CN101186908A - 重组李痘病毒NIa蛋白酶对融合蛋白的体外特异切割 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了纯化的重组李痘病毒(PPV)NIa蛋白酶可以在体外对融合蛋白进行高效特异酶切的应用。本发明还公开了一种体外高效切割融合蛋白的方法，包括使用重组李痘病毒NIa蛋白酶在以下条件下切割融合蛋白：反应温度：4－30℃；盐浓度：＜300mM NaCl。另外还发明了包括重组李痘病毒NIa蛋白酶、目的基因克隆的原核表达载体、酶切缓冲液和用法说明书的试剂盒。

Description

重组李痘病毒NIa蛋白酶对融合蛋白的体外特异切割

技术领域

本发明涉及基因工程、融合蛋白表达和纯化领域。具体地，涉及重组PPV NIa蛋白酶在体外对融合蛋白进行高效特异酶切的应用，还有相关试剂盒的研发应用。

背景技术

利用融合蛋白的方式来表达目的蛋白是一种很有效的手段。目的蛋白前面的融合短肽不但有助于目的蛋白的检测和分离纯化，而且可以提高目的蛋白在不同生物反应器(原核、酵母、动物和植物)表达的可溶性。但是为了避免融合短肽对目的蛋白的活性影响，一般在纯化后要去除融合短肽。目前已经有几种途径可以切除目的蛋白前的融合短肽，其中蛋白酶在体外对融合蛋白的特异切割是常见的一种方法。蛋白酶可以识别特异的几个氨基酸并进行切割，利用它们的这种性质，在融合短肽和目的蛋白间加上蛋白酶的识别位点，纯化后将融合蛋白和蛋白酶在一定的缓冲液体系中进行温育，蛋白酶会识别特异的位点并进行酶切。最常用的商业化蛋白酶是factor Xa，thrombin，enterokinase，和tobacco etch virus(TEV)NIaprotease，但是factor Xa，thrombin，enterokinase在某些条件下会识别非特异的序列并切割，从而导致非目标产物的出现或者目的蛋白的降解，识别位点旁侧的氨基酸也可能对蛋白酶的活性存在影响。由于TEV NIa蛋白酶有很高的位点识别严谨性和酶切活性，而且对它的位点识别特异性有非常深入的研究，所以应用非常广泛。但是，野生型的TEVNIa蛋白酶在大肠杆菌表达后会自我水解，酶切活力随之大幅度降低，现在商业化应用的多为后来研究发现的TEV NIa蛋白酶突变体，这些突变体的自身水解能力大大降低，而且可以保持原来的酶切活性。而且TEV NIa蛋白酶在大肠杆菌中可溶性偏低，必须使用合适的融合短肽(如半乳糖结合蛋白)和优化的密码子才能提高它的可溶性。同时，由于TEV NIa蛋白酶至少可以识别7个酶切位点，如果融合蛋白中含有TEV NIa蛋白酶的识别位点就会导致非特异性的切割，所以寻找新的在体外可以高效特异地酶切融合蛋白的蛋白酶非常必要。

李痘病毒(plum pox virus，PPV)与烟草蚀刻病毒(tobacco ecth virus，TEV)都属于马铃薯Y病毒属(Potyviridae)。TEV和PPV的NIa蛋白酶在序列和功能上都有很大的相似性。它们的NIa蛋白酶在自身基因组中识别位点各有7个(A，B，C，D，V，E，F)，PPV NIa蛋白酶与TEV NIa蛋白酶识别序列各不相同，因此相互之间不能替代功能。关于PPV NIa蛋白酶的蛋白酶活性报道一般只在大肠杆菌系统内部进行，而且底物一般只限于PPV基因组所翻译的蛋白。应用纯化的PPV NIa蛋白酶在体外特异切割融合蛋白的研究到目前还没有报道。PPV NIa蛋白酶在大肠杆菌中可以得到大量可溶的蛋白吗？纯化的PPV NIa蛋白酶是否能持有足够的活性在体外切割融合蛋白？在什么反应条件下PPV NIa蛋白酶对融合蛋白的酶切效率最高？重组的PPV NIa蛋白酶在体外是否存在自身水解失活的现象？这些在现有技术中都未报道或解决。

发明内容

本发明的一个目的在于应用纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外对重组蛋白进行高效特异的酶切。本发明所克隆的PPV NIa蛋白酶对应的基因序列已知(GenBank accession number：M26965)，来源于李痘病毒Rankovic株系。

本发明的另一个目的在于提供了一个可用于表达目的蛋白的原核表达载体pET-sF，载体中带有融合短肽，重组PPV NIa蛋白酶识别位点

对应的核苷酸序列和多克隆位点。

本发明的另一个目的在于提供了一种高效特异切割融合蛋白的试剂盒，其中包含重组李痘病毒NIa蛋白酶，可克隆目的基因的原核表达载体pET-sF，酶切缓冲液和用法说明书。

