CN101323849B

CN101323849B - 液态β-淀粉酶制剂的制备方法

Info

Publication number: CN101323849B
Application number: CN2008100231941A
Authority: CN
Inventors: 胡洪清; 华家荣
Original assignee: WUXI SYDER BIO-PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUXI SYDER BIO-PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2028-07-31
Also published as: CN101323849A

Abstract

本发明涉及一种液态β-淀粉酶制剂的制备方法，其特征在于以麸皮为原料，其工艺步骤包括麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、配方、二次精滤、酶活力调整。本发明采用合适配比的防腐剂以及合适的温度和pH，能够有效的抑制细菌生长，防止腐败以及酶的失活；所得的产品杂质含量低，相对于固体酶制剂而言所含的工业盐浓度低，易达到食品添加剂标准的要求。本发明是全新的液态β-淀粉酶制剂制备工艺，工艺简单、生产效率高、生产成本低，适合于工业化生产。

Description

液态β-淀粉酶制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及酶制剂的制备方法，具体涉及利用植物制备液态β-淀粉酶制剂的制备方法。

背景技术

β-淀粉酶(又称α-1，4-D葡聚糖麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.2)是一种外切型淀粉水解酶，它能从淀粉的非还原性末端开始，依次催化水解α-1，4-D葡萄糖苷键，生成麦芽糖。与此同时，发生瓦尔登转位反应(Waldeninversion)，使产物由α-型变为β-型，故称β-淀粉酶。

由于β-淀粉酶不能水解支链淀粉的α-1，6键，也不能跨过分支点α-1，6键而切开内部的α-1，4键和α-1，6键附近的2～3个α-1，4键，所以在水解产物中残留下侧支外常挂有2～3个葡萄糖残基的β-极限糊精。β-淀粉酶即使作用于直链淀粉时，也只能使淀粉的70％～90％水解成麦芽糖，其它为麦芽三糖和寡糖。β-淀粉酶在工业上是一种重要的酶，它可把淀粉质原料转化成麦芽糖，含量不同的麦芽糖产品可以用于如糖果、啤酒发酵等食品工业，高纯度的麦芽糖液还可替代葡萄糖输液用于糖尿病人。

在目前已有报道的生产技术中，有用微生物发酵法生产的商品β-淀粉酶，此酶耐热稳定性能差，除产生麦芽糖外，还产生相当量的麦芽三糖，而植物β-淀粉酶耐热稳定性好，作用pH范围广，能产生较多的麦芽糖。但现有从植物中提取的β-淀粉酶都是固体产品，为粗制品杂质含量高，不能作为食品添加剂(见专利公开号CN1225943A大豆β-淀粉酶的制备工艺)，并在制备过程中采用盐析工艺，硫酸钠回收困难，存在废液处理问题。反复冻融使操作复杂，成本高。而专利《提取β-淀粉酶的方法》(见专利公开号CN1491279A)仅提供了采用纤维素酶从大麦或小麦中提取β-淀粉酶，但纤维素酶价格高，生产成本高。到目前为止，由于缺乏有效的制备工艺，高酶活力的液体植物β-淀粉酶制剂仍未实现工业化规模生产。

发明内容

针对上述现有β-淀粉酶制备方法存在生产成本高、产品杂质含量高以及废液处理等问题，本申请人提供一种液态β-淀粉酶制剂的制备方法。

本发明的技术方案如下：

液态β-淀粉酶制剂的制备方法，其工艺步骤包括：

以麸皮为原料，其工艺步骤包括麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、配方、二次精滤、酶活力调整，分述如下：

浸提：

(1)配制浸提水：在水中按(重量/体积)加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0.01～0.03％、山梨酸钾0.1～0.25％、苯甲酸钠0.2～0.5％，还原剂焦亚硫酸钠0.5～1.5％、低亚硫酸钠0.5～1.5％；

