CN101194157B - 微观流体装置和使用该装置的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微观流体装置，包括一个或多个流体通道、一个或多个流体端口和V形粒子保持结构。流体通道通常与粒子保持结构相对，流体端口位于流体通道与粒子保持结构之间，粒子保持结构具有斜侧壁。流体，包括试剂，可以通过一个或多个流体通道或流体端口传输到微观流体装置。本发明还涉及使用微观流体装置来监视、观察、测量或者记录粒子生物参数的方法，以便从一组粒子中分离出单一的粒子、培养细胞、处理粒子和在装置中来回移动粒子。

Description

微观流体装置和使用该装置的方法

技术领域

本发明涉及微观流体装置(microfluidic device)和使用该装置的方法。

背景技术

近年来，微观流体“芯片”(microfluidic“clip”)技术已经广泛应用于生物分析^1-3。尤其用于细胞生物化学分析的各种微观流体芯片技术近来得到发展^4-19。对于片上实验来说，细胞的传输和选择主要通过液体流动(liquid flow)来获得^{4-7，9，11，20-22}。成功的细胞生物化学研究的主要技术问题包括在试剂传送期间保持细胞和维持细胞完整性的方法。到目前为止，用于细胞固定的主要方法包括(1)细胞粘着^8，23，24，(2)在切口型过滤器^25-28、堰型过滤器^{9，11， 29，30}或者聚合材料^31，32中的物理保持，和(3)双向电泳^33-35。细胞粘着和阻塞通常不会均匀地对整个细胞表面产生力，而是对一小部分细胞表面产生局部的力。即使这些粒子保持策略对静止细胞没有任何的负面影响，用于给细胞传递试剂和缓冲液所须的液体流动也可能毁坏细胞。这是因为液体流动总是对细胞施加力。因此，强的液体流动可能毁坏细胞。另一方面，为了确保足够的液体流动用于试剂传送，该液体流动也不应太弱。为了平衡液体流动的力，需要对细胞施加一个相反的力。

近来，生物化学研究已经受益于微观流体芯片技术^1-3。尤其是对保持在微观流体芯片中的生物细胞进行的研究^4-19。大多数研究基于多组细胞进行，只有一些研究基于单个细胞进行^{1，6，14，19}。而且，微观流体芯片单细胞实验通常受限于只能用一种类型的刺激，或者这些实验只能进行一次或者经过很短的一段时间。这不能提供足够的与单细胞生物化学相关的信息。很多情况下，与单个细胞相关的有用信息无法通过对细胞整体进行的测量来获得。虽然有必要研究多组细胞(例如，为了了解细胞-细胞间的相互作用)，但进行基因单细胞微观流体实验也是有用的。

发明内容

本发明涉及一种微观流体装置，包括至少一个用于将第一流体引入该装置的第一通道和用于在该装置中保持粒子的大致V形的粒子保持结构，该粒子保持结构具有相对的壁部分和位于所述相对的壁部分之间的中心壁部分，其中粒子保持结构大致位于第一通道对面，并且相对的壁部分和中心壁部分具有斜侧壁。一个或多个流体端口布置在第一通道和粒子保持结构之间，用于传送第二流体到该微观流体装置或者用于允许流体流出该装置。

该斜侧壁可弯曲，并且可精确弯曲。当该侧壁精确弯曲时，其可以具有两倍或更多倍于保持在微观流体装置中的粒子或细胞的宽度的曲率半径的弧。第一通道具有大于保持在微观流体装置中的粒子或细胞的宽度的宽度。中心壁部分可以具有两倍或更多倍于粒子或细胞的宽度的宽度。V形粒子保持结构可以具有两倍或更多倍于粒子或细胞的宽度的高度。一个或多个流体端口的宽度可以是粒子或细胞的宽度的两倍或者更多倍，也可以是粒子或细胞的宽度的4倍。粒子保持结构的侧端部分(lateral end portion)相对于相对的壁部分可以有一个0～180度的角度，该角度可以是135度。

当流体通过第一通道传送时，流体在V形粒子保持结构上能形成一个零速度点。由于在一个或多个流体端口之一中的电势或流体势的增加，由在第二流体从一个或多个流体端口之一的传送的增加，该零速度点可以侧向平移。

本发明的微观流体装置还可以包括靠近V形粒子保持结构的用于检测粒子生物参数的检测窗口。中心壁部分还可以包括一个或多个凹槽。

本发明还涉及包括两个或更多个粒子保持结构、两个或更多个流体端口、两个或更多个第一流体通道的微观流体装置。

本发明还涉及使用本发明的微观流体装置来监视、观察、测量或者记录粒子生物参数的方法，生物参数可以是任何参数，包括大小、形态、生长率、生物标记、物质流入、物质流出、粒子对一种或多种刺激的反应或者粒子对其环境变化的反应。所述物质可以是有色物质、发色物质(chromogenicsubstance)、荧光物质、荧光标记物质、辐射标记物质或者任何其它物质。动力学参数和热力学参数可以从细胞或粒子的生物参数中通过数学方法推算出。可以实时以在扩展的时间周期上监视、观察、测量和记录生物参数。

本发明还涉及包括使细胞在本发明的微观流体装置中生长的培养细胞的方法，在微观流体装置中用流体处理粒子的方法，和使用微观流体装置从一组粒子中分离粒子的方法。

本发明还涉及在微观流体装置中移动粒子的方法，该方法包括在零速度点隔离粒子并在微观流体装置中移动该零速度点。

本发明还涉及监视蛋白质、蛋白质晶体、纳米粒子或其它粒子的合成和生长的方法。

微观流体装置和方法也可以用于任何类型的粒子，例如细胞、熔珠(bead)、病毒粒子、蛋白质、蛋白质晶体、纳米粒子或其它粒子。细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞或其它细胞。

附图说明

图1描述了细胞选择机构和微观流体装置的实施例的设计。(图.1A)微观流体装置包括用于引入细胞(从端口12或14之一)的端口12和14，以及用于传送缓冲液或试剂溶液的通道16(40μm宽)。位于试剂通道16的相对端的V形粒子保持结构由其间具有中心壁部分的相对的壁部分组成。光电倍增管(PMT)在检测窗口(在插入图中显示为白色矩形框)中检测荧光信号。单一的酵母细胞自由地靠在由液体流动平衡的15μm半径(见插入图)的斜壁上。(B)细胞引入：来自左侧的液体流动载有一组细胞到达粒子保持结构。(C)细胞选择：来自通道16的液体流动分离细胞并向下方的检测窗口发送需要的细胞。液体流动可以由流体势(＜1mm)或电势差(0.01～1.5kV)之一来驱动。“+”表示高电势。(D)描述了微观流体装置的一个实施例。(E)是沿图1D所示的线S1的微观流体装置的一个实施例的截面图。(F)是沿线S2的截面图。(G)是图1E的一部分的放大图。(H)是微观流体装置的实施例的透视图。

图2描述了通过微观流体装置的实施例得到的3-维流动控制。(A)由来自通道16的流动产生的2-维通道流场。存在一个在该点处流速降低到接近于零的零速度点(ZSP)。当不存在来自端口12和14的流动时，ZSP位于中间，直接与通道16相对(符号12、14、16已经在图.1中描述过)。第三维流场沿着在插入图中的截面图所示粒子保持结构的斜侧壁。(B-E)当来自右侧的流体势增加时，流场的形状改变并且ZSP移至右侧。(F)所示当不存在来自通道16的试剂流动时，流场可以由来自右侧的流体势驱动。(G-J)当来自左侧的流体势增加时，流场形状也改变。(K)所示当不存在来自通道16的试剂流动时，流场可以由来自左侧的流体势驱动。(L)沿着粒子保持结构斜侧壁的第三维流场导致细胞在斜侧壁上平衡。细胞上由液体流动(f)施加的向上的力、细胞自身向下的重力(g)和来自斜壁(P)的反作用力相互平衡。(M-O)随着来自通道16的试剂流动增加，细胞在斜侧壁上的位置改变。(P)当没有流时细胞的位置。

图3描述了施加给包含在本发明的微观流体装置中的细胞的力。(A)显示了液体流过粒子保持结构斜侧壁附近时的不同方向和强度。(B)施加给细胞的力在粒子保持结构的斜侧壁上平衡；g：细胞重力(减去浮力)；fa：流动以角度(a)施加的力；f_H：水平流体流动施加的力(即a＝0)；P_a：对以角度(a)定向的流动来说，斜侧壁对细胞的反作用力；P_H：对水平流动来说，斜侧壁对细胞的反作用力。(C)液体流过垂直壁附近时的方向和强度。(D)施加给细胞的力相对于垂直壁平衡。P_v：底壁对重力的反作用力；P_H：由于水平流动，垂直壁对细胞的反作用力。(E)(B)中给出的力g、f_a和P_a之间的关系。(F)当细胞在以增加的斜角(β)精确倾斜的侧壁上平衡时，力g、f_H和P_H之间的关系。

图4是光学测量装置的概略图。其设置包括倒置显微镜和相关的光学器件。20：分色镜1(495nm)；22：分色镜2(540nm)；24：带通滤波器(470nm/40nm)；26：长波通滤波器(645nm)；28：带通滤波器(525nm/50nm)；30：显微镜目标(ELWD，40X/0.60)；32：反射镜。第一光学路径(红光，到26，到微观流体装置，到30，到20，到32，到22，和到CCD相机)用于明场光学观测；第二光学路径(激发光(excitation light)，到24，到20，到30，到微观流体装置，到30，到32，到22，到28，和到PMT)用于荧光测量。所示微观流体装置的实施例用在单细胞实验中。微观流体装置的宽度为16mm。在微观流体装置的照片中，小瓶a连接到端口12，小瓶b连接到端口14，小瓶c连接到通道16。

图5包括一系列说明在微观流体装置中3-维流体流动的图像。(A)带有FDA(12μM)的缓冲液从通道16注入粒子保持结构。溶液前端向下延伸，如相衬模式的倒置显微镜观测的。(B)来自通道16的熔珠行进到粒子保持结构。每0.24秒捕获图像并覆盖。因此，每一帧中，四个熔珠代表一个熔珠的行进路径，在每个经过了0.72秒的图像中。任意两个最近熔珠之间的距离说明0.24秒内熔珠行进的长度。熔珠在通道16中快速行进，但当它们接近粒子保持结构时行进速度减慢。熔珠演示了图2H所描述的流场。(C)使用流体流动的熔珠的选择、保持和固定。将要选择的需要的熔珠环绕。此外，每0.24秒捕获熔珠图像，并且每0.24秒覆盖图像以显示出它们的位置。

图6包括了熔珠和酵母细胞在粒子保持结构的斜侧壁上平衡的图像。(A)在弱试剂流动存在的情况下，熔珠在斜侧壁上平衡。熔珠痕迹代表了熔珠在0.08秒间隔内的移动。(B)当流动增加时，熔珠向斜侧壁上更高的上方移动并到达一个新的力平衡位置。(C)向斜侧壁移动直到相对侧壁平衡的芽殖酵母细胞(0-8s)。三个点代表相同的单个细胞在不同时间的图像，其演示了如何扫描荧光细胞。在荧光检测期间(10-16s)，将细胞扫描到右侧。在强试剂流动中，细胞进一步沿斜侧壁向上移动到达一个新的力平衡位置(39-46s)。在荧光检测期间(59-60s)，细胞在其新的力平衡位置扫描。

图7描述了一系列从视频记录(以秒为时间)捕获的片上细胞培养图像。(A)在微观流体装置中(24℃)生长的酵母细胞(细胞1)。在细胞上对FDA新陈代谢进行实验前，将细胞分成两份。(B)将直接从细胞群体中挑选的另一个酵母细胞(细胞2)在24℃的微观流体装置中培养。其培育了17000s。(C)另一个酵母细胞(细胞7)具有移除了细胞壁的片上细胞。该过程持续了3.84s。每一张照片都附有概略图，用以说明细胞壁移除过程的各个步骤。

图8描述了通过细胞扫描和噪声滤除检测到的酵母细胞产生的荧光信号。(A)通过检测窗口来回行进的荧光酵母细胞在背景上产生峰值。(B)滤除噪声(＞2.5Hz)后峰值信号变得更清晰。(C)使用较窄的检测窗口允许母酵母细胞从它的子酵母细胞中区分出来，就像峰值信号(由较大的母细胞产生)和肩部信号(由较小的子细胞产生)所描述的荧光信号那样。

图9描述了存储在本发明的微观流体装置中的缓冲液溶液(无细胞)的背景荧光。荧光的渐增是由于FDA的慢水解在水缓冲液中产生了荧光素。(A)缓冲液G7；(B)缓冲液H4；(C)G7和H4间的改变。

图10描述了用于纠正数据信号的背景荧光信号。将背景纠正应用于酵母细胞(细胞5)实验。(A)由于细胞荧光加上背景而产生的峰值。(B)从(A)中提取的背景基线。(C)减去背景后的细胞荧光峰值。(D)所有荧光峰值的峰值包络。两种试剂比例指示出缓冲液类型和FDA浓度。激发光比例指示出激发光何时打开或关闭。

图11由一系列在微观流体装置里的细胞培养中的酵母细胞的图像和随后的片上细胞选择(细胞1参考图12A，以秒为时间)组成。(A)微观流体装置。(B-G)从一组细胞中选择细胞。(H-K)试剂流动中从母酵母细胞逃离的子细胞。在图7A中也描述了这些细胞(细胞1)。