本发明的一个目的在于提供了可以在体外室温条件下保持不降解状态长达5天以上的重组PPV NIa蛋白酶。

本发明的一个目的在于检测了温度对于纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外酶切融合蛋白的活性影响。

本发明的一个目的在于检测了盐浓度对于纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外酶切融合蛋白的活性影响。

本发明的一个目的在于检测了蛋白酶抑制剂对于纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外酶切融合蛋白的活性影响。

本发明的一个目的在于检测了变性剂对于纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外酶切融合蛋白的活性影响。

本发明的一个目的在于检测了去垢剂对于纯化的重组PPV NIa蛋白酶在体外酶切融合蛋白的活性影响。

本发明的技术方案如下：

利用PCR技术获得PPV NIa蛋白酶对应的核苷酸，通过DNA重组技术将此序列克隆在原核表达载体pET-32a(+)中。利用PCR技术获得GFP基因对应的核苷酸列，通过DNA重组技术并将此序列克隆在原核表达载体pET-32a(+)中，并将人工合成的PPV NIa蛋白酶识别位点F所对应的核苷酸接头通过DNA重组技术克隆在GFP基因的5′端。利用PCR技术获得SARS-CoVN基因对应的核苷酸，通过DNA重组技术并将此序列克隆在原核表达载体pET-32a(+)中，并将人工合成的PPV NIa蛋白酶识别位点F所对应的核苷酸接头通过DNA重组技术克隆在SARS-CoV N基因的5′端。pET-32a(+)载体的N-端提供了Trx(硫氧化蛋白)tag，6×His(组氨酸)tag，S tag，C-端提供了6×His tag来简化目的蛋白的表达和纯化。

上述所得到的重组质粒分别通过热激法转化入大肠杆菌(BL21Ai株系)中，并在大肠杆菌中分别表达和纯化重组的PPV NIa蛋白酶、重组的GFP蛋白和重组的SARS-CoV N蛋白，得到大量表达及纯化的重组PPVNIa蛋白酶和重组底物。其中，纯化的重组PPV NIa蛋白酶大小为47kDa，产量为20毫克/升；重组的GFP蛋白大小为45kDa，产量分别为80毫克/升；重组的SARS-CoV N蛋白大小为64kDa，产量为30毫克/升，纯度均在90％以上。

在体外分别检测重组的PPV NIa蛋白酶对重组的GFP蛋白和重组的SARS-CoV N蛋白的酶切特异性和酶切效率。结果表明重组PPV NIa蛋白酶可以在30℃，2小时内特异酶切50倍质量比的底物，酶切效率大于80％；重组PPV NIa蛋白酶可以在30℃，10小时内特异酶切100倍质量比的底物，酶切效率大于95％，而且没有非特异副产物的出现。

本发明进一步对影响重组PPV NIa蛋白酶的酶切活性的可能因素(温度、盐浓度、蛋白酶抑制剂、变性剂和去垢剂)做详细分析。结果表明，重组PPV NIa蛋白酶的最佳酶切温度为30℃；盐浓度(＜300mM)对酶切活性影响不大；工作浓度的蛋白抑制剂(苯甲脒、胃蛋白酶抑制剂、抑肽酶、亮肽素、抗木瓜蛋白酶、乙二胺四乙酸)对重组PPV NIa蛋白酶的酶切活性几乎没有影响；重组PPV NIa蛋白酶可以耐受1M尿素，2％(v/v)TritonX-100，但是重组PPVNIa蛋白酶对0.05％(w/v)SDS敏感。

最后，检测重组的PPV NIa蛋白酶在体外的自我降解可能性。结果表明重组PPV NIa蛋白酶在20℃至少保持120小时不降解的状态。

有益效果

本发明首次应用了重组PPV NIa蛋白酶在体外高效特异切割融合蛋白的应用。由于现有商业化蛋白酶的非特异性或者位点局限性，寻找新的对融合蛋白可以高效特异酶切的蛋白酶十分重要。本发明满足了这一市场要求，而且优化了PPV NIa蛋白酶的酶切条件。本发明提供的重组PPV NIa蛋白酶在体外可以保持不降解状态达5天，这对于融合蛋白的长时间酶切非常重要。本发明还提供了一个包括重组PPV NIa蛋白酶和用于目的基因克隆的原核表达载体pET-sF在内的完整试剂盒，为从目的基因克隆到纯化提供了有力的工具。

附图说明

图1为重组PPV NIa蛋白酶和重组底物表达载体图式。其中，pET-P质粒代表含有重组PPV NIa蛋白酶对应的核苷酸序列的原核表达质粒，pET-sG/pET-sN代表了含有GFP/SARS-CoV N蛋白对应的核苷酸序列和重组PPV NIa蛋白酶识别位点F对应的核苷酸序列的原核表达质粒。