(2)浸提：将麸皮按(重量/体积)1∶4～7加入步骤(1)配制的浸提水；常压下，浸提温度控制在40～55℃，pH控制在4.5～6.5，浸提6～8小时；

固液分离：浸提后进行固液分离。

精滤：分离出的浸提液迅速冷到20℃以下，分离出的浸提液加入1～2％(重量/体积)的硅藻土，过精滤板框进行精滤；

超滤浓缩：所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20℃以下；

配方：超滤浓缩到所需规格的酶活力要求后，将所得超滤浓缩液放入配方罐，按(重量/体积)加入稳定剂18～22％的氯化钠、8～10％的醋酸钠、5～8％麦芽糊精、0.1～0.25％的山梨酸钾、0.2～0.5％苯甲酸钠，搅拌溶解，混合均匀；

二次精滤：所得配方液中加入1～2％(重量/体积)的硅藻土，过精滤板框进行精滤。

酶活力调整：收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，用稀释液将二次精滤滤液的酶活力调整到300000U/g或600000U/g。

所述酶活力调整所用的稀释液是按(重量/体积)加入稳定剂18～22％的氯化钠、8～10％的醋酸钠、5～8％麦芽糊精、0.1～0.25％的山梨酸钾、0.2～0.5％苯甲酸钠的水溶液。

根据上述制备工艺生产出的300000U/g、600000U/g液态植物β-淀粉酶制剂，产品为棕褐色液体、无异味、可以与水互溶，产品热稳定性好、催化活性强，最适合作用温度在55℃～60℃之间。当温度超过65℃时，反应速度加快，但失活也加快。本品最适合作用pH值范围为5.0～6.8之间。本产品中不含α-淀粉酶。

本发明所得成品能达到以下指标：酶活力300000U/g、600000U/g，容重：1.15～1.25g/ml，pH5.0～6.0，菌落总数≤10000cfu/ml。活力保存稳定性极高，在25℃以下，保存6个月之后酶活力仍大于90％。

以上工艺的总酶活回收率≥74％，上述工艺与指标均优于用其它技术得到的酶制剂制品。本发明是全新的液态β-淀粉酶制剂制备工艺，工艺简单、生产效率高、生产成本低，适合于工业化生产。

本发明以麸皮为原料，生产成本低；在液态β-淀粉酶制剂的生产过程中，由于工序时间长，容易腐败，引起酶的失活，本发明采用合适配比的防腐剂以及合适的温度和pH，能够有效的抑制细菌生长，防止腐败以及酶的失活；本发明是一种液态的β-淀粉酶制剂，相对于固体酶制剂而言所含的工业盐浓度低，易达到食品级标准要求；在生产过程中，温度只需控制在20℃以下，降低了生产能耗；本发明采用精滤-超滤浓缩-二次精滤的步骤，所得的产品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；分离后的麸皮经干燥后可作饲料，无废固物处理问题。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为用于酶活力测定的DNS半量法标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

1、浸提：

(1)配制浸提水：250L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0.025Kg、山梨酸钾0.625Kg、苯甲酸钠0.875Kg、还原剂焦亚硫酸钠1.25Kg、低亚硫酸钠3.75Kg，搅拌溶解；

(2)浸提：称取50Kg麸皮加入步骤(1)配制的浸提水中；常压下，水浴升温至45℃保温，调pH为4.5，每小时搅动一次，浸提6小时；

2、固液分离：浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；

3、精滤：分离出的浸提液迅速冷到20℃以下，浸提液加入3.75Kg的硅藻土，过精滤板框进行精滤；

4、超滤浓缩：步骤3所得精滤液进入超滤浓缩器进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为4英寸卷式膜，截流分子量为 10K道尔顿；

5、配方：超滤浓缩到酶活力在390000U/g时放出，得到约6.14L超滤浓缩液，置于配方罐，加入1105g的氯化钠、491g的醋酸钠、307g麦芽糊精、防腐剂6.14g山梨酸钾、12.28g苯甲酸钠溶解，搅拌均匀。

6、二次精滤：在配方液中加入79.8g硅藻土，搅拌均匀过滤。得成品7.25Kg，酶活力320000U/g，收率77％。

7、酶活力调整：收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重：1.18g/ml，pH5.5，菌落总数≤10000cfu/ml。用稀释液进行酶活力调整，所用稀释液是按(重量/体积)加入稳定剂18～22％的氯化钠、8～10％的醋酸钠、5～8％麦芽糊精、0.1～0.25％的山梨酸钾、0.2～0.5％苯甲酸钠的水溶液，将酶活力调整到300000U/g。