图12描述了FDA新陈代谢期间酵母细胞产生的荧光信号。(A)片上细胞培养(细胞1)、介质和试剂改变、荧光检测和数据处理。(B)(C)(D)(E)对其它单个芽殖酵母细胞进行的FDA实验。(F)对移除了片上细胞壁后的原生质进行的FDA实验。(G)(H)对单个静止的酵母细胞进行的FDA实验。缓冲液类型的三种比例，FDA浓度(0或12mM)和细胞荧光密度(每秒10³次)与(A)中的相同。Y：酵母细胞培养介质(YPD)。H4和H7：285mM HEPES，分别在pH＝4.3和pH＝7.3。G7和G4：28.5mM HEPES加上256mM D-glucose，分别在pH＝7.3和pH＝4.3。熔珠：荧光熔珠用于在8ks时进行校正。所有结果在背景校正后显示，如(A)所示。

图13描述了Ca²⁺活动跟踪测试期间在单个酵母细胞中检测到的荧光信号。(A)(B)(C)片上细胞选择后的实验，其次是片上细胞壁移除和Fluo-4-AM装载。(D)片外细胞壁移除和Fluo-4-AM装载后的实验，其次是片上细胞选择。(E)片上细胞选择后的实验，其次是直接片上高浓度Fluo-4AM(在DMSO中)装载。(F-O)片外高浓度(在DMSO中为1mM)Fluo-4AM装载后的实验，其次是片上细胞选择。所有三种缓冲液的比例、Ca²⁺浓度和荧光密度与图3O中相同。Y：培养介质(YPD)；E：EDTA。除了(E)外，所示的所有结果都是在背景纠正之后的(图2A中所示)。

图14描述了钙在三种单个酵母细胞(静止、芽殖、处理芽殖(TREATEDBUDDING))中响应葡萄糖和pH值变化的活动。箭头显示缓冲液类型的变化和相关的细胞内荧光(Ga²⁺-Fluo-4)的变化。箭头的线宽度指示荧光的变化，在图例中以百分比的形式给出。

图15是酵母细胞图像的比较，这些图像描述了在不同条件下生长的细胞的荧光的区别。(A-B)由G7(12μM FDA)培育1.5ks后形成的荧光素产生的荧光；(A)静止细胞；(B)H4培育1ks后的芽殖细胞；(C-E)由在4s片外高浓度Fluo-4-AM/DMSO(1mM)装载后形成的Ca²⁺-Fluo-4而产生的荧光，接着进行0.5ks Ca²⁺(在G7中为10mM)处理；(C)静止细胞；(D，E)芽殖细胞；(F)由6μm荧光熔珠产生的荧光。

图16描述了单细胞中(细胞3)FDA新陈代谢的数学模型。曲线拟合和灵敏度测试：(I)有三种细胞处理，即流入、水解、流出。酵母细胞控制FDA的流入(A)，FDA的水解(B)，以响应pH值和葡萄糖的刺激形成荧光素(C)以及荧光素的流出。(II)细胞内FDA(B)和荧光素(C)的浓度。只有C是用实验方法测量的。T₀、T₁和T₂分别代表缓冲液变化、峰值增加和峰值降低发生的时间(s)。(III)曲线拟合：图中虚线和实现分别代表细胞内FDA和荧光素的模型量，实线下的条线区代表荧光素检测量的信号峰值，它是用已知密度的荧光熔珠校正过的。应该注意的是，该实验之前已经在图2B中描述过。(IV，V，VI，VII)模型的灵敏度测试：将对模型线的影响描述为一系列黑线，当一个参数在下述情况之一变化时，(IV)T₂-T₁：2300-2700s，(V)V_m0：0.001-0.005μM s^-1，(VI)k：(4-8)×10^-6μM s^-2，(VII)V_e：1-4μM μms^-1。(RFI：相对荧光密度，其中1％代表由6×10^-19摩尔的FDA完全水解的生成物产生的荧光)。

图17描述了各种刺激下细胞的荧光。曲线拟合是基于由于pH和葡萄糖刺激而经历了一系列变化的(A)细胞4和(B)细胞5完成的。虚线和实现分别代表细胞内FDA和荧光素的模型量，实线下的条线区代表代表荧光素检测量的信号峰值。带有数字的箭头指示出缓冲液类型和FDA浓度的变化，并以文字进行描述。注意(A)还在图12D中描述过，(B)在图12C中描述过。

图18描述了不同类型的细胞扫描。左侧系列图A-D显示了细胞保持结构中的不同扫描路径(箭头指示A和B中的移动细胞，或者C和D中的移动检测窗口)。右侧系列图A-D显示了测量结果。

图19描述了使用窄检测窗口和两种不同扫描速度情况下的芽殖酵母细胞的扫描结果。左侧的五个峰值由500V电压产生，导致较快的扫描速度，右侧的五个峰值由200V电压产生，导致较慢的扫描速度。插入图显示了描述母细胞及其芽体的荧光密度的两个镜像峰值。

图20描述了开放区细胞扫描的优点。左侧系列图A-E显示了在不同结构中的不同扫描路径(箭头指示移动检测窗口)。右侧系列图A-E显示了期望的扫描结果(C-E中的虚线指示可能的细胞信号)。

图21描述了分离FDA水解(增加荧光密度)和光致褪色效果(降低荧光密度)的光致褪色模型的参数。F0、F1、F2和F3分别为t＝0、T、2T和3T时的荧光。当0＜t＜T和2T＜t＜3T时，激发光打开。当T＜t＜2T时，激发光关闭。(B)由在无液体流动情况下G7中的FDA水解产生的荧光素的荧光密度。激发光的遮光器每隔100s打开和关闭。(C)整个实验持续20000s，其间得到(B)的数据。(D)相对RFI标出的光致褪色率常数k_p，其在每一级的相对荧光密度(RFI)确定。

图22描述了植入到标准载玻片上的酵母细胞的荧光测量：原始数据(A)、其分离出的背景(B)和提取的细胞荧光(C)。FDA用于在水解后产生细胞荧光。

图23描述了在微芯片内部流动中的酵母细胞的荧光测量：原始数据(A)、其分离出的背景(B)和提取的细胞荧光(C)。FDA用于在水解后产生细胞荧光。

具体实施方式

为提供对本发明更全面的理解，在下述说明中，阐述了特定的细节。然而，没有这些细节本发明也可以实施。此外，为使本发明易于理解，没有进行描述或显示公知的部件。因此，应当将说明书和附图看作是说明性的，而不是限制性的。

本发明提出了一种使用三维流动控制的微观流体装置。该流动控制结合了在第一维中(1-D)的细胞平衡能力以及在通道维(2-D)中的细胞扫描能力。

虽然本发明在此是以细胞为背景进行描述的，但是本领域技术人员应该理解本发明也可以用于保持和操纵其它粒子，诸如熔珠、病毒粒子、蛋白质、蛋白质晶体和纳米粒子。

为了平衡微观流体装置中的细胞或粒子，发明者利用残留在斜壁上的细胞向下的残留重力来平衡通过微观流体装置中的通道或端口的液体流动施加给细胞的向上的力。微观流体装置的斜侧壁可以由例如象玻璃或硅这样的材料做成的微观流体装置的各向同性腐蚀产生。

为了扫描细胞并获得关于生物参数的数据，发明者使用了零速度点(ZSP)，该零速度点(ZSP)是由液体流动场相对于微观流体装置中特殊形状的粒子保持结构产生的。

通过三维流动控制，发明者成功地进行了细胞平衡、细胞扫描、生理参数测试和单细胞观察。选择酵母细胞作为示例是因为它们的有效性和短生命周期(用于细胞培养)。然而，微观流体装置和使用该装置的方法可以用于任何类型的细胞，包括原核细胞和真核细胞，例如真菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。如上所述，本发明也可用于研究任何类型的粒子，包括熔珠、蛋白质、蛋白质晶体、纳米粒子等。

此外，通过细胞平衡和细胞扫描技术，已经成功实现了“片上(on-chip)”单细胞的培养。本发明中，术语“片上”是指发生在微观流体装置内部的活动。当前的片上培养方法只能以批量模式执行，不能跟踪单个细胞，并且仅用于粘附细胞^36-41。本发明的微观流体装置允许用单细胞进行实验和方法。

3-维流动控制

图1D描述了微观流体装置的实施例。参考图1D，该微观流体装置10由包括流体通道16的通道确定部分8、与通道确定部分8间隔开的大致V形的粒子保持结构2组成，粒子保持结构2包括：相对的壁部分4；设置于相对的壁部分4之间的中心壁部分6；和侧端部分18，其中每个相对的壁部分4设置在中心壁部分6和一个侧端部分18之间。粒子保持结构2大致与流体通道16相对。将流体端口12和14确定在通道确定部分8与侧端部分18之间。微观流体装置可以包括多个流体通道16。可选择地，微观流体装置10还可以包括用于检测保持在微观流体装置10中的细胞的检测窗口30。(见图1A)。

相对的壁部分4的侧壁和中心壁部分6向内部倾斜。在一些实施例中，该向内部倾斜的侧壁可以向内部弯曲，并且可以向内部精确弯曲(见图1A、1F和1G)。图1E是图1D所示的微观流体装置的一个实施例沿线S1的截面图。图1F是沿线S2的截面图。图1G是图1F的一部分的放大图。图1H是微观流体装置10的实施例的二等分透视图。

角θ是在侧端部分18和相对的壁部分4之间形成的角。角θ可以是0～180°之间，例如135°或者任何其它合适的角度。对于直径为X的粒子或细胞，中心壁部分6的长度应该等于或大于2X。横穿流体端口12和14的宽度应该大于2X，并且可以是4X，以易于粒子清洗和粒子传送。V形的粒子保持结构的深度，即从侧端部分18至中心壁部分6的距离，应该是2X或更大，以使细胞可以远离流经微观流体装置的流动。在一些实施例中，通道16可用于将细胞或粒子传送到微观流体装置。在这些实施例中，通道16的宽度可以大于X，以允许细胞从通道16传送入微观流体装置。中心壁部分6可以是平的，或者为了帮助细胞集中在中心壁部分中的检测窗口，其可以包括一个或多个如图1D中的中心壁部分6A和6B的实施例所示的凹槽。在那些粒子保持结构的向内倾斜侧壁为弓形地弯曲的实施例中，侧壁的曲率半径e可以等于或大于2X。然而，向内倾斜侧壁可以包括任何弯曲的形状。而且，向内倾斜侧壁的倾角可以变化或可以为常量。

参考图1B，对于细胞选择来说，水平液体流动(该情况下从端口12，虽然端口12或14中任何一个都可以使用)可以承载贴近V形粒子保持结构的一组细胞。来自通道16的并与来自端口12或14的液体流动方向垂直的另一液体流动分离细胞，并把需要的细胞向检测窗口位于其中的V形粒子保持结构发送(图1C)。

对于细胞平衡和细胞扫描来说，使用了三维流动控制的概念(见图2A)。当液体高速从通道16流出进入微观流体装置的更多开放区域，并流向粒子保持结构2时，一些流体将向一旁逃离并且流体的流速减慢。因为粒子保持结构2与通道16相对，液体流动通常沿着粒子保持结构2的轮廓前行，之后在粒子保持结构2的中心分开。所以，如果左、右两侧流动相同，则在粒子保持结构2的中心存在一个零速度点(ZSP)。如两侧流动不同，则ZSP将移动。例如，在图2B中，当由于较高的电压加到右侧而使向左的侧向流动较强时，ZSP向右侧移动。更强的向左的侧向流动将ZSP进一步向右移动(见图2C-D)，直到ZSP不在位于粒子保持结构区域或者消失(见图2E)。在只有侧向流动没有试剂流动(来自通道16)的情况下，图2F描述了这种流动。同样，侧向流动相同，向右的侧向流动较强(由于较高的电压加到左侧)，或者没有试剂流动的情况分别在图2G、2H-J和2K中进行了描述。这些实际上是二维流动。本领域的技术人员应该理解，流入通道16或者侧向端口12和14的流动可以由电、压力或其它合适的装置控制。

沿着作为深度的第三维，液体流动是不均衡的。图2A的截面图(如小图(inset)所示)描述了这种情况。这里，即使来自通道16的流速为常数，沿着粒子保持结构壁的斜侧壁的流速也会逐渐降低到零。因此，ZSP实际上在斜壁(见图2A的小图)的上端。即使由于前述差动侧向流动而使ZSP移到一旁，这种情形也是有效的。

因此，这些在通道维(侧向流动和水平流动)和深度维(沿着斜侧壁向上的流动)中的液体流动实际上是三维流动。

对于细胞扫描来说，细胞是静止的并且由此保持在ZSP周围。由于差动侧向流动引起的ZSP的侧向移动造成在微观流体装置中细胞的侧向移动。因此，ZSP周期性的侧向移动导致细胞在微观流体装置中来回地扫描。

通过施加给细胞的力的平衡来获得细胞的平衡(见图2L)。首先，由于试剂流动施加的力(f)，将细胞沿着斜侧壁向上推。其次，由于细胞的残余重力(g)(减去细胞的浮力后)或沉降力和斜面对细胞的反作用力(P)，存在合力(f′)。当两个力即f和f′平衡时，细胞静止并完成粒子保持。

如果试剂流动较强，f增加，细胞保持在斜侧壁上较高的位置，见图2M-O。如果没有试剂流动，细胞根本不会沿着斜侧壁向上行进，而是停留在平的通道底部上，见图2P。

因此，试剂流动的强度并无太大关系。因为细胞的位置通过沿着斜侧壁向上移动随着流动的强度进行调整，所以试剂流动不会粉碎细胞或冲走细胞。此外，如果躺在斜侧壁上的细胞非常靠近壁顶端(在ZSP点)，则液体流速相比通道16中的将会非常慢。如果细胞距离ZSP较远，则流速将会很高。因此，高速流动可以非常快速地运载试剂和接近细胞，之后低速流动将这些试剂转递给细胞。所有这些流动控制都可以在不给细胞施加任何有害的局部力情况下得以实现。此外，斜侧壁上细胞的位置，或者细胞远离ZSP(图2M-O)的距离，显示了施加给细胞的流动的速度，并且因此允许微观流体装置的用户易于通过观察在微观流体装置中细胞的位置来调整流速。尤其当在水平方向横跨检测窗口来回扫描细胞以便检测到细胞的信号或者生物参数时，即使有细胞粘连，该粘连也将最小化，并且细胞位置将会更灵敏以帮助调整来自试剂通道或流动端口的液体流动的速率。