图2为重组PPV NIa蛋白酶的表达及纯化。泳道1：Fermentas公司的预染蛋白Marker(PagsRuler^TM Prestained protein ladder，目录号为SM0671)，蛋白条带大小在图右边标出；-：诱导前；+：诱导后；FS：裂解后上清；FP：裂解后沉淀；E1：100mM咪唑竞争洗脱液；E2：250mM咪唑竞争洗脱液；E3：500mM咪唑竞争洗脱液。重组的PPV NIa蛋白酶在图中表示为rProtease。

图3为重组的GFP和SARS-CoV N蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化。其中

图(A)重组的GFP蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化。泳道1：Fermentas公司的预染蛋白Marker(PagsRuler^TM Prestained protein ladder，目录号为SM0671)，蛋白条带大小在图右边标出；-：诱导前；+：诱导后；FS：裂解后上清；FP：裂解后沉淀；E1：100mM咪唑竞争洗脱液；E2：250mM咪唑竞争洗脱液；E3：500mM咪唑竞争洗脱液。重组的GFP蛋白表示为sG。

图(B)重组的SARS-CoV N蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化。泳道1：Fermentas公司的预染蛋白Marker(PagsRuler^TM Prestained protein ladder，目录号为SM0671)，蛋白条带大小在图右边标出；-：诱导前；+：诱导后；FS：裂解后上清；FP：裂解后沉淀；E1：100mM咪唑竞争洗脱液；E2：250mM咪唑竞争洗脱液；E3：500mM咪唑竞争洗脱液。重组的SARS-CoV N蛋白表示为sN。

图4为重组PPV NIa蛋白酶对重组GFP和SARS-CoV N蛋白的特异酶切。其中

sG部分：泳道1：50μg重组GFP蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系，30℃条件下温育5分钟；泳道2：50μg重组GFP蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系，30℃条件下2小时；泳道3：100μg重组GFP蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在100μl反应体系，30℃条件下10小时。

sN部分：泳道1：50μg重组SARS-CoV N蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系，30℃条件下温育5分钟；泳道2：50μg重组SARS-CoV N蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系，30℃条件下2小时；泳道3：100μg重组SARS-CoV N蛋白与1μg重组PPV NIa蛋白酶在100μl反应体系，30℃条件下10小时。

GFP和N分别代表重组GFP和SARS-CoV N蛋白被酶切后的产物。

图5为温度，盐浓度，蛋白酶抑制剂，变性剂和去垢剂对重组PPV NIa蛋白酶的影响分析。其中

图(A)温度对重组PPV NIa蛋白酶的酶切活性的影响。50μg sG与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系温育，反应温度分别是4℃、20℃、30℃和40℃，在不同的反应时间(5、20、30、40、60、120、240和600分钟)取样分析。

图(B)盐浓度对重组PPV NIa蛋白酶的酶切活性的影响。50μg sG与1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl反应体系反应，30℃温育，并在反应体系添加NaCl。NaCl终浓度为50mM、100mM、200mM、300mM和500mM。在不同的反应时间(5、30、60、120、240、和360分钟)取样分析。

图(C)蛋白酶抑制剂对重组PPV NIa蛋白酶酶切活力的影响。1μg重组PPV NIa蛋白酶与50μg sG在50μl反应体系，30℃，温育2小时，并在反应体系添加以下的蛋白酶抑制剂。PMSF：苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride)；Benz：苯甲脒(Benzamidine)；Pep.A：胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A)；Apro：抑肽酶(Aprotinin-dihydrochloride)；Leu：亮肽素(Leupeptin)；Anti：抗木瓜蛋白酶(Antipain)；EDTA：乙二胺四乙酸(EDTA-Na₂)。没有添加蛋白酶抑制剂的反应物作为正对照。

图(D)去垢剂和变性剂对重组PPV NIa蛋白酶的影响。1μg重组PPVNIa蛋白酶与85μg sG在50μl反应体系，30℃，温育3小时，并添加不同的化合物：0.05％(w/v)SDS；1M-2M尿素；1％-2％(v/v)Trion-X100。未切割的底物作为负对照；没有添加以上化合物的反应体系作为正对照。

图6重组PPV NIa蛋白酶的稳定性。将1μg重组PPV NIa蛋白酶于15μl反应缓冲液中温育，温度为20℃或者4℃。在不同的时间点(0、12、24、48、120小时)取样，监测重组PPV NIa蛋白酶的降解情况。

图7本发明构建的载体pET-sF。该载体由pET-sG改造而来，载体骨架为pET-32a(+)^TM。此载体提供了Trx·Tag^TM，Stag^TM，6×His tag^TM融合短肽序列以及PPV NIa蛋白酶识别位点F的序列。该质粒是氨苄青霉素抗性的。在图中显示了pET-sF的序列标志，其中：

