CN101360830A - Flj13639基因相关疾病的诊断和治疗方案 - Google Patents

Abstract

提供了测定怀疑患有或诊断患有癌症的个体预后的方法，其中高CD24/低FLJ13639比值预示着预后不佳。还提供了增强化疗剂活性的方法和用于改善个体预后以及增强化疗剂活性的分离的纯化FLJ13639蛋白。

Description

FLJ13639基因相关疾病的诊断和治疗方案

本申请要求2005年12月8日提交的美国临时申请号60/748,652的优先权，其内容通过引用纳入本文。

发明领域

总体上，本发明涉及血液恶性肿瘤和实体瘤的预后指示物以及利用本发明蛋白质的治疗方法。

相关技术描述

在几种血液恶性肿瘤以及实体瘤中，13q14区域常发生改变。例子包括但不限于：前列腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌。13q14改变(主要是缺失)常见于急性白血病(1)、多发性骨髓瘤和外套细胞淋巴瘤。对于骨髓瘤患者，13q14改变(见于25-40％的样品中)构成了统计学显著的独立不良预后因素(independentadverse prognostic factor)(2-4)。现已证明染色体13缺失与未见显著性的单克隆γ球蛋白病(Monoclonal Gammopathy of Unknown Significance)(MGUS)向多发性骨髓瘤转变有关(5)。在50％的外套细胞淋巴瘤病例中也观察到13q14缺失(6)。类似地，现已描述了各种实体瘤的13q14改变。然而，对13q14染色体改变相关的基因和这种改变与恶性肿瘤表型的关系表征不佳。此外，虽然13q14改变相关恶性肿瘤的某些预后参数是已知的，但它们不足以预测各患者中恶性肿瘤的行为。因此，13q14改变相关恶性肿瘤的患者需要用于个性化预后评估的患者-特异性信息。

发明概述

本发明提供测定诊断患有或怀疑患有癌症的个体的预后情况的方法。该方法包括获得个体的生物学样品，检验该样品以测定CD24表达与FLJ13639表达之比。高CD24/低FLJ13639表达水平预示着预后不佳。

在另一实施方式中，与正常的非恶性细胞相比，低FLJ13639表达水平预示着预后不佳。

还提供了分离的纯化FLJ3639蛋白，例如重组FLJ3639蛋白，和利用该蛋白改善诊断患有或怀疑患有癌症并显示高CD24/低FLJ13639表达水平分布的个体预后的方法。改善个体预后的方法包括将改善个体预后有效量的重组FLJ3636蛋白给予个体。在一个实施方式中，通过降低个体中癌细胞的增殖和/或转移来改善个体的预后。

本发明还提供增强化疗剂作用的方法。该方法包括联合给予化疗剂与增强该化疗剂作用有效量的FLJ3639蛋白。

附图简述

图1A和1B分别是MUTZ5细胞系以及作为对照的G519和EBN-Lin细胞系中FLJ13639和WDFY2基因的RT-PCR结果的照片。

图2是三种FLJ13639转录物及其各自的开放读框的示意图。

图3是FLJ13639P1、P2和P3的细胞定位的照片。所有三张照片均显示线粒体定位与线粒体示踪剂(Mitotracker)(线粒体的一种特异性标记)的模式相同。FLJ13639蛋白的开头20个氨基酸或其余氨基酸的选择性亚克隆证明了所述开头20个氨基酸对于P1线粒体定位的作用。

图4A是电泳分离代表在一系列白血病细胞系和对照中CD24和/或FLJ13639/P1表达的RT-PCR产物的照片。

图4B是电泳分离四种卵巢癌细胞系和EBV-LIN(成淋巴细胞样细胞系)的CD24/FLJ13639/P1的RT-PCR产物的照片。应注意，亲代A2780和顺铂抗性衍生细胞系A2870CP3(以及其它耐受性细胞系)之间的分布翻转，其显示高CD24/低FLJ13639表达分布的转变与化学抗性有关。

图4C是电泳分离代表三种肺癌细胞系中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图4D是电泳分离代表前列腺癌细胞系中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图4E是电泳分离代表一系列侵袭性乳腺癌细胞系中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图5A是电泳分离代表从白血病患者处获得的生物学样品中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图5B是电泳分离代表从卵巢癌患者处获得的生物学样品中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图5C是电泳分离代表从肺癌患者处获得的生物学样品中CD24和FLJ13639表达的RT-PCR产物的照片。

图6提供了通过RT-PCR测试CD24和FLJ13639/P1表达，基于29位患者样品分类的卡普兰-迈耶存活曲线。

图7A是电泳分离乳腺癌肿瘤临床样品的CD24和FLJ13639/P1 cDNA的RT-PCR扩增(产物)的照片。左上图：无染色(0)；右上图：低染色(1+)；左下图：中等染色(2+)；右下图：强染色(3+)。

图7B显示了组织宏观试验(tissue macro array)中石蜡包埋的侵袭性乳腺癌肿瘤的CD24染色。用可商品化购得的抗-CD24抗体染色组织切片来评估CD24染色与疾病阶段之间的关系。晚期疾病(advanced disease)与CD24染色较强有关。

图8A显示了pTAT-HA-FLJ13639/P1载体。

图8B是SDS-PAGE分离FLJ13639/P1-TAT重组蛋白的照片。

图9A图示了将UoCB1细胞与含量渐增的FLJ13639/P1-TAT重组蛋白培育后CD24 mRNA表达的变化。

图9B图示了将肺癌细胞系与FLJ13639/P1-TAT培育后CD24表达的变化。

图10A图示用FLJ13639/P1-TAT重组蛋白(右图)或对照(左图)处理后，UoCB1细胞侵袭可能性的变化。

图10B图示总结了如图10A所示用P1-TAT处理后侵袭性的降低。

图11A图示了与20μg FLJ13639/P1-TAT培育6、12、18和24小时后UoCB1细胞中CD24表达水平的时程分析(time-course analysis)。

图11B提供了在用或不用P1-TAT处理48小时的OM9；22 ALL细胞系中通过免疫荧光评估CD24表达的照片。

图12A是用肺癌细胞系实施的伤口愈合试验的照片。用FLJP1-TAT处理H520细胞(或不处理)，通过光学显微镜监测细胞的活动性来分析所产生空隙的闭合情况。从该图可知，5天后空隙几乎完全填满，而FLJ13639P1-TAT处理抑制了空隙的充填，这表明细胞的活动性和增殖受到抑制。

图12B是用乳腺癌细胞实施的图12A所述伤口愈合试验。

图13图示了用或不用FLJ13639P1-TAT重组蛋白处理的HeLa细胞中的乳酸产量。*表明统计学显著的差异。

图14A图示了如x-轴所示处理HL60/VDR细胞(长春新碱(vinctrisin)抗性细胞系)检测到的绿/红荧光强度比值数据。*表明统计学显著的差异。

图14B是显示绿/红(荧光)比值低或高的细胞的照片，表明了未受破坏的线粒体膜电势(左图)，而占优势的绿荧光染色(右图)表明受破坏的线粒体膜电势。

图15图示了用亚最佳剂量长春新碱和联用或不联用FLJ13639/P1-TAT重组蛋白处理后的HL60/VCR存活试验结果。

图16是利用FLJ13639/P1-TAT MAb的蛋白质印迹照片。

发明详述

本发明提供测定诊断患有或怀疑患有癌症的个体的预后的方法。该方法包括获得个体的生物学样品，检验该样品以测定CD24表达与FLJ13639表达之比，其中高CD24/低FLJ13639表达水平预示着预后不佳。在另一实施方式中，与正常细胞相比，仅低FLJ13639表达水平即预示着预后不佳。

还提供了鉴定个体是否可作为FLJ13639蛋白治疗的候选对象的方法。该方法包括获得个体的生物学样品，化验该样品以确定CD24表达与FLJ13639表达之比，其中高CD24/低FLJ13639表达比值将该个体鉴定为FLJ13639蛋白治疗的候选对象。

