CN101182509A

CN101182509A - 用于抗原特异性t细胞纯化的固相t细胞选择

Info

Publication number: CN101182509A
Application number: CNA2007101703216A
Authority: CN
Inventors: 李炯明
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2008-05-21
Also published as: WO2008061047A2; WO2008061047A3

Abstract

本发明涉及用于抗原特异性T细胞纯化的固相T细胞选择。本发明的方面涉及将细胞与基层结合的方法、将靶T细胞从T细胞群中除去的方法、将同种反应性T细胞从诸如骨髓或干细胞移植细胞的样品中清除的方法以及测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法。

Description

用于抗原特异性T细胞纯化的固相T细胞选择

发明领域

本发明的领域包括细胞在基层上的固定和用于抗原特异性T细胞纯化的固相T细胞选择。本发明的方面涉及将细胞与基层结合的方法、将靶T细胞从T细胞群中除去的方法、将同种反应性T细胞从骨髓移植细胞中清除的方法以及测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法。

发明背景

贴壁细胞的贴壁特性已被用于多种方法，如基于细胞的微阵列、组织工程以及分离和扩增特异细胞群的方法。通过使用细胞外基质蛋白(如胶原或纤连蛋白)或其衍生的肽以及聚合物处理诸如明胶包被的玻片的表面增强贴壁性质。这样的方法经常依赖于疏水相互作用。这类技术的主要局限性是不能将其应用延伸至非贴壁细胞例如树突状细胞或EBV转化的B细胞。另外，依赖于非共价键，相互作用能够导致细胞从基层的释放。

已开发了多种技术用于选择和扩增或除去抗原特异性T细胞。扩增特异细胞群能够增强其在诸如干细胞移植过程中的治疗免疫效果，其中患者能够得益于例如增加显示抗肿瘤效果的淋巴细胞群。同样重要的是从群中除去T细胞的方法。例如，从供体淋巴细胞中除去同种反应性T细胞以降低潜在致命的移植物抗宿主病的发生和严重性。所述方法可应用差异密度离心、磁珠或与特异肽缔合且与荧光染料结合的MHC四聚体。这些方法通常昂贵、耗时，并且效率低。经常失去抗原特异性。其它方法使用淘选的抗原提呈细胞，如单核细胞的膜层，但这些方法限于贴壁细胞，要求知晓MHC限制表位肽以选择抗原特异性细胞，并且可能要求特殊的离心机(如Elutra^TM)。

测定给定样品中抗原特异性T细胞的频率有多种方法。最常用的是流式细胞术细胞内细胞因子测定、ELISPOT测定以及MHC-四聚体测定。这些方法测定活化的抗原特异性细胞毒性T细胞的含量(即浓度)，但要求特殊的仪器，如ELISPOT读数器或流式细胞计。这些方法通常耗时和费事，并且昂贵。

过继T细胞疗法目前作为治疗人类中恶性疾病的方法被研究。对黑素瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤及白血病的临床研究显示有希望的结果。临床上其包括采集免疫学致敏的T细胞、体外活化和扩增这些淋巴细胞以及将这些细胞重新引入宿主中以造成肿瘤的消退。有多种用于刺激、分离和离体扩增效应性细胞毒性T细胞的方案，每一方案使用抗原提呈细胞、细胞因子、抗原形式和浓度以及刺激周期持续时间的不同组合。然而，有若干临床瓶颈限制其临床应用。这些包括定量的限制(不能产生足够数量的抗原特异性CD8 T细胞)和定性的限制(由于过量提供细胞因子和共刺激而产生功能障碍的细胞毒性T细胞)。

例如，在治疗鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤的临床试验中通常需要数月(4至5个月)来制造足够数量和质量的EBV特异的细胞毒性T细胞。另外，产生这些效应性T细胞的成本高得令人却步，不允许其广泛应用。

发明概述

本发明的一方面涉及将细胞与基层结合的方法。在该方法中，使基层与3-氨基丙基三乙氧基硅烷连接剂(硅烷连接剂)接触，使得硅烷连接剂与基层结合。然后，将硅烷连接剂与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪连接剂(PEG连接剂)接触，使得PEG连接剂与硅烷连接剂结合。然后将PEG连接剂与细胞在允许细胞与PEG连接剂结合的条件下接触。

本发明另一方面涉及将细胞与基层结合的另一方法。此方法中，将蛋白包被的基层与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪连接剂接触，使得连接剂与蛋白包被的基层结合。然后，将基层和连接剂与细胞在允许细胞与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪结合的条件下接触。