T7启动子                      5121-5137

T7转录起点                                5138

Trx·Tag编码序列                          5209-5535

His·Tag编码序列                          5557-5574

S·Tag编码序列                            5608-5652

PPV NIa位点F                              5668-5688

多克隆位点(PstI-XhoI)                     5701-5755

His·Tag编码序列                          5760-5777

T7终止子                                  5844-5891

包含本发明构建的载体pET-sF的大肠杆菌于2007年10月26日在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保存，保藏号为2233。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

本发明实施例中所用原料及试验试剂的来源：

(1)含有PPV NIa蛋白酶cDNA(GenBank accession number：M26965)的质粒pGGNIa购自西班牙Juan Antonio Garcia实验室(Centro Nacionalde Biotecnología-CSIC，Campus Universidad Autónoma de Madrid，28049Madrid，Spain.)。

(2)含有SARS-CoV N蛋白cDNA(GenBank accession number：AY278741)的质粒购自西班牙Lius Enjuans实验室(Centro Nacional deBiotecnología-CSIC，Campus Universidad Autónoma de Madrid，28049Madrid，Spain.)。

(3)pEGFP-N2质粒为Clontech公司产品。

(4)pET-32a(+)原核表达载体为Novagen公司产品。

(5)预染蛋白Marker为Fermentas公司的PagsRuler^TM Prestained proteinladder，目录号为SM0671。

(6)TAKARA Ex Taq^TM DNA聚合酶为TAKARA公司产品，目录号为DRR100A。

(7)本发明所使用的限制性内切酶都为Fermentas公司产品。

(8)胶回收(小量)试剂盒和PCR产物(小量)纯化试剂盒为Axygen公司产品。

(9)Ni-NTA琼脂糖为Qiagen公司产品，目录号为30210。

(10)超滤膜Amicon Ultra-15membrane为Millipore公司产品。

(11)蛋白条带定量分析软件ImageQuant TL v2005为GE公司产品。

(12)扫描仪Uniscan C1080scanner为清华紫光公司产品。

(13)蛋白浓度测定试剂盒为中国碧云天生物技术公司产品。

(14)考马斯亮蓝R-250为Sigma公司产品。

(15)大肠杆菌感受态(XL1-Blue株系)为Stratagene公司产品。

(16)其它化学试剂均为北京化学试剂厂产品。

实施例1重组的PPV NIa蛋白酶的克隆、表达以及纯化。

PPV NIa蛋白包括两个结构域：N-端的VPg结构域和C-端的蛋白酶结构域，全长1308个核苷酸，编码436个氨基酸。其中VPg区域长579个核苷酸，编码193个氨基酸；NIa蛋白酶区域长729个核苷酸，编码243个氨基酸。本发明只针对于蛋白酶区域。质粒pGGNIa包含李痘病毒(Rankovic株系)的cDNA序列，购自西班牙Juan Antonio Garcia实验室。利用PCR技术，用引物对(正向5′CAgagctcAGTAAATCACTGTTCAGAGG 3′；反向5′CTaagcttGTGAGTGTAAACAAA TTCCC 3′)从pGGNIa质粒模板中扩增了PPV NIa蛋白酶对应的cDNA序列，PCR反应体系和反应条件见附录(下同)。PCR产物和pET-32a(+)载体分别用SacI-HindIII进行酶切，酶切反应体系和反应条件见附录(下同)，回收连接，转化到大肠杆菌感受态(XL1-Blue株系)中，得到的阳性克隆经酶切图谱分析和测序确认。含有PPV NIa蛋白酶cDNA序列的原核表达载体被命名为pET-P。将pET-P转化入大肠杆菌感受态(BL21Ai株系)中，用于蛋白表达。

挑取带有pET-P质粒的大肠杆菌(BL21Ai株系)的单克隆在添加氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体中培养，培养条件为37℃，200rpm，过夜。过夜后的细胞培养液稀释到250ml LB液体中使O.D._600nm为0.1，培养温度降至18℃。当培养液O.D._600nm为0.5时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.1％，1小时后，加入IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.25mM，诱导12到16小时。诱导结束后，4000rpm离心15分钟，收集菌体，然后用PBS洗1-2次，保存于-20℃。第二天，细胞沉淀用预冷的裂解溶液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0)悬浮，加入蛋白酶抑制剂(1mMPMSF，1mg/mL Benzamidine，2μg/mL Aprotinin，1μM Pepstatin A)，然后用French Press进行细胞破碎。细胞破碎后在12,000rpm，4℃离心45分钟，取上清。pET-32a(+)载体在PPV NIa蛋白酶的N-端提供了融合短肽(Trxtag，S tag和6×His tag)，因此可以通过Ni-NTA琼脂糖(Cat.No.30210，Qiagen)进行分离。组氨酸(histidine)可以跟Ni离子结合，从而使融合蛋白结合在琼脂糖上，然后用咪唑(100mM-500mM)竞争组氨酸对Ni离子的结合，从而使融合蛋白洗脱出来。洗脱出来的蛋白通过超滤方法浓缩去盐(Amicon Ultra-15membrane，Millipore)。纯化后的PPV NIa蛋白酶悬浮于15％的甘油，使终浓度为1mg/ml，存放于-80℃。用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以已知浓度的BSA作为标准品(碧云天)。pET-P载体在大肠杆菌中受IPTG诱导后表达，可以在图2“+”泳道中看到重组PPV NIa蛋白酶的诱导表达，细胞裂解后重组PPV NIa蛋白酶大部分处于裂解上清液中，说明重组PPV NIa蛋白酶大部分是可溶的。通过Ni离子亲和层析纯化后只有47kDa的单一条带，而且没有明显的降解，1L的LB培养基可以纯化得到20mg可溶的重组PPV NIa蛋白酶。