在另一实施方式中，本发明提供分离的纯化FLJ13639蛋白和含有该蛋白的组合物，以及利用这种组合物改善诊断患有或怀疑患有癌症的个体预后的方法。该方法包括将足以改善个体预后的量的FLJ33636蛋白给予个体。据信，通过减少个体中癌细胞的增殖和/或转移能改善个体的预后。

还有另一实施方式提供了增强化疗剂作用的方法。该方法包括联合给予化疗剂与增强该化疗剂作用有效量的FLJ13639蛋白。业已证明该方法能有效增强化疗剂抗耐受该化疗剂的细胞的活性。

FLJ13639也称为“DHRS12”。因此，为描述的目的，述及DHRS12数据库条目与述及FLJ13639基因和/或FLJ13639基因表达所得mRNA及蛋白质产物同义。

我们已测定了FLJ13639基因表达为至少三种大小不同的转录物，在本文中称为“P1”、“P2”和“P3”。不想局限于任何具体的理论，在这些转录物中，据信P1是FLJ13639的活性形式。在本文中，编码P1的cDNA序列是SEQID NO：1。在本文中，编码P2的cDNA的DNA序列是SEQ ID NO：3。在本文中，编码P3的cDNA的序列是SEQ ID NO：4。本领域技术人员应该知道可从P2和P3蛋白各自的cDNA序列推导出它们的氨基酸序列。虽然同样的情况也适用于P1蛋白，但为方便起见，本文的SEQ ID NO：2是其氨基酸(序列)。

FLJ13639基因位于人染色体13基因组毗连参比装配体(genomic contigreference assembly)中，可以GeneBank登录号NT_024524，2006年8月26日条目获得。按照本发明测定FLJ13639表达时，优选检测P1 mRNA的量或P1mRNA所表达的蛋白的量。

CD24是27个氨基酸的、小的、粘蛋白样糖基化蛋白质核心(Lim SC，Biomed Pharmacother.(2005)Vol：59(增刊2)：S351-4)。其基因位于染色体6q21上(Kristiansen G等，J Molec Histol 2004年3月；35(3)：255-262)。CD24用作P-选择蛋白的特异性配体(Aigner S等，Blood.(1997)Vol.89(9)：3385-95)。后者见于活化的血细胞和内皮细胞上，其通过与特异性唾液酸化碳水化合物相互作用而介导黏附和前滚(rolling)(Lim SC)。不想局限于任何具体的理论，据信CD24阳性肿瘤细胞的细胞黏附(随后发生新转移的生长)倾向性提高，该途径可能是肿瘤细胞向靶器官募集和释放至关重要的因素。CD24 cDNA的序列是SEQ ID NO：6。

本发明有助于确定和/或改善诊断患有或怀疑患有各种恶性肿瘤的个体的预后。例如，这些恶性肿瘤可包括实体瘤(例如，前列腺、乳腺、结肠直肠、肺(小细胞和非小细胞)、卵巢、黑色素瘤、泌尿系统、子宫、子宫内膜、胰腺、口腔、甲状腺、胃、脑和其它神经系统、肝和食道)或血液学癌症，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、慢性和其它白血病及骨髓瘤。

可通过各种方法获得适用于本发明的生物学样品。个体怀疑患有或已诊断患有的癌症类型决定了对本发明所用生物学样品来源的选择。例如，对于白血病，优选测定骨髓样品的FLJ13639和CD24的表达比值。然而，对于实体瘤，优选肿瘤活检。

采用任何合适的方法分析生物学样品的mRNA或蛋白质来测定CD24/FLJ13639表达之比。可测定不同样品，或同一样品的不同部分的mRNA或蛋白质。然而，本领域技术人员应知道，优选通过比较所测定的具体生物学样品的FLJ13639 mRNA水平和所测定的同一生物学样品的CD24mRNA水平，或通过比较所测定的具体生物学样品的FLJ13639蛋白水平和所测定的同一生物学样品的CD24蛋白水平以获得CD24/FLJ13639之比。

可以采用任何合适的方法来测定FLJ13639和CD24 mRNA的表达水平。例如，可通过标准技术，包括Northern印迹、狭线印迹、核糖核酸酶保护、定量或半定量RT-PCR或微阵列分析来测定mRNA水平。可根据本文提供的FLJ13639和CD24 cDNA序列并结合本领域技术人员熟知的影响核酸杂交参数的诸多因素，采用标准方法制备任何这些技术所用的合适引物或探针。

可通过任何可接受的方法测定CD24和/或FLJ13639蛋白水平。优选的方法包括免疫检测方法。例如，可采用蛋白质印迹、原位杂交、免疫组织化学、ELISA等检测FLJ13639和CD24蛋白的存在和含量。在这方面，本发明还提供用于检测FLJ13639蛋白并测量FLJ13639蛋白表达水平的单克隆抗体(mAb)。我们制备了FLJ13639 mAb，包括mAb 4B3、4B4、1A9、2C12、9A11、4E8、10F11、2F5、10D1、4G7、8E1、8H9。这些mAb可用于，例如通过生物学样品的流式细胞术分析来检测CD24/FLJ13639蛋白质水平之比，或用于免疫染色，例如用于石蜡包埋或冷冻肿瘤样品的免疫组化分析。

本发明还提供分离的纯化FLJ13639蛋白，例如重组FLJ13639蛋白。可采用任何合适的方法制备重组FLJ13639蛋白。在一个实施方式中，可将含有FLJ13639 PI cDNA的蛋白质翻译表达载体引入合适的宿主细胞，进而从所述宿主细胞中产生重组蛋白并采用常规方法，例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(1989)所述的那些方法提取。本领域技术人员还应知道可对蛋白质序列作出常规修饰以促进蛋白质纯化，例如通过掺入常规的蛋白质纯化标签，或改善蛋白质的药理学递送。例如，可修饰FLJ13639蛋白使之包含蛋白质的转导结构域，例如HIV-1 TAT结构域，从而促进该蛋白不依赖于经典的受体或内吞作用介导途径而通过生物膜。本发明将这种修饰的蛋白也视作重组FLJ13639蛋白。还考虑可采用已知的基因治疗方法将编码FLJ13639的核酸给予个体而将其用作治疗剂。

可将重组FLJ13639蛋白与药学上可接受的标准载体混合来制备常规剂型而给药。可与蛋白质联用的可接受的药物载体见《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版，A.R.Gennaro等编，马克出版社公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990)。

可采用本领域技术人员已知的各种方法将重组FLJ13639蛋白制剂给予个体。这些方法包括但不限于：真皮内、肌肉内、瘤内、腹膜内、静脉内、皮下和鼻内途径。应该知道可根据熟知的变量，例如给药途径、个体的体积和疾病的阶段确定可用的FLJ13639蛋白剂量。

当将重组FLJ13639蛋白用于本发明方法来增强化疗剂的作用时，其可在给予化疗剂之前、同时或之后给予。合适化疗剂的例子包括但不限于：长春新碱、阿霉素和顺铂。在另一实施方式中，可给予重组FLJ13639蛋白来增强放疗和/或光动力疗法(PDT)的抗癌症作用。

本领域技术人员从以下实施例可以知道，我们鉴定了FLJ13639，其是位于因t(12；13)染色体易位而断裂的染色体13q14上的假定的脱氢酶基因。我们证明FLJ13639表达丧失或降低的后果之一是CD24过度表达，FLJ13639和CD24表达之比预示了患者的存活率。我们开发了FLJ13639重组蛋白，证明用该重组蛋白恢复FLJ13639水平诱导了CD24的下调，降低或阻断了癌细胞的侵袭性和活动性，抑制了它们的生长并增强了显示高CD24/低FLJ13639分布的细胞的化学敏感性。我们还证明再次引入FLJ13639蛋白使得与线粒体有关的实质性细胞功能得到恢复。然而，这些实施例是说明性的，而不是对本发明的限制。