本领域技术人员会认识到本发明的不同实施方案中所使用的基层能够是玻璃、聚合物、金属、金属合金或任何合适的基层。另外，所述基层能够用聚合物、肽或蛋白包被，并能够成形为片、珠或其它方便的形式。

在另一实施方案中，所述基层为用例如牛血清白蛋白(BSA)或其片段的蛋白包被的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)或玻璃。

本发明的另一方面涉及将靶T细胞从T细胞群中除去的方法。在此方法中，将抗原提呈细胞与抗原接触，使得抗原提呈细胞提呈抗原。然后使用上文讨论的本发明的任何方法将抗原提呈细胞结合到基层上。将T细胞群与已与基层结合的抗原提呈细胞接触，使得对该抗原特异的T细胞与抗原提呈细胞结合。然后将对抗原非特异的T细胞洗脱。

本发明的另一方面涉及将同种反应性T细胞从诸如骨髓或干细胞移植细胞的细胞样品中清除的方法。在此方法中，使用上文讨论的本发明的任何方法将得自受体的抗原提呈细胞与基层结合。使供体细胞通过基层并与得自受体的抗原提呈细胞在允许任何对该抗原特异的供体T细胞与抗原提呈细胞结合的条件下接触。然后将非同种反应性细胞从基层洗脱。在一实施方案中，可将所述基层包含在柱或其它适当的器皿或容器中。

本发明的另一方面涉及测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法。首先，将抗原提呈细胞用例如荧光染料标记，而将T细胞用例如不同于用于标记抗原提呈细胞的荧光染料的荧光染料标记。然后，使用上文讨论的本发明的任何方法将抗原提呈细胞固定在表面上。然后将抗原提呈细胞与所关注的抗原接触，使抗原提呈细胞提呈该抗原，然后，将淋巴细胞加入到第二表面并且将两个表面装配，使得形成与抗原提呈细胞层紧密接触的淋巴细胞层。然后将装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成。然后，对形成的免疫突触进行检测和计数。通过用形成的免疫突触的总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。

在另一实施方案中，将抗原提呈细胞用例如荧光染料标记，而将T细胞用例如不同于用于标记抗原提呈细胞的荧光染料的荧光染料标记，如上文所提到的。然后将抗原提呈细胞和T细胞浓缩并混合在一起。能够形成单层细胞，这些细胞在例如玻璃载玻片上或在例如玻璃载玻片之间。然后将装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成。然后，对形成的免疫突触进行检测和计数。通过用形成的免疫突触的总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。

与以前的方法相比，本发明的方法提供数个优势。在以前的选择抗原特异性T细胞的方法中，自发贴壁在表面的细胞，如单核细胞，倾向于随时间从表面浮起，并且因此不用于选择蛋白或肿瘤细胞特异性T细胞。另外，以前的方法要求特殊的离心机用于淘选单核细胞或抗原特异性T细胞的选择仅限于当MHC限制表位肽是已知的时。另外，不自发贴壁在表面的抗原提呈细胞，如树突状细胞、EBV转化的B细胞(LCL)及其它现在能够被用于选择抗原特异性T细胞。本领域技术人员会认可，本发明的方法能够利用许多种不同的细胞，包括但不限于本文所述的那些细胞。

过继T细胞疗法目前作为治疗人类中恶性疾病的方法被研究。对黑素瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤及白血病的临床研究显示有希望的结果。临床上其包括采集免疫学致敏的T细胞、体外活化和扩增这些淋巴细胞以及将这些细胞重新引入宿主中以造成肿瘤的消退。有多种用于刺激、分离和离体扩增效应性细胞毒性T细胞的方案，每一方案使用抗原提呈细胞、细胞因子、抗原形式和浓度以及刺激周期持续时间的不同组合。然而，有若干临床瓶颈限制其临床应用。这些包括定量的限制(不能产生足够数量的抗原特异性CD8 T细胞)和定性的限制(由于过量提供细胞因子和共刺激产生功能障碍的细胞毒性T细胞)。

