例如)出于实验、诊断和/或治疗的目的，待对其传送抗体组合物的个体。优选个体是哺乳动物，尤其驯养哺乳动物(例如，狗、猫等)、灵长类动物或人类。 
如本文所使用的“治疗”通常可包括逆转、减轻、降低、抑制这一术语所应用的疾病、病症或病状或这种疾病、病症或病状的一种或一种以上症状或表现症状的的进展或减小其可能性。“预防”指使得疾病、病症、病状或其症状或表现症状或其严重程度的恶化不出现。 
“载体”在本文中使用指能够介导核酸分子进入(例如转移、运输等)到细胞中的核酸或病毒、病毒基因组或其部分(例如，病毒壳体或病毒基因组的组分)。当载体是核酸时，待转移的核酸分子通常连接于(例如，插入于)载体核酸分子。核酸载体可包括引导合适宿主细胞内的自发复制的序列(例如，复制起源)或可包括足以使所有核酸的部分整合于宿主细胞DNA中的序列。适用的核酸载体包括(例如)DNA或RNA质粒、柯斯质粒和天然存在或修饰病毒基因组或其部分或可包装在病毒壳体中的核酸(DNA或RNA)。质粒载体通常包括复制起源和一种或一种以上可选择标记。质粒可包括部分或所有病毒基因组(例如，病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可用于将核酸分子引入到细胞中的病毒或其部分(例如，病毒壳体)称为病毒载体。适用的动物病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒和其他痘病毒、单纯疱疹病毒(herpex simplex virus)和其他类似物。适用的植物病毒载体包括那些基于烟草花叶病毒(tobamovirus)、等轴不稳环斑病毒(ilarvirus)等的病毒载体。当病毒载体引入宿主细胞中时，其可能会含有或可能不会含有足够的制造传染性病毒的病毒基因信息，即，病毒载体可能具有复制缺陷且对本发明的某些实施例来说，这些复制缺陷病毒载体可能更优选。当缺乏足够信息时，可能(但不必)由宿主细胞或引入细胞中的另一载体供应。 
本发明的某些实施例的详细描述 
本发明涉及编码单克隆抗体(MAb)PA的核酸和编码单克隆抗体LF的核酸。核酸所编码的抗体和其功能片段分别特异性识别炭疽蛋白PA和LF且抑制活性和产生性炭疽 传染。本发明也涉及编码包含PA和/或LF的修饰形式和其功能片段的多肽的核酸和包含PA和/或LF的修饰形式和其功能片段的多肽。这些抗体和功能片段保留亲本鼠类抗体PA和/或LF的结合特异性和抑制活性。本发明另外涉及PA和/或LF抗体的最佳形式，与PA和/或LF抗体的亲本形式相比，其展示增加的结合亲和力和特异性。 
广泛使用首先由Kohler和Milstein，Nature 256：495，1975描述的融合瘤法用于鉴别展示想要结合性质的单克隆抗体。简单来说，这种技术通常包括从免疫哺乳动物中分离淋巴细胞，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，和分离由融合产生的克隆细胞系(融合瘤)。筛选这些细胞系以鉴别那些产生与所关注的多肽或其特定部分或抗原决定子结合的抗体的细胞系。也可筛选细胞系以鉴别产生对靶多肽具有想要的亲和力的抗体的细胞系。免疫哺乳动物可能已有意被免疫(例如，接种疫苗)或可能已被传染性生物体传染、暴露于抗原等。因此，“免疫哺乳动物”指产生与所关注的多肽特异性结合的抗体的任何哺乳动物。在本发明的一优选实施例中，哺乳动物是人类，例如已接种防传染因子的疫苗、暴露于传染因子等的人类。 
本发明提供用于(例如)使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)从融合瘤分离编码抗体重链或轻链的cDNA的寡核苷酸引物和引物组。 
在一实施例中，寡核苷酸包含SEQ ID NO：1-44中的任一个。在另一实施例中，寡核苷酸由SEQ ID NO：1-44中的任一个组成。其他方面，某些引物中所提供的限制酶位点可被修饰为任何优选限制酶位点，以调适引物为合乎需要的载体插入位点。 
另一方面，本发明提供分离编码抗体链或其部分的核酸的方法。在一实施例中，所述方法包含如下步骤：(a)使由抗体产生细胞获得的核酸与至少一个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸引物接触；和(b)进行扩增反应。扩增反应通常是聚合酶链反应(PCR)。在本发明的某些实施例中，步骤(a)包含使核酸与至少两个选自由SEQID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸引物接触。应了解，尽管本发明的引物和方法可具有从融合瘤克隆抗体链cDNA(即，编码抗体链的cDNA)的特定用途，其无论如何不局限于这个目的，而是可用于从任何抗体产生细胞、细胞株等克隆抗体链cDNA。抗体链优选是人类抗体链。 
另一方面，本发明提供编码结合炭疽蛋白的抗体多肽链或其功能片段的核酸组合物。在一实施例中，编码抗体多肽链或其功能片段的核酸组合物包含结合炭疽芽孢杆菌保护性抗原的功能蛋白。在一实施例中，本发明提供编码与炭疽芽孢杆菌保护性抗原结合的单克隆抗体或其功能片段的κ轻链的核酸。在一实施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。在另一实施例中，本发明提供编码与炭疽芽孢杆菌保护性抗原结合的单 克隆抗体或其功能片段的γ重链的核酸。在一实施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。 
在一实施例中，编码抗体多肽链或其功能片段的核酸组合物包含结合炭疽芽孢杆菌致死因子的功能蛋白。在一实施例中，本发明提供编码与炭疽芽孢杆菌致死因子结合的单克隆抗体或其功能片段的κ轻链的核酸。在一实施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。在另一实施例中，本发明提供编码与炭疽芽孢杆菌致死因子结合的单克隆抗体或其功能片段的γ重链的核酸。在一实施例中，核酸是cDNA序列或包含cDNA序列。 
本发明进一步提供多种包含一种或一种以上本发明核酸、例如编码抗体重链或轻链的核酸的核酸构造体，其中使用一个或一个以上本发明引物从表达抗体重链或轻链的细胞或细胞系中分离所述核酸。举例来说，本发明提供含有一种或一种以上本发明核酸的载体，例如表达载体。在某些实施例中，载体是适于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转型的双元载体。在某些实施例中，载体是植物病毒。在某些实施例中，载体基于植物的病毒，即，其含有一种或一种以上植物病毒的基因组组分。 
本发明进一步提供表达一种或一种以上所提供的核酸且产生单克隆抗体或其功能片段的重链或轻链的宿主细胞。 
本发明进一步提供产生抗体重链或轻链的方法，其包含：(i)提供表达系统，其含有编码单克隆抗体或其功能片段的重链或轻链的核酸，其中使用一个或一个以上本发明的引物分离所述核酸，其中所述核酸可操作性连接于在表达系统中引导核酸的表达的诸如启动子的调控元件；(ii)将表达系统维持在表达发生的条件下。所述方法可进一步包含(iii)收集抗体或其功能片段。抗体或其功能片段可使用所属领域中已知的多种技术中的任一种纯化。表达系统可以是任何合适的表达系统，例如，细胞培养物、转基因植物或动物、克隆根或植物细胞系等。完整抗体可通过使重链和轻链彼此缔合来产生。 
本发明进一步提供产生包含重链和轻链的抗体或其功能片段的方法，其包含(i)提供表达系统，其含有编码抗体重链或其功能片段的核酸且进一步含有编码抗体轻链或其功能片段的核酸，其中所述核酸中的任一个或两个可操作性连接于在表达系统中引导表达的诸如启动子的调控元件；(ii)将表达系统维持在表达发生的条件下。两个抗体链都是由表达系统产生且可在表达系统中彼此缔合。所述方法可进一步包括收集抗体的步骤。可使用任何合适的表达系统。 
本发明进一步提供治疗个体的方法，其包含投与包含重链和轻链的抗体或其功能片段，其中任一个链或两个链都是根据本文所述的本发明方法产生的。 