                        实施例1

本实施例表征了急性白血病中的13q断裂点(1)。为有利于该表征，我们从患者样品衍生了含独特t(12；13)(p12；14)易位的细胞系(7)。我们利用该细胞系鉴定涉及该重排的一种或多种基因，从而建立了可能导致白血病产生及其维持的致病事件的分子特征，但除了血液学恶性肿瘤外，该白血病模型还与各种实体瘤有关。

我们首先鉴定了染色体12p12上参与单易位的基因，例如参与多种平衡易位的ETV6基因(1)。我们试图采用分子RACE技术克隆伴侣基因(partner gene)，未获成功。因此，我们利用能鉴定跨越易位断裂点的BAC克隆(RPCI BAC克隆RP11-147H23；GenBank登录号AL136525，2005年5月18日条目)的市售可得的RPCI BAC克隆实施FISH步进方案(FISH walking approach)。因此，分析了该BAC克隆的序列来鉴定何种基因(如果有的话)存在于该区域中。只鉴定到两个基因：WDFY2，因与另一基因WDFY1的同源性而命名；和预测的基因FLJ13639。

为测定t(12；13)易位改变了这些基因中的哪一个，基本上如实施例6所述对MUTZ-5细胞系实施RT-PCR，EBV-LIN(成淋巴细胞样细胞系)作为正常对照。简言之，采用常规技术从细胞培养物中提取总RNA并进行逆转录。RT-PCR反应中所用的WDFY2引物的正向序列为5′TCTGTCTCAACCTGTGTCCC 3′(SEQ ID NO：7)，反向序列为5′GAAGAGTCCCCTTGCGAGT 3′(SED IDNO：8)。为扩增FLJ13639 P1，使用的正向引物的序列为5’CATCCGGGAGAGCGGTAACC3’(SEQ ID NO：9)，反向引物序列为5’AGCACAGGGATCAGGCCGGTC3(SEQ ID NO：10)。

结果表明WDFY2在两种细胞系中表达正常(图1B)，而在MUTZ-5中未检测到FLJ13639表达(图1A)。(G519是从非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞系建立的细胞系)。因此，t(12；13)染色体断裂导致FLJ13639表达消除。

                   实施例2

本实施例鉴定了FLJ13639基因。我们通过生物信息学分析测定到FLJ13639与短链脱氢酶还原酶超家族(SDR)具有同源性。FLJ13639蛋白具有SDR的典型特征，包括代表NAD(H)或NADP(H)辅酶结合基序的共有GlyXXXGlyXGly模式，AsnAsnAsnAlaGly(SEQ ID NO：11)折叠基序以及代表暗示的底物结合袋和催化位点的TyrXXXLys区段(11)。我们利用EST序列比对，通过生物信息学分析仔细研究了FLJ13639的三种mRNA变体(P1、P2和P3)，测定到基因的5’和3’端的交替剪接产生了该三种转录物(总结于图2)。这三种转录物产生了证明定位在线粒体的三种蛋白质(P1、P2和P3)(图3)。具体地说，图3显示表达为增强型绿色荧光蛋白融合体(图3中的EGFP)的FLJ13639蛋白定位于线粒体。开头20个N-末端氨基酸(单独作为EGFP融合蛋白；“P1 20 AA N-末端”；图3)的亚克隆证明线粒体靶向序列是P1的该区域，因为其表达模式类似于用完整的FLJ13639-GFP融合蛋白所得的。然而，当蛋白质的其余部分与GFP一起表达，即不含开头20个氨基酸时(“P1-C末端”)，线粒体特征丧失。不想局限于任何具体的理论，据信P2和P3可能作用于P1作为逆控制环(retrocontrol loop)或“看守者(gatekeeper)”。

                      实施例3

为分析FLJ13639的功能，将P1以反义取向亚克隆入pCDNA3表达载体(可购自英杰公司(Invitrogen

))，采用磷酸钙法将该构建物转染入永生化成纤维细胞中(以及空的载体作为对照)。其目的是评估哪些基因受到FLJ13639下调直接或间接的影响。转染子选择后，提取这些细胞的总RNA，利用逆转录酶扩增为cDNA。利用人昂飞(Affymetrix)U133阵列分析cDNA。比较单用载体或反义构建物转染的细胞之间的表达分布。通过RT-PCR证实反义试验所致的FLJ13639下调。

大多数基因得到下调(223种下调，14种上调)。我们测定到过度表达的基因之一是CD24，当FLJ13639表达丧失时其过度表达(5倍)。

                        实施例4

本实施例证明白血病、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中，FLJ13639表达降低与CD24表达增加有关。

通过RT-PCR检测了B-细胞(UoCB1、ALL-1、OM9；22、ALLCJ)、T-细胞(207/CEM)来源的急性白血病细胞系以及CML白血病急性发作(CMLblast crisis)(K562)中CD24和FLJ13639的表达水平。还包括EBV-LIN细胞系作为对照。基本上如实施例6所述进行RT-PCR来测定CD24和FLJ13639的表达水平。RT-PCR扩增分别产生了CD24和FLJ13639P1的300和233bp扩增子。通过琼脂糖凝胶电泳分离来仔细研究这些扩增产物，利用溴化乙锭目测观察。

成淋巴细胞样细胞系(EBV-LIN)显示CD24和FLJ13639的表达中等，而发现测试的所有其它白血病细胞系具有高CD24/低FLJ13639(图4A)。测试了其它肿瘤(卵巢、肺和乳腺)细胞系，其显示相同的高CD24/低FLJ13639P1分布(图4B-C)。所示细胞系衍生自白血病(ALLCJ、UOCB1、K562、ALL-1、OM9；22)；卵巢癌(A2780、A2780CP3、SKOV3、OVCAR3)；肺癌(A549、H520、H522)；前列腺癌(DU145、PC3、LNCAP)；和乳腺癌(SKBR3、MCF7、MDA453、MDA341、MDA435、MDA468、ZR75、BT54911)。前列腺癌(图4D)和乳腺癌(图4E)所得结果类似。应注意，图4B证明高CD24/低FLJ13639表达分布的转变与化学抗性相关，因为与A2780相反，变为顺铂抗性A2780CP3细胞系后，其显示高CD24/低FLJ13639分布。

我们还开发可抗FLJ13639/P1的单克隆抗体，证明FLJ13639 mRNA的减少对应于FLJ13639蛋白产量降低。具体地说，图16显示了利用我们开发的FLJ13639/P1-TAT(如实施例6所述)mAb实施的蛋白质印迹及其在检测FLJ13639/P1-TAT重组蛋白(印迹的左部分)以及一种ALL细胞系(OM9；22)和对照成淋巴细胞样细胞系EBV-LIN中的应用。观察到一条对应于二聚体大小的条带，但急性白血病细胞系与对照细胞系中蛋白质表达水平的差异反映了RT-PCR检测到的差异，从而证明FLJ13639 mRNA减少导致FLJ13639蛋白表达降低。

                         实施例5

与实施例4所示细胞系结果一致，本实施例证明从癌症患者所得的生物学样品中FLJ13639表达的降低与CD24表达升高有关。该实施例还证明高CD24/低FLJ13639P1之比预示着白血病患者的存活率不佳。

为获得图5A-5C所示的数据，我们对急性白血病、卵巢癌和肺癌的一系列患者样品进行了RT-PCR试验。与相应的毗邻组织显示低CD24/高FLJ13639P1分布相反(T＝肿瘤，N＝毗邻的正常组织)，所有10个高侵袭性卵巢肿瘤(图5B)以及研究的10个肺肿瘤(图5C)显示高CD24/低FLJ13639P1分布。在急性白血病中，我们对29份诊断样品进行了CD24/FLJ13639 RT-PCR试验。半数样品显示高CD24/低FLJ13639P1(图5A).