实施例2：

1、浸提：

(1)配制浸提水：7000L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯1.4Kg、山梨酸钾14Kg、苯甲酸钠14Kg、还原剂焦亚硫酸钠70Kg、低亚硫酸钠70Kg，搅拌溶解；

(2)浸提：称取1000Kg麸皮加入步骤(1)配制的浸提水中；常压下，水浴升温至55℃保温，调pH为5.0，每小时搅动一次，浸提7小时；

2、固液分离：浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；

3、精滤：分离出的浸提液迅速冷到 20℃以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，过精滤板框进行精滤；

4、超滤浓缩：步骤3所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为8英寸卷式膜，截流分子量为20K道尔顿；

5、配方：超滤浓缩到酶活力在780000U/g时放出，得到59.6L超滤浓缩液，置于配方罐加入12.49kg的氯化钠、5.62kg的醋酸钠、4.1kg麦芽糊精、防腐剂：125g山梨酸钾、219g苯甲酸钠溶解，搅拌均匀。

6、二次精滤：在配方液中加入0.9kg硅藻土，搅拌均匀过滤。得成品70.25kg，酶活力632000U/g，收率74％。

7、酶活力调整：收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重：1.17g/ml，pH5.6，菌落总数≤10000cfu/ml。将酶活力调整到600000U/g，所用稀释液与实施例1相同。

实施例3：

1、浸提：

(1)配制浸提水：30000L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯9Kg、山梨酸钾30Kg、苯甲酸钠150Kg、还原剂焦亚硫酸钠450Kg、低亚硫酸钠150Kg，搅拌溶解；

(2)浸提：称取5000Kg麸皮加入步骤(1)配制的浸提水中；常压下，水浴升温至50℃保温，调pH为6.5，每小时搅动一次，浸提8小时；

2、固液分离：浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；

3、精滤：分离出的浸提液迅速冷到20℃以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，过精滤板框进行精滤；

4、超滤浓缩：步骤3所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为8英寸卷式膜，截流分子量为60K道尔顿；

5、配方：超滤浓缩到酶活力在780000U/g时放出，得到309.03L超滤浓缩液，置于配方罐，加入67.98kg的氯化钠、30.9kg的醋酸钠、24.72kg麦芽糊精，防腐剂618g山梨酸钾、1.54kg苯甲酸钠溶解，搅拌均匀。

6、二次精滤：在配方液中加入3.71kg硅藻土，搅拌均匀过滤。得成品370.8kg，酶活力615000U/g，收率75.7％。

7、酶活力调整：收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重：1.20g/ml，pH5.4，菌落总数≤10000cfu/ml。将酶活力调整到600000U/g，所用稀释液与实施例1相同。

实施例1-3所得的产品，其酶活力测定方法如下：

β-淀粉酶酶活力的测定，依据行业惯用测定方法，采取DNS半量法测定。

麸皮中β-淀粉酶总酶活力的测定，称取50g麸皮置于烧杯中。取200ml水加入对羟基苯甲酸乙酯0.02g、山梨酸钾0.2g、苯甲酸钠0.4g，还原剂焦亚硫酸钠1g、低亚硫酸钠1g搅拌溶解，调pH4.5。倒入置麸皮的烧杯中搅拌混合。水浴升温至40℃保温每小时搅动一次浸提8小时。滤纸过滤，滤液用下面描述的方法测定酶活力。本说明书中酶活力均由该方法测定得到。

酶活力定义：在pH5.50，温度60℃的条件下，每小时水解1.10％淀粉液所产生1mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位(u/g或u/ml)。

酶活力测定(DNS半量法)

1试剂

1.10.2M，pH5.50磷酸缓冲液

甲液：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)53.65g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。

乙液：称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·12H₂O)27.8g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。