本申请案提及多种专利、专利申请案、期刊文章和其他公开案，所有都以引用的方式并入本文中。另外，下列标准参考资料以引用的方式并入本文中：Ausubel，F.(编)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols in Immunology，CurrentProtocols in Protein Science和Current Protocols in Cell Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，2002年7月编；Sambrook，Russell和Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，2001；Harlow，E.等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版1988)；Goldsby，R.A.等人(编)，Kuby Immunology，第4版，W.H.Freeman & Company，New York，2000和Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw Hill，2001。如果任何所并入的参考文献与本说明书或所属领域的技术人员的理解之间存在冲突或不一致，那么应以说明书为主，应理解，是否存在冲突或不一致的判定是在发明者的判断内且可在任何时候进行。 
本发明提供用于(例如)使用聚合酶链反应(PCR)从融合瘤分离编码抗体重链或轻链的核酸(例如，cDNA)的新颖的寡核苷酸引物和引物组。PCR在所属领域是熟知的且描述于(例如)PCR Primer：A Laboratory Manual，Dieffenbach，C.W.和Dveksler，G.S.(编)；PCR Basics：From Background to Bench，Springer Verlag，2000；M.J.McPherson等人；Mattila等人，Nucleic Acids Res.，19：4967(1991)；Eckert等人，PCR Methods andApplications，1：17(1991)；PCR(McPherson等人编，IRL Press，Oxford)和美国专利第4,683,202号。在本发明的某些实施例中，从细胞或细胞系(诸如，融合瘤)中分离RNA，例如mRNA)。使RNA进行逆转录以产生cDNA。使用一个或一个以上本发明的寡核苷酸引物或引物组扩增编码抗体重链或轻链的核酸。也可使用其他扩增技术将本发明引物用于扩增反应。 
本发明的寡核苷酸列于表1中，表1也指示抗体基因或cDNA的与引物杂交的部分，例如，γ链恒定区(CG)、λ链恒定区(CL)、κ链恒定区(CK)、重链可变区(VG)、λ链可变区(VL)或κ链可变区(VK)。应了解，某些引物与编码链或非编码链杂交，因此“杂交”打算涵盖这些可能性中的任一种。表1也指示可获自GenBank的个别序列的数目，其可归为应该可能会使用特定引物而加以扩增的“家族”。指示为“短”的某些引物不含工程化限制性位点。较长的其他引物含有位于相对于与抗体基因或cDNA杂交的部分的5′处的Sfi I限制位点。这些引物在5′端处还含有CTC或CTCGC以提高由限制酶裂解的效率。本发明涵盖包含具有表1的“短”引物的序列的部分且进一步包含位于相对于具有短引物的序列的部分的5′处的限制位点的其他寡核苷酸。包含Sfi I位点(以 粗体指示)的引物提供本发明的短引物可如何被修饰以并入限制位点的实例。 
因此，一方面，本发明提供序列包含SEQ ID NO：1-44中的任一个或由SEQ ID NO：1-44中的任一个组成的寡核苷酸。另一方面，本发明提供含有至少2个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本发明提供含有至少3个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本发明提供含有至少4个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本发明提供含有至少5个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸的引物混合物。另一方面，本发明提供含有至少6个选自由SEQ ID NO：1-44组成的群组的寡核苷酸的引物混合物。在本发明的某些实施例中，引物混合物中的至少1个引物是恒定区引物且引物混合物中的至少1个引物是可变区引物。 
在一些实施例中，引物混合物含有至少1个与编码γ链恒定区的至少一部分的序列杂交的引物(CG引物)和至少1个与编码重链可变区的至少一部分的序列杂交的引物(VG引物)。在一些实施例中，引物混合物含有至少1个与编码λ链的恒定区的至少一部分的序列杂交的引物(CL引物)和至少1个与编码λ链的可变区的至少一部分的序列杂交的引物(VL引物)。在一些实施例中，引物混合物含有至少1个与编码κ链的恒定区的至少一部分的序列杂交的引物(CK引物)和至少1个与编码κ链的可变区的至少一部分的序列杂交的引物(VK引物)。在本发明的一些实施例中，引物混合物含有至少2个或3个VG引物和至少1个CG引物。在本发明的一些实施例中，引物混合物含有至少2个或3个VL引物和至少1个CL引物。在本发明的一些实施例中，引物混合物含有至少2个或3个VK引物和至少1个CK引物。在任何前述实施例中，引物可能是短的或长的。在本发明的一些实施例中，使用引物组或一对短引物进行第一PCR反应且使用引物组或一对含有限制位点的引物(长引物)进行第二PCR反应。长引物可包含如实例1中所述的短引物的序列。 
表1：RT-PCR引物
Figure RE-S2006800361361D00121
Figure RE-S2006800361361D00141
应了解，表1中所列的序列表示具有所列序列的单一寡核苷酸分子或各自具有所列序列的寡核苷酸分子群体。表1中所列的某些引物是简并的，即，由序列表示的寡核苷 酸分子群体含有序列在简并位置处不同的个别成员。术语“位置”指聚核苷酸中分配给各核苷的数值，通常相对于5′端。 
简并引物的概念在所属领域中是熟知的且在本文中与所属领域中的理解一致使用。表2含有IUPAC模糊代码，其列出表示可在简并位置存在的核苷酸的缩写。举例来说，K表示G或T。 
表2：模糊代码
如果在寡核苷酸的给定位置处存在“N”种可能的核苷酸，那么认为这一位置为N重简并。因此，引物序列“CG”，即，5′-CTCGCGGCCTCCGAGGCCTCATTTACCCKGAGACAGG-3′(SEQ ID NO：1)表示含有位置29被G占据的一些成员和位置29被T占据的一些成员的寡核苷酸群体。本发明包括简并位置被任何在这一位置处可能的替代物占据的寡核苷酸。举例来说，本发明涵盖具有位置29被G占据的SEQ ID NO：1序列的寡核苷酸以及涵盖具有位置29被T占据的SEQ ID NO：1的序列的寡核苷酸。涵盖所有可能。举例来说，引物VG1+7短”(SEQID NO：13)在位置9处和11处是2重简并。因此，除涵盖由SEQ ID NO：13表示的含有具有4种不同序列中的任一种序列的寡核苷酸分子的简并寡核苷酸外，本发明还涵盖SEQ ID NO：13的4种非简并变异体。本发明还涵盖比表1中所指示的少的位置是简并的实施例。举例来说，本发明涵盖仅SEQ ID NO：13的位置9是简并(且位置11是由Y 表示的任一核苷酸)的实施例和仅SEQ ID NO：13的位置11是简并(且位置9是由S表示的任一寡核苷酸)的实施例。 
简并寡核苷酸的寡核苷酸群体中的不同寡核苷酸的比例可变化。群体中各序列通常大致相等地呈现。然而，可能希望偏离混合物的组成。表1中所列的简并寡核苷酸的任何特定百分率组成都在本发明的范畴内。寡核苷酸的总简并度是寡核苷酸群体中可存在的不同序列的总数。举例来说，如果存在3个简并位置，各简并位置是2重简并，那么寡核苷酸群体的简并度是23＝8。 
表达系统和抗体产生
使用任何本发明寡核苷酸引物分离的编码抗体重链或轻链的核酸可表达于多种表达系统的任一种中。表达系统是能够合成多肽的任何合适的生物系统，诸如细胞系或转基因动物或植物。通常将核酸插入表达载体中，已知多种表达载体。表达所关注的聚核苷酸的合适方法在所属领域中是已知的且描述于Ausubel，前述和Sambrook，前述中也参见美国专利第4,816,567号和第6,331,415号。可使用任何原核或真核表达系统。在本发明的某些实施例中，表达系统不是融合瘤且不是人类，即，表达系统是不天然产生抗体链的表达系统。 
在本发明的某些实施例中，使用基于植物的表达系统。基于植物的表达系统是任何使用植物或其部分的细胞的表达系统。表达系统可以是植物细胞系、整株植物、克隆根细胞系等。植物细胞系、整株植物、克隆根细胞系等可以是转基因的或非转基因的。 
在基于植物的表达系统中表达所关注的聚核苷酸(例如抗体重链或轻链)的方法和载体在所属领域中是熟知的。参见，例如美国专利第6,852,319号。在本发明的某些实施例中，使用基于植物病毒基因组的载体。在不限制的情况下，本发明涵盖使用任何基于植物病毒或病毒基因组(例如，RNA植物病毒或病毒基因组、DNA植物病毒或病毒基因组等)的载体。参见，例如美国专利第5,602,242号、第5,500,360号和第5,846,795号。 