如图6所示，依据29份患者样品分类的卡普兰-迈耶存活曲线证明显示高CD24/低FLJ13639/P1分布的样品的存活率统计学显著地低于中等/低组(显示低CD24/高FLJ13639/P1的样品以及其中CD24与FLJ13639/P1水平之比接近1的样品(中等))。Log-排名检验提供给我们的P-值有显著性(p＝0.04)。

                       实施例6

本实施例证明CD24与FLJ13639的表达水平之比是乳腺癌的独立预后因素。

组织

得到机构伦理委员会(Institutional Review Board)的适当批准后，用1993-2001年间在罗斯韦尔园区癌症研究院(Roswell Park Cancer Institute)处理的一群未选择的福尔马林固定、石蜡包埋乳腺肿瘤构建组织微阵列(TMA)。将各肿瘤的两个1mm核心转移至接受块(recipient block)。

按照常规技术取得用于分子研究的组织(参见，即Varma G等，Cancer(2005)19；93(6)：699-708)。得到机构伦理委员会的适当批准后，从西纽约(Western New York)和贝拉鲁斯(Belarus)的患者获得新鲜的乳腺癌样品。排除具有明显乳腺癌家族史或已知携带BRCA突变的患者。所有样品在RPCI进行加工。2002年8月和2003年1月间从贝拉鲁斯收集样品，快速冷冻(snap frozen)并放在干冰上运至美国。这些患者的数据限于治疗时对该疾病的临床和病理学描述(Varma G等，Cancer.2005年9月19日；93(6)：699-708)。RNA定量测定证明3份样品降解。从罗斯韦尔园区癌症研究院(RPCI)的组织获取实验室(tissue procurement facility)获得西纽约样品。有两位患者的数据未得到。

从实体瘤提取RNA

利用俄亥俄州辛辛那提市塔克玛公司(Tekmar)的塔克玛组织匀浆器(Tekmar Tissumizer)匀浆冷冻在液氮中并于-80℃保存的新鲜组织样品。按照生产商的方案，用加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的三唑(Trizol)试剂分离总RNA。采用加利福尼亚州帕洛阿尔托市安捷仑技术公司的安捷仑2100生物分析仪(Agilent 2100 bioanalyzer，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)以及质谱法测定RNA的质量和数量。

逆转录和聚合酶链式反应

在含有最少1.25μg总RNA、1μl10mM脱氧核苷酸三磷酸(马萨诸塞州伊普斯维奇市NEB公司(NEB，Ipswitch，MA))、1μl 0.5μg/μl寡聚(dT)18(艾奥瓦州科拉维尔市的IDT公司(IDT，Coralville，Iowa))、1μl 40U/μl核糖核酸酶抑制剂(马里兰州汉诺威市的佛门泰斯公司(Fermentas，Hanover，MD))、2μl10X反应缓冲液(NEB公司)和0.25μl 200U/μl MMLV逆转录酶(NEB公司)的20μl体系中进行逆转录。与1μl 5Uμl RNA酶H(NEB公司)培育20分钟后，进行多重PCR反应，从而能同时检测CD24和FLJ13639表达水平。引物是：CD 24(获得300bp的扩增产物)正向引物：5’TCTCTTCGTGGTCTCACTCT3’(SEQ ID NO：12)，反向引物：5’GATGTTGCCTCTCCTTCATC3’(SEQ ID NO：13)。FLJ13639的引物与实施例1所述相同(获得233bp的扩增产物)。反应是，起始变性95℃10分钟，然后进行35轮：变性50秒95℃，退火50秒54℃和延伸60秒75℃。按照以下方案进行肌动蛋白扩增作为内部对照：15秒95℃，30秒60℃就60秒75℃。

组织微阵列免疫组化

抗原回收后，将5个μm TMA切片与1μg/ml的抗-CD24小鼠单克隆抗体(加利福尼亚州圣迭戈市法玛金公司的Clone ML5-(Pharmingen，San Diego，CA)反应2小时。利用加利福尼亚州卡奔塔利亚市达科公司(Dako，Carpentaria，CA)的小鼠观察试剂盒(mouse Envision kit)检测信号。二氨基联苯(DAB)用作色原，苏木精用作复染剂。包括CD24-阳性乳腺癌细胞作为外部阳性对照。核与胞质染色强度分别评分为0(无)、1+(弱)、2+(中等)和3+(强)。

统计学分析

利用北卡罗莱纳州加里公司(Cary，NC)的SAS软件包9.1版进行统计学分析。采用皮尔逊相关系数、对数、累计对数和泊松模型分别评估CD24、FLJ13639和CD24/FLJ13639与临床病理学变量之间关系的统计学显著性。按照卡普兰-迈耶方法进行单变量存活分析，利用log-排名检验评估存活曲线中的差异。利用Cox比例风险模型(Cox proportional hazard model)进行多变量存活分析。依据目测评估log(-log(存活))图，利用发现不违反比例风险假设的变量，通过住院时间(level of stay)＝1的反向选择来选择拟合的Cox比例风险模型。根据拟合模型的参数估计值计算风险比和95％置信区间。

结果

用于评估CD24的研究群体包括154位患者。患者群的平均年龄是56.9岁。平均肿瘤体积是2.8cm，62位患者的疾病为IIB期或更高。65个病例具有阳性淋巴结，其中每位患者平均5.7个阳性淋巴结。对95位患者实施了保留乳腺的外科手术(breast conserving surgery)。对147位患者实施辅助细胞毒性治疗(adjuvant cytotoxic therapy)。对患有激素受体阳性癌症的总共116位患者中的108位实施内分泌治疗。

对于胞质定位，38份样品(24.7％)中的肿瘤评分为3+，对于核定位，37份样品(24.0％)中的肿瘤评分为3+。只有强CD24染色(评分为3+)的病例认为表达水平异常(图7B)。

中值随访是4.81年。25例复发，18例癌症相关的死亡。CD24的核定位与任何临床信息不相关。强胞质染色(3+)与疾病阶段(p＝0.007)和激素受体状态(ER p＝0.03，PR p＝0.04)具有统计学显著的关系。与坏死、淋巴管浸润、分级和淋巴结状态没有统计学显著的关系。

人乳腺癌样品和临床相关性的分子分析

根据异常表达CD24的临床相关性的这些IHC结果，我们分析了过度表达CD24的乳腺肿瘤是否实际上FLJ13639(表达)低或阴性，以及高CD24/低/无FLJ13639分子分布是否与较差的结果有关。对40例主要绝经前乳腺癌(predominantly premenopausal breast cancer)进行多重RT-PCR，其中8例来自贝拉鲁斯，其余来自RPCI。贝拉鲁斯患者的数据限于治疗时对该疾病的临床和病理学描述，不包括随访信息。RNA定量测定证明这些样品中的3份降解。未能获得RPCI的两份样品的数据。这5例不作分析。

诊断的中值年龄是43岁(29岁到56岁)。平均肿瘤大小是3.9cm，患者大多数患有IIB期疾病。28位患者(80％)具有淋巴结阳性疾病，每位患者平均2个阳性淋巴结。24位患者接受放疗。所有美国患者还接受全身化疗，其中2位具有转移性疾病，5位接受新辅助疗法。未获得贝拉鲁斯患者的激素受体状态。患受体阳性疾病的美国妇女中，只有1位未用抗激素疗法治疗。中值随访时间是42.77个月，显示有8例复发，9位美国患者死于癌症相关的原因。

利用合适的内部对照，半定量地评估多重RT-PCR结果(图7A)。然后将分子表达数据表示为CD24与FLJ13639之比。较高的数值对应于高CD24和低/无FLJ13639的病理学分子表达分布。利用阈值比3鉴定分子分布不佳的患者。可进行分析的35份样品中14份(40.0％)的CD24/FLJ13639之比为3或更高。CD24和FLJ13639表达之间有统计学显著的相关性(p＝0.01)。CD24与肿瘤大小(p＝0.03)、组织学分级(p＝0.04)和阳性淋巴结数目(p＜0.0001)正相关。FLJ13639与雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)状态有统计学显著的相关性(p值分别为0.02和0.03)。其表达与核分级(p＝0.009)和阳性淋巴结数目(p＜0.0002)负相关。CD24和FLJ13639之比(确定“风险”情况)是总存活率降低的统计学显著预测器，其中单变量分析的风险比是1.3(p＝0.03)(95％CI：1.0-1.6)。根据其它因素调节后，通过多变量分析估算的CD24/FLK13639升高的估计风险比是1.51(p＝0.005)(95％CI：1.1-2.0)。当将数值3作为阈值分类CD24/FLJ13639之比以定义风险升高时，预测不佳后果的能力变得更强，其中单变量分析的风险比是3.65(p＝0.03)，多变量分析的风险比是8.9(p＝0.01)。