图3更详细地分析了细胞的受力平衡。当液体离侧壁越远时，液体流动越快(图3A)。当液体接近斜侧壁时，液体沿侧壁的形状前行并且流速减慢。这将产生施加给限定尺寸细胞的不同方向和强度的力。图3B描述了在水平方向上以角度α(0≤α≤90°)施加的力f_α。力f_α平衡了力f’_α(或者P_α和g的合力)。在特殊情况下，f’_H(或者P_H和g的合力)平衡了水平力f_H(即α＝0)。对比来看，在垂直壁的情况下(见图3C，D)，P_H和P_V分别平衡了f_H和g，并且没有对液体力的角度依赖。

图3E也表明了力f_α，P_α和g之间的关系。当α＝0，f_α和P_α分别达到f_H和P_H的最大值，见图3F。此外，f_H＝g tanβ，并且P_H＝g/cosβ，其中β(β＜90°)代表斜角。例如，如果细胞以45°的角度保持在斜侧壁上，则墙壁的反作用力不超过

，且流动引入的力不超过g。如果β＞45°，反作用力将有更大的限制；例如，如果β＞60°，墙壁的反作用力不超过2g，这对细胞仍然是一个较小的力。然而，微观流体装置的用户可以通过记录细胞在斜面上的位置和相应地调整液体流速来限制对细胞的反作用力。另一方面，如果墙壁垂直(图3C、D)，细胞就不会调整其位置，并且强的流动能够引起来自垂直墙壁的非常高的反作用力(P_H)。

值得提及的是，由于流体流动的分离，斜侧壁或者垂直侧壁中的任何一个都会产生ZSP。然而，只有斜侧壁允许调整细胞的位置以防止强流动毁坏细胞。斜侧壁实际上充当一个缓冲区。当细胞退回到ZSP点附近时，细胞可以从强流动中逃离。因此，斜侧壁对保护细胞来说是非常有效的。

在本发明的另一实施例中，发明者公开了使用本发明的微观流体装置测量细胞随时间的生物参数的方法，包括监视细胞随时间响应各种刺激的生物参数的变化，和经过一个或多个生命周期在微观流体装置中培育细胞。

本领域技术人员应理解，本发明的微观流体装置也可以用于非细胞的其它原料，如粒子，包括熔珠、病毒粒子、蛋白质、蛋白质晶体、纳米粒子和其它能够用本发明的微观流体装置进行研究的粒子。本申请中，可以将使用细胞的微观流体装置的方法应用于粒子。

能够观察和测量的生物参数包括细胞型态、细胞大小、生长率、细胞表面和细胞内的生物标志(例如钙或其它矿物质或铁、信使、蛋白质、碳水化合物或其它合适的生物标志)、基质和代谢物的流入、流出，包括有色基质、发色基质、荧光基质、辐射标记基质和代谢物、对刺激的反应、对试剂条件变化的反应，或者任何其它对观察有用的参数。

在一个实施例中，发明者开始让基质流入单个酵母细胞，并观察在几个小时的周期中响应多种刺激形成和流出的代谢物。此外，发明者研究了在多个实验中响应多种刺激的单个细胞中钙的活动。

在另一实施例中，为了在本发明的微观流体装置的实施例中监视生物活动，使用三维流动控制，从一组细胞中选择单个酵母细胞，将其保持、培养并在整个检测窗口来回扫描。

本发明的微观流体装置提供了研究细胞和进行单细胞实验的非干扰环境。在微观流体装置中，培养介质可以连续更新，并且细胞可以自由生长。实验期间，任何时候可以改变试剂的浓度，并且流动可以连续冲走排泄物或流出物。来自单细胞实验的数据能够提供关于代谢物浓度的实时变化数据。

例如，在传统溶解酶模型中，流入、流出和酶反应的运动参数一般取常数。没有单细胞生物化学实验，不可能测试细胞是否改变了运动参数或者是否具有较强的控制酶的能力。

在本发明的一个实施例中，为了使用本发明的微观流体装置研究酵母新陈代谢过程的模型，发明者选择了通常用于确定细胞生活能力⁴²的浸透性细胞荧光基质，荧光素二乙酸酯(FDA)。FDA流入酵母细胞后，细胞内的羧酸酯酶⁴³将FDA水解成荧光素，之后将其从细胞中排泄出(通过排出物)。与其它的FDA衍生物⁴⁵相比，流出物带有特别浓的FDA。通过流式细胞计^44，45进行了酵母中FDA新陈代谢的动态研究，但是这些研究不能完全显示出这种复杂的流入-水解(由酯酶)-流出过程的复杂性。

因此，发明者将FDA引入培养的、静止的或处理的单个酵母细胞中，并在由于pH值和葡萄糖的变化而受刺激时获得上述新陈代谢过程的运动参数。发明者通过测量由于在一个单个酵母细胞中形成的荧光素而产生的细胞荧光信号来实现上述过程。然后在数学模型中使用这些数据来提取Michaelis-Menten参数。

在下述讨论的一个实例中，响应一种外部刺激，酵母细胞开始新陈代谢FDA，响应另一种外部刺激，酵母细胞开始排泄荧光素。结果，发明者确定了三种模式的细胞控制，即‘自控’、‘失控’和‘死亡’来描述细胞的新陈代谢过程模式。‘自控’模式描述了能够控制酶的活动的细胞。‘失控’模式描述了不能改变酶的活动但酶仍可以活动的细胞。‘死亡’模式描述了不响应其环境的任何变化的细胞。而且，发现这些新陈代谢过程与钙的活动有关。

在本发明的另一实施例中，发明者研究了由于羧酸酯酶响应pH值或葡萄糖的刺激而产生的FDA的新陈代谢。刺激也能激活作用于其它基质的其它酶。在另一实例中，发明者测量了各种刺激时单个酵母细胞中细胞内的钙来研究钙离子的活动。

本领域的技术人员应理解，通过使用本发明的微观流体装置还能够分析其它细胞中的其它生物参数。也可以在本发明的微观流体装置中监视对其它细胞中响应其它刺激产生的其它代谢物的分析。片上单细胞实验可用于说明复杂的生物系统。

                 实例

下述实例用于说明本发明的实施例，但并不是为了限制本发明的范围。

实例1：微观流体装置

图1描述了微观流体装置和细胞选择机构的实施例的设计。玻璃微观流体装置通过加拿大微电子公司(Canadian Microelectronic Corporation)的Protochip程序制作。浮法(Borofloat)玻璃晶片用于制作通道板和上面的板(16mm×95mm)。然后，这两个玻璃板热结合在一起形成完成的芯片。图1D描述了粒子保持结构的一个实施例的布局。在该特定的实施中，使用的微观流体装置包含15μm深的通道。在该实施例中，粒子保持结构的侧壁向内精确倾斜。精确倾斜的宽壁的曲率半径应该大于细胞的直径。为了在测量细胞参数中均匀扫描细胞，中心壁部分6一般是平的。同样的微观流体装置易于清洗和再使用，并且经过了很多小时(～200h)的实验时间。

对于光学测量来说，将微观流体装置设置在具有双成像模块(Nikon)的倒置显微镜(Nikon TE 300)的平移片上，其中双成像模块耦合至CCD摄像机(JVC TKC 1380)和光电倍增管(PMT)(Photon Technology Intl，PTI)(图4)。使用该专用光学测量设备同时实现单细胞的荧光测量和光学观察。具体地，使用摄像机利用红光(＞645nm)观察细胞。任何细胞的运动连续显示在电视监视器上并由磁带录像机(JVC HR-S7500U)记录。使用氙弧灯(PTI)刺激荧光团。由于细胞内形成的荧光素而产生的绿色荧光信号不能到达摄像机，因而只能由PMT检测。来自PMT的荧光信号由使用Felix软件(PTI)的计算机记录。PMT仅仅记录在检测窗口(图1A)内的荧光信号。如果酵母细胞在窗口中，该信号代表细胞荧光加上荧光背景。如果不在窗口中，则检测到的仅仅是荧光背景。

3-维液体流动可以由电压驱动。为了产生向下的试剂流动，给通道16施加高电压(50-500V)，两个端口12和14接地。为了产生向右的侧向流动，给端口12施加高电压而端口14接地，反之亦然。

当需要高电解缓冲液时，例如在细胞培养实验中，可以使用电压控制，并且仅使用流体势(通过液体位差＜1mm)。例如，微观流体装置中，诸如培养介质这样的高导电液体被直接引入到图7中使用的细胞(细胞1，2，7中。例如，通过只在一个流体端口中增加一滴流体，就会产生流体势，并且流体因静液压力而流过微观流体装置。可选择地，可以使用流体端口12和14的泵和阀，以及通道16控制液体流动。

为了检测微观流体装置中液体流动的速度和方向，使用了聚苯乙烯熔珠(6μm直径，InSpeck^TMGreen，Molecular Probes)。选择该熔珠大小是因为其与酵母细胞的大小相同。

实例2：缓冲液的合成

在单细胞实验中，微观流体装置允许试剂流动直接传递到细胞表面。不像标准载玻片上的传统实验那样，发明者能确保试剂或缓冲液以希望的浓度实时到达细胞。将FDA存储溶液(5mg/mL in DMSO)稀释成12μM。使用该浓度的FDA是因为其在水性缓冲液中有限的可溶性。使用两种缓冲液用于稀释，它们是G7(28.5mM HEPES，256mM D-glucose，pH＝7.3)和H4(285mM HEPES，pH＝4.3)。在室温(24℃)(DMSO：二甲基亚砜；HEPES：N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N′-[2-ethanesulfonicacid])下进行实验。

实例3：酵母菌株和生长条件

酵母(囊状杀酵母素Sacchomyces cereviase)菌株(野生类(wild type)，CBY858)首先在YPD-琼脂片上培养，然后存储在冰箱内。通过在2m LYPD培养介质(2％葡萄糖，2％酵母抽提物，1％蛋白胨)中有氧培育细胞克隆进行片外细胞培养直至指数生长期(OD_600nm～0.5-1.0)。酵母细胞的大小为2-5μm。

用或不用片外预培养来进行片上细胞培养。为了开始片外预培养，从琼脂片上的群体中挑选酵母细胞，然后把它们放入2mL YPD培养介质中，室温(24℃)条件下约7000s。之后，把培养介质中的酵母细胞引入微观流体装置。使用3-维流动控制从一组细胞中选择一个芽殖细胞。然后，发明者把来自于试剂通道16的恒流中更多的培养介质提供给细胞以进行片上细胞培养。微观流体装置一直保持在室温的条件下。从玻璃瓶c流出的新鲜介质持续更新细胞。细胞继续其在微观流体装置中的芽殖过程。在直接片上培养的情况下(例如没有预培养)，将细胞群体直接引入到微观流体装置中。然后选择单个的片上酵母细胞。之后，从试剂通道传送YPD培养介质以开始如前所述的细胞培育和芽殖。通过酶、zymolase实现酵母细胞壁的移除。

实例4：微观流体装置中的流场

为了描绘微观流体装置中的3-维流动场，发明者使用了试剂液体和聚苯乙烯熔珠。发明者使用了包含FDA的溶液来描绘流动。将FDA引入微观流体装置后，FDA从通道16高速流出并且在微观流体装置中较宽的部分里慢速向一旁分散。工作在相衬模式的显微镜(图5A)记录下液体前端的运动。可以观测到，液体前端的速度在各个方向上是不同的，并且液体前端不是半圆形的。较快的侧向流动和与侧向流动垂直的较慢的流动使液体前端类似半椭圆形。如果需要，可以通过到液体前端直角的画线得到流动场线。

当液体前端不能清晰显示不同流速如何在各个位置的变化时，发明者将熔珠加入试剂通道中以直接指示流动场(图5B)。在成像中使用多次曝光以显示熔珠在其4个连续位置的路径。这之后，不仅能够看见流动场，而且能确定移动熔珠的速度。已经证明，当熔珠接近粒子保持装置时它们的行进速度会减慢。例如，在图5B中(0-1s)，熔珠以大约200μm/s的速度冲出通道16。然后熔珠(圆形围绕的)速度降低到大约60μm/s(1-2s)。这之后，在斜侧壁附近其速度大约为30μm/s(2-3s)。最后，熔珠靠近壁并因为达到力平衡而停留在斜壁上(3-4s)。同时，液体继续从试剂通道流出，并且来自该试剂通道的其它熔珠显示它们被液体流驱动的速度。熔珠(圆形围绕的)在ZSP附近的停流即使在快速试剂流动(5-8s)面前也会持续很长时间。因为左侧流体势更大，导致更大的向右的侧向流动，将熔珠保持在其附近的ZSP点向粒子保持结构的左侧转移。可以将该观测与上面讨论过的图2H比较。

实例5：粒子和细胞的选择、保持和扫描

粒子的选择、保持和扫描能够如在图.5C中的多次曝光成像中所示的那样容易地实现。在0-0.72s期间，将熔珠(圆形围绕的)从通道喷射出并移动到微观流体装置内的左侧。同时，靠近粒子保持结构的第二熔珠也移动到粒子保持结构的左侧。当发明者增加左侧流体势时，两个熔珠转变方向向右侧移动(0.72-1.68s)。同时，向下的试剂流动将第一熔珠进一步推向粒子保持结构的中心壁部分，而第二熔珠并不移动同样多。当发明者扫描他们选择的第一熔珠时，第一熔珠呈之字形向下移动到底部(1.92-2.64s)。第二熔珠因分散的流动场(2.88-3.60s)流出粒子保持结构而只有第一熔珠保持(3.84-4.56s)。当发明者为了保持熔珠(圆形围绕的)而扫描ZSP的位置时，许多其它熔珠连续冲出试剂通道，在微观流体装置中显示出流动的方向(4.80-25.20s)。这些实验证明了通过扫描ZSP的位置可以实现第一熔珠的选择、扫描和保持。最后，应注意的是，可以在粒子保持结构中将熔珠保存希望长的时间(210s)。