实施例2重组的GFP蛋白和重组SARS-CoV N蛋白的克隆、表达和纯化。

本发明所应用的SARS-CoV属于Urbani株系(GenBank Accessionnumber：AY278741)，含有SARS-CoV N蛋白对应的cDNA序列的BAC载体购自Luis Enjuanes实验室。SARS-CoV N蛋白对应的核苷酸为1269个核苷酸，编码423个氨基酸，蛋白分子量为46,000道尔顿(kDa)。扩增SARS-CoV N基因所使用的PCR引物对为：正向5′AAgcatgcgtcgacATGTCTGATAATGGACC 3′；反向5′ATacgcgtTTATGCCTGAGTTGAATC 3′，此扩增产物在5′带有SphI和SalI的酶切位点，3′端带有MluI酶切位点。扩增产物直接连接到pGEM-T(Promega)载体中，得到的载体命名为pGEM-T-N。含有PPV NIa蛋白酶识别位点F的寡聚核苷酸接头由两条互补链复性而得到，正义链为：5′CGGTACCAACGTTGTTGTGCACCAAGCTGACGAACTGCAGCCATGGC3′；反义链为：5′TCGAGCCATGGCTGCAGTTCGTCAGCTTGGTGCACAACAACGTTGGTACCGCATG 3′。复性反应为：将合成的寡聚核苷酸用去离子水溶解，分别取5-10μg的正义链和反义链寡聚核苷酸混合，加入NaCl至终浓度为50mM，置于装有0.5L沸水的烧杯中加热10秒钟，然后烧杯置于室温中逐渐冷却。取1-2μl复性产物与经过SphI-SalI酶切并回收的pGEM-T-N载体连接，从而产生了pGEM-T-sN载体。pGEM-T-sN和pET-32a(+)作为片段和载体进行了KpnI-SalI酶切，连接，转化，产生了用于表达重组SARS-CoVN蛋白的原核表达载体pET-sN。GFP基因片段从pEGFP-N2质粒(Clontech)扩增而来，使用的引物对为：正向5′AGccatgggagctcATGGGTAAGGGAGAAGAACTT 3′；反向5′GGactagtgagctcTTATTTG TATAGTTCATCCAT 3′。此GFP基因编码的蛋白为28kDa。PCR扩增产物的5′端分别加上了NcoI和SacI酶切位点，3′端加上了SacI和SpeI酶切位点，然后对扩增产物进行NcoI-SpeI酶切，插入到相同酶切的pET-sN载体中，从而用GFP基因替换了SARS-CoV N基因，新的原核表达载体命名为pET-sG。将pET-sG和pET-sN质粒分别转化入大肠杆菌感受态(BL21Ai株系)中，用于蛋白表达。

重组的GFP蛋白和重组SARS-CoV N蛋白的表达步骤同重组PPV NIa蛋白酶的表达。pET-32a(+)载体在GFP蛋白和SARS-CoV N蛋白的N-端分别提供了融合短肽(Trx tag，S tag和6×His tag)，因此可以通过Ni-NTA琼脂糖(Cat.No.30210，Qiagen)进行分离。组氨酸(histidine)可以跟Ni离子结合，从而使融合蛋白结合在琼脂糖上，然后用咪唑(100mM-500mM)竞争组氨酸对Ni离子的结合，从而使融合蛋白洗脱出来。洗脱出来的蛋白通过超滤方法浓缩去盐(Amicon Ultra-15membrane，Millipore)。重组GFP蛋白和重组SARS-CoV N蛋白悬浮于PBS，存放于-80℃。用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以已知浓度的BSA作为标准品(碧云天)。

pET-sG质粒在大肠杆菌中受IPTG诱导后表达，可以在SDS-PAGE(SDS-PAGE配制见附录)中看到重组GFP蛋白(sG)的诱导表达(图3，A中“+”泳道)，细胞裂解后sG蛋白大部分处于裂解上清液中，说明sG蛋白大部分是可溶的。通过Ni离子亲和层析纯化后只有45kDa的单一条带，而且没有明显的降解，1L的LB培养基可以纯化得到80mg可溶的sG蛋白。

pET-sN质粒在大肠杆菌中受IPTG诱导后表达，可以在图3，B中“+”泳道中看到重组SARS-CoV N蛋白(sN)的诱导表达，细胞裂解后sN蛋白大部分处于裂解上清液中，说明sN蛋白大部分是可溶的。通过Ni离子亲和层析纯化后只有64kDa的单一条带，而且没有明显的降解，1L的LB培养基可以纯化得到30mg可溶的sN蛋白。