                       实施例6

本实施例说明了重组FLJ13639/P1蛋白的产生。为制备该蛋白，我们框内亚克隆了FLJ13639/P1 cDNA与HIV病毒的TAT蛋白转导结构域。简言之，通过PCR扩增排除FLJ13639/P1起始密码子的全长FLJ13639/P1 cDNA。然后亚克隆入图8A所示的TAT载体中。该载体含有其本身的起始密码子，纯化所用的6x组氨酸标签和编码FLJ13639/P1蛋白的FLJ13639/P1 DNA序列。这样能在细菌中体外产生该重组蛋白，随后利用6xHIS标签在镍柱上纯化。与逆转录病毒相比，P1-TAT-重组蛋白的氨基酸序列可用于在细胞中高效地体内运输蛋白质(16)。此外，该方法也许能分析细胞摄入的蛋白质剂量。

我们成功地用BL21细菌表达了重组蛋白，还利用NiNTA柱纯化了该蛋白(利用位于TAT标签之前的6xHis标签的结合能力)(图8B)。本文将该重组蛋白称为“P1-TAT”或“FLJ13639/P1-TAT”。P1-TAT的氨基酸序列是SEQ IDNO：5。编码P1-TAT的DNA序列是SEQ ID NO：14。利用正向引物和反向引物将FLJ13639 P1克隆入表达载体，正向引物的序列为5’CTCGAGTCCTGTACCGCAGCG(SEQ ID NO：15)，反向引物的序列为5’GAATTCTCCTATTTAAATGTTCGA(SEQ ID NO：16)。P1-TAT蛋白可溶于含盐和甘油的缓冲液中，并适合在高级纯化后通过注射给予。

                       实施例7

本实施例证明给予P1-TAT能调节白血病和肺癌细胞中的CD24表达。

将不同的白血病细胞系与P1-TAT重组蛋白培育来评估P1功能对CD24表达的作用。具体地说，将UoCB1细胞系与含量渐增的P1-TAT重组蛋白培育。培育48小时后，收集细胞，提取RNA，通过RT-PCR将cDNA用于CD24表达评估。CD24表达水平与加入培养液的P1-TAT蛋白量成反比(图9A)。检验了与20μg P1-TAT培育后，其它细胞系(OM9：22，ALL-1.K562，207)的CD24表达，显示CD24下调明显(数据未显示)。此外，对肺癌细胞实施的相同类型试验获得相似结果(图9B)。

                   实施例8

本实施例证明给予P1-TAT能抑制白血病细胞的侵袭性表型。

用P1-TAT重组蛋白处理后，检验UoCB1细胞系的侵袭性潜力的变化。用20μg P1-TAT处理细胞48小时，采用标准基质胶侵袭试验(Matrigel invasionassay)检验(处理与未处理)。为实施基质胶侵袭试验，将细胞沉积在基质胶孔之上，而使化学引诱物(胎牛血清)溶液位于基质胶基质之下。只有具有侵袭性潜力的细胞能穿过基质胶向化学引诱物溶液“移动”。本试验的结果显示用P1-TAT处理能将UoCB1细胞的侵袭性潜力降低2.4倍(图10A)。

                        实施例9

本实施例证明给予外源性P1-TAT能下调白血病和卵巢癌细胞中CD24的表达。

用20μg P1-TAT进行时程培育(即，使细胞系与20μg P1-TAT培育0、6、12、16、24和48小时)来评估与重组蛋白培育后CD24下调的时间范围(timeframe)。与P1-TAT培育后6小时，CD24水平显著下调(图11A)。此外，用P1-TAT处理48小时后，CD24蛋白表达下调(图11B)。利用OVCAR3卵巢癌细胞系获得相同的结果(未显示)。

                    实施例10

本实施例证明给予P1-TAT能抑制肺癌和乳腺癌细胞的侵袭性潜力并抑制它们的增殖。为获得本实施例所示的数据，伤口愈合试验中将肺癌细胞系(图12A)(H520)和MCF7(图12B)与P1-TAT培育(或不培育作为对照)。通过将细胞培养至汇合，利用移液管顶端刮擦形成“伤口”来进行该试验。然后用P1-TAT处理这些细胞，评估它们填补人工产生的两个细胞群之间空隙的能力。由图12A和12B可知，P1-TAT处理显著降低了癌细胞的活动性，这证明它们的侵袭性潜力极大降低，并且它们的增殖受到抑制。

                         实施例11

本实施例证明给予P1-TAT能通过将能量代谢从厌氧糖酵解转变成有氧呼吸而恢复有氧呼吸。

线粒体在细胞呼吸和凋亡中的实质性作用是熟知的。已知癌细胞改变了线粒体呼吸，其中丙酮酸在乳酸发酵途径中被分解代谢，而不是用于更有效地产生能量的线粒体克雷布斯循环(Krebbs cycle)中。HeLa细胞显示能产生数量较多的乳酸，我们证明这些细胞显示高CD24/低FLJ13639/P1分布(未显示)。在本实施例中，用P1-TAT重组蛋白处理HeLa细胞3天(或不处理，作为对照)。检测培养液的乳酸水平。用P1-TAT重组蛋白处理后的乳酸水平明显较低(图13)。

                        实施例12

本实施例证明给予外源性P1-TAT能增强化疗剂对化学抗性癌细胞的活性。

线粒体膜电势的破坏(Δψ_m)是凋亡的早期现象，可能是导致细胞色素c释放的几种因素之一(17，18)。利用分子探针公司(Molecular Probes，Inc)的JC-1线粒体电势传感器染色和荧光显微镜，我们分析了VCR(长春新碱)处理的HL60细胞中的Δψ_m。在健康细胞中，染料累积和聚集在线粒体中，在该处发出鲜红色荧光。然而，在凋亡细胞中，如果Δψ_m改变则染料不能进入线粒体，染料作为胞质单体发出亮绿色荧光。因此，红/绿荧光强度之比降低表明线粒体去极化。我们观察到未处理的HL60细胞以及用蛋白缓冲液、20μg FLJP1-TAT或0.1μg VCR处理的细胞显示的绿/红荧光比低。然而，用0.1μg VCR+20μgP1-TAT、1μg VCR或1μg VCR+20μg P1-TAT处理后，检测到绿/红荧光比显著增加(p＜0.01)(图14A和B)。

为评估FLJ13639/P1恢复是否影响了低P1-TAT(高CD24)细胞的化学敏感性，将HL60/VCR(长春新碱抗性)细胞与长春新碱和FLJ13639/P1-TAT蛋白的不同组合以及适当的对照培育(图15)。实验开始后第48小时通过普罗麦格公司(Promega)的常规MTT试验方案进行活力试验。长春新碱(0.1μM)对HL60细胞几乎无作用，长春新碱(1μM)将细胞活力降低90％。0.1μM和20μgFLJ13639/P1-TAT的组合的效果与用10x浓度的长春新碱溶液培育的效果相同(图15)。

通过具体实施方式描述了本发明。然而，本领域技术人员知道可对组合物、方法和装置作出常规改进，这些改进应属于本发明的范围。

参考文献

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18.Heiskanen等，J Biol Chem.1999年2月26日；274(9)：5654-8.

序列表

<110>L.科格奈特等(Coignet，Lionel，et al.)