在本发明的某些实施例中，使用转基因或非转基因芽作为表达系统。参见，例如美国公开案第20040093643号和Ensley等人在2005年2月11日申请的标题为“Productionof Foreign Nucleic Acids and Polypeptides in Sprout Systems”的U.S.S.N.60/652,186。在本发明的某些实施例中，使用克隆根细胞系或其他克隆细胞系。参见，例如2005年2月18日申请的标题为“SYSTEMS AND METHODS FOR CLONAL EXPRESSION INPLANTS”的U.S.S.N.11/061,980。含有表达所关注聚核苷酸的相关信息的其他专利申请案包括美国公开案第20050026291号、第20050114920号、第WO2005026375号、第WO0046350号、第WO0025574号、第WO2005049839号和美国专利第US6448070号。 
本发明明确地涵盖编码抗体轻链或重链的核酸的表达，其中使用本文所揭示的方法和/或引物使用这一部分所列的任何专利申请案和公开案中所述或所参考的表达系统和方法分离所述核酸。可使用其中所描述的任何特定植物、植物病毒、植物病毒复制子等。在一些实施例中，病毒复制子含有充分序列元件，如此其可视情况利用诸如由转型植物(例如，植物是转基因的或包含另一表达RNA聚合酶的载体)供应的RNA聚合酶的组分复制于植物细胞中。复制子可能会包括或可能不会包括外壳蛋白基因或运动蛋白基因。可使用任何特殊的将植物病毒或复制子引入植物或植物细胞或植物部分中的方法。实例包括涂敷于诸如叶的植物部分，磨蚀(例如，将病毒转录体引入到叶中)、农杆菌渗入法(agroinfiltration)、土壤杆菌介导的转型、生物弹法(biolistics)等。本发明涵盖任何包含根据本文所述的方法分离的核酸的植物病毒载体或复制子，例如，重组植物病毒载体或复制子，且进一步涵盖包含载体的植物、植物部分或源自植物的克隆培养物。本发明进一步涵盖转基因植物，其基因组包含核酸。 
在本发明的一些实施例中，共表达编码重链和轻链的核酸序列，如此这些链可彼此缔合以在收集之前形成完整抗体。 
可使用任何合适的方法收集且视情况纯化根据本发明方法产生的抗体链或抗体。 
当然，也可化学合成抗体的重链或轻链。具有编码重链或轻链的核苷酸序列提供氨基酸序列。 
使用任何本发明寡核苷酸引物所分离的编码抗体重链或轻链的核酸可以多种方式中的任一种修饰。举例来说，其可经修饰以破坏否则将会发生在真核细胞中的糖基化事件或其他后转译加工事件。举例来说，可进行改变会被糖基化的氨基酸或相邻或附近位点的突变。如所属领域中所熟知，Asn-X-(Ser/Thr)是可由真核N-连接的糖基化手段识别的序列。可考虑待使用的表达系统中可见的特定糖基化手段选择待修饰的特定位点。其可经修饰以包括编码多肽标记(例如，促进纯化)的部分、使抗体链靶向特定细胞器的序列等。可使用多种变异而不干扰抗体的特异性抗原结合性质且这些变异在本发明的范畴内。在某些实施例中，这些变异产生与天然存在的抗体为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列一致性的抗体。 
根据本发明的方法产生的抗体可能是抗体片段，诸如Fab′、F(ab′)2、scFv(单链可变)或保留抗原结合位点的其他片段。片段可表达为片段，即，可表达仅编码这一片段的核酸，或可使用已知技术(例如，裂解或消化)加工完整抗体以产生片段。 
载体
如以上所提及，使用本发明引物和方法所分离的cDNA可插入到多种载体中且表达 于多种细胞类型和表达系统中。本发明提供适于插入使用包含限制位点的本发明引物所分离的核酸的其他载体。载体含有与引物中所存在的相同的限制位点。限制位点存在于载体的一个或一个以上位置。在一些实施例中，(例如)使用定点突变(site-directedmutagenesis)移除载体的不想要的位置处的限制位点。在一些实施例中，限制位点是SfiI限制位点。 
在一特定实施例中，本发明提供适于土壤杆菌介导的转型的双元载体pBI121的修饰形式，其中位置11031处的内部Sfi I位点突变且其中产生一个或一个以上新Sfi I位点。简单来说，pBI121运载新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase，NPTII)基因和α-葡糖醛酸酶(α-glucuronidase，GUS)基因(Jefferson等人，EMBO J，6：3901-3907，1987)。新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因受胭脂碱合酶(nopaline synthase，nos)启动子和提供聚腺嘌呤信号的胭脂碱合酶(nos)的终止子控制。新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因给予卡那霉素(kanamycin)耐药性。α-葡糖醛酸酶(GUS)活性受花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)35S启动子和提供聚腺嘌呤的胭脂碱合酶(nos)的终止子控制。本发明提供pBI121的修饰形式，其中最初Sfi I位点突变且其中引入两个新Sfi I位点以使得方便插入异源核酸，诸如编码抗体重链或轻链的核酸。 
试剂盒
本发明提供试剂盒，其包含一种或一种以上表1中所列的寡核苷酸。试剂盒优选含有至少两种寡核苷酸。在特定实施例中，试剂盒含有至少3与44之间的任何数目的寡核苷酸。试剂盒通常含有一对或一组适于扩增编码重链(例如，γ重链)核酸的寡核苷酸和/或一对或一组适于扩增编码轻链(例如，κ或λ轻链)的核酸的寡核苷酸。在一些实施例中，试剂盒含有一对或一组适于扩增γ重链的寡核苷酸、一对或一组适于扩增κ轻链的寡核苷酸和一对或一组适于扩增λ轻链的寡核苷酸。上述任一对或任一组寡核苷酸可包括在试剂盒中。试剂盒通常应包括使用试剂盒从诸如融合瘤的细胞或细胞系中分离编码一个或一个以上抗体链的核酸的说明书。 
除一种或一种以上寡核苷酸外，试剂盒可进一步包含任何多种其他试剂。举例来说，试剂盒可含有进行PCR反应(例如，RT-PCR反应)的试剂。因此，试剂盒可含有(例如)逆转录酶、热稳定DNA聚合酶、核苷酸、缓冲液等。试剂盒可含有从融合瘤或其他RNA细胞源纯化RNA的试剂。 
试剂盒可含有一个或一个以上使用试剂盒可将所扩增的核酸插入其中的载体。载体可能是表达载体，其含有足以引导细胞(例如，植物细胞、细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)中的表达的调控元件(例如，启动子)。也可包括其他合适的 元件，诸如转录终止子等。在所属领域中，可利用多种表达载体，且任何这些表达载体都可包括在试剂盒内。在一实施例中，载体是适于土壤杆菌介导的转型的双元载体。 
载体可含有一个或一个以上方便的限制位点，如此用限制酶裂解载体产生与试剂盒中所存在的一个或一个以上寡核苷酸引物中所存在的限制位点相容(即，杂交)的“粘端”。在一些实施例中，载体含有一个或一个以上识别8个核苷酸的识别位点的酶的限制位点。这8个核苷酸可能是连续的或可能被一个或一个以上其他核苷酸(例如，1-10个核苷酸)隔开，这其他核苷酸不被特异性识别，即使间隔对识别来说可能是必不可少的。举例来说，在某些实施例中，酶在XXXXNNNNNXXXX内切割，其中N代表任何核苷酸且X代表任何特异性核苷酸(即，X各自独立选择)。这些位点会是有利的，因为其允许仅使用一种酶通过在插入的5′端和3′端处具有不同的5个核苷酸序列进行定向克隆。在一些实施例中，载体含有一个或一个以上Sfi I限制位点，其在位点GGCCNNNNNGGCC内切割。这一载体可以直线或环形形式提供。也可提供裂解载体的限制酶。可包括进行连接的试剂，例如连接酶、连接酶缓冲液等。 
试剂盒内或试剂盒上可存在标识符，例如条形码、射频ID标记等。出于质量控制、库存控制、跟踪、工作站之间的移动等的目的，可使用标识符(例如)唯一地鉴别试剂盒。 
试剂盒通常将包括一个或一个以上容器，如此某些个别试剂可单独安置。试剂盒也可包括以相对封闭限制装入个别容器以进行商业销售的构件，例如塑料箱，其中可装入说明书、诸如泡沫聚苯乙烯(styrofoam)的包装材料等。 
编码抗炭疽抗原的人类单克隆抗体和分离重链和轻链的核苷酸序列