例如，在治疗鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤的临床试验中通常需要数月(4至5个月)来制造足够数量和质量的EBV特异的细胞毒性T细胞。另外，生产这些效应性T细胞的成本高得令人却步，不允许其广泛应用。为了克服这些障碍，我们开发了新的固相T细胞选择方法以纯化和扩增抗原特异性T细胞。在此方法中，我们实验室开发的固定剂将类淋巴母细胞细胞系(LCL)固定在固体载体的表面上，以选择并纯化T细胞。基础假设是抗原特异性T细胞识别其关联抗原(cognate antigen)，并且与其的结合快于非抗原特异性T细胞。我们的数据确实证明比非抗原特异性T细胞更优先选择抗原特异性T细胞。除去漂浮的细胞后，由于免疫突触的形成随后将抗原特异性T细胞在表面上“浓缩”。然后通过加入低剂量IL-2(20U/ml)来扩增这些活化的T细胞。选择和扩增的联合使我们能够在一周内产生纯度＞60％且总细胞＞10⁸的LCL特异性T细胞。2周内在第二轮的T细胞选择和扩增后能够达到超过90％纯度的LCL特异性T细胞。当用LCL选择T细胞时可将LMP2特异性T细胞富集至＞30％，该LCL是用LMP2表位肽冲击的。此新的T细胞纯化方法不仅容易进行，而且快速和便宜。

附图的简要说明

图1是显示通过固相T细胞选择方法进行EBV特异性T细胞纯化的示意图。

图2是显示通过固相T细胞选择方法的EBV特异性T细胞纯化的图。

图3是显示选择时间的影响的图。

图4是显示T细胞选择和扩增之后的细胞计数的柱状图。

图5是显示细胞毒性实验结果的图。

图6是显示通过固相T细胞选择方法进行LMP2特异性T细胞纯化的一般方案的示意图。

图7显示由CLG冲击的LCL选择而产生的CLG特异性T细胞溶解用CLG冲击的T2细胞系，并且对于用CMV pp64肽P_495-503冲击的T2细胞系不具有显著的杀灭。每一个点代表三次重复实验数据的平均值。

图8显示由不同选择时间产生的淋巴细胞溶解自体LCL，而当在LCL中加入MHC I类抗体(w6/32)时，没有对K562和LCL的显著百分溶解(作为代表，显示来自5分钟选择T细胞的细胞毒性数据)。每一个点代表三次重复实验数据的平均值。

图9显示由固定的LCL选择方法产生的M27L特异性T细胞识别其目标并且相对于不匹配的单核细胞偏爱溶解黑素瘤细胞。

图10显示CEA CAP1-6D特异性T细胞选择和扩增。选择前有0.2％的CAP1-6D特异性T细胞。第一次选择和扩增后，CAP1-6D特异性T细胞的频率增加至10％。第二次选择和扩增后，CAP1-6D特异性T细胞的频率增加至35％。

图11显示WT1特异性T细胞选择和扩增。选择前有0.2％的WT1特异性T细胞。第一次选择和扩增后，WT1特异性T细胞的频率增加至11％。第二次选择和扩增后，WT1特异性T细胞的频率增加至40％。

发明的详细描述

本发明涉及将细胞与基层结合的方法、将靶T细胞从T细胞群中除去的方法、将同种反应性T细胞从诸如骨髓移植细胞的样品中清除的方法以及测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法。

在一实施方案中，本发明涉及将细胞与基层结合的方法，该方法包含下述步骤：(i)提供基层；(ii)将所述基层与3-氨基丙基三乙氧基硅烷连接剂接触，使得连接剂与基层结合；(iii)将所述基层和3-氨基丙基三乙氧基硅烷连接剂与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪接触，使得2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪与3-氨基丙基三乙氧基硅烷连接剂结合；以及(iv)与细胞在允许细胞与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪结合的条件下接触。

在另一实施方案中，本发明涉及将细胞与基层结合的方法，该方法包括下列步骤：(i)提供蛋白包被的基层；(ii)将所述蛋白包被的基层与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪连接剂接触，使得所述连接剂与蛋白包被的基层结合；以及(iii)将基层和连接剂与细胞在允许细胞与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪结合的条件下接触。

基层是任何想要的在尺寸上稳定的固体，其可以由陶瓷物质、玻璃、金属、结晶材料、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合、或一种材料在另一种材料上的包被组成。例如，但不限于(半)贵金属如金或银；玻璃材料如钠玻璃、Pyrex玻璃、Vycor玻璃、石英玻璃；金属或非金属氧化物；硅、磷酸单铵盐及其它这样的结晶材料；过渡金属；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(醋酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如聚(醋酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)等。在优选实施方案中，可修饰基层以实现生物分子的固定，例如，但不限于，用金或银包被、形成有图案的表面，等等。