<120>FLJ13639基因相关疾病的诊断和治疗方案

<130>003551.00268-PCT

<140>PCT/US06/46890

<141>2006-12-07

<150>60/748,652

<151>2005-12-08

<160>16

<210>1

<211>1291

<212>DNA

<213>人FLJ13639 P1 cDNA

<400>1

gaggccgcgc cgggagcgcg gtggggctag gcgtggggcg ctcccggcat gtccctgtac 60

cgcagcgtcg tgtggttcgc caaggggctg cgcgagtaca ccaagagtgg ctatgaatct 120

gcatgtaaag actttgtccc tcatgacttg gaggtccaga ttcctggaag agtctttttg 180

gtcactggag gaaacagcgg cattggcaaa gcaactgccc ttgaaatcgc caagcgaggt 240

ggcacagttc acctggtttg tcgagatcaa gccccagcag aagatgccag gggtgagatc 300

atccgggaga gcggtaacca gaacattttt ctgcacattg tggacttgtc tgatcccaag 360

caaatctgga aatttgttga aaatttcaag caggaacata aactccatgt tctgatcaat 420

aatgcaggtt gcatggtcaa taaaagagag ctcacagaag atggacttga aaaaaacttt 480

gctgccaata ctctgggtgt gtacattctc acgaccggcc tgatccctgt gctggagaaa 540

gaacacgacc cccgagtgat aaccgtctcc tcaggaggaa tgttggttca gaaactgaac 600

accaatgatc tccagtccga aagaacacca tttgatggaa ctatggtcta tgcacaaaac 660

aagaggcagc aagtggttct gacggagcgg tgggcccaag ggcacccggc catccatttt 720

tcttccatgc atcctggctg ggccgacacc ccaggtgtga ggcaggcgat gccggggttc 780

cacgccaggt tcggggaccg cctgcgctcc gaggcccagg gcgcggacac catgctgtgg 840

ctggccctct cctctgccgc agccgcacag cccagcggcc gcttctttca agatcggaag 900

ccagtttcta cacacttgcc tctcgctaca gcgtcctcct caccggccga agaggagaaa 960

ctcattgaaa tcctggaaca gctggctcag acatttaaat aggccaaccc agacacagtg 1020

cggtaccaga attgccttag aagataccag aaggtgcggt ctagggacca gtgaataaga 1080

agaccccact tcaacttccc ctcgaagacg ttgtgcctta cagcgaggcc tacaagggat 1140

gggaactttt atttcaaaat aaatactacc gaggctgtga tcaggctcac cttgaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a    1291

<210>2

<211>355

<212>PRT

<213>人FLJ13639 P1蛋白

<400>2

Met Arg Gly Ser Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met

                  5                  10                  15

Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Arg Trp Gly Ser Lys Leu Gly Gln Arg

                 20                  25                  30

Arg Arg Gly Gly Ser Thr Met Ser Gly Ser Leu Tyr Arg Ser Val

                 35                  40                  45

Val Trp Phe Ala Lys Gly Leu Arg Glu Tyr Thr Lys Ser Gly Tyr

                 50                  55                  60

Glu Ser Ala Cys Lys Asp Phe Val Pro His Asp Leu Glu Val Gln

                 65                  70                  75

Ile Pro Gly Arg Val Phe Leu Val Thr Gly Gly Asn Ser Gly Ile

                 80                  85                  90

Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu Ile Ala Lys Arg Gly Gly Thr Val

                 95                 100                 105

His Leu Val Cys Arg Asp Gln Ala Pro Ala Glu Asp Ala Arg Gly

                110                 115                 120

Glu Ile Ile Arg Glu Ser Gly Asn Gln Asn Ile Phe Leu His Ile

                125                 130                 135

Val Asp Leu Ser Asp Pro Lys Gln Ile Trp Lys Phe Val Glu Asn

                140                 145                 150

Phe Lys Gln Glu His Lys Leu His Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly

                155                 160                 165

Cys Met Val Asn Lys Arg Glu Leu Thr Glu Asp Gly Leu Glu Lys

                170                 175                 180

Asn Phe Ala Ala Asn Thr Leu Gly Val Tyr Ile Leu Thr Thr Gly

                185                 190                 195

Leu Ile Pro Val Leu Glu Lys Glu His Asp Pro Arg Val Ile Thr

                200                 205                 210

Val Ser Ser Gly Gly Met Leu Val Gln Lys Leu Asn Thr Asn Asp

                215                 220                 225

Leu Gln Ser Glu Arg Thr Pro Phe Asp Gly Thr Met Val Tyr Ala

                230                 235                 240

Gln Asn Lys Arg Gln Gln Val Val Leu Thr Glu Arg Trp Ala Gln

                245                 250                 255

Gly His Pro Ala Ile His Phe Ser Ser Met His Pro Gly Trp Ala

                260                 265                 270

Asp Thr Pro Gly Val Arg Gln Ala Met Pro Gly Phe His Ala Arg

                275                 280                 285

Phe Gly Asp Arg Leu Arg Ser Glu Ala Gln Gly Ala Asp Thr Met

                290                 295                 300

Leu Trp Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gln Pro Ser Gly

                305                 310                 315

Arg Phe Phe Gln Asp Arg Lys Pro Val Ser Thr His Leu Pro Leu

                320                 325                 330

Ala Thr Ala Ser Ser Ser Pro Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ile Glu