熔珠和细胞的平衡也可以如图6所示的那样实现。在图6A中，在粒子保持结构的中心壁部分6的中间选择熔珠(圆形围绕的)(0-1s)。通过来自试剂通道16(图示为其它熔珠1s的运动)的试剂流动实现熔珠的扫描和保持(7-32s)。图6B描述了另一个保持在靠近壁轮廓位置的熔珠(0-1s)，该熔珠因为较强的试剂流动而保持，如熔珠的多次曝光成像所跟踪的较长的路径所示。正如理论所述，较强的试剂流动将导致粒子在斜壁上较高的位置平衡(见图2M-O)，因此，看上去更接近斜壁或者壁轮廓的顶端。当试剂流动增加更多时(4-5s)，熔珠开始向弧形斜壁的更高处移动，并在更接近壁轮廓的位置平衡(14-15s)。即使在强试剂流动情况下，熔珠还是能保持很长一段时间(24-25s)。

图6C描述了通过力平衡保持的荧光酵母细胞。首先，由试剂流动将细胞向上或向着靠近壁轮廓的斜壁推进(0-8s)。其次，通过使用从左向右的较强的侧向流动调整ZSP的位置向右侧扫描细胞(10-16s)。当增加试剂流动时，细胞表现为向壁轮廓进一步向上移动(39-46s)。该实验中，酵母细胞的扫描可以持续很长一段时间(59-60s)。有时候，仅仅通过在检测窗口来回移动微观流体芯片就可实现细胞扫描，而不用转移细胞的ZSP位置。这可以通过移动安装了芯片的平移片来实现。

实例7：片上酵母细胞培养和细胞壁移除

基于3-维流动控制，细胞不仅经受到很小的流动引起的力，而且还经受力的均匀。因此，发明者认为该流动场为用于细胞的非干扰系统，这意味着细胞可以感觉到微观流体装置中的液体环境及其通常生活的环境之间的细微差别。因此，为了利用非干扰系统，发明者使用YPD培养介质在微观流体装置中培养单个酵母细胞。这里，发明者利用酵母细胞的短细胞周期进行片上细胞培养实验。

片外预培养之后，使用3-维流动控制选择单个酵母细胞(细胞1)。细胞1在微观流体装置中继续其芽殖过程，如图7A所示那样。经过大约5000s的片上细胞培养，细胞1比其子细胞大。在大约10000s时，子细胞也开始发芽。在大约15000s时，细胞1产生其第二个子细胞，而且细胞1的第一子细胞还另外繁殖其子细胞。这些过程类似于通常在片外细胞培养中的指数增长阶段。在17093s时，细胞1的子细胞和细胞1的子细胞的子细胞从微观流体装置中流出，并且选择细胞1(及其第二子细胞)用于随后的实验。

在第二个片上细胞培养实验中，不进行片外预培养而直接将酵母细胞群体引入微观流体装置中。选择片上酵母细胞(细胞2)。通过从通道16连续提供的培养介质，酵母细胞在大约7700s时开始发芽并继续生长直到17000s(图7B)。经过该实验，发明者确信微观流体装置中在3-维流动控制下的酵母细胞已经提供了用于单细胞培养的最佳条件。这些片上细胞培养实验是在室温下进行的。

发明者还尝试了利用酶(zymolyase)进行酵母细胞壁的片上移除。再次将zymolyase溶液从通道16连续引入到达选择的酵母细胞(细胞7)。将酵母细胞壁浸透并且从480s到1200s开始变暗(图7C)。这之后，酵母细胞突然崩溃并由试剂流动带走。该过程持续3.84s，如图7C(i)-(vii)中所示。在钙活动实验中，对于Ca²⁺荧光染色装载来说，细胞壁移除看来是必须的。

实例8：细胞扫描、信号检测和噪声滤除

通常，连续监视在固定检测窗口中静止的单个细胞上的荧光信号。当细胞内荧光非常强并且噪声和背景荧光非常低(即高信号噪声和信号背景比)时，这种方法是有效的。此外，假设背景在整个实验过程中不变化。在单细胞实验中，在细胞产生强荧光信号之前就应开始检测。这种情况下，细胞的低信号背景比不会从固定检测窗口中静止的细胞产生任何有用的信息。当背景较高时，这种情况更差。

利用3-维流动控制，通过固定检测窗口来回扫描细胞产生一系列代表细胞荧光信号的峰值(图8A)。当细胞移出检测窗口时，PMT测量背景荧光。当细胞进入检测窗口时，PMT测量信号和背景荧光。可见，正如峰值高度给出的那样，酵母细胞的荧光密度由于增加的FDA新陈代谢开始上升。由于噪声的原因，荧光密度只在第75s之后才能清晰可见(图8A)。因为数据收集率为50Hz并且发明者控制峰值宽度在1s到超过10s之间(即0.1～1Hz)，所以发明者在2.5-50Hz的频率范围内进行噪声滤除。在滤除了如图8A中所示的数据中的噪声后，结果显示在图8B中。噪声滤除后，尤其在25-75s期间内(图8B)，甚至峰值细胞信号都变得非常清楚。如果对固定检测窗口内静止的细胞进行测量，将会丢失这样低的信号。

如果检测窗口比细胞大，峰值高度代表整个细胞的全部荧光，而不管扫描率。如果发明者想知道细胞的荧光分布，发明者可以将检测窗口变窄。这种策略允许大的母细胞与其小的芽殖子细胞之间的区别。这在包括另一酵母细胞的实验中进行了描述，如在噪声-滤除荧光数据中所示的那样(图8C)。高峰值来自于母细胞而肩部峰值由子细胞产生。在检测窗口中来回扫描细胞产生了镜像峰值对。

在某些情况下，细胞可能粘附到弱流动中微通道的底部，不容易由细胞扫描过程移动。这种情况下，可以通过用移动扫描检测窗口代替移动细胞来进行扫描。图18描述了不同的细胞扫描方法。左侧系列图A-D显示了细胞保持结构中不同的扫描路径(箭头指示A和B中的移动细胞或者C和D中的移动检测窗口)。右侧系列图A-D显示了测量结果。当先从右向左，然后再从左向右扫描检测窗口时，与通过细胞扫描得到的结果相同，得到双峰值(见图18C)。仍然要进行背景纠正，但要基于细胞附近的背景荧光与细胞所在处的荧光相同这一假设之上。

在图18A中所示的细胞扫描中，描述为矩形框的检测窗口保持静止，扫描细胞在所示的2个位置。当细胞经过窗口时，检测到强的全部荧光并产生荧光峰值。当细胞在窗口之外时，只测量背景。酵母母细胞及其芽体产生了双峰值的形状，其中酵母母细胞的芽体具有比其母细胞具有的荧光更弱的荧光。当芽体首先进入窗口时，由于芽体产生的小的峰值首先出现，紧跟着是母细胞的较高的峰值(见图18A左侧的双峰值)。另一方面，当细胞从右侧返回左侧时，母细胞首先进入窗口中，并且较高的峰值首先出现(见图18A右侧的双峰值)。如前所述，细胞扫描期间窄窗口的使用提供了测量酵母细胞的荧光及其芽体的荧光之间的区别的方法。连续的细胞扫描过程产生一对镜像峰值。

当使用更宽的检测窗口时，将不能识别母细胞的荧光及其芽体的荧光之间的区别，这导致只有单个峰值(图18B)。由于该更宽的窗口检测母细胞及其芽体组合的荧光密度，因而峰值高度高于由窄窗口得到的双峰值的高度。当使用更宽的窗口测量较大区域时，背景也会更高。然而，如果窗口太宽，则背景增加而细胞荧光不会增加，并且在获得最好的信号背景比上没有优势。在这两种情况中，通过从总的荧光中减去背景来进行背景纠正。

当使用窄窗口用于细胞扫描时，能够调整扫描速度以显示出关于母细胞及其芽体的荧光密度之间的区别的更多细节。图19显示了以2个不同的速度扫描细胞的结果。对于左侧一组峰值，由于更高的差分电压(500V)施加到该装置两端，所以得到更快的扫描速度。相比于右侧使用更低的200V差分电压获得的一组峰值，这5个峰值彼此间隔更近，并且峰值宽度更小。图19的插图显示了仅以更低的扫描速度就可获得的关于母细胞及其芽体的荧光密度之间的区别的细节。这些结果是从具有比图18所述的细胞更小的芽体和更低的荧光密度的另一个芽殖酵母细胞获得的。

在开放的细胞保持结构中扫描的优点

在扫描过程中，检测窗口不包括细胞保持结构的壁，并且这些在相同背景荧光下的结果覆盖了整个扫描区域(图20A)。将该过程称为等-背景扫描。如果移动扫描窗，例如，为了部分地包括中心壁部分6，虽然背景仍然与整个扫描区域相等，但是因为检测到更少的试剂量，所以背景荧光更低(图20B)。为了检测背景噪声之上的弱细胞荧光信号，不变的背景也是必须的。另一方面，图20C显示了从顶端向底端扫描微观流体装置的结果，其中背景在试剂区域更高，而在芯片区域更低，导致了类谷状信号。任何细胞荧光信号将仅能置于峡谷的斜面区域上，很难识别和提取纯细胞荧光。

因此，微芯片中开放的细胞保持结构不仅提供了较宽范围大小和形状的单细胞的选择和保持，而且提供了用于等-背景扫描的空间。此外，试剂交换可以在开放区域快速发生以便在细胞周围产生均匀的背景。与此相反，如果细胞保持结构在大小和形状上与细胞相同，如图20D或图20E所示的那样，背景信号将出现峰值。背景峰值也发生在与细胞峰值相同的位置。因此，该扫描方法将会对受限的细胞保持结构的背景纠正没有用处。而且，受限的细胞保持结构产生复杂的光散射，并使细胞荧光信号的提取更加困难。由于该结构较小的尺寸，向细胞传递试剂也更加困难。

实例9：检测信号的背景纠正

在荧光测量中，当与总信号同时测量背景时纠正背景是可行的。通过细胞扫描进行这2个参数的测量。通过下述过程执行背景纠正。首先，确定因为背景荧光产生的基线。其次，通过从基线扣除背景产生信号峰值。用产生的信号峰值，创建峰值包络以便在曲线拟合中用于酶模型。

在使用不同试剂刺激细胞的单细胞实验中，由于试剂或缓冲液不同的背景荧光，背景荧光不是一个常数。图9A和9B描述了在超过8000s(或大约2h)的时间内分别逐渐增加G7和H4缓冲液的荧光密度。这种增加是由水溶液中FDA的低水解引起的。通过连续交换缓冲液G7和H4，很明显G7具有更高的荧光背景(图9C)，这可能是由于在G7缓冲液中更高的pH值上具有更高的FDA水解率。

使用细胞扫描技术，将荧光背景记录为基线，将细胞荧光记录为峰值。在不同时间点使用各种试剂的复杂实验中，荧光数据看起来很奇怪而且很难解释(图10A)。然而，却很容易分离基线(图10B)。在使用这些基线数据进行背景纠正后，获得的就仅仅是峰值信号了(图10C)。背景纠正方法使发明者能够抓住细胞真实的动态信息，这有助于数据解释。

此外，基线为发明者提供了额外的信息。发明者通过检查基线(图10B，在1，2，12，13ks处)能够知道是否成功地出现不同缓冲液的切换，如G7和H4之间。而且，发明者关掉刺激光三次(图10A-C，10-12ks)以确定光致褪色是否对细胞荧光具有任何显著的影响。如下所述，快速衰减的基线显示光致褪色效应确实影响荧光背景(图10B，10-12ks)。然而，背景纠正后，细胞显示信号没有明显降低(图10C，10-12ks)。最后，生成对提出的FDA新陈代谢模型的曲线拟合非常重要的峰值包络(图10D)。

光致褪色

发明者确定光致褪色是否对背景有影响。当使用激励辐射刺激荧光团以检测和测量其发射时，存在光致褪色。虽然在这些实验中使用氙弧灯代替高功率激光，光致褪色影响程度较低，但仍然存在。因为当激发光遮光器关闭时，没有光致褪色，而当遮光器再次打开时，光致褪色恢复，所以使用该开-关过程来研究荧光测量系统中光致褪色的影响。在该研究中，液体流动在微芯片中停止流动，并且没有来自该液体流动的包含G7缓冲液的补充FDA。因此，只能由下述的荧光素形成(来自FDA水解)和荧光素光致褪色的过程来指示测量的荧光素。

首先，如下定义光致褪色影响，

$\left(1\right)---\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dt}}={-k}_{p}c$

其中C为荧光素浓度，k_p为光致褪色率常数。

根据积分方程(1)，我们有

$\left(2\right)---\ln \frac{C_T}{C_0}={-k}_{P}T$

其中C₀和C_T分别为t＝0和t＝T时的荧光素浓度。

重新整理方程(2)，如下得到k_p，

$\left(3\right)---k_p=\frac{1}{T}\ln \frac{C_0}{C_T}$

图21A是显示了当打开和关闭激发光时荧光密度的概略图。因为在t＝0之前没有光致褪色，C₀为F₀/m，其中F₀为初始荧光密度，m代表将测量的荧光密度与荧光素浓度相关的机械因子。在0＜t＜T期间，存在光致褪色和来自FDA水解的荧光素的形成。因此，假设在0＜t＜T和T＜t＜2T期间形成相同量的荧光素，则测量的荧光素密度应该减去由于荧光素的形成而产生的量，即(F₂-F₁)。这得出C_T＝[F₁-(F₂-F₁)]/m。k_p可以与C₀和T一起由方程(3)确定。