实施例3重组的PPV NIa蛋白酶对重组的GFP蛋白和重组SARS-CoV N蛋白的特异酶切。

将1μg重组PPV NIa蛋白酶与不同质量的重组底物sG或者sN在反应缓冲液进行温育，反应缓冲液的成分为20mM Hepes，pH7.5，10mM MgCl₂，10mM KCl和1mM DTT(本发明中所有的重组PPV NIa蛋白酶的酶切反应体系均用此缓冲液)。每ml反应体系中重组底物量为1μg。反应温度为30℃，反应时间2-10小时。用4×SDS-PAGE的上样缓冲液终止酶切反应，95℃加热10分钟，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色，考马斯亮蓝R-250染色的蛋白电泳条带用Uniscan C1080scanner(THUNIS)扫描，条带的像素密度用ImageQuant TL v2005(GE health)软件进行计算。

结果表明，在5分钟内50μg的重组底物sG就可以被重组PPV NIa蛋白酶少量切割(图4，sG-1)。大于80％的50μg底物sG在2小时内被重组PPVNIa蛋白酶特异切割。融合蛋白sG被切割后产生分离的GFP蛋白(28kDa)和N-端的融合短肽(Trx tag，S tag和6×His tag)(17kDa)(图4，sG-2)。在5分钟内50μg的重组底物sN就可以被重组PPV NIa蛋白酶少量切割(图4，sN-1)。大于80％的50μg底物sN在2小时内被重组PPV NIa蛋白酶特异切割。融合蛋白sN被切割后产生分离的N蛋白(47kDa)和N-端的融合短肽(Trx tag，S tag和6×His tag)(17kDa)(图4，sN-2)。如果反应持续10小时，1μg的重组PPV NIa蛋白酶对100μg底物sG和SN的切割效率大于95％，而且不会产生非特异性酶切(图4，sG-3，sN-3)。重组的PPV NIa蛋白酶对sG和sN的酶切能力没有明显的区别。

实施例4不同影响因子对重组的PPV NIa蛋白酶酶切效率的影响。

将50μg底物sG和1μg重组PPV NIa蛋白酶在不同温度(4℃、20℃、30℃、40℃)温育0-10小时(反应缓冲液同实施例3)，不同时间点取样，分析被特异切割的底物量占总量的比例，作为分析重组PPV NIa蛋白酶的活性依据(下同)。结果表示，对于重组PPV NIa蛋白酶而言，最佳酶切温度在30℃附近；在20℃时，重组PPV NIa蛋白酶可以提供足够的活性将50μg的底物在10小时内酶切完全；重组PPV NIa蛋白酶在4℃仍然持有50％以上的活性；但是酶切能力在40℃明显下降。在40℃时，重组底物sG酶切后出现了酶切产物GFP蛋白的降解，因此对于重组PPVNIa蛋白酶而言，应该尽量避免过高的反应温度(图5，A)。

将50μg底物sG和1μg重组PPV NIa蛋白酶在不同NaCl浓度(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM)下进行切割0-6小时(反应缓冲液同实施例3)，不同时间点取样分析重组PPV NIa蛋白酶的活性。重组PPVNIa蛋白酶对盐浓度的依赖性远远低于其对温度的依赖性。就算在500mMNaCl存在的情况下，40％以上的底物sG(50μg)被1μg重组PPV NIa蛋白酶在30分钟内酶切；60％以上的底物sG(50μg)被1μg重组PPV NIa蛋白酶在6时内酶切。低于200mM盐浓度对重组PPV NIa蛋白酶的酶切能力影响很少(图5，B)。

将50μg底物sG和1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl体系中进行温育(反应缓冲液同实施例3)，并在系统中添加不同的蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，5mM Benzamidine，0.1mM Pepstatin A，200μg/mlAprotinin-dihydrochloride，1mM Leupeptin，1mM Antipain，50mMEDTA-Na2)。反应条件为30℃，2小时。以没有添加蛋白酶抑制剂的体系作为正对照。从结果可看出，只有PMSF对重组PPV NIa蛋白酶的酶切能力有很微弱的抑制，其它蛋白酶抑制剂几乎没有抑制效果(图5，C)。