本发明的另一实施方案涉及将靶T细胞从T细胞群中移除的方法，所述方法包含下列步骤：(i)将抗原提呈细胞与抗原接触，使得所述抗原提呈细胞提呈抗原；(ii)使用本发明的任何方法将所述抗原提呈细胞结合到基层上；(iii)将T细胞群与已与基层结合的抗原提呈细胞接触，使得对该抗原特异的T细胞与抗原提呈细胞结合；以及(iv)将对该抗原非特异的T细胞洗脱。

本发明的另一实施方案涉及将同种反应性T细胞从移植细胞中除去的方法，所述方法包含：(i)使用本发明的任何方法将得自受体的抗原提呈细胞与基层结合；(ii)将供体细胞通过基层，由此将供体细胞与得自受体的抗原提呈细胞在允许对抗原特异的供体T细胞与抗原提呈细胞结合的条件下接触；以及(iii)将非同种反应性细胞从基层洗脱。

本发明的另一实施方案涉及测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法，所述方法包含：(i)将抗原提呈细胞(APCs)用荧光染料标记；(ii)将T细胞用不同于用于APCs的荧光染料的荧光染料标记；(iii)使用本发明的任何方法将APCs固定在表面上；(iv)将APCs与所关注的抗原接触，使APCs提呈抗原；(v)将淋巴细胞加入到第二表面；(vi)将两个表面装配，使得形成与APCs层紧密接触的淋巴细胞层；(vii)将装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成；(viii)检测形成的免疫突触的数量；以及(ix)通过用形成的免疫突触总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。或者，如上文所提到的，将抗原提呈细胞用荧光染料标记，而将T细胞用不同于用于标记抗原提呈细胞的荧光染料的荧光染料标记。然后将抗原提呈细胞和T细胞浓缩并混合在一起。能够形成单层细胞，这些细胞在两片玻璃载玻片之间。然后将装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成。然后，对形成的免疫突触进行检测和计数。通过用形成的免疫突触总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。

实施例

实施例1-将细胞固定在玻璃表面或聚对苯二甲酸乙二酯(PET)表面所需材料：

磷酸盐缓冲的盐水(PBS)pH8.5

pH2的PBS(基于pH 0-14的pH试纸用1N HCl粗调)

PBS

pH0-14的pH试纸(EM Science，cat.9590)

pH6.5-10的pH试纸(EMD Chemicals Inc，cat.9583)

活化PEG聚合物

饱和碳酸氢钠溶液

5％BSA的PBS溶液，无菌

原理：BSA会自发附着在玻璃或PET表面上。活化PEG聚合物在其每一端具有活化官能基团，其会分别连接在BSA和细胞表面蛋白上。

过程：

将3ml的5％BSA加入到100ml Pyrex烧杯中，并在室温下放置过夜。倾出BSA溶液并用PBS洗涤三次以除去非附着的BSA。

将5ml PBS加入到含有0.4克活化PEG聚合物的50ml圆锥形管中(pH会立即变为酸性)。剧烈搅拌后，将溶液加入到用BSA预处理过的100ml Pyrex烧杯中。用pH试纸监控pH以保持pH在8至9。在室温(20℃)经过15分钟后，倾出，并用PBS漂洗三次以除去残余的未反应聚合物。加入3ml PBS(pH2)。加入酸性PBS后，能够立即或在24小时后将细胞固定在表面上。

制备用于固定的细胞：如果指明，在固定前首先辐照细胞。将15×10⁶ EBV转化的B细胞(LCL)或其它类型的细胞用50ml PBS洗涤两次。将不含蛋白的细胞悬浮在2.5ml PBS(pH8.5)中，并沿内壁缓慢引入到Pyrex烧杯中。用无菌盖子盖上，在显微镜下移动进行观察。2-3分钟内不要干扰，使得细胞尽快沉淀在表面上。然后将烧杯移至细胞培养箱(37℃和5％CO₂)。30分钟后，小心摇动并倾出培养基。用10％FCS/RPMI小心洗涤3次以除去漂浮的细胞。在进一步实验之前允许固定的细胞于培养箱中在10％FCS/RPMI 1640或10％NABS/RPMI1640中恢复1小时。

结果：3.5±0.2×10⁶ LCL细胞可被固定在100ml Pyrex^Tm烧杯的表面上。当被置于细胞培养箱中时固定后24小时88±2％的这些细胞存活。

实施例2-抗原特异性T细胞选择

在75cm²培养瓶中将50ml完全培养基(CM)中的50×10⁶个外周血单核细胞(PBMC)加入到5×10⁶ LCL中，所述完全培养基由含有10％热灭活的正常AB血清的RPMI 1640培养基组成。在第7天，对这些初次激活的淋巴细胞进行计数，并用固定在固体载体表面上的LCL细胞进行选择。