图21B显示了在用于激发光的遮光器的打开和关闭周期(100s的间隔)期间的荧光素背景(即没有细胞)的变化。在每个打开-周期期间，由于光致褪色，荧光素降低。然而，在激励关闭100s后，由于荧光素再次形成，荧光变高，因此，由于持续进行的FDA水解，总荧光保持上升。图21B实际上是该实验在长得多的周期上的扩展区域，如图21C所示。用该数据组，计算多于100k_p的值，并绘制在图21D中。相比在0.01M的水溶液⁵⁶中报告的用于自由荧光素的值0.038s^-1而言，这导致k_p的平均值为0.00138±0.00022s^-1。

光致褪色对细胞信号的影响

为了研究光致褪色对细胞信号的影响，使用无液体流动的标准载玻片或者液体流动下的微芯片中的任何一个对酵母细胞进行实验。

在标准载玻片实验中，没有液体流动，因此任何自由荧光素没有补充地连续光致褪色。图22A显示了原始数据。数据提取后，图22B描述了背景，图22C显示了提取的细胞信号。很清楚，正如每一个激励-打开周期期间荧光密度逐渐下降所指示的那样，细胞和背景荧光素都具有光致褪色，分别见图22B和22C。在图22B中，比较了在关闭周期的起点和末端的荧光水平。从中发现，虽然荧光水平总的趋势是降低的，但有轻微的恢复。这种总的降低趋势表示缺少荧光素的补充。在关闭周期后细胞荧光素的恢复不明显，如图22C所示。而且，细胞荧光素淹没在总的降低趋势中，这可能是因为荧光素的流出引起的。因为在标准载玻片中进行的没有流动的实验中不能分离荧光素的流出及其光致褪色，发明者进行了微观流体装置流实验。有如下的发现，没有荧光素流出，也没有对细胞荧光的光致褪色。

在该微观流体装置实验中，包含FDA的缓冲液连续传输给细胞，并且荧光素的背景水平由于FDA的水解而保持增加。激励关闭周期设置3个值，即100s，200s和300s，以评估关闭时间对光致褪色的影响。图23A显示了原始数据。数据提取后，图23B描述了背景，图23C显示了提取的细胞信号。很清楚，正如荧光密度的急剧下降所示的那样(图23B)，在背景中有荧光素的光致褪色。随后，密度变得平滑，这主要是由于从流动中补充了包含FDA的缓冲液(和荧光素)引起的。在激发光关闭之后，光致褪色不再发生，并且荧光密度因FDA的水解而恢复到一个更高的值。当关闭周期更长时，荧光密度因为由FDA更长时间水解产生的更多的补充而变得更高。

如果细胞具有相同的光致褪色影响，信号在激励-打开周期期间将引起特性下降。但是关闭周期之后在峰值包络上观测不倒这样的下降，并且该系列密度的峰值(图23C中的系列峰值)保持粗略地相同。细胞内荧光素分子受限制的环境可以解释酵母细胞中这种非光致褪色得影响，其减小了光致褪色的影响⁵⁵。

实例10：FDA新陈代谢的单细胞实验

为了检查微观流体装置的实施例中的细胞，将该装置设置在倒置显微镜的平移片上，并同时进行光学观测和荧光测量。为了在微观流体装置中进行荧光密度校正，使用了聚苯乙烯熔珠(6μm直径，InSpeck^TMGreen，MolecularProbes)。通过电势或流体势中的任意一个来完成3-维液体流动控制。

用电势控制，只有低导电液体，例如G7、H4，能够传递给细胞(细胞3、4、5)。两种缓冲液是G7(28.5mM HEPES，256mM D-glucose，pH＝7.3)和H4(285mM HEPES，pH＝4.3)。这里使用12μM的FDA是合适的。用流体势(＜1mm)控制，也可以使用高导电液体，例如YPD、氯化钠(NaCL)、氯化钾(KCL)、EDTA。

使用三种酵母细胞。静止细胞是直接取自存储在冰箱内琼脂板上的细胞群体的饥饿细胞(细胞8、9、18、19、20、21、22、23、24)。芽殖细胞是片上(细胞1)或片外(细胞3、4、5、6、14、15、16、17)YPD介质中培养的健壮细胞。球芽细胞是使用如前所述的名为zymolase的酶移去细胞壁的酵母细胞(细胞7、10、11、12、13)。

为了随后的荧光测量，进行片上酵母细胞培养和粒子保持，见图11。图11A描述了粒子保持结构。图11B-G显示了如何从一组中选择酵母细胞(细胞1)和后续的该细胞的片上细胞培养。图11H-K显示了如何保持细胞1和移除其子细胞。该细胞随后用于FDA新陈代谢的实验(图12A)，稍后给出对该实验的说明。

在该实验之前，根据传统的用于测试细胞生存能力的协议⁴⁵，发明者尝试了将G7中的FDA(12μM)直接引入到培养的细胞。然而，培养的细胞(细胞3)产生非常微弱的荧光信号(图12B：0-1000s或0-1ks)。在另一细胞(细胞4)中观测到了同样的结果(见图12C，0-1ks)。对较早阶段(图12D小图，0-2ks)获得的微弱信号进行分析显示细胞对H4培育前的pH值变化有微弱的响应。相反，存储在冰箱中的细胞(这之后称为静止细胞)显示出较强的荧光信号。这些观测结果提出了一些问题。芽殖细胞或静止细胞，那个是可行的？酵母细胞中的FDA新陈代谢开始于何时？由于细胞在整体上的异质性，这些问题之前没有提及。正是从这些单细胞实验中得出的观测结果促使发明者提出这些问题。

可知，葡萄糖和pH值的变化与细胞生长和新陈代谢有很大的关系^46，47。因此，发明者在低pH值缓冲液(即H4)中培育了细胞1ks。结果发现，酵母细胞对初始的FDA新陈代谢更敏感并产生强的细胞荧光(图12B)。在图12C中，FDA新陈代谢在3ks开始，在图12D中，在2.5ks开始。在图12A中的18.5ks获得的荧光密度具有显著的增加。应注意，在数据处理中应用了背景纠正以产生结果，更详细的内容见实例9。可得出结论，FDA新陈代谢仅在低pH值培育后开始。

另一观测结果是，荧光素的流出在1.5-2ks不需任何刺激自然开始并在4ks之后完成(图12B)。在图12A(19.2ks)、图12C(4ks、7ks)和图12D(4.5ks)中也得到了荧光素自然流出这一相同的观测结果。应该注意的是，这种流出过程只有当为了检测真实的荧光素而移除细胞外荧光素时才能观测到，这在微观流体装置中在连续液体流动情况下很容易实现。

此外，一个单一细胞能够通过pH-葡萄糖刺激反复开始FDA新陈代谢(图12C)。将图12B、C和D的数据进一步应用于数学建模中，见实例13。

更多实验分别显示了pH值和葡萄糖刺激的细节。在图12E中，在YPD介质中选择片上细胞之后，开始对一个单个酵母细胞(细胞6)进行实验。首先，将在H4中的FDA引入到细胞。在周期0-0.3ks期间，细胞仅产生少量荧光信号。然而，在该H4的培育经过0.3ks后，额外的葡萄糖(G7)导致荧光信号增加(0.3ks-1ks)。YPD介质(没有FDA)的替代没有引起细胞任何巨大的变化(在1ks)。相反，荧光密度逐渐降低，这是由于来自细胞的荧光素的流出而引起的(1-2.5ks)。该过程引起了荧光素的流出并导致细胞恢复以用于随后的FDA新陈代谢研究。

FDA新陈代谢可以仅由pH刺激物刺激。在2.5ks时，在H4中再次进行培育(图12E，2.5ks-3.3ks)。这次，荧光密度开始慢慢增加。在3.3ks时，当低pH值变化到高pH值时，细胞强烈地响应单独的pH刺激(3.3ks-4ks)。为了检查单独的葡萄糖刺激的影响，在4.4ks时加入pH值为7.3的葡萄糖(G7)(图12E)。可以观测到，一个小的峰值出现在大的荧光峰值或“山峰”顶端上，这证明了细胞对葡萄糖的响应。这次，刺激是由葡萄糖单独引起的。随后，细胞自然地开始其荧光素的流出(4.1ks)。增加的没有FDA的PYD培养介质加速了荧光素的流出(4.25ks)。

继续对相同的细胞(细胞6)进行实验。在5.85ks时，当带有FDA的H4应用于细胞时，进行第三H4培育。在该期间，细胞荧光保持很低。在6.4ks时，甚至H4中的葡萄糖(G4)对细胞也没有影响。在6.7ks时，当葡萄糖溶液的pH值变化到7.3时，细胞再次受到刺激并且荧光信号从6.7ks到7.4ks连续增加。这次，没有观测到自然流出。但是在7.4ks时，虽然FDA在介质中，但PYD培养介质的增加导致了即时流出。

在对细胞(细胞6)进行10ks(或3h)的多种刺激、多次实验后，细胞的响应变得越来越微弱。10ks后对细胞进行的相同的实验显示低信号直到12ks。所有这些观测结果显示出在初始的FDA新陈代谢中pH值刺激比葡萄糖刺激提供了更大的响应。然而，葡萄糖的存在对自然荧光素的流出是必须的，而且在培养介质中的流出更强，见图12E的4.3ks和7.4ks。

在用片上培养的酵母细胞进行的FDA实验中，发明者也观测到流出开始得非常早和强(图12A，18.5ks)。应注意，在细胞的子细胞在16.7ks逃离之前，荧光信号包括母细胞、其子细胞以及子细胞的的子细胞的贡献。那之后，荧光信号仅仅显示出母细胞及其第二子细胞。所以在16.7ks之前应该减小峰值高度。

在片上细胞壁移除后，发明者还对酵母细胞进行了实验。该原生质(细胞7)也表明FDA(在H7中)一被添加，就会新陈代谢(图12F)。显然，zymolase处理不仅破坏细胞壁障碍导致FDA更有效的流入，而且产生与无葡萄糖的H4培育相同的情况。在1.3ks时，葡萄糖刺激引起即时流出。一段时间(～0.1ks)后，该细胞破裂，从而导致萤光信号消失。

下面讨论在Ca²⁺实验后对静止酵母细胞进行进一步的FDA实验(图12G、H)。

实例11：对Ca ²⁺ 的活动进行的单细胞实验

真核细胞(在改变细胞内Ca²⁺的水平中)能响应多种环境压力，包括pH值的改变和营养(即葡萄糖)的有效性^48，49。因此可以通过监视Ca²⁺离子的活动来研究这些压力因素对酵母细胞的影响。通常由象Indo-1、Fluo-3或Fluo-4⁵⁰这样的萤光探针来测量细胞内的Ca²⁺。通过酵母细胞壁障碍装载这些探针(正如它们的乙酸化甲基酯前体)又慢又困难，而且已经尝试了各种方法，例如低pH值⁴⁹或电穿孔⁵¹。

使用钙敏感的染色体Fluo-4进行钙活动实验。首先，将Fluo-4乙酸化甲基(AM)酶装载到片上(细胞10-14)或片外(细胞15-24)的酵母细胞中。随后由于细胞中AM酶的水解开始形成Fluo-4。

发明者尝试了另一种装载方法，该方法包括使用zymolase移除片上细胞壁。在细胞壁移除后，酵母细胞形成原生质。然后，把Fluo-4AM酯装载到原生质中变得更加有效。Fluo-4AM酯之后将由细胞的羧酸酯酶水解以形成Fluo-4，Fluo-4允许检测细胞内的Ca²⁺浓度。(图13A、B、C、D)。

在图13A中，在H4中培育后，原生质(细胞10)受带有Ca²⁺(10mM)的G7刺激，并且荧光信号由于Ca²⁺流入或活动而增加(0.7ks)。只要细胞浸泡在外部的Ca²⁺中，荧光密度或者细胞内Ca²⁺的水平就会保持。在3.8ks时，外部Ca²⁺的移除引起荧光密度或细胞内Ca²⁺的轻微降低。在4.3ks时，将缓冲液转换到Y(YPD培养介质包含象葡萄糖这样丰富的营养)引起荧光密度的剧烈下降。基于观测到的在前面FDA实验中存在葡萄糖情况下的荧光FDA代谢物的自然流出，发明者相信由于Fluo-4-Ca²⁺产生的荧光密度的降低是由Fluo-4的流出引起的。正如之后在说明书中描述的那样，更多证据强化了这一观点。H4的进一步培育(4.5-4.8ks)和在4.8ks时带Ca²⁺的G7的应用引起荧光密度的第二次上升，虽然低，推测是由于流出使Fluo-4持续减少引起的。

在图13B中，重复进行了Ca²⁺活动实验。当应用带外部Ca²⁺的G7时，细胞在0.2ks时(细胞11)再次产出荧光密度。在1ks时以与图13A相同的方式移除外部Ca²⁺引起荧光强度的降低。在H7中或者在H4中这种降低都会持续(1-1.8ks)。

在图13C中，当将H4转换到H7(0.2ks)，而不是图13B中从H4转换到G7时，将外部Ca²⁺应用于细胞12。因为细胞在不存在葡萄糖的情况下产生了荧光的增加，发明者相信pH值的刺激引起了Ca²⁺的活动。当转换到G7(0.8ks)时，这时作为对葡萄糖刺激的反应，细胞在高荧光密度上产生另外的增加。在1.2ks时移除外部Ca²⁺之后的荧光降低过程中，在1.5-1.7ks期间，G7中EDTA(5mM)的应用没产生额外的降低，推测是因为液体流动已经从细胞中移走了所有的外部Ca²⁺。重新应用Ca²⁺(1.7ks)不能激励另外的荧光增加。最后，在1.8ks时高浓度KCl(0.9M)的应用引起荧光信号突然降低到一个很低的水平。这是因为在高渗性KCl溶液存在的情况下，原生质(没有酵母细胞壁的保护)崩溃。