我们将85μg底物sG和1μg重组PPV NIa蛋白酶在50μl体系中(反应缓冲液同实施例3)，30℃温育3小时，并在反应体系中分别添加了不同浓度的urea(变性剂)、SDS(及是变性剂，也是去垢剂)、Triton X-100(去垢剂)，并设立了正负对照。结果表示，重组的PPV NIa蛋白酶可以耐受1Murea，在2M urea中也可以保持70％的酶切能力；2％的Triton X-100对重组PPV NIa蛋白酶的酶切活性几乎没有影响。我们发现重组的PPV NIa蛋白酶对SDS敏感，在0.05％SDS中，PPV NIa蛋白酶失去了大部分的活性(图5，D)。

在以上反应中，PPV酶的酶切反应用4×SDS-PAGE的上样缓冲液终止，95℃加热10分钟，SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝R-250染色，考马斯亮蓝R-250染色的蛋白电泳条带用Uniscan C1080scanner(THUNIS)扫描，条带的像素密度用ImageQuant TL v2005(GE health)软件进行计算。重复实验的平均值以Microsoft Excel程序计算。

实施例5重组的PPV NIa蛋白酶的稳定性

1μg的重组PPV NIa蛋白酶置于15微升的反应缓冲液(反应缓冲液同实施例3)中，放置于4℃或者20℃，不同时间(0、12、24、24、48、120小时)用4×SDS-PAGE的上样缓冲液终止(同实施例4)，95℃加热10分钟，SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝R-250染色。结果表明重组PPV NIa蛋白酶在20℃至少保持120小时不降解的状态(图6)。

实施例6可用于克隆目的基因的原核表达载体pET-sF的构建

pET-sF的载体由pET-sG载体改造而来，用SacI酶切pET-sG载体，去除GFP片段，只回收载体片段，然后载体自连，所得到的新载体命名为pET-sF。这个载体骨架为pET-32a(+)载体，在N-端提供了Trx tag，S tag和6×His tag融合短肽的核苷酸序列，中间插入了PPV NIa蛋白酶识别位点F

对应的核苷酸序列和多克隆位点，在C-端提供了6×His tag融合短肽的核苷酸序列。这个载体可用于目的基因的克隆，然后进行原核表达及纯化，最后融合短肽可经由PPV NIa蛋白酶识别位点F而被PPV NIa蛋白酶切除，正如本发明利用重组PPV NIa蛋白酶对sG和sN蛋白的酶切一样。图7列出了这个原核表达载体重要元件及酶切位点。质粒pET-sF通过热激法转化进入大肠杆菌(XL-1blue株系)，含有pET-sF质粒的菌种于2007-10-26在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保存，保藏号为2233。

实施例7重组PPV NIa蛋白酶试剂盒

(1)试剂盒内容

重组PPV NIa蛋白酶(50U，1U/μl)，溶于15％甘油，纯度＞95％。

可克隆目的基因的原核表达载体pET-sF(2ug)，冻干粉。

10×酶切缓冲液(成分为200mM Hepes，pH 7.5，100mM MgCl₂，100mM KCl和10mM DTT)

用法说明书

(2)试剂盒说明

本试剂盒根据重组的重组PPV NIa蛋白酶在体外可以高效特异切割融合蛋白而研发。重组PPV NIa蛋白酶对融合蛋白的切割具有高特异性，高效率的特点。重组PPV NIa蛋白酶可以耐受300mM NaCl，1M Urea，2％triton X-100，但是重组PPV NIa蛋白酶对0.05％SDS敏感。经测试，多种蛋白酶抑制剂(苯甲脒、胃蛋白酶抑制剂、抑肽酶、亮肽素、抗木瓜蛋白酶、乙二胺四乙酸)在工作浓度对重组PPV NIa蛋白酶的酶切没有影响。重组PPV NIa蛋白酶在体外可以保持120小时以上不降解状态。原核载体pET-sF用于克隆目的基因。目的基因可克隆在下图所示的多克隆位点区间。该载体具有pET-32a(+)^TM的载体骨架并经过改造，此载体在N-端提供了Trx·Tag^TM，S tag^TM，6×His tag^TM融合短肽的核苷酸序列以及PPV NIa蛋白酶识别位点F

的核苷酸序列，在C-端提供了6×His tag^TM融合短肽的核苷酸序列。该质粒是氨苄青霉素抗性的。

图解说明

Trx.tag 1-327bp

6×His tag 349-366bp

S tag 400-444bp

PPV NIa Site F 460-480bp

多克隆位点487-551bp

6×His tag 552-569bp

(3)活性定义

1U的重组PPV NIa蛋白酶在30℃，3小时内可以切割50μg的标准融合蛋白，酶切效率在95％以上，而且不产生非特异性切割。

(4)使用方法

A 目的基因的原核表达载体构建          20μl

  10×T4DNA连接酶缓冲液               5μl

  pET-sF(相应酶切后)                  50ng

  目的基因片断(相应酶切后)            50ng

  T4DNA连接酶                         1unit

  去离子水                            不定量

20℃连接1小时后，转化大肠杆菌感受态细胞，在添加氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板筛选阳性克隆。