如实例1中更详细地描述，使用表1中所列的引物分离编码两种不同人类单克隆抗体(human monoclonal antibody，huMAb)的γ重链和κ轻链的cDNA序列。分离这些cDNA是本发明的寡核苷酸引物的用途的例示。一个huMAb与炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)多肽(称为PA-1)的域4特异性结合。另一个huMAb与炭疽芽孢杆菌致死因子(LF)多肽(称为LF-1)特异性结合。炭疽芽孢杆菌是炭疽的病原体。PA和LF在细菌发病机理中和免疫反应中的作用在所属领域中是熟知的。从融合瘤细胞系中分离cDNA序列，所述融合瘤细胞系是通过使已接收炭疽接种疫苗的个体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合且使用标准方法筛选对炭疽芽孢杆菌具有特异性的抗体获得。 
本发明提供分离核酸，其包含PA-1huMAbκ轻链cDNA的DNA序列(SEQ ID NO：45)、PA-1huMAbγ重链cDNA的DNA序列(SEQ ID NO：47)、LF-1huMAbκ轻链cDNA的DNA序列(SEQ ID NO：49)或LF-1huMAbγ重链cDNA的DNA序列(SEQ ID NO： 51)。本发明也提供相应RNA序列，其中T经U置换。 
本发明也提供由SEQ ID NO：45、47、49或51中的任一个所编码的分离多肽。这些多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：46、48、50和52阐明。本发明也提供与SEQ ID NO：46、48、50或52的多肽为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更高一致性的分离多肽。本发明也提供抗体组合物，其中SEQ ID NO：45、47、49或51中的一个或一个以上表达于不为融合瘤或人类的表达系统中。 
PA-1huMAbκ轻链cDNA的DNA序列：5′- 
PA-1huMAbκ轻链的氨基酸序列：
Figure RE-S2006800361361D00202
PA-1huMAbκ轻链的CDR序列以粗体描绘，且对应于SEQ ID NO：46的氨基酸残基50-61(PA-lCDR1)、氨基酸残基77-83(PA-lCDR2)，和和氨基酸残基116-124(PA-lCDR3)。分离的各CDR序列由以下各者组成： 
PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59) 
PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60) 
PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61) 
PA-1huMAbγ重链cDNA的DNA序列：5′- 
Figure RE-S2006800361361D00211
PA-1huMAbγ重链的氨基酸序：
Figure RE-S2006800361361D00212
PA-1huMAbγ重链的CDR序列以粗体描绘，且对应于SEQ ID NO：48的氨基酸残基51-60(PA-hCDR1)、氨基酸残基75-90(PA-hCDR2)和和氨基酸残基124-133 (PA-hCDR3)。 
PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62) 
PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63) 
PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64) 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA为至少90％序列一致性的轻链CDR1(SEQ ID NO：59)；(ii)与PA-lCDR2：GASSRAT(SEQID NO：60)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)PA-hCDR1为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQID NO：63)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与PA-hCDR3：HRLQRGGFDP (SEQ ID NO：64)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQID NO：61)为至少90％序列一致性的轻链CDR3；和三个由以下各者组成的重链互补决定区(CDR)：(i)与PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ IDNO：64)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQID NO：59)；(ii)轻链PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)；和(iii)轻链PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)；(ii)轻链PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)；和(iii)轻链PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)；(ii)轻链PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)；和(iii)轻链PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合 物。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQID NO：62)；(ii)重链PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)；和(iii)重链PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)；(ii)重链PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQID NO：63)；和(iii)重链PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)；(ii)重链PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)；和(iii)重链PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链PA-lCDR1：RASQSVSYSSLA(SEQ ID NO：59)；(ii)轻链PA-lCDR2：GASSRAT(SEQ ID NO：60)；和(iii)轻链PA-lCDR3：QHYGNSPYT(SEQ ID NO：61)；和三个由以下各者组成的重链互补决定区(CDR)：(i)重链PA-hCDR1：GYTFTSNAIQ(SEQ ID NO：62)；(ii)重链PA-hCDR2：WINGGDGNTKYSQKFQG(SEQ ID NO：63)；和(iii)重链PA-hCDR3：HRLQRGGFDP(SEQ ID NO：64)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌保护性抗原特异性结合。 
在某些实施例中，PA-1抗体功能片段是Fv、Fab、F(ab)2或scFV功能片段中的任一个。 
LF-1huMAbκ轻链cDNA的DNA序列：
Figure RE-S2006800361361D00251
LF-1huMAbκ轻链的氨基酸序列：
Figure RE-S2006800361361D00252
LF-1huMAbκ轻链的CDR序列以粗体描绘且对应于SEQ ID NO：50的氨基酸残基51-60(LF-lCDR1)、氨基酸残基75-90(LF-lCDR2)和和氨基酸残基124-133(LF-lCDR3)。 
LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65) 
LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66) 
LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67) 
LF-1huMAbγ重链cDNA的DNA序列：
Figure RE-S2006800361361D00261
LF-1huMAbγ重链的氨基酸序列：
Figure RE-S2006800361361D00262
LF-1huMAbγ重链的CDR序列以粗体描绘，且对应于SEQ ID NO：52的氨基酸残 基51-60(LF-hCDR1)、氨基酸残基75-90(LF-hCDR2)和和氨基酸残基124-133(LF-hCDR3)。 
LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68) 
LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSYKG(SEQ ID NO：69) 
LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70) 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-1CDR1：RASQSVGSSLH(SEQID NO：65)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与LF-1CDR2：YASQSFS(SEQID NO：66)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与LF-1CDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ IDNO：68)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69) 为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQID NO：70)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)与LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65)为至少90％序列一致性的轻链CDR1；(ii)与LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)为至少90％序列一致性的轻链CDR2；和(iii)与LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)为至少90％序列一致性的轻链CDR3，和三个由以下各者组成的重链互补决定区(CDR)：(i)与LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)为至少90％序列一致性的重链CDR1；(ii)与LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)为至少90％序列一致性的重链CDR2；和(iii)与LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)为至少90％序列一致性的重链CDR3，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQID NO：65)；(ii)轻链LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)；和(iii)轻链LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQID NO：65)；(ii)轻链LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)；和(iii)轻链LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65)；(ii)轻链LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)；和(iii)轻链LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性 结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在某些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含一个或一个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQID NO：68)；(ii)重链LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)；和(iii)重链LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含两个或两个以上选自以下各者的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)；(ii)重链LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)；和(iii)重链LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的重链(HC)互补决定区(CDR)：(i)重链LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)；(ii)重链LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)；和(iii)重链LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。进一步提供编码前述抗体或片段序列的核酸组合物。 
在一些实施例中，提供分离抗体或其功能片段，其中抗体包含三个由以下各者组成的轻链(LC)互补决定区(CDR)：(i)轻链LF-lCDR1：RASQSVGSSLH(SEQ ID NO：65)；(ii)轻链LF-lCDR2：YASQSFS(SEQ ID NO：66)；和(iii)轻链LF-lCDR3：HQSSSLPLT(SEQ ID NO：67)；和三个由以下各者组成的重链互补决定区(CDR)：(i)重链LF-hCDR1：GFMFSSYAMS(SEQ ID NO：68)；(ii)重链LF-hCDR2：GISGSGGTTNYADSVKG(SEQ ID NO：69)；和(iii)重链LF-hCDR3：DGVYGRLGGSDY(SEQ ID NO：70)，且抗体或其功能片段可与炭疽芽孢杆菌致死因子特异性结合。 
在某些实施例中，LF-1抗体功能片段是Fv、Fab、F(ab)2或scFV功能片段中的任何一个。 
抗体组合物和传送工具和方法
本发明提供包含一种或一种以上根据本发明的方法制备的抗体的抗体组合物。“抗体组合物”指包含一种或一种以上抗体或其功能片段和视情况抗体纯化过程中未移除的制造系统的任何组分的组合物。因此，应了解包含通过将使用本发明的寡核苷酸引物分离的cDNA表达于所选择的表达系统(例如，基于植物的表达系统)中制备的抗体或其功能片段的第一抗体组合物可能与包含相同抗体的第二抗体组合物不同，其中第二抗体组合物使用不同表达系统制备。举例来说，包含由维持在组织培养物中的融合瘤产生的 抗体的抗体组合物可含有可见于组织培养基中的残余组分，而使用基于植物的表达系统产生的抗体通常将不含这些组分中的某些。因此，在某些实施例中，本发明的抗体组合物不同于含有相同抗体的其他抗体组合物。 
在一些实施例中，在适于投与个体以达到诊断和/或治疗目的的医药组合物中提供一种或一种以上根据本发明的方法制备的抗体，其中“治疗目的”理解为包括预防性目的(即，在出现疾病或病状的任何病征或症状之前投与)和治疗目的(即，在出现疾病或病状的一种或一种以上病征或症状之后投与)。本发明的抗体可(但不限于)用于诊断、预防和/或治疗传染病(例如，细菌性、病毒性、真菌性或寄生虫性疾病)；癌症(这一术语涵盖癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓发育不良综合症、良性肿瘤等)；以不希望的血管生成、移植排斥反应、移植对宿主疾病等为特征的发炎性病状、病症。本发明的抗体的其他应用包括不良细胞(诸如癌细胞、淋巴细胞等)的活体外免疫衰竭(immunodepletion)。也可使用抗体使其他药剂(例如，诊断剂或治疗剂)靶向体内表达抗体识别的抗原的位点。 