固相T细胞选择过程：

第一轮选择：LCL(以8000rad辐照)被固定在100ml Pyrex烧杯表面上之后，加入3ml温CM中的浓度为25×10⁶ml^-1的初次激活的淋巴细胞(第7天)。在5、10和15分钟考查选择时间。用移液管除去非贴壁细胞。将余下的贴壁细胞用温CM小心洗涤3次，并在孵育15-30分钟后再次洗涤。24h后，通过用移液管小心搅拌而除去贴壁细胞，并将其转移至培养瓶的100ml CM和rhIL-2中(最终浓度20Um1^-1)。每2-3天加入rhIL-2。在第14天，通过流式细胞术细胞内细胞因子测定(ICC)分析培养的细胞。图1图示说明了T细胞选择的一般方案。

第二轮选择：在第14天通过5分钟选择产生的T细胞被用于第二轮T细胞选择和扩增。在第21天，通过ICC分析培养的细胞。

传统EBV特异性T细胞刺激方法

作为对照，我们还用传统刺激方法制备了多克隆EBV特异性T细胞。在培养瓶中将50×10⁶ PBMC与自体LCLs(以8000rad辐照)以10∶1的应答者/刺激质比率进行共培养。在第7天对其再次刺激，然后在第14天以4∶1的应答者/刺激质比率再次刺激。从第7天开始，然后每2-3天加入IL-2至最终浓度为20Uml^-1。在第21天，通过ICC分析培养的细胞。

结果：我们用来自3个供体的PBMC进行了T细胞选择实验，并且将某些有代表性的数据显示如下。

在第7天，通过细胞内细胞因子测定(ICC)在用LCL初次激活的淋巴细胞中测量产生IFN-γ的CD8+T细胞(供体1，平均值2％)。参见图2。随后用固定在玻璃表面上的LCL细胞(■)选择这些淋巴细胞(选择时间5分钟)，并且然后用IL-2扩增。在第14天，通过ICC在培养的细胞中测量产生IFN-γ的CD8+T细胞。然后再次用固定在玻璃表面上的LCL细胞(■)选择这些培养的细胞，并且然后用IL-2扩增。在第21天，通过ICC在培养的细胞中测量产生IFN-γ的CD8+T细胞。作为对照，相同的初次激活的淋巴细胞也用LCL刺激，而不进行两次每周一次的选择(第7天和第14天)(▲)。用IL-2扩增T细胞后，在第14天(第一次刺激后7天)和第21天(第二次刺激后7天)通过ICC测量产生IFN-γ的CD8+T细胞。

选择时间的影响参见图3。在第7天，用固定在玻璃表面上的LCL细胞选择如图2所示的相同的初次激活的淋巴细胞(供体1)。选择时间为5、10和15分钟。作为对照，也用LCL刺激这些相同的初次激活的淋巴细胞，而不以4∶1的应答者/刺激质比率进行选择。在第14天，通过细胞内细胞因子测定(ICC)测量产生IFN-γ的CD8+T细胞。

T细胞选择和扩增后的细胞计数参见图4。如图3所示的第一轮T细胞选择和扩增(供体1)7天后，通过Vi-细胞计数器对T细胞计数。

细胞毒性实验参见图5。通过固相T细胞选择方法(选择时间5分钟)产生的T细胞(供体1)能够杀灭自体LCL，但不能杀灭K562细胞系.

实施例3-LMP2特异性T细胞选择

过程：通常在PBMC被LCL初次激活之后不存在可检测的LMP2特异性T细胞。然后再次用LCL刺激初次激活的淋巴细胞，并用IL-2扩增。

LCLs(以8000rad辐照)被固定在100ml Pyrex烧杯表面后，将贴壁细胞用10-20μM选定的LMP2表位肽在37℃冲击2h。除去培养基，并将贴壁细胞在温PBS中洗涤3次。然后加入3ml温CM中的浓度为25×10⁶ml^-1的培养的淋巴细胞。选择时间为5分钟。用移液管除去非贴壁细胞。将剩余的贴壁细胞用温CM小心洗涤三次，并在孵育15-30分钟后再次洗涤。第二天，通过用移液管小心搅拌而除去贴壁细胞，并将其转移至培养瓶的100ml CM和rhIL-2中(最终浓度20Uml^-1)。每2-3天加入rhIL-2。选择后第7天，通过ICC分析培养的细胞。图6图示说明了T细胞选择的一般方案。