发明者还尝试了片外酵母细胞壁的移除和最亮的原生质(细胞13)的片上选择，其中最亮的原生质已经显示了在包含Ca²⁺的G7中的细胞荧光(图13D)。在5.2ks时转换到不带Ca²⁺的H4引起了之前刺激的细胞的荧光密度的降低。因为不同酵母细胞可能具有不同的细胞活性。进行该实验以通过最亮的原生质的片上选择来选择具有最大细胞活性的细胞，然后检查它对外部刺激的响应。用这种方式，能够得到细胞的最高信号-背景比，而且不需要持续的细胞扫描。然而，如果由于转换试剂使得背景荧光有任何变化，则可能仍然需要偶尔的细胞扫描。因此，将这种细胞选择技术用于随后的实验(细胞15-24)中以得到最好的信号水平。这证明了3-维流动控制用于片上单细胞实验的能力。

可以观察到，与最亮的原生质(细胞13)的响应相比，原生质(细胞10、11、12)响应pH值或葡萄糖的变化而在其中引起的Ca²⁺水平的增加不是很高。发明者怀疑在细胞壁移除过程中一些原生质的细胞膜受到损害(虽然细胞壁移除之后装载到原生质中的染料数量应该更大)。因此，发明者想尝试另外的不用移除细胞壁的染料-装载方法。在Fluo-4AM装载中，因为DMSO的毒性，其浓度通常控制在10％(v/v)以下⁵²。然而，发明者发现，为了避免杀死细胞，在DMSO中使用高浓度Fluo-4AM，只要使用较短的装载时间，甚至不用细胞壁移除也能够产生有效的装载进入酵母细胞中。[134]

在图13E中，对选择的芽殖细胞(细胞14)进行片上Fluo-4AM(1mM)装载。在该实验中，为了指示出由于试剂(Y，Fluo-4-AM/DMSO，H7，Ca²⁺/H7)的变化而产生的真实的背景荧光波动，没有进行背景校正。在0.18ks时应用外部Ca²⁺产生了荧光(见插入图)。因为荧光密度仍然不高，发明者将这归因于当使用片上装载时装载时间不能控制得太短这样的事实。因此，发明者决定进行片外装载。

随后，发明者应用片外高浓度Fluo-4AM装载，接着进行Ca²⁺培育和最亮细胞的片上选择以用于Ca²⁺活动实验(图13F-O)。在图13F中，短时间(4s)片外染料装载后，接着进行Ca²⁺培育(在G7中)和细胞的片上选择，芽殖细胞(细胞15)已经产生了非常强的荧光(0s)。因为荧光太强，以至于只能在开始时进行细胞扫描。H4、H7、G4、G7的背景与信号相比非常低而且易于纠正(0-1ks)。YPD介质具有更高的背景，所以发明者再次使用细胞扫描技术用于背景纠正(1ks之后)。在图13F中，对细胞15的第一刺激是pH值从7.3到4.3的变化(0.09ks)。该pH值刺激产生了小但明显的增加(见插入图)，该增加只能由Ca²⁺的流入解释。随后，信号稳定下降，发明者重新引入H7给细胞作为第二刺激(0.26ks)。这次芽殖细胞几乎没有任何响应。随后的葡萄糖刺激(0.42ks)确实产生了增加。总共13个刺激施加给细胞15，包括不同pH值的变化、葡萄糖、甚至氯化钠或氯化钾。芽殖细胞对很多刺激没有响应但其却在包括葡萄糖的YPD介质中产生了较强的Fluo-4的流出(1ks)。另外的荧光降低发生在应用H7-E时(2ks)，因为EDTA(5mM)能隔离Ca²⁺并降低细胞内的Ca²⁺。

在图13G中，当受各种刺激物刺激时，芽殖细胞(细胞16)具有甚至更少的荧光变化，除非当在1.4ks时移除外部Ca²⁺时。在图13H中，就像前面FDA实验中处理的那样，细胞(细胞17)首先由H4处理1000s。细胞然后在0.18ks时强烈响应葡萄糖的刺激(从H7到G7)。在0.52ks时的第二响应是在葡萄糖(G4-G7)存在的情况下当pH值从4.3变化到7.3时的纯pH刺激引起的。在0.9ks时加入YPD培养介质加速了染料的流出。

与芽殖细胞相反，只要存在外部Ca²⁺，饥饿的静止细胞对pH值或葡萄糖刺激总是具有较强的Ca²⁺响应。例如，图13I显示了外部Ca²⁺一接触到静止细胞，这些细胞(细胞18)就增加了其荧光密度(0.4ks)。在外部Ca²⁺存在的情况下，葡萄糖的存在激发了由于Ca²⁺的增加而产生的峰值(0.9ks)。没有外部Ca²⁺，pH值变化不能激发Ca²⁺峰值(1.4ks)。

图13J再次显示了当没有外部Ca²⁺时pH值和葡萄糖刺激不能导致静止细胞(细胞19)中可检测的荧光信号的变化。在图13K中，加入到静止细胞(细胞20)的EDTA导致Ca²⁺的移除并且在0.2ks时荧光降低。应注意，细胞已经用Ca²⁺(G7)进行了处理，然后选择用于实验。在重新应用外部Ca²⁺后，细胞能够恢复其对pH值/葡萄糖刺激的响应(0.7ks)。

发明者在0.1ks和1ks时对另一静止细胞(细胞21)(图13L)进行了两次葡萄糖刺激。细胞立即响应葡萄糖的刺激。在加入YPD介质后，因为fluo-4通过细胞的流出快速移除，荧光密度突然下降。可以得出结论，培养介质(YPD)产生Fluo-4的快速流出，导致细胞荧光信号的下降。这一观测结果与在FDA新陈代谢实验中荧光素的流出相同，正如在实施例10中所讨论的那样。

为了揭示关于细胞如何响应不同刺激的细节，进行了更多的实验。图13M显示了静止酵母细胞(细胞22)在存在葡萄糖(在2.1ks时对YPD培养介质)的情况下和不存在葡萄糖(0.97ks)的情况下对pH值的变化(pH值从7.3到4.3)的响应和在相同的pH值为7.3(0.21ks)时对葡萄糖的响应。

图13N显示了静止细胞(细胞23)在相同的pH值为7.3(0.1ks)时对葡萄糖变化的响应和在G7中相当长时间(4ks)的培育后对YPD培养介质(带葡萄糖)的响应。

图13O显示了另一静止细胞(细胞24)对pH值从7.3到4.3的变化(不带葡萄糖)的响应(0.15ks)、对PH值从4.3到7.3的变化(不带葡萄糖)的响应(0.4ks)、对pH值为7.3时的葡萄糖的变化的响应(0.7ks)、对pH值从7.3到4.3的变化(与葡萄糖一起)的响应(1.1ks)、在存在葡萄糖的情况下对pH值从4.3到7.3的变化的响应(1.26ks)、对pH值为7.3时的YPD培养介质(带葡萄糖)的响应(1.75ks)和对移除外部Ca²⁺的响应(2.4ks-3.1ks)。

总之，对于芽殖细胞来说，由于pH值和葡萄糖刺激引起的Ca²⁺的增加是非常弱的。例如，在图13F中，对于H7-H4(或H4-H7)的变化，荧光密度(与Ca²⁺的活动成比例)的变化为5％，而对于H7-G4的变化则为3％，但是对于其它变化是不可检测的。在图13G中，Ca²⁺的变化是根本不可检测的。

但是在H4中培育1ks后，将芽殖细胞饿死而且有更多的Ca²⁺增加(图13H：24％H7-G7，6％G7-G4，13％G4-G7，3％G7-YPD)。对于饿死的静止细胞，Ca²⁺的变化对pH值或葡萄糖刺激非常敏感(图13I：80％H7-G7)。在图13K中得到了相同的观测结果(22％H7-G7)。

显然Ca²⁺增加发生在细胞外[Ca²⁺]较高时(见图13I、J、K中代表Ca²⁺浓度的比例)。此外，相同刺激能够包括相同细胞上不止一次的Ca²⁺峰值(图13L：对于H7-G7，在0.1ks时12％，在0.9ks时18％)。

对静止细胞进行的多刺激单细胞实验(图13M、N、O)显示了更多关于响应pH值和葡萄糖刺激引起的Ca²⁺增加[H7-G7：25％(细胞22)，69％(细胞23)，14％(细胞24)；H7-H4：19％(细胞22)，27％(细胞24)；H4-H7：8％(细胞24)；G7-G4：6％(细胞24)；G4-G7：29％(细胞24)；G7-YPD：30％(细胞22)，13％(细胞23)，15％(细胞24)]。这些实验显示变化是合理的而且细胞能够对连续的多次刺激响应多次。

在所有实验中(图13F-O；细胞15-24)，荧光密度具有通常的降低趋势。发明者认为细胞在某种程度上总是具有染料流出的。实验中，通过各种刺激进行的具有可检测的荧光信号的复杂实验能够持续超过6ks(见图13N)。

显然，Ca²⁺的活动结果显示了与FDA新陈代谢结果强大的相关性。在FDA实验中，静止细胞对pH值或葡萄糖刺激具有最强烈的响应。在指数生长期中的细胞或芽殖细胞对pH值或葡萄糖刺激具有最弱的响应。然而，在H4中进行1000s的培育后，芽殖细胞对pH值或葡萄糖的刺激变得更加敏感。

Ca²⁺实验显示了相同的结果。开始FDA新陈代谢的pH值和葡萄糖刺激也能引起Ca²⁺的活动。因此，发明者总结了从图13中得到的所有Ca²⁺的结果以显示响应用于三种类型的单个酵母细胞(静止细胞、芽殖细胞和处理的芽殖细胞)的pH值、葡萄糖和培养介质的变化而产生的细胞内Ca²⁺信号的各种范围。因为只显示了相对荧光变化(百分比)，所以不必确定Ca²⁺的绝对浓度。如图14中所示，在静止细胞中Ca²⁺活动的百分比变化最大(达到25％或以上)，而在芽殖细胞中最小(5％或更低)。在H4中培育芽殖细胞1000ks后，Ca²⁺变化的百分比大于那些在没有经过H4处理的芽殖细胞中获得的Ca²⁺变化的百分比。

在所有类型的单细胞中，观察到对下面刺激响应较大的Ca²⁺变化：(1)在pH值为7时葡萄糖的增加(即H7-G7，但不是H4-G4)；(2)在葡萄糖存在的情况下pH值从4.3到7.3的变化(即G4-G7)或者没有葡萄糖时pH值从7.3到4.3的变化(即H7-H4)；(3)pH值从4.3到7.3的变化和从无葡萄糖到有葡萄糖(H4-G7)的组合刺激。因为H7-G4的变化只有很小的响应，所以在图14中没有示出。

在观察到静止细胞响应葡萄糖的刺激而使细胞内Ca²⁺具有非常强的增加后，发明者然后使用单个静止细胞进行了附加的两个FDA实验(图12G、H)。在图12G中，FDA一应用在YPD培养介质中的静止细胞(细胞8)就开始FDA新陈代谢。因为在YPD介质中存在葡萄糖，发明者在1.5ks时还观察到了自然的荧光素流出。

在图12H中，对于H7(无葡萄糖)中的静止细胞(细胞9)，FDA一应用就开始FDA新陈代谢。更重要的是，葡萄糖刺激更大程度地增加了FDA新陈代谢，并且导致在第一荧光峰值顶端上的第二峰值(图12H，3.7ks)。因为存在葡萄糖，随后在4.5ks时再次发生自然流出。当缓冲液在6.5ks交换到YPD时加速该流出过程。

实例12：与在标准载玻片上进行的实验比较

为了比较，发明者在标准载玻片上进行了一些成像实验。图15A，B描述了增加FDA后酵母细胞的荧光图像。在图15A中，大多数静止细胞能够由FDA形成荧光素并且变成荧光性的。另一方面，生长到指数生长期的酵母细胞在增加FDA后不显示任何荧光，因此发明者不会有这些芽殖细胞的图像。只有在H4中培育芽殖细胞1000s后，对细胞的FDA(G7)处理将使大多数细胞由于形成荧光素而变成荧光性的(图15B)。

图15C、D、E显示了用于Ca²⁺活动实验的酵母细胞的荧光图像。因为低浓度(10μM)的细胞渗透性Fluo-4AM不容易装载带有细胞壁的酵母细胞，所以发明者在非常短的装载时间(4s)里在DMSO中使用高浓度的Fluo-4AM(1mM)用于装载以降低DMSO的毒性。当加入外部Ca²⁺时，一些静止细胞(图15C)和芽殖细胞(图15D、E)开始因Fluo-4-Ca²⁺显示荧光。为了比较，图15F描述了荧光熔珠的图像。

在这些在显微镜载波片上进行的实验中，使用试剂的增加且只能使用一次。然而，为了动态研究必须在微观流体装置中用多种刺激对单个细胞进行连续荧光测量，而且只能通过使用3-维流动控制用于细胞处理和试剂传送。

实例13：FDA新陈代谢的数学模型

到目前为止，FDA新陈代谢和钙活动实验一直是定性的或者半定量的。为了证明单细胞测量的实用性，发明者提出了一个数学模型，用于描述FDA新陈代谢的动力学。图16I描述了带有子细胞芽体的酵母细胞的概略图，其显示了细胞外FDA的浓度(A)、细胞内FDA(B)和作为时间(t)的函数的荧光素(C)之间的关系。一些方程可以描述该动力学模型。方程(1)为细胞内FDA(B)的材料平衡。方程(2)为细胞内荧光素(C)的材料平衡。方程(1)和方程(2)是从下面讨论的第一原理得出的。