例如抗体的大体上纯的制剂的合适制剂可与医药学上可接受的载剂、稀释剂、溶剂等组合以产生适当的医药组合物。因此，本发明提供投与个体的多种医药学上可接受的组合物，其包含(i)抗体；和(ii)医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂。应理解，当将本发明的医药组合物投与个体时，其优选投与一段时间且以足以治疗或预防投与其以治疗或预防的疾病或病状的量投与。 
在本发明的各实施例中，通过任何合适的投药途径向个体投与有效量的医药组合物，所述投药途径包括(但不限于)静脉内、肌肉内、吸入、导管、眼内、口服、直肠、皮内、涂敷于皮肤等。 
本发明组合物可经调配以通过任何可用途径传送，这些途径包括(但不限于)非经肠、口服、吸入到肺、鼻用、支气管、经眼、经皮(局部)、粘膜、直肠和阴道途径。如本文所使用的术语“非经肠”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、器官内和颅内注射或输注技术。 
术语“医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”指不破坏与之调配的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。本发明的组合物中可使用的医药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括(但不限于)离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，诸如人类血清白蛋白、缓冲物质，诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、 羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。可包括与医药投药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。也可将例如具有独立抵抗待治疗的疾病或临床病状的活性的化合物或增强化合物活性的化合物的补充活性化合物并入组合物中。 
本发明的化合物的医药学上可接受的盐包括那些衍生自医药学上可接受的无机及有机的酸和碱的盐。合适的酸性盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、褐藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐(fumarate)、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(maleate)、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、胶质酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。诸如草酸的其他酸，虽然其本身不为医药学上可接受，但可用于制备适用作获得本发明的化合物和其医药学上可接受的酸加成盐的中间体的盐。 
衍生自适当碱的盐包括碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。本发明还预想本文所揭示的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。由所述季铵化作用可获得水或油可溶或可分散产物。 
调配医药组合物以使其与预定的投药途径相容。用于非经肠(例如，静脉内)、肌肉内、真皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括下列组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节pH值。可将非经肠制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。 
适于注射使用的医药组合物通常包括无菌水性溶液(其中水可溶)或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌散剂。对于静脉内投药来说，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)、磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)或林格氏溶液(Ringer′s solution)。 
通常使用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。诸如油酸和其甘油酯衍生物的脂肪酸适用于制备 可注射剂，因为其为天然的医药学上可接受的油类，诸如橄榄或蓖麻油，特别是其聚乙氧基化的形式。这些油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或调配医药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)中通常使用的类似分散剂。出于调配的目的，也可使用其他常用表面活性剂，诸如制造医药学上可接受的固体、液体或其他剂型通常使用的吐温类(Tweens)、司盘类(Spans)和其他乳化剂或生物可用性增强剂。 
在所有情况下，如果可能，组合物应为无菌的，且应达到容易注射的流动程度。 
优选医药配方在制造和存储条件下是稳定的且必须防腐以免受诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。通常，相关载剂可以是溶剂或分散介质，含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适混合物。(例如)通过利用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下维持所需的粒度和通过利用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等可达成对微生物作用的预防。在许多情况下，将优选在组合物中包括等张剂(例如糖)、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来引起。口服组合物的延长吸收可通过各种包括胶囊化的方式达成。 
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物并入根据需要具有以上所列举的一种成分或其组合的适当溶剂中，接着过滤杀菌来制备。注射用溶液优选不含内毒素。分散液通常通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自以上所列举的那些成分的所需其他成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌散剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此由其先前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何其他想要成分的散剂。 
口服组合物通常包括惰性稀释剂或食用载剂。出于口服治疗投药的目的，可使活性化合物合并有赋形剂且以片剂、含片或胶囊(例如，明胶胶囊)的形式使用。口服组合物也可使用流体载剂制备而用作嗽口水。可包括医药学上相容性的粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何下列成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、淀粉羟基乙酸钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，硬脂酸镁或硬酯酸盐类(Sterotes)；助流剂，诸如胶状二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。经口传送配方可有利地合并有改进在胃肠道中的稳定性和/或增强吸收的试剂。 
对于吸入投药来说，本发明组合物优选从含有合适的推进剂(例如，诸如二氧化碳的气体)的加压容器或分配器或喷雾器中以气雾剂喷雾的形式传送。可使用液体或无水气雾剂(例如，无水散剂、多孔大粒子等)。本发明还涵盖使用鼻用喷雾传送组合物。 