通过固相T细胞选择方法进行LMP2特异性T细胞纯化，参见图6。

结果：本实验中使用4种LMP2肽(均限制于HLA-A*0201)：

LLW：LLWTLVVLL

CLG：CLGGLLTMV

FLY：FLYALALLI

TVC：TVCGGIMFL

选择前LMP2特异性T细胞的频率(平均值，供体5)为：

LLW：0.8％

CLG：0.8％

FLY：0.8％

TVC：0.8％

总LMP2-特异性T细胞：3.2％

总EBV-特异性T细胞：15％

选择后LMP2特异性T细胞的频率(平均值)为：

LLW：1.5％

CLG：4％

FLY：10％

TVC：7％

总LMP2特异性T细胞：22％

总EBV-特异性T细胞：70％

实施例4-人细胞分离柱的构建

我们用这种新的活化PEG聚合物和玻璃珠构建了人细胞分离柱。用牛血清白蛋白(BSA)包被玻璃珠。然后在上文所述的条件下加入活化的PEG聚合物，使得PEG聚合物连接在BSA上。按照上文所述的条件加入LCLs使得LCLs最终结合在玻璃珠上。

这是为了在人干细胞移植中除去T细胞以治疗恶性疾病。除去T细胞的目的是减少急性GVHD(移植物抗宿主病)。目前T细胞的除去是通过珠子、光除去方法，其很昂贵并且效率低。细胞分离柱由受体抗原提呈细胞如LCL或单核细胞制成，其中这些细胞通过活化的PEG聚合物固定在玻璃珠表面。允许供体淋巴细胞流过柱。那些同种反应性T细胞(即能够识别受体抗原提呈细胞的供体T细胞)会被选择并保留在柱中。从柱中流出的细胞不能引起GVHD。该过程能够显著降低T细胞清除的成本和工作量。

实施例5-用固定的LCLs进行LMP2特异性T细胞选择

在75cm²培养瓶中将50ml培养基中的100×10⁶外周血单核细胞(HLA*A0201+)用负载有EBV LMP2肽CLGGLLTMV(CLG)的10×10⁶单核细胞活化，所述培养基由含有10％热灭活的正常AB血清的RPMI 1640培养基组成。在第7天，有0.8％的CLG特异性T细胞。

在将辐照的(80Gy)自体LCLs如实施例1所述固定之后，将其用肽CLG再次加载1小时，所述自体LCLs在固定前用2μM肽CLG冲击4小时。在细胞培养箱中将活化的淋巴细胞(90×10⁶±10在3mL培养基中，37℃)加入到固定的抗原提呈细胞中。检测了不同的选择时间(3、5、7.5、10和15分钟)。在每一选择时间的终点除去非贴壁细胞。用37℃的培养基小心洗涤剩余的贴壁细胞。在37℃孵育30分钟后重复洗涤。在载体表面，在3、5、7.5、10和15分钟选择的细胞中产生IFN-γ的细胞分别增加到10％、17％、24％、21％和19％(平均值)。然后在T细胞选择后的第二天以及之后每隔一天通过加入IL2(20u/ml)扩增所选的淋巴细胞。在第8天，在选择时间为5、7.5和15分钟的扩增的细胞中产生IFN-γ的细胞分别增加到55％、70％和65％(平均值)。在选择时间为5、7.5和15分钟的最终扩增的细胞群中分别有80×10⁶、100×10⁶和100×10⁶(平均值)个细胞。超过90％(平均值)的这些细胞群为CD3+CD8+。细胞毒性杀灭示于图7。

实施例6-用固定的LCLs进行EBV特异性T细胞选择

在75cm²培养瓶中将50ml培养基中的100×10⁶外周血单核细胞(HLA*A0201+)用10×10⁶经辐照的(80Gy)自体LCLs活化，所述培养基由含有10％热灭活的正常AB血清的RPMI 1640培养基组成。在第7天，有1.8％的EBV特异性T细胞。