                335                 340                 345

Ile Leu Glu Gln Leu Ala Gln Thr Phe Lys

                350                 355

<210>3

<211>1353

<212>DNA

<213>人FLJl3639 P2 cDNA

<400>3

ggcacgaggc cgcagcgtct tgtggttcgc caaggggctg cgcgagtaca ccaagagtgg 60

ctatgaatct gcatgtaaag actttgtccc tcatgacttg gaggtccaga ttcctggaag 120

agtctttttg gtcactggag gaaacagcgg cattggcaaa gcaactgccc ttgaaatcgc 180

caagcgagaa catttttctg cacattgtgg acttgtctga tcccaagcaa atctggaaat 240

ttgttgaaaa tttcaagcag gaacataaac tccatgttct gatcaataat gcaggttgca 300

tggtcaataa aagagagctc acagaagatg gacttgaaaa aaactttgct gccaatactc 360

tgggtgtgta cattctcacg accggcctga tccctgtgct ggagaaagaa cacgaccccc 420

gagtgataac cgtctcctca ggaggaatgt tggttcagaa actgaacacc aatgatctcc 480

agtccgaaag aacaccattt gatggaacta tggtctatgc acaaaacaag aggcagcaag 540

tggttctgac ggagcggtgg gcccaagggc acccggccat ccatttttct tccatgcatc 600

ctggctgggc cgacacccca gacaggaatg agcaggagct gaggaaggta gtgggagagg 660

cccagactgc ctcaccactc cccaggtttt tggaaataat gatgcatgaa ggtaaatgcc 720

agccacaagg acacagctcg aatgatctgg aagcgtgttg gagcagcggt ggaggggagc 780

agaattctct tccggattgg cctcaccaac tccatgacct caggcagctc acctgggctc 840

tctgcagctc tttcctcctc tacaaacaag ggaactgaaa gcagcagcag ccacagcaca 900

caccccaggg tgcacccgcg gcgccaagaa ctggtctcag cgctgtctgc ggattaacgc 960

atttgtcctc aagcctctgt ggagtggcca ctactgtcta ttatcacacc catttacaga 1020

tgagggaact gaggcccaga gaggctaaga cctcccagcc gggcctggcc atggggtttt 1080

gggaatcagg ctctcacaca ctgctggcat ggcctttctg aaaatcacta tttatcagaa 1140

gccttggaat tcatcctaag aaataaagat agggaaaaca aggttgctta tcacagtgct 1200

ggtggtagga gatgaagtta ataaattata gaacacctgt gcaaaatctg ttcagggctg 1260

aagactctgc tgccaatcat gcctatggaa aaaccctgtg tgcactatat cattaaatga 1320

agataccaag ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa  1353

<210>4

<211>1970

<212>DNA

<213>人FLJ13639 P3 cDNA

<400>4

gaggccgcgc cgggagcgcg gtggggctag gcgtggggcg ctcccggcat gtccctgtac 60

cgcagcgtcg tgtggttcgc caaggggctg cgcgagtaca ccaagagtgg ctatgaatct 120

gcatgtaaag actttgtccc tcatgacttg gaggtccaga ttcctggaag agtctttttg 180

gtcactggag gaaacagcgg cattggcaaa gcaactgccc ttgaaatcgc caagcgagaa 240

catttttctg cacattgtgg acttgtctga tcccaagcaa atctggaaat ttgttgaaaa 300

tttcaagcag gaacataaac tccatgttct gatcaataat gcaggttgca tggtcaataa 360

aagagagctc acagaagatg gacttgaaaa aaactttgct gccaatactc tgggtgtgta 420

cattctcacg accggcctga tccctgtgct ggagaaagaa cacgaccccc gagtgataac 480

cgtctcctca ggaggaatgt tggttcagaa actgaacacc aatgatctcc agtccgaaag 540

aacaccattt gatggaacta tggtctatgc acaaaacaag aggcagcaag tggttctgac 600

ggagcggtgg gcccaagggc acccggccat ccatttttct tccatgcatc ctggctgggc 660

cgacacccca ggtgtgaggc aggcgatgcc ggggttccac gccaggttcg gggaccgcct 720

gcgctccgag gcccagggcg cggacaccat gctgtggctg gccctctcct ctgccgcagc 780

cgcacagccc agcggccgct tctttcaagg tgacttcctc cctggctgtg aaggcagctg 840

acacagggct aggggcagca gctgggcctt cgaggcgcac cttcccctcc gtgaaacctg 900

gggtgggact gtcccctggg gggtgcctgg gcttctttgg cgagatgatt gctttgcctg 960

ctgaggttag ttttgggaag cgcttcactc caggttggta gcttctttgg agacttgtga 1020

taaccctgtc atcaaggtcc tgtgagaacg ggagaggcag ttcctacctt gggaatggaa 1080

gattttctct gcagtttgct gaggcccagg aggggcgcta ttcaaagctg cactgcaaag 1140

ggagtaacgg actctgcttc tctgcagtgc aaagggtgta agggactctg cttctctatt 1200

tttggaagca gtgatctgtt cacgtctctc cccagtgggc tcctaagggg gcaggcgtgt 1260

gagtggacgc catccgaaga cagcacttga cctcgggtgg aagccaggct ctttgcttgg 1320

cttctctttc ctctgttctt gatgagaacc acccttgctt gaggaattct gaagcgctgg 1380

tgacccctgg ggtatccggg aggatggccg caccccttcc tgctgatcac ccaaacgtgg 1440

tctcccgtcc agccctggct gcagcctccc agttcccaaa ctgcacttta catatcaatc 1500

catgctgcct gatccctgtg ggacctttga cagcagggat gggggtctaa cagctgtagg 1560

gtgctgccac tccagcaggc gtcggttcaa ggcctgagca gcacagggac atggacccag 1620

ccacgctgca gcagctcaca cctctctgcg gttccctctc acttttagat cggaagccag 1680

tttctacaca cttgcctctc gctacagcgt cctcctcacc ggccgaagag gagaaactca 1740

ttgaaatcct ggaacagctg gctcagacat ttaaataggc caacccagac acagtgcggt 1800

accagaattg ccttagaaga taccagaagg tgcggtctag ggaccagtga ataagaagac 1860

cccacttcaa cttcccctcg aagacgttgt gcctcacagc gaggcctaca agggatggga 1920

acttttattt caaaataaat actaccgagg ctgtgatcag gctcaccttg 1970

<210>5

<211>391

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>与TAT融合的重组人FLJ13639 P1蛋白

<400>5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met

                  5                  10                  15

Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp

                 20                  25                  30

Lys Asp Arg Trp Gly Ser Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg

                 35                  40                  45

Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr

                 50                  55                  60

Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Met Ala Gly Thr Gly Leu Glu

                 65                  70                  75

Ser Leu Tyr Arg Ser Val Val Trp Phe Ala Lys Gly Leu Arg Glu

                 80                  85                  90

Tyr Thr Lys Ser Gly Tyr Glu Ser Ala Cys Lys Asp Phe Val Pro

                 95                 100                 105

His Asp Leu Glu Val Gln Ile Pro Gly Arg Val Phe Leu Val Thr

                110                 115                 120

Gly Gly Asn Ser Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Glu Ile Ala

                125                 130                 135

Lys Arg Gly Gly Thr Val His Leu Val Cys Arg Asp Gln Ala Pro

                140                 145                 150

Ala Glu Asp Ala Arg Gly Glu Ile Ile Arg Glu Ser Gly Asn Gln

                155                 160                 165

Asn Ile Phe Leu His Ile Val Asp Leu Ser Asp Pro Lys Gln Ile

                170                 175                 180

Trp Lys Phe Val Glu Asn Phe Lys Gln Glu His Lys Leu His Val

                185                 190                 195

Leu Ile Asn Asn Ala Gly Cys Met Val Asn Lys Arg Glu Leu Thr

                200                 205                 210

Glu Asp Gly Leu Glu Lys Asn Phe Ala Ala Asn Thr Leu Gly Val

                215                 220                 225

Tyr Ile Leu Thr Thr Gly Leu Ile Pro Val Leu Glu Lys Glu His

                230                 235                 240

Asp Pro Arg Val Ile Thr Val Ser Ser Gly Gly Met Leu Val Gln

                245                 250                 255

Lys Leu Asn Thr Asn Asp Leu Gln Ser Glu Arg Thr Pro Phe Asp

                260                 265                 270

Gly Thr Met Val Tyr Ala Gln Asn Lys Arg Gln Gln Val Val Leu

                275                 280                 285

Thr Glu Arg Trp Ala Gln Gly His Pro Ala Ile His Phe Ser Ser

                290                 295                 300

Met His Pro Gly Trp Ala Asp Thr Pro Gly Val Arg Gln Ala Met

                305                 310                 315

Pro Gly Phe His Ala Arg Phe Gly Asp Arg Leu Arg Ser Glu Ala

                320                 325                 330

Gln Gly Ala Asp Thr Met Leu Trp Leu Ala Leu Ser Ser Ala Ala

                335                 340                 345

Ala Ala Gln Pro Ser Gly Arg Phe Phe Gln Asp Arg Lys Pro Val

                350                 355                 360

Ser Thr His Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ser Ser Ser Pro Ala Glu