对于局部施用来说，医药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一种或一种以上载剂中的活性组分的合适软膏形式调配。用于局部投与本发明的化合物的载剂包括(但不限于)矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，医药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一种或一种以上医药学上可接受的载剂中的活性组分的合适洗剂或乳膏形式调配。合适的载剂包括(但不限于)矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60、十六酯蜡、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。 
对于局部传送到眼睛来说，医药学上可接受的组合物可调配为于等张的pH值调节无菌生理盐水的微粒化悬浮液或优选为于等张的pH值调节无菌生理盐水中的溶液，含有或不含诸如苯甲基氯化铵的防腐剂。或者，对于眼睛使用来说，医药学上可接受的组合物可以诸如凡士林的软膏形式调配。 
本发明的医药学上可接受的组合物也可通过鼻用气雾剂或吸入投与。这些组合物可根据医药配方领域熟知的技术制备且可使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规溶解剂或分散剂制备为于生理盐水中的溶液形式。 
也可通过粘膜或经皮方式全身性投药。对于粘膜或经皮投药来说，在调配物中使用适于渗透障壁的渗透剂。这些渗透剂通常在所属领域中是已知的且对于粘膜投药来说，包括(例如)洗涤剂、胆盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。粘膜投药可通过使用鼻用喷雾或栓剂来实现。对于经皮投药来说，可将抗体调配为如所属领域中通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。 
抗体组合物也可以用于直肠传送的栓剂(例如，与诸如可可油和其他甘油酯的常规栓剂基质一起)或保留灌肠剂形式制备。 
除上述试剂外，在本发明的某些实施例中，抗体组合物用将保护抗体以免从身体快速排出的载剂制备，诸如控释配方，包括植入物和微囊化传送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚醚和聚乳酸。制备这些配方的方法对所属领域的技术人员来说应显而易见。某些这种物质也可在商业上从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。也可使用脂质悬浮液作为医药学上可接受的载剂。这些可根据所属领域的技术人员已知的方法制备，例如 如美国专利第4,522,811号和本文所列的其他参考文献所述。已描述脂质体，包括靶脂质体(例如，抗体靶脂质体)和聚乙二醇化脂质体(Hansen CB等人，Biochim Biophys Acta.1239(2)：133-44，1995；Torchilin VP等人，Biochim BiophysActa，1511(2)：397-411，2001；Ishida T等人，FEBS Lett.460(1)：129-33，1999)。所属领域的技术人员应了解，为制备控释配方、植入物等所选择的物质和方法应使得保留抗体的活性。举例来说，可能会希望避免过度加热诸如抗体的多肽，过度加热可导致变性和活性损失。 
为便于投药和使剂量均一，以单位剂型调配口服或非经肠组合物通常是有利的。如本文所使用的单位剂型是指对于待治疗的个体来说适合作为单一剂量的物理上离散单元；各单元含有经计算产生想要治疗作用的预定数量的抗体以及所需的医药载剂。 
可由标准医药程序在细胞培养物或实验动物中确定这些组合物的毒性和治疗功效，例如，确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(治疗上对50％的群体有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，且其可表示为比率LD50/ED50。展示高治疗指数的组合物优选。虽然可使用展示毒性副作用的组合物，但应小心设计使这些组合物靶向被感染组织的位点的传送系统以使对未被传染细胞的潜在损害最小且从而减小副作用。 
在调配用于人类的剂量范围中可使用由细胞培养物分析和动物研究所获得的数据。剂量优选位于包括具有极小毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可在视所使用的剂型和所利用的投药途径而定的范围内变化。对于本发明的方法中所使用的任何抗体或其他化合物来说，治疗有效剂量最初可由细胞培养物分析估算。可在动物模型中调配剂量以获得包括细胞培养物中所确定的ED50的循环血浆浓度范围。这些信息可用于更精确地确定人类中适用的剂量。可(例如)通过高效液相色谱测量血浆中的含量。 
医药组合物的治疗有效量通常在每公斤体重约0.001mg到100mg、优选每公斤体重约0.01mg到25mg、更优选每公斤体重约0.1mg到20mg且甚至更优选每公斤体重约1mg到10mg、2mg到9mg、3mg到8mg、4mg到7mg或5mg到6mg的范围内。医药组合物可根据需要以各种间隔和经不同时段投与，例如一天多次，每天一次、隔天一次、每周一次持续约1周到10周、2周到8周、约3周到7周、约4周、5周或6周等。所属领域的技术人员应了解，某些因子可影响有效治疗个体所需的剂量和时限，包括(但不限于)疾病或病症的严重程度、先前治疗、个体的一般健康状况和/或年龄和所存在的其他疾病。用本发明组合物治疗个体通常可包括单一治疗，或在许多情况下，可包括一系列治疗。应了解，可使用一定范围的不同剂量组合(即，两种或两种以上抗体或一种或一种以上抗体和一种或一种以上其他活性剂的剂量)。 
例示性剂量包括每公斤个体或样品重量的抗体毫克量或微克量(例如，每公斤约1微克到每公斤约500毫克、每公斤约100微克到每公斤约5毫克或每公斤约1微克到每公斤约50微克)。对于局部投药(例如，鼻内)来说，可使用比这些剂量小得多的剂量。更进一步了解，适当的剂量取决于药剂的效能且可视情况随特定接受者而调整，例如通过投药递增剂量直到达成预定的想要的反应。应理解，对任何特定个体来说，特定剂量可取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间；投药途径；分泌速率；任何药物组合和待调节的表达或活性的程度。 
本发明进一步提供包含两种或两种以上本发明的抗体和视情况一种或一种以上其他活性剂的医药组合物。 
实例
下列实例描述从产生与炭疽芽孢杆菌PA或LF蛋白质特异性结合的抗体的人类融合瘤细胞系克隆的cDNA。从由从用许可炭疽疫苗免疫的人类患者分离的细胞产生的融合瘤细胞系分离特异性识别PA(本文称为PA)或LF(本文称为LF)的单克隆抗体的人类重链和轻链的cDNA。 
实例1：从融合瘤分离编码人类单克隆抗体的cDNA 
这一实例描述使用表1中所列的某种寡核苷酸引物分离编码人类单克隆抗体的cDNA。根据制造商的指南使用所有试剂盒。 
从融合瘤细胞系纯化RNA 
所有RNA都是使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从任何给定融合瘤细胞系的105个细胞中纯化。在50μl水中洗脱RNA(不计算产率)且各RT-PCR反应中使用5μl。 
逆转录-PCR 
用于RT-PCR的引物列于表1中。用Superscript One-Step RT-PCR以Platinum TaqDNA聚合酶(Invitrogen)进行RT-PCR。为高效靶向任何给定重链或轻链序列中的所有可能的可变区，各RT-PCR反应使用引物的组合，且同时进行数个RT-PCR反应来扩增各抗体基因。 
对重链来说，在一个反应中，使2μM引物VG1+7短、VG2短和VG3短中的每一个与2μMγ链恒定区短(CG短)引物组合，且在第二反应中，使2μM引物VG4-短、VG5-短和VG6-短中的每一个与2μMγ链恒定区短(CG-短)引物组合。然后使用QiaexII(Qiagen)纯化任何产物，且如果产物来自第一初始反应，那么用2μM引物VG1、VG2和VG3的每一个与2μM引物CG再扩增，或如果产物来自第二RT-PCR反应，那 么用2μM引物VG4、VG5和VG6中的每一个与2μM引物CG再扩增，使用Platinum PCRSuperMix High Fidelity(Invitrogen)引入不同的5′和3′Sfi I限制位点。 