B 融合蛋白的表达

重组质粒转化进入大肠杆菌表达型菌株(建议用BL21系列菌株)进行表达，表达后融合蛋白可用Ni²⁺Resin对重组蛋白进行纯化，纯化后建议超滤。

C 重组PPV NIa蛋白酶对融合蛋白的酶切体系     50ul

  10×酶切缓冲液                            5μl

  重组PPV NIa蛋白酶                         1μl

  融合蛋白                                  50μg

  去离子水                  不定量

  30℃酶切3小时或者4℃酶切过夜

  酶切后可通过Ni²⁺Resin去除重组PPV NIa蛋白酶和融合短肽。

(4)保存

-20℃保存。

附录

(1)PCR反应体系             (20μl)

   10×Ex Taq缓冲液        2μl

   dNTP                    200μM

   正向引物                200nM

   反向引物                200nM

   Ex Taq                  1unit

   质粒模板                10-100ng

   去离子水                不定量

PCR反应条件

94℃5min→94℃0.5min、(TM-2)℃0.5min、72℃1.5min，35个循环→72℃10min→4℃保存。

(2)限制性内切酶反应体系               (20μl)

   10×酶切缓冲液                     2μl

   限制性内切酶                       1unit

   质粒                               1μg

   去离子水                           不定量

   限制性内切酶反应条件

   37℃或者推荐酶切温度，温育1小时。

(3)SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)蛋白胶制备

A 12％分离胶                              10ml

  去离子水                                3.4ml

  1.5M Tris pH 8.8                        2.5ml

  10％SDS                                 0.1ml

  Acrylamide/Bisacrylamide(29％/1％w/v)   4ml

  10％(w/v)过硫酸胺                       100μl

  TEMED                                   10μl

B 40％浓缩胶                              10ml

  去离子水                                6ml

  1M Tris pH 6.8                          1.25ml

  10％SDS                                 0.1ml

  Acrylamide/Bisacrylamide(29％/1％w/v)   1.37ml

  10％(w/v)过硫酸胺                       50μl

  TEMED                                   10μl

IB076985-序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>重组李痘病毒NIa蛋白酶对融合蛋白的体外特异切割

<130>IB076985

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cagagctcag taaatcactg ttcagagg                 28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctaagcttgt gagt gtaaac aaattccc                28

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aagcatgcgt cgacatgtct gataatggac c             31

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

IB076985-序列表

<400>4

atacgcgtt tatgcctgagt tgaatc                                         26

<210>5

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggtaccaac gttgtt gtgc accaagctga cgaactgcag ccatggc                 47

<210>6

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tcgagccatg gctgcagttc gtcagcttgg tgcacaacaa cgttggtacc gcatg         55

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

agccatggga gctcatgggt aagggagaag aactt                               35

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ggactagtga gctcttattt gtatagttca tccat                               35

<210>9

<211>639

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg    60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc    120

ccgatt ct gg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac  180

IB076985-序列表

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg   240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg   300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat   360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa   420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtacca acgttgttgt gcaccaagct   480

gacgaactgc agccatggga gctcactagt gcggccgcct gcaggtcgac aagcttgcgg   540

ccgcactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg   600

aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactag                          639

<210>10

<211>212

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1               5                   10                  15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

            20                  25                  30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

        35                  40                  45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

    50                  55                  60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

                85                  90                  95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

            100                 105                 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

        115                 120                 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

    130                 135                 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asn Val Val Val His Gln Ala

145                 150                 155                 160

Asp Glu Leu Gln Pro Trp Glu Leu Thr Ser Ala Ala Ala Cys Arg Ser

                165                 170                 175

Thr Ser Leu Arg Pro His Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ile

            180                 185                 190

IB076985-序列表

Arg Leu Leu Thr Lys Pro Glu Arg Lys Leu Ser Trp Leu Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Leu Ser Asn Asn

    210

Claims (5)

1.重组李痘病毒NIa蛋白酶在体外高效特异切割融合蛋白的应用。

2.一种体外高效切割融合蛋白的方法，包括使用重组李痘病毒NIa蛋白酶在以下条件下切割融合蛋白：反应温度：4-30℃；盐浓度：＜300mM NaCl。

3.根据权利要求2的方法，其中的反应温度为：20-30℃；盐浓度：＜200mM NaCl。

4.一种表达载体，其是从保藏编号为CGMCC No.2233的大肠杆菌中获得的。

5.一种高效特异切割融合蛋白的试剂盒，其包含重组李痘病毒NIa蛋白酶，权利要求4的表达载体，酶切缓冲液和用法说明书。

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