                365                 370                 375

Glu Glu Lys Leu Ile Glu Ile Leu Glu Gln Leu Ala Gln Thr Phe

                380                 385                 390

Lys

391

<210>6

<211>2116

<212>DNA

<213>人CD24 cDNA

<400>6

cggttctcca agcacccagc atcctgctag acgcgccgcg caccgacgga ggggacatgg 60

gcagagcaat ggtggccagg ctggggctgg ggctgctgct gctggcactg ctcctaccca 120

cgcagattta ttccagtgaa acaacaactg gaacttcaag taactcctcc cagagtactt 180

ccaactctgg gttggcccca aatccaacta atgccaccac caaggcggct ggtggtgccc 240

tgcagtcaac agccagtctc ttcgtggtct cactctctct tctgcatctc tactcttaag 300

agactcaggc caagaaacgt cttctaaatt tccccatctt ctaaacccaa tccaaatggc 360

gtctggaagt ccaatgtggc aaggaaaaac aggtcttcat cgaatctact aattccacac 420

cttttattga cacagaaaat gttgagaatc ccaaatttga ttgatttgaa gaacatgtga 480

gaggtttgac tagatgatga atgccaatat taaatctgct ggagtttcat gtacaagatg 540

aaggagaggc aacatccaaa atagttaaga catgatttcc ttgaatgtgg cttgagaaat 600

atggacactt aatactacct tgaaaataag aatagaaata aaggatggga ttgtggaatg 660

gagattcagt tttcattggt tcattaattc tataaggcca taaaacaggt aatataaaaa 720

gcttccatcg atctatttat atgtacatga gaaggaatcc ccaggtgtta ctgtaattcc 780

tcaacgtatt gtttcgacgg cactaattta atgccgatat actctagatg aatgtttaca 840

ttgttgagct attgctgttc tcttgggaac tgaactcact ttcctcctga ggctttggat 900

ttgacattgc atttgacctt ttaggtagta attgacatgt gccagggcaa tgatgaatga 960

gaatctaccc cagatccaag catcctgagc aactcttgat tatccatatt gagtcaaatg 1020

gtaggcattt cctatcacct gtttccattc aacaagagca ctacattctt ttagctaaac 1080

ggattccaaa gagtagaatt gcattgacca cgactaattt caaaatgctt tttattatta 1140

ttatttttta gacagtctca ctttgtcgcc caggccggag tgcagtggtg cgatctcaga 1200

tcagtgtacc atttgcctcc cgggctcaag cgattctcct gcctcagcct cccaagtagc 1260

tgggattaca ggcacctgcc accatgcccg gctaattttt gtaattttag tagagacagg 1320

gtttcaccat gttgcccagg ctggtttaga actcctgacc tcaggtgatc cacccgcctc 1380

ggcctcccaa agtgctggga ttacaggctt gagcccccgc gcccagccat caaaatgctt 1440

tttatttctg catatgtttg aatacttttt acaatttaaa aaaatgatct gttttgaagg 1500

caaaattgca aatcttgaaa ttaagaaggc aaaatgtaaa ggagtcaaac tataaatcaa 1560

gtatttggga agtgaagact ggaagctaat ttgcataaat tcacaaactt ttatactctt 1620

tctgtatata catttttttt ctttaaaaaa caactatgga tcagaatagc aacatttaga 1680

acactttttg ttatcagtca atatttttag atagttagaa cctggtccta agcctaaaag 1740

tgggcttgat tctgcagtaa atcttttaca actgcctcga cacacataaa cctttttaaa 1800

aatagacact ccccgaagtc ttttgtttgt atggtcacac actgatgctt agatgttcca 1860

gtaatctaat atggccacag tagtcttgat gaccaaagtc ctttttttcc atctttagaa 1920

aactacatgg gaacaaacag atcgaacagt tttgaagcta ctgtgtgtgt gaatgaacac 1980

tcttgcttta ttccagaatg ctgtacatct attttggatt gtatattgtg gttgtgtatt 2040

tacgctttga ttcatagtaa cttcttatgg aattgatttg cattgaacga caaactgtaa 2100

ataaaaagaa acggtg 2116

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WDFY2的正向引物

<400>7

tctgtctcaa cctgtgtccc 20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>WDFY2的反向引物

<400>8

gaagagtccc cttgcgagt 19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人FLJ13639 P1 cDNA

<220>

<223>正向FLJ13639 P1引物

<400>9

catccgggag agcggtaacc 20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向FLJ13639 P1引物

<400>10

agcacaggga tcaggccggt c 21

<210>11

<211>5

<212>PRT

<213>人

<220>

<222>NADP(H)辅酶结合基序

<400>11

Asn Asn Asn Ala Gly

                  5

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD 24正向引物

                5

<400>12

tctcttcgtg gtctcactct 20

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CD 24反向引物

<400>13

gatgttgcct ctccttcat 19

<210>14

<211>1176

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码P1-TAT的cDNA

<400>14

atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60

atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccaa gcttggctac 120

ggccgcaaga aacgccgcca gcgccgccgc ggtggatcca ccatgtccgg ctatccatat 180

gacgtcccag actatgctgg ctccatggcc ggtaccggtc tcgagtccct gtaccgcagc 240

gtcgtgtggt tcgccaaggg gctgcgcgag tacaccaaga gtggctatga atctgcatgt 300

aaagactttg tccctcatga cttggaggtc cagattcctg gaagagtctt tttggtcact 360

ggaggaaaca gcggcattgg caaagcaact gcccttgaaa tcgccaagcg aggtggcaca 420

gttcacctgg tttgtcgaga tcaagcccca gcagaagatg ccaggggtga gatcatccgg 480

gagagcggta accagaacat ttttctgcac attgtggact tgtctgatcc caagcaaatc 540

tggaaatttg ttgaaaattt caagcaggaa cataaactcc atgttctgat caataatgca 600

ggttgcatgg tcaataaaag agagctcaca gaagatggac ttgaaaaaaa ctttgctgcc 660

aatactctgg gtgtgtacat tctcacgacc ggcctgatcc ctgtgctgga gaaagaacac 720

gacccccgag tgataaccgt ctcctcagga ggaatgttgg ttcagaaact gaacaccaat 780

gatctccagt ccgaaagaac accatttgat ggaactatgg tctatgcaca aaacaagagg 840

cagcaagtgg ttctgacgga gcggtgggcc caagggcacc cggccatcca tttttcttcc 900

atgcatcctg gctgggccga caccccaggt gtgaggcagg cgatgccggg gttccacgcc 960

aggttcgggg accgcctgcg ctccgaggcc cagggcgcgg acaccatgct gtggctggcc 1020

ctctcctctg ccgcagccgc acagcccagc ggccgcttct ttcaagatcg gaagccagtt 1080

tctacacact tgcctctcgc tacagcgtcc tcctcaccgg ccgaagagga gaaactcatt 1140

gaaatcctgg aacagctggc tcagacattt aaatag 1176

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>P1-TAT正向克隆引物

<400>15

ctcgagtcct gtaccgcagc g 21

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>P1-TAT反向克隆引物

<400>16

gaattctcct atttaaatgt tcga 24

Claims (20)

1.一种测定诊断患有或怀疑患有癌症的个体的预后的方法，该方法包括：

i)获得该个体的生物学样品；

ii)检测该样品中CD24mRNA或CD24蛋白的含量；

iii)检测该样品中FLJ13639mRNA或FLJ13639蛋白的含量；

iv)比较CD24mRNA的含量与FLJ13639mRNA的含量，或比较CD24蛋白的含量与FLJ13639蛋白的含量，从而获得CD24与FLJ13639的表达比；

其中，CD24与FLJ13639表达比为3∶1或更高预示着该个体的预后不佳。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过进行RT-PCR或微阵列分析来测定CD24mRNA的含量与FLJ13639mRNA的含量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，进行FLJ13639mRNA的RT-PCR扩增了包含SEQ ID NO：1所示序列的cDNA和/或进行CD24mRNA的RT-PCR扩增了包含SEQ ID NO：6所示序列的cDNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组化或ELISA测定CD24蛋白的含量与FLJ13639蛋白的含量。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是血液、骨髓或肿瘤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体已诊断患有或怀疑患有选自下组的癌症：前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、黑色素瘤、泌尿系统癌症、子宫癌症、子宫内膜癌、胰腺癌、口腔癌、甲状腺癌、胃癌、脑癌、血液学癌症和它们的组合。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述血液学癌症选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、白血病和骨髓瘤。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该个体的不佳预后将该个体鉴定为用重组FLJ13639蛋白治疗的候选对象。

9.一种分离的纯化蛋白，其包含SEQ ID NO：2所示序列。

10.如权利要求9所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白是重组蛋白。

11.如权利要求10所述的蛋白，其特征在于，该蛋白还包含蛋白纯化标签和/或蛋白转导结构域。

12.如权利要求10所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列。

13.一种改善诊断患有或怀疑患有癌症的个体的预后的方法，该方法包括给予该个体含有改善该个体预后有效量的FLJ13639蛋白的组合物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述组合物包含药学上可接受的载体。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，给予所述FLJ13639蛋白抑制了该个体中癌细胞的生长。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，给予所述FLJ13639蛋白抑制了该个体中癌细胞的转移。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述FLJ13639蛋白包含SEQ ID NO：2所示序列。

18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该方法还包括将化疗剂给予个体，其中给予包含FLJ13639蛋白的组合物增强了所述化疗剂的活性。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自：长春新碱、阿霉素和顺铂。

20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述个体已诊断患有或怀疑患有选自下组的癌症：前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、黑色素瘤、泌尿系统癌症、子宫癌症、子宫内膜癌、胰腺癌、口腔癌、甲状腺癌、胃癌、脑癌、血液学癌症和它们的组合。

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