对于轻链来说，RT-PCR产物产率一直足以使产物立即亚克隆，从而消除对短引物的初始RT-PCR反应的需要。实情为，使2μM三个可变区引物中的每一个与2μM恒定区引物(表1)组合，产生λ轻链的三个独立反应和κ轻链的两个独立的反应。反应尤其含有2个或3个可变区引物，如下： 
CK+VK1、2+1.8和3 
CK+VK4和5 
CL+VL1、2和3 
CL+VL4、5和6+9 
CL+VL7和10+8 
应了解，可能已使用其他组合。 
PCR循环条件由Krebber，A.，Bornhauser，S.，Burmester，J.，Honegger，A.，Willuda，J.，Bosshard，H.R.和Pluckthun，A.(1997).Reliable cloning of functional antibody variabledomains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phagedisplay system.J Immunol Methods 201，35-55改编而来。对于RT-PCR，循环条件如下：45℃下30分钟，94℃2分钟，将94℃1分钟、63℃下30秒、58℃下50秒、72℃下3分钟循环7次，且将94℃下1分钟、63℃下1min和72℃下3分钟循环33次，接着72℃下7分钟。对于常规PCR(非RT-PCR)，省略45℃下30分钟和94℃下2分钟的起始步骤。 
将扩增产物克隆到双元载体pBISfi中，pBISfi的构造描述于实例2中。 
实例2：构造载体pBISfi 
这一实例描述修饰双元载体pBI121以促进其在植物中表达抗体的用途。首先，如下使载体pBI121的11031碱基对处的内部Sfi I位点突变：用Sfi I消化载体且使用Klenow填充所得单链悬臂且再连接所得钝端。为产生5′唯一性Sfi I位点，使寡核苷酸BamSfi 1(5′-GATCCGGCCCAGCCGGCCG-3′；SEQ ID NO：53)与BamSfi 2(5′-GATCCGGCCGGCTGGGCCG-3′；SEQ ID NO：54)彼此粘接且连接到载体pBI121(缺乏内部Sfi I位点)的BamH I位点。类似地，使寡核苷酸SacSfi 1(5′-GCCTCGGGGGCCGAGCT-3′；SEQ ID NO：55)与SacSfi 2(5′-GCCCCCGAGGCCGAGCT-3′；SEQ ID NO：56)粘接且连接到pBI121(缺乏内部Sfi I位点)的Sac I位点产生3′唯一性Sfi I位点。 
实例3：使编码PA抗体重链的cDNA突变 
使用Invitrogen的QeneTailor试剂盒根据制造商的建议使编码PAγ链的cDNA突变以改变PAγ链的位置318处的N-糖基化位点。使用如下突变引物：5′-ccgcgggaggagcagtacCAAagcacgtaccgt-3′(SEQ ID NO：57)。反向引物是：gtactgctcctcccgcggctttgtcttggca(SEQ ID NO：58)。作为突变的结果，AAC密码子被CAA密码子置换，产生Asn-＞Gln的变异。 
实例4：在植物中产生糖基化和非糖基化PA抗体 
在pBISfiI的35S启动子下，用携带轻链或重链cDNA的农杆菌培养物(Agrobacterialculture)的1∶1混合物农杆菌渗入后从烟草(Nicotiana benthamiana)植物的叶子中纯化糖基化和非糖基化PA抗体(分别为PA和PANG)。使用蛋白质A和T凝胶色谱法纯化抗体且使用SDS-PAGE比较抗体。图1展示凝胶图像，其清楚地展示归因于缺乏糖基化PANG重链的电泳迁移率的差，即，因为PANG重链较轻，所以其比PA重链迁移得快。西方印迹(Western blot)和ELISA分析证实PA、PANG和LF抗体分别对PA和LF具有特异性结合活性，表明在植物中产生并不减弱抗体结合特异性。 
实例5：大鼠中抗PA和抗LF人类单克隆抗体的半衰期研究 
用50μg植物产生的PA、植物产生的PANG或植物产生的LF腹膜内注射雄性Fischer大鼠。注射前以及注射后2小时和第1、2、3、4、5、10、15和20天时采集血清样品。用PA或LF特异性结合ELISA分析血清。植物产生的PA和PANG展示类似的半衰期，而与两个植物产生的PA抗体相比，LF抗体具有稍低的半衰期。 
实例6：动物保护研究 
根据Beedham和其同事的方法测定植物产生的PA保护A/J小鼠以免受炭疽芽孢杆菌史特内菌株(Sterne strain)的孢子的激发的能力。通过腹膜内途径给予5只小鼠的组存于PBS中的180μg植物产生的PA mAb。对照小鼠接受PBS。被动免疫后2.5小时，动物接受炭疽芽孢杆菌孢子，剂量为于0.1mL PBS中的1×104个孢子(约30半致死剂量)。激发之后，每日监测动物持续14天从而为发病率或死亡率提供证据。接受植物产生的mAb的动物不显示疾病症状，仍健康且幸免于激发，而所有对照动物出现疾病且在激发后3天内死亡。 
仅仅使用常规实验，所属领域的技术人员应认识到或能够探知本文所述的本发明的特定实施例的许多等价物。本发明的范畴不打算受上述描述限制，而是如附加权利要求书中所述。在权利要求书中，除非上下文明确指示相反意思，否则诸如“一”和“所述”的用语可能意谓一个或一个以上。除非上下文明确指示相反意思，否则包括群组的一个 或一个以上成员之间的“或”的权利要求或描述视为满足在给定产物或过程中存在、使用或与之相关的一个、一个以上或所有群组成员的情况。此外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中一个或一个以上所列权利要求的一个或一个以上限定、要素、从句、描述性术语等引入到另一权利要求中。具体来说，依赖于另一权利要求的任何权利要求可经修饰以包括依赖于同一基础权利要求的任何其他权利要求中可见的一个或一个以上限定。另外，应理解，属于现有技术的本发明的任何特定实施例可能明确地排除在权利要求书之外。因为认为这些实施例为所属领域的技术人员所知，所以即使在本文中没有明确陈述，其也可能被排除。举例来说，可从权利要求书中排除任何特定的寡核苷酸、cDNA、核酸或抗体。 
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Claims (14)

1.一种产生抗体链的方法，其包含在基于植物的表达系统中表达核酸，所述核酸是使用具有SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58序列的寡核苷酸引物从细胞扩增，其中所述细胞是抗体产生细胞，其产生抵抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原的抗体。
2.一种多肽，其包含SEQ ID NO：48氨基酸序列，其中318位置处的Asn被Asn以外的其它氨基酸置换。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中318位置处的Asn被Gln置换。
4.一种抗体，其包含由SEQ ID NO：46氨基酸序列组成的轻链，且包含由SEQ ID NO：48氨基酸序列组成的重链，其中SEQ ID NO：48的318位置处的Asn被Asn以外的其它氨基酸置换。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中SEQ ID NO：48的318位置处的Asn被Gln置换。
6.一种分离核酸，其编码根据权利要求2或权利要求3所述的多肽。
7.一种表达载体，其含有根据权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞、转基因动物或转基因植物，其包含根据权利要求6所述的核酸。
9.一种宿主细胞、转基因动物或转基因植物，其包含根据权利要求7所述的表达载体。
10.一种植物病毒载体或复制子，其包含根据权利要求6所述的核酸。
11.一种产生抗体链的方法，其包含将根据权利要求6所述的核酸在合适的表达系统中表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述表达系统是基于植物的表达系统。
13.一种产生抗体的方法，其包含在足以产生抗体的条件下培养根据权利要求8或权利要求9所述的宿主细胞和纯化所产生的抗体。
14.一种组合物，其包含根据权利要求2或权利要求3所述的多肽；或者根据权利要求4或权利要求5所述的抗体，以及医药学上可接受的载剂。
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