$\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dt}}=\frac{S}{V}{k}_b(A-B)-\frac{V_{m}B}{K_m+B}---\left(1\right)$

$\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dt}}=\frac{V_{m}B}{K_m+B}-\frac{S}{V}\frac{V_{e}C}{K_e+C}---\left(2\right)$

符号A：细胞外FDA(μm)；B：细胞内FDA(μm)；C：细胞内荧光素(μm)；S：细胞表面面积(μm²)；和V：细胞体积(μm³)是从细胞直径(D1，μm)及其芽体直径(D2)计算得到的；k_b：传输因子(μms^-1)；V_m(μMs^-1)和K_m(μm)：羧酸酯酶的Michaelis-Menten动力学参数；V_e(μMμms^-1)和K_e(μM)：流出过程的Michaelis-Menten动力学参数。

为了解释向上凹的荧光峰值的上升部分，发明者包括了一个另外的方程。以后将给出该方程更多的解释。

$\frac{{\mathrm{dV}}_m}{\mathrm{dt}}=k---\left(3\right)$

方程(3)代表由Michaelis-Menten参数V_m指示的羧酸酯酶活动的增加率，其中k为比率常数(μMs^-2)。

方程(1)的推导：细胞内FDA的材料平衡

如果细胞内FDA总量是T_B，那么

         T_B＝BV    (4)

其中B是细胞内FDA的浓度，V是细胞体积。

因为V在实验中是细胞的常量，则

$\frac{{\mathrm{dT}}_B}{\mathrm{dt}}=V\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dt}}---\left(5\right)$

可以由FDA的流入率(F_in)及其由于水解率(F_h)引起的损失确定，

$\frac{{\mathrm{dT}}_B}{\mathrm{dt}}=F_m-F_h---\left(6\right)$

首先，可以由下面的Fick’s第一扩散法则给出，

$F_m={-\mathrm{Sk}}_D\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dx}}---\left(7\right)$

其中S是细胞表面积，在该实验中其是细胞的一个常数；k_D是FDA通过细胞膜的扩散因子，

是FDA穿过细胞膜的浓度梯度。

因为在微观流体芯片中通过液体流动连续传送缓冲液和试剂，所以可以认为细胞外FDA浓度(A)是常量。假设为常量，那么其可以由细胞膜厚度(d_m)计算给出，

$\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dx}}=\frac{B-A}{d_m}---\left(8\right)$

结合方程(7)和(8)，我们有

$F_m={\mathrm{Sk}}_D\frac{A-B}{d_m}---\left(9\right)$

其中对酵母细胞来说为常量的d_m可以与k_D结合给出k_b，并且方程(9)变为

F_m＝Sk_b(A-B)           (10)                  [

现在，细胞内FDA的酶水解率F_h由下式给出

$F_h=V\frac{V_{m}B}{K_m+B}---\left(11\right)$

这就是Michaelis-Menten动力学模型，V_m和K_m是一般的动力学参数。结合方程(5)、(6)、(10)和(11)，我们得到方程(1)如下，

$\frac{\mathrm{VdB}}{\mathrm{dt}}={\mathrm{Sk}}_b(A-B)-V\frac{V_{m}B}{K_m+B}$

或者 $\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dt}}=\frac{S}{V}{k}_b(A-B)-V\frac{V_{m}B}{K_m+B}---\left(1\right)$

方程(2)的推导：细胞内荧光素的材料平衡

细胞中FDA的细胞内水解增加了细胞内荧光素的含量，但是荧光素由于流出过程也会损失。

以同样的方式获得方程(4)、(5)和(6)，现在我们有

$\frac{\mathrm{VdC}}{\mathrm{dt}}=F_h-F_e---\left(12\right)$

其中C是细胞内荧光素浓度，F_e是荧光素形成后的流出率。可以由第二Michaelis-Menten模型描述，

$F_e=S\frac{V_{e}C}{K_e+C}---\left(13\right)$

其中V_e和K_e是一般的动力学参数；S之前已经定义为细胞的表面积。结合方程(11)、(12)和(13)，我们得到方程(2)如下，

$V\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dt}}=V\frac{V_{m}B}{K_m+B}-S\frac{V_{e}C}{K_e+C_e}$

或者 $\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dt}}=\frac{V_{m}B}{K_m+B}-\frac{S}{V}\frac{V_{e}C}{K_e+C_e}---\left(2\right)$

通过计算机对方程(1)、(2)和(3)进行数值计算后，该模型提供了B和C的时-程(time-course)变化的产生，如图16II中给出的那样。这里，T₀、T₁和T₂分别为流入、水解和流出开始的时间。使用该模型，得到了通过实验测得的峰值高度包络C的极好拟合(图16III)。

发明者提出该模型有四个原因：(1)即使外部FDA浓度很高，细胞内FDA的新陈代谢也不总是发生。细胞仅仅在低pH培育后和一些诸如pH变化或葡萄糖变化这样的刺激后才开始FDA新陈代谢；(2)荧光素形成的速率随时间增加，如向上的曲线所示；(3)在恒定的外部FDA浓度中，因为多种刺激，细胞可以开始FDA新陈代谢很多次；(4)即使不给细胞施加刺激，细胞也会突然开始流出，即流出过程是自然的。

通常，溶液中酶的Michaelis-Menten动力学是通过使用不同基质浓度的初始速率法进行研究的。然而，因为诸如培养基流入和生成物流出这样的额外过程，细胞中酶的Michaelis-Menten动力学不能用同样的方式进行研究。因此，发明者通过监视很长一段时间内的内部生成物浓度的过程曲线进行动力学研究。

该新模型与之前提出的用于血细胞计数研究的模型⁴⁴不同。首先，在片上单细胞实验中不再需要之前模型必须的假设，因为(a)当单个细胞连续浸泡在微观流体装置中的12μM的FDA溶液中时，外部培养基浓度实际上是时变的，(b)因为流出生成物由微观流体装置中的流动连续冲走，外部生成物浓度实际上远小于内部生成物浓度，(c)与流动中多个单细胞的血细胞计数实验相比，在对单细胞进行的片上细胞实验中，细胞-细胞间在表面积和体积上的变化并不存在。

其次，V_m不是常量，因为如果V_m是常量，就不能解释为什么峰值的上升部分是向上凹的。为了解释可能是由于酶的增长量而引起的酶活动的增长率，将参数K包括进来。考虑到这些，发明者相信细胞能够努力自我控制并且发明者在模型中采用3种不同的模式来解释在单个细胞中发生的流入、水解和流出过程。将这3种方式称为“自控”、“失控”和“死亡”模式。

在自控模式中，当不允许流入时，k_b＝0。当允许流入时，显然是在装入低pH值的缓冲液之后，流入(T₀到T₁)发生在没有水解和流出的时候，即k_b＞0，V_m＝0并且V_e＝0。在水解期间(T₁到T₂)，没有流入和流出，即k_b＝0，V_m＞0并且V_e＝0。最后，在流出期间(T₂以后)，没有流入和水解，即k_b＝0，V_m＝0并且V_e＞0。在失控模式下，k_b＞0，V_m＞0并且V_e＞0。在“死亡”模式下，k_b＝0，V_m＝0并且V_e＝0。在这种情况下，当细胞内荧光素的浓度没有变化时，细胞好像死亡了。

为了描述该模型的鲁棒性(robustness)，对各种参数进行了灵敏度测试：T₂-T₁、V_m0、k和V_e(图16IV-VII)。注意V_m0是V_m的初始值。在图16IV中，参数T₂-T₁变化，这影响了流出的开始时间。在图16V中，参数V_m0变化，这影响了最初时的水解速率。在图16VI中，参数k变化，这影响了上升曲线的凹度。在图16VII中，参数V_e变化，这影响了流出的开始速率。

还对在各种刺激下的两个其它单个酵母细胞进行了曲线拟合实验，见图17。在这些实验中，发明者发现细胞荧光多次波动而且有多个最大峰值。这些观测结果引导发明者提出了酵母细胞中FDA新陈代谢的自控模式。在各种时间间隔上进行曲线拟合以获得在3种模型方程中的依靠细胞是否在自控模式还是失控模式的各种参数。例如，对于细胞5(图17A)，在间隔1-2、2-3、3-4、4-5期间，调用自控模式；在间隔5-8期间，使用失控模式。

当细胞失去控制时(即点5)，发明者就像在传统模式中那样在没有细胞外FDA变化时观察信号饱和度。此外，当移除细胞外FDA时，细胞内荧光没有下降(即点8)。因此，考虑传统模式以使其类似于该模型中的失控模式。对于细胞4(图17B)来说，在间隔11-13、13-14、14-15期间，调用自控模式；在间隔16-17期间，使用失控模式。在自控模式中，细胞外FDA的任何变化不影响荧光素流出(点12)。当细胞失去控制时(即点16)，再次观察信号饱和度。另一方面，在点17之后，细胞不响应缓冲液和细胞外FDA的任何变化，并且细胞荧光水平保持较高，因此，发明者相信细胞已经死亡。

在该模型中，发明者应用了三种不同的模式来描述使用从单细胞实验获得的数据的整个过程。因此，发明者没有使用稳态的计算。从曲线拟合获得的这些或其它细胞的各种参数列于表1中。不幸的是，这些在相同条件下的参数不能在文献中找到以用于比较。

用于使用本发明的微观流体装置的单细胞实验的3-维流动控制概念提供了在单个细胞中研究复杂生物系统的平台。实验结果揭示了使用FDA作为原型培养基对酵母细胞新陈代谢过程的细胞控制。在单细胞水平上对Ca⁺²活动进行的进一步实验提出了用FDA新陈代谢实验进行的校正。即使用传统的方式充分了解了新陈代谢的过程，用单细胞进行的实验能够揭示出进一步的信息。从FDA新陈代谢实验得到的数据已经用于酶模型的拟合并获得了相关的参数。

在这些工作中，3-维流动控制概念已经被单个酵母细胞中钙的活动和细胞内酯酶所使用以检查模型培养基的新陈代谢。然而，本发明的微观流体装置可以广泛用于研究其它生物化学过程以及其它生物实体上的细胞，例如哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、病毒和其它类型的细胞。

虽然上面讨论了很多典型的方面和实施例，但本领域的技术人员将会认识到某些更改、变化以及其增加和减少的组合。因此，认为下面附加的权利要求和之后引入的权利要求包括所有这样的更改、变化以及其增加和减少的组合，这些都在本发明的真正精神和范围之内。

本申请要求于2004年7月16日申请的、申请号为60/588317的美国临时专利申请的优先权。

               参考文献

1.P.A.Auroux，D.Lossifidis，D.R.Reyes and A.Manz，Anal.Chem.2002，74，2637-2652.

(P.A.奥罗克斯，D.洛西非迪斯，D.R.雷耶斯和A.曼札，分析化学2002，74，2637-2652.)

2.Landers，J.P.Anal.Chem.2003，75，2919.(兰德斯，J.P.分析化学2003，75，2919.)

3.M.A.Northrup，K.F.Jensen and D.J.Harrison eds.Proc.of 7th Intl.Symp.Micro TotalAnalysis System，Oct 2003，Squaw Valley，CA，USA，Transducer Research Foundation，2003.

(M.A.诺思拉普，K.F.詹森和D.J.哈里森eds.第七届国际Symp.微总分析系统学报，2003年10月，斯阔峡谷，加利福尼亚，USA，转换器研究基金会，2003.)

4.Wheeler，A.R.；Throndset，W.R.；Whelan，R.J.；Leach，A.M.；Zare，RN.；Liao，Y.H.；Farrell，K.；Manger，I.D.；Daridon，A.Anal.Chem.2003，75，3581-3586

(惠勒，A.R.；思朗塞特，W.R.；惠伦，R.J.；里奇，A.M.；塞耳，RN.；Liao，Y.H.；法雷尔，K.；梅恩杰，I.D.；戴瑞东，A.分析化学2003，75，3581-3586)

5.Fu，A.Y.；Spence，C.；Scherer，A.；Arnold，F.H.；Quake，S.R.Nature Biotechnol.1999，17，1109-1111

(傅，A.Y.；思朋斯，C.；斯科里，A.；阿诺德，F.H.；奎克，S.R.自然生物工艺学.1999，17，1109-1111)

6.Li，P.C.H.；Harrison，D.J.Anal.Chem.1997，69，1564-1568

(李，P.C.H.；哈里森，D.J.分析化学1997，69，1564-1568)

7.Voidman，J.；Gray，M.L.；Toner，M.；Schmidt，M.A.Anal.Chem.74，2002，3984-3990(沃依德曼，J.；格雷，M.L.；托纳，M.；施密特，M.A.分析化学74，2002，3984-3990)

8.Takayama，S.；Mcdonald，J.C.；Ostuni，B.；Liang，M.N.；Kenis，P.J.A.；Smagilov，R.F.；Whiteside，G.M.Proc.Nati.Acad.Sci.1999，96，5545-5548

(高山，S.；麦克唐纳，J.C.；Ostuni，B.；梁，M.N.；肯尼思，P.J.A.；斯迈吉诺夫，R.F.；怀特赛德，G.M.美国国家科学院学报1999，96，5545-5548)

9.Li，P～C.H.；Camprieu，L.；Cai.J.；Sangar，M.；Labehip 2004，4，174-180

(李，P～C.H.；凯姆瑞尔，L.；蔡.J.；桑哥，M.；Labehip 2004，4，174-180)

10.Schilling，E.A.；Kamholz，A.E.；Yager，P.；Anal.Chem.2002，74，1798-1804

(先令，E.A.；凯姆霍兹，A.E.；耶格，P.；分析化学2002，74，1798-1804)

11.Yang，M.；Li，C.W.；Yang，J.；Anal.Chern.2002，74，3991-4001

(杨，M.；李，C.W.；杨，J.；分析化学2002，74，3991-4001)

12.Fu，A.Y.；Spence，C.；Scherer，A.；Arnold，F.H.；Quake，S.R.Nat.Biotechnol.1999，17，1109-1111.