取甲液6.5ml，乙液93.5ml，混合后以酸度计校正pH5.50即成。

1.210％pH5.50磷酸缓冲液

取上述0.2M，pH5.50磷酸缓冲液10ml，加入90ml蒸馏水，混合即成。

1.3DNS溶液

精确称取3.5-二硝基水杨酸1.0000g，苯酚0.2g，亚硫酸钠0.05g，氢氧化钠1g，酒石酸钾钠20g，用蒸馏水加热溶解，冷却定容至100ml，于棕色瓶中贮存，放置一周后方能绘制标准曲线(每次配制需绘制)。

1.41.1％淀粉缓冲液

煮沸约50ml蒸馏水，加入到1.1g淀粉的少量蒸馏水溶解液中，再煮沸至透明，冷却，

加10ml、0.2M，pH5.50磷酸缓冲液，定容至100ml。

2仪器和设备

2.1恒温水浴0～100℃(精度±0.2℃)

2.2秒表

2.325ml具塞比色管

2.4移液管

2.5容量瓶

3标准曲线的绘线(DNS半量法)

准确称取于(105～110℃)干燥后的葡萄糖50mg，用蒸馏水溶解定容至50ml，配成1mg/ml葡萄糖液，按表一比例操作及开水煮沸15min，冷却，加入10.5ml蒸馏水，722型分光光度计550nm比色。

表一

见图2，以OD值为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制标准曲线图(用回归方程算出常数K(K＝葡萄糖mg/OD)。样品根据所测定的OD值，在标准曲线上查出其相当于葡萄糖mg数，再乘以1.9倍，即为麦芽糖mg数。

4测定步骤

4.1样品制备

准确称取一定量酶样，用10％磷酸缓冲液溶解定容、摇匀。(每mg酶液约20单位为宜，OD值控制在0.2～0.4之间)。

4.2测定

a.准确吸取1.4溶液9.0ml，于60℃恒温水浴预热5min，加入1ml酶样，立即计时准确反应30min。

b.迅速吸取0.5ml反应液于已吸入DNS试剂1.50ml的25ml具塞比色管中，煮沸15min，冷却。再加入10.50ml蒸馏水，摇匀。用550nm比色。对照：以蒸馏水替代酶样，其它操作同。

4.3计算

酶活力单位u/mg＝OD×2×20×1.9×K×n＝OD×K×76×n

式中：K——标准曲线常数

n——样品稀释倍数

2——反应30min换算成60min

20——将吸取0.5ml反应液换算成10ml

1.9——麦芽糖葡萄糖分子量之比

测得提取液酶活力15064U/g，折算到麸皮中含量60256U/g麸皮。

利用以上方法，实施例1-3的数据列表如下：

Claims

1.一种液态β-淀粉酶制剂的制备方法，其特征在于以麸皮为原料，其工艺步骤包括麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、配方、二次精滤、酶活力调整，分述如下：

浸提：

(1)配制浸提水：在水中按重量/体积比加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0.01～0.03％、山梨酸钾0.1～0.25％、苯甲酸钠0.2～0.5％，还原剂焦亚硫酸钠0.5～1.5％、低亚硫酸钠0.5～1.5％；

(2)浸提：将麸皮按重量/体积比1∶4～7加入步骤(1)配制的浸提水；常压下，浸提温度控制在40～55℃，pH控制在4.5～6.5，浸提6～8小时；

固液分离：浸提后进行固液分离；

精滤：分离出的浸提液迅速冷到20℃以下，分离出的浸提液加入1～2％重量/体积比的硅藻土，过精滤板框进行精滤；

配方：超滤浓缩到所需规格的酶活力要求后，将所得超滤浓缩液放入配方罐，按重量/体积比加入稳定剂18～22％的氯化钠、8～10％的醋酸钠、5～8％麦芽糊精、0.1～0.25％的山梨酸钾、0.2～0.5％苯甲酸钠，搅拌溶解，混合均匀；

二次精滤：所得配方液中加入1～2％重量/体积比的硅藻土，在20℃以下过精滤板框进行精滤；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述超滤浓缩采用卷式膜，截流分子量为10～60K道尔顿。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述酶活力调整所用的稀释液是按重量/体积比加入稳定剂18～22％的氯化钠、8～10％的醋酸钠、5～8％麦芽糊精、0.1～0.25％的山梨酸钾、0.2～0.5％苯甲酸钠的水溶液。