将经辐照的自体LCLs如实施例1所述固定。在细胞培养箱中将活化的淋巴细胞(90×10⁶±10在3mL培养基中，37℃)加入到固定的抗原提呈细胞中。检测了不同的选择时间(1、3、5、10和15分钟)。在每一选择时间的终点除去非贴壁细胞。用37℃的培养基小心洗涤剩余的贴壁细胞。在37℃孵育30分钟后重复洗涤。在载体表面，在1、3、5、10和15分钟选择的细胞中产生IFN-γ的细胞分别为22％、44％、20％、12％和8％(平均值)。然后，在T细胞选择后的第二天以及之后每隔一天通过加入IL2(20u/ml)扩增所选的淋巴细胞。在第7天，在选择时间为3、5、10和15分钟的扩增的细胞中产生IFN-γ的细胞分别增加到80％、65％、50％和45％(平均值)。在选择时间为3、5、10和15分钟的最终扩增的细胞群中分别有30×10⁶、100×10⁶、120×10⁶和120×10⁶(平均值)个细胞。当将自体单核细胞用EBV LMP2肽LLWTLVVLL(LLW)、CLG和FLYALALLI(FLY)一起冲击并与通过选择和扩增所产生的淋巴细胞共培养时，由3、5、10和15分钟选择而产生的淋巴细胞中产生IFN-γ的细胞分别有17％、19％、9％和7％(平均值)。这里通过固相选择方法产生的淋巴细胞识别和杀灭自体LCL，但对K562没有显著的杀灭；当在LCL中加入MHC I类抗体(w6/32)时，该淋巴细胞对自体LCL也没有显著的杀灭(图8)。

实施例7-用固定的LCLs进行黑素瘤特异性T细胞选择

在75cm²培养瓶中将50ml培养基中的100×10⁶外周血单核细胞(HLA*A0201+)用负载有M27L(Melan-A 26-35变体ELAGIGILTV)的5×10⁶个经辐照的(30Gy)自体树突状细胞活化，所述培养基由含有10％热灭活的正常AB血清的RPMI 1640培养基组成。在第7天，有0.8％的M27L特异性T细胞。

在将经辐照的(80Gy)自体LCLs如实施例1所述固定之后，将其用肽M27L再次加载1小时，所述自体LCLs在固定前用10μM肽M27L冲击4小时。在细胞培养箱中将活化的淋巴细胞(90×10⁶±10在3mL培养基中，37℃)加入到固定的抗原提呈细胞中。检测了不同的选择时间(3、5、7.5和10分钟)。在每一选择时间的终点除去非贴壁细胞。用37℃的培养基小心洗涤剩余的贴壁细胞。在37℃孵育30分钟后重复洗涤。在载体表面，在3、5、7.5和10分钟选择的细胞中产生IFN-γ的细胞分别为6％、7.4％、8％和8％(平均值)。然后，在T细胞选择后的第二天以及之后每隔一天通过加入IL2(20u/ml)扩增选择了10分钟的淋巴细胞。在第7天，在设门的CD3+细胞(220×10⁶，＞90％为CD3+细胞，平均值)中产生IFN-γ的细胞为65％(平均值)。参见图9。

实施例8-用固定的LCLs进行CEA CAP1 6D特异性T细胞选择

最初将PBMCs(HLA*A0201+)用负载有CEA CAP1 6D的DCs(10μM)活化，然后通过用CEA CAP1 6D(10μM)冲击的单核细胞进行再刺激后，存在0.2％(平均值)的CAP1-6D特异性T细胞。用负载有CEA CAP1 6D(10μM)的固定的LCL进行第一次选择(10分钟选择时间)，然后用20U/ml的IL2扩增7天后，存在10⁸(平均值)细胞，其中10％(平均值)为CAP1-6D特异性T细胞(图10)。将这些淋巴细胞用负载有CEA CAP1 6D(10μM)的固定的LCL进行第二次T细胞选择(10分钟选择时间)，然后扩增7天。存在10⁸(平均值)的细胞，其中35％(平均值)为CAP1-6D特异性T细胞(图10)。

实施例9-用固定的LCLs进行WT1特异性T细胞选择

最初将PBMCs(HLA*A0201+)用负载有WT1的DCs(10μM)活化，然后通过用WT1(10μM)冲击的单核细胞进行再刺激后，存在0.2％(平均值)的WT1特异性T细胞。用负载有WT1(10μM)的固定的LCL进行第一次选择(10分钟选择时间)，然后用20U/ml的IL2扩增7天后，存在10⁸(平均值)个细胞，其中11％(平均值)为WT1特异性T细胞(图11)。将这些淋巴细胞用负载有WT1(10μM)的固定的LCL进行第二次T细胞选择(10分钟选择时间)，然后扩增7天。存在10⁸(平均值)的细胞，其中40％(平均值)为WT1特异性T细胞(图11)。

对本领域技术人员很显然能够对本发明做出各种修改或变化，而不背离本发明的精神和范围。因此本发明旨在覆盖本发明的修改和变化，条件是其落在所附权利要求及其等同的范围内。