(傅，A.Y.；思朋斯，C.；斯科里，A.；阿诺德，F.H.；奎克，S.R.自然生物工艺学.1999，17，1109-1111.)

13.Lin，Y.C.；Jen，C.M.；Huang，M.Y.；Wu，C.Y.；Lin，X.Z.Sens.Actuators B.2001，79，137-143.

(林，Y.C.；金，C.M.；黄，M.Y.；吴，C.Y.；林，X.Z.传感致动器B.2001，79，137-143.)

14.Roper，M.G.；Shackman，J.G.；Dahigren G.M.；Kennedy，R.T.Anal.Cheni.2003，75，4711-4717.

(诺伯，M.G.；歇克曼，J.G.；达西伦G.M.；肯尼迪，R.T.分析化学2003，75，4711-4717.)

15.McClain，M.A.；Culbertson，C.T.；Jacobson，S.C.；Alibritton，N.L.；Sims，C.E.；Ramsey，R.M.Anal.Chem.2003，75，5646-5655.

(麦克莱恩，M.A.；卡伯特森，C.T.；杰科森，S.C.；阿利瑞通，N.L.；西姆斯，C.E.；拉姆齐，R.M.分析化学2003，75，5646-5655.)

16.Sohn，L.L.；Saleh，0.A.；Facer，G.R.；Beavis，A.J.；Allan，R.S.；Notterman，D.A.Proc.Nat.Acad Sci，2000，97，10687-10690.

(索恩，L.L.；赛拉，0.A.；菲瑟，G.R.；伯沃斯，A.J.；埃伦，R.S.；诺特曼，D.A.美国国家科学院学报，2000，97，10687-10690.)

17.Pu，A.Y.；Chou，H.；Spence，C.；Arnold，F.H.；Quake，S.R.Anal.Chem.2002，74，2451-2457

(蒲，A.Y.；周，H.；思朋斯，C.；阿诺德，F.H.；奎克，S.R.分析化学2002，74，2451-2457)

18.Salimi-Moosavi，H.；Szarka，R.；Andersson，P.；Smith，R.；Harrision，D.J.Proc.lvflcroTotal Analysis Systems‘98，Banff，Canada，Oct.1998，1998，69-72

(沙利米-穆沙夫，H.；什扎卡，R.；安德森，P.；史密思，R.；哈里森，D.1998年lvflcro总分析系统学报，班夫，加拿大，1998年10月，1998，69-72)

19.Tamaki，B.；Sato，K.；Tokeshi，M.；Sato，K.；Aihara，M.；Kitamori，T.Anal.Chem.2002，74，1560-1564

(玉置，B.；乡，K.；武，M.；乡，K.；相原，M.；北盛，T.生物化学2002，74，1560-1564)

42.Jones，K.H.；Senft，J.A.；J.Histochern.Cytochem.1985，33，77-79

(琼斯，K.H.；圣夫特，J.A.；中国组织化学与细胞化学杂志1985，33，77-79)

43.Degrassi，G.；Uotila，L.；Klima，R.；Venturi，V.Appl.Environ.Microbiol.1999，65，3470-3472

(德格雷斯G.；Uotila，L.；克利马，R.；文丘里，V.应用环境微生物学1999，65，3470-3472)

44.Wittrup，K.D.；Bailey，J.E.Biotechnol.Bioeng.1990，35，525-532

(威特拉普，K.D.；贝利，J.E.生物工艺和生物工程1990，35，525-532)

45.Breeuwer，P.；Drocourt，J.L.；Bunschoten，N.；Zwietering，M.H.；Rombouts，F.M.；Abee，T.Appi.Environ.Microbiol.1995，61，1614-1619

(布瑞威，P.；左科特，J.L.；巴恩斯科特恩，N.；直夫特林，M.H.；诺姆保特，F.M.；阿比，T.应用环境微生物学1995，61，1614-1619)

46.Palková，Z.et al.Mol.Biol.Cell.2002，13，3901-3914

(帕考夫，Z.等 分子生物细胞.2002，13，3901-3914)

47.Ramos，S.；Balbin，M.；Raposo，M.；Valle，B.；Pardo，L.A.J Gm.Microbiol.1989，135，2413-2422.

(拉莫斯，S.；伯宾，M.；拉帕索，M.；范利，B.；帕多，L.A.J Gm.Microbiol.1989，135，2413-2422.)

48.Denis，V.；Cyert，M.S.J.Cell Biol.2002，156，29-34

(丹尼丝，V.；赛俄特，M.S.细胞生物杂志2002，156，29-34)

49.Halachmi，D.；Eilam，Y.；FEBS Lett.1989，256(1-2)，55-61

(哈拉什米，D.；埃拉姆，Y.；FEBS Lett.1989，256(1-2)，55-61)

50.Gee，K.R.；Brown，K.A.；Chen，W-N.U.；Bishop-Stewart，J.；Gray，D.；Johnson，I.CellCalcium 2000，27(2)，97-106

(吉，K.R.；布朗，K.A.；陈，W-N.U.；毕晓普-斯图尔特，J.；格雷，D.；约翰逊，I.细胞钙2000，27(2)，97-106)

51.lida，H.；Yagawa，Y.；Anraku，Y.J.Biol.Chem.1990，256(22)，13391-13399

(林达，H.；Yagawa，Y.；Anraku，Y.J.生物化学1990，256(22)，13391-13399)

52.Murata，Y.；Momose，Y.；Hasegawa，M.；Iwahashi，H.；Kornatsu，Y.Chern-BioInformatics Journal 2002，2(1)，18-31

(村田，Y.；百濑，Y.；长谷川，M.；岩桥，H.；子夏，Y.化学生物信息科学杂志2002，2(1)，18-31)

53.Kell，D.B.；Mendes，P.，Technological and Medical Implications of Metabolic ControlAnalysis (ed.Cornish-Bowden，A.& Cárdenas，M.L.eds.)，Dordrecht，Kiuwer AcademicPublishers，pp.3-25.(2000)

(克尔，D.B.；门德斯，P.，新陈代谢控制的分析的技术和医学牵连(ed.康尼希-鲍顿，A.& 卡德拉斯，M.L.eds.)，多德雷赫特，Kiuwer学术出版社，3-25页(2000))

54.Arias，A.M.；Stewart，A.Cell，2003，113，8-10

(Arias，A.M.；斯图尔特，A.细胞，2003，113，8-10)

55.Song，L.；Varina，C.A.G.0.；Verhoeven，J.W.；Tanke，H.J.，Biophy.J.，1996，70，2959.

(宋，L.；温瑞纳，C.A.G.0.；温霍万，J.W.；谈克，H.J.，生物物理杂志，1996，70，2959.)

56.L.Song，；EJ.Hennink.；I.T.Young，；H.J.Tanke，Biophy.J，1995，68，2588.

(L.宋；EJ.Hennink；I.T.Young，；H.J.谈克，生物物理杂志，1995，68，2588.)

Claims (41)

1.一种微观流体装置，包括：

a.至少一个第一通道，用于将第一流体引入该装置；

b.大致V形的粒子保持结构，与第一通道间隔开，用于在其中保持粒子，该粒子保持结构具有相对的壁部分和设置在相对的壁部分之间的中心壁部分，其中该粒子保持结构大致位于第一通道的对面，并且相对的壁部分和中心壁部分具有斜侧壁，所述斜侧壁分别从相对的壁部分和中心壁部分的上部向所述微观流体装置的下部延伸；和

c.设置在第一通道和粒子保持结构之间的一个或多个流体端口，用于将第二流体引入到该微观流体装置中，和用于允许一个或多个第一流体和第二流体流出该微观流体装置。

2.根据权利要求1的微观流体装置，其中该斜侧壁向下倾斜。

3.根据权利要求1的微观流体装置，其中该斜侧壁是弯曲的。

4.根据权利要求3的微观流体装置，其中该斜侧壁是弓形地弯曲的。

5.根据权利要求4的微观流体装置，其中所述弓形地弯曲的侧壁具有两倍或更多倍于保持在微观流体装置中的粒子的宽度的曲率半径的弧。

6.根据权利要求1的微观流体装置，其中该第一或第二流体包括一个或多个粒子。

7.根据权利要求6的微观流体装置，其中该粒子选自细胞、熔珠、病毒粒子、蛋白质或纳米粒子。

8.根据权利要求7的微观流体装置，其中该粒子是细胞。

9.根据权利要求8的微观流体装置，其中该粒子是酵母细胞。

10.根据权利要求1的微观流体装置，其中该第一通道的宽度大于保持在微观流体装置中的粒子的宽度。

11.根据权利要求1的微观流体装置，其中该中心壁部分的宽度是保持在微观流体装置中的粒子的宽度的两倍或者更多倍。

12.根据权利要求1的微观流体装置，其中该粒子保持结构的高度是保持在微观流体装置中的粒子的宽度的两倍或者更多倍。

13.根据权利要求1的微观流体装置，其中该一个或多个流体端口的宽度是保持在微观流体装置中的粒子的宽度的两倍或者更多倍。

14.根据权利要求13的微观流体装置，其中该一个或多个流体端口的宽度是保持在微观流体装置中的粒子的宽度的四倍。

15.根据权利要求1的微观流体装置，其中该相对的壁部分相对于粒子保持结构的侧端部分为0～180度的角。

16.根据权利要求15的微观流体装置，其中该相对的壁部分相对于粒子保持结构的侧端部分成135度的角。

17.根据权利要求1的微观流体装置，其中第一流体通过第一通道传送，并且该第一流体形成相对粒子保持结构的零速度点。

18.根据权利要求17的微观流体装置，其中该零速度点由第二流体从该一个或多个流体端口之一的传送中的增加侧向平移。

19.根据权利要求17的微观流体装置，其中该零速度点由在该一个或多个流体端口之一中的电势或流体势的增加侧向平移。

20.根据权利要求1的微观流体装置，其中还包括用于检测保持在粒子保持结构中的粒子的检测窗口。

21.根据权利要求20的微观流体装置，其中该检测窗口接近中心壁部分。

22.根据权利要求1的微观流体装置，其中该中心壁部分包括一个或多个凹槽。

23.根据权利要求1的微观流体装置，其中该装置包括两个或更多个粒子保持结构。

24.根据权利要求1的微观流体装置，其中该装置包括两个或更多个第一通道。

25.根据权利要求1的微观流体装置，其中该装置包括两个或更多个位于粒子保持结构的相对侧面的流体端口。

26.一种微观流体装置，包括：

a.一个或多个第一通道，用于将第一流体引入该装置；

b.大致V形的粒子保持结构，与第一通道间隔开，用于在其中保持粒子，该粒子保持结构具有相对的壁部分和设置在相对的壁部分之间的中心壁部分，其中该粒子保持结构大致位于第一通道的对面，并且相对的壁部分和中心壁部分具有斜侧壁，所述斜侧壁分别从相对的壁部分和中心壁部分的上部向所述微观流体装置的下部延伸；和

c.设置在第一通道和粒子保持结构之间的流体端口，用于将第二流体引入到该微观流体装置中，和用于允许一个或多个第一流体和第二流体流出该微观流体装置。

27.一种监视、观察、测量或者记录粒子生物参数的方法，包括在根据权利要求1的微观流体装置中监视、观察、测量或者记录粒子的生物参数。

28.根据权利要求27的方法，其中所述微观流体装置包括用于检测保持在粒子保持结构中的粒子的检测窗口，该生物参数是通过微观流体装置中的检测窗口被监视、观察、测量或者记录的。

29.根据权利要求27的方法，其中还包括测量被监视、观察、测量或者记录的生物参数的背景水平并且从被监视、观察、测量或者记录的生物参数的水平中减去背景水平。

30.根据权利要求29的方法，其中测量生物参数的背景水平包括调整背景水平以用于光致褪色。

31.根据权利要求27的方法，其中该生物参数选自大小、形态、生长率、生物标记、物质流入、物质流出、粒子对一种或多种刺激的反应和粒子对细胞环境变化的反应。

32.根据权利要求31的方法，其中该物质选自由有色物质、发色物质、荧光物质、荧光标记物质和辐射标记物质构成的组。

33.根据权利要求27的方法，其中监视、观察、测量或者记录粒子生物参数包括测量荧光、颜色或辐射的水平。

34.根据权利要求27的方法，其中发生在粒子中的过程的动力学或者热力学常数是从粒子的生物参数中通过数学方法推算出的。

35.根据权利要求27的方法，其中通过微观流体装置中的检测窗口，实时以及在扩展的时间周期上监视、观察、测量或者记录生物参数。

36.一种培养细胞的方法，包括在根据权利要求1的微观流体装置中培养细胞，其中将流体连续传送到微观流体装置中以形成零速度点，并且将细胞保持在零速度点中。

37.一种用流体处理粒子的方法，包括在根据权利要求1的微观流体装置中隔离粒子，并且将流体传送到微观流体装置中以处理粒子。

38.根据权利要求27的方法，其中该粒子选自细胞、熔珠、病毒粒子、蛋白质或纳米粒子。

39.根据权利要求38的方法，其中该细胞是酵母细胞。

40.一种从一组粒子中分离粒子的方法，包括把该组粒子注入根据权利要求1的微观流体装置，通过第一通道将流体连续注入微观流体装置中以形成零速度点，和在零速度点分离粒子。

41.一种在根据权利要求1的微观流体装置中移动粒子的方法，包括在零速度点隔离粒子，和通过增加来自一个或多个流体端口之一的第二流体的传送来在微观流体装置中移动该零速度点。

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