Claims

1.将细胞与基层结合的方法，所述方法包含：

a.提供基层，

b.将所述基层与3-氨基丙基三乙氧基硅烷在允许3-氨基丙基三乙氧基硅烷与所述基层结合的条件下接触，

c.将步骤b的所述基层与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪在允许2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪与3-氨基丙基三乙氧基硅烷结合的条件下接触；以及

d.将步骤c的所述基层与细胞在允许所述细胞与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪结合的条件下接触。

2.将细胞与基层结合的方法，所述方法包括：

a.提供蛋白包被的基层，

b.将所述蛋白包被的基层与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪在允许2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪与所述蛋白包被的基层结合的条件下接触；以及

c.将步骤b的所述基层与细胞在允许细胞与2-O-4，6-二氯-s-三嗪-聚乙二醇-2-O-4，6-二氯-s-三嗪结合的条件下接触。

3.将靶T细胞从T细胞群中除去的方法，所述方法包含：

a.将抗原提呈细胞与抗原接触，使得所述抗原提呈细胞提呈抗原，

b.使用如权利要求1或2所述的方法将所述抗原提呈细胞结合到基层上，

c.将T细胞群与步骤b的与基层结合的所述抗原提呈细胞在允许对步骤a的抗原特异的T细胞与步骤b的所述抗原提呈细胞结合的条件下接触；以及

d.将对步骤a的抗原非特异的T细胞洗脱。

4.将同种反应性T细胞从样品中清除的方法，所述方法包含：

a.使用如权利要求1或2所述的方法将得自受体的抗原提呈细胞与基层结合，

b.使包含供体细胞的样品通过步骤a的所述基层，由此将所述样品与步骤a的得自受体的抗原提呈细胞在允许来自所述样品中的对步骤a的抗原特异的T细胞与步骤a的抗原提呈细胞结合的条件下接触；以及

c.将非同种反应性细胞从所述基层洗脱。

5.测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法，所述方法包含：

a.将抗原提呈细胞(APCs)用第一标记物标记，

b.将T细胞用不同于步骤a的所述第一标记物的第二标记物标记，

c.使用如权利要求1或2所述的方法将步骤a的APCs固定在第一表面上，

d.将步骤c的APCs与所关注的抗原接触，使得所述APCs提呈抗原，

e.将淋巴细胞加至第二表面，

f.将所述两个表面接触，使得步骤e的淋巴细胞的层形成为与步骤d的APCs的层紧密接触，形成装配物，

g.将步骤f的所述装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成，

h.检测形成的免疫突触的数目；以及

i.通过用形成的免疫突触总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。

6.测量样品中抗原特异性T细胞的频率的方法，所述方法包含：

a.将抗原提呈细胞(APCs)用第一标记物标记，

c.将步骤a的标记的APCs与步骤b的标记的T细胞混合，

d.将步骤c的所述混合物与第一表面接触，

e.将步骤d的所述表面用第二表面覆盖，形成装配物，

f.将步骤e的所述装配物孵育足够长的时间以允许免疫突触形成，

g.检测形成的免疫突触的数目；以及

h.通过用形成的免疫突触总数除以淋巴细胞总数来测定抗原特异性T细胞的频率。

7.如权利要求1-6所述的方法，其中所述基层选自玻璃、塑料、金属、金属合金、陶瓷或聚合物。

8.如权利要求1-6所述的方法，其中用聚合物或蛋白包被所述基层。

9.如权利要求1-6所述的方法，其中所述基层为珠子。

10.如权利要求8所述的方法，其中包被所述基层的蛋白包含BSA。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞包含抗原提呈细胞、肿瘤细胞以及被病原体感染的细胞。

12.如权利要求1-6所述的方法，其中所述细胞是非贴壁细胞。

13.如权利要求1-6所述的方法，其中所述基层是玻璃载玻片。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述抗原提呈细胞为非贴壁细胞。

15.如权利要求1-6所述的方法，其中所述基层包含聚对苯二甲酸乙二酯。

16.如权利要求1-4所述的方法，其中所述基层在柱中。

17.如权利要求3所述的方法，其中所述供体细胞包含骨髓或外周干细胞。

18.如权利要求4所述的方法，其中所述供体细胞包含骨髓或外周干细胞。

19.如权利要求5所述的方法，其中步骤a的所述第一标记物包含第一荧光染料，并且步骤b的所述第二标记物包含第二荧光染料。

20.如权利要求6所述的方法，其中步骤a的所述第一标记物包含第一荧光染料，并且步骤b的所述第二标记物包含第二荧光染料。