CN101175859B - 蛋白质的生产方法 - Google Patents

Abstract

通过在以甲醇为主要碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含可在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和将分泌的目的蛋白回收。

Description

蛋白质的生产方法

技术领域

本发明涉及使用甲醇同化细菌分泌生产蛋白质的方法，所述蛋白质包括工业上有用的酶或生物活性蛋白。

背景技术

甲醇是能够以低成本大量获得的发酵原料，并且其作为碳源是非常有用的。已经开发出使用甲醇为主要碳源，用甲醇同化细菌生产L-氨基酸的方法(专利文献1)和使用甲醇同化细菌生产多糖的方法(专利文献2)。

同样，到目前为止已知在毕赤酵母属酵母(Pichia yeast)中使用醇氧化酶(AOX)基因的启动子通过甲醇诱导在菌体内生产lacZ的例子(非专利文献1)和使抑肽酶(牛源、胰腺胰蛋白酶抑制剂)以活性型分泌到培养物上清液中的例子(非专利文献2)。

此外，在甲醇同化细菌中，已知有在非专性甲醇同化细菌扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)的细胞内蓄积荧光蛋白(GFP)的例子(专利文献3、非专利文献3)，但尚未得知在专性甲醇同化细菌中向菌体外分泌蛋白的例子。

专利文献1：欧洲专利公开第1188822号说明书

专利文献2：特开平11-56384号公报

专利文献3：WO2003/046226 A1

非专利文献1：Nucleic Acids Res.1987 May 11；15(9)：3859-76.

非专利文献2：J Ind Microbiol.1991 Apr；7(3)：197-201.

非专利文献3：FEMS Microbiol Lett.2000 Dec 15；193(2)：195-200

发明内容

本发明的课题是提供有效分泌生产目前难于用埃希氏菌属(Escherichia)细菌等分泌生产的蛋白质等的方法。

本发明人等注意到源自甲醇同化细菌的启动子、信号序列，并进行了深入的研究。结果发现通过将携带DNA构建体的甲醇同化细菌培养在以甲醇为主要碳源的培养基中，所述DNA构建体包含可在甲醇同化细菌中发挥作用的启动子序列以及编码信号序列和目的蛋白的核酸序列，能够有效地分泌生产蛋白质，从而完成了本发明。

即本发明如下。

(1)蛋白质的生产方法，该方法包括通过在以甲醇为主要碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包含信号序列和所述目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。

(2)根据(1)的方法，其中所述在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列选自甲醇脱氢酶启动子、tac启动子、σE启动子和核糖体蛋白启动子。

(3)根据(1)的方法，其中所述启动子序列为具有序列号11、12、21或22的碱基序列的启动子。

(4)根据(1)～(3)任一项的方法，其中所述信号序列为选自甲醇脱氢酶、肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的蛋白质的信号序列。

(5)根据(1)～(3)任一项的方法，其中所述信号序列具有选自序列号18和20的氨基酸序列。

(6)根据(1)～(5)任一项的方法，其中所述甲醇同化细菌为选自下组的细菌：嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌、甲基菌属(Methylobacillus)细菌、噬甲基菌属(Methylophaga)细菌、无色杆菌属(Achromobacter)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌、精朊杆菌属(Protaminobacter)细菌、甲烷单胞菌属(Methanomonas)细菌、微环菌属(Microcyclus)细菌和甲基杆菌属(Methylobacterium)细菌。

(7)根据(1)～(6)任一项的方法，其中所述蛋白为选自肌醇六磷酸酶、白细胞介素、转谷氨酰胺酶、干扰素、胰岛素、酸性磷酸酶和肽合成酶(peptidesynthase)的蛋白。

(8)根据(1)～(7)任一项的方法，其中所述甲醇同化细菌为专性甲醇同化细菌。

(9)根据(8)的方法，其中所述专性甲醇同化细菌为选自下组的细菌：嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌、甲基菌属(Methylobacillus)细菌和噬甲基菌属(Methylophaga)细菌。

发明的优选实施方式

本发明的生产方法的特征在于：通过在以甲醇为碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列以及以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。在本文中术语“分泌”指将目的蛋白由细胞内排出(excretion)或释放(release)到菌体外，不包括目的蛋白在细胞内的蓄积。

即通过该甲醇同化细菌，首先产生包含信号序列和目的蛋白的多肽，然后通过切断信号序列将目的蛋白转移至周质，其后目的蛋白被分泌至菌体外。回收这些分泌的蛋白即可进行目的蛋白的生产。以下，将使细菌分泌蛋白、并回收该蛋白的生产过程成为“蛋白的分泌生产”。

已知通常将分泌性蛋白翻译成前肽(prepeptide)或前肽原(prepropeptide)，之后它们成为成熟蛋白。即，众所周知在将分泌性蛋白翻译为前肽或前肽原后，通过切割前体部分(pre-portion)转变为成熟肽或肽原(propeptide)，肽原在蛋白酶的作用下其原体部分(pro-portion)进一步被切割，从而成为成熟蛋白。担负着这样的信号肽切割任务的蛋白酶通常被称为“信号肽酶”。

在本发明中，目的蛋白可以是以成熟蛋白或肽原的形式分泌的蛋白，当其以肽原的形式分泌时，在回收后用适当的蛋白酶进行处理，可以获得成熟蛋白。

在本说明书中，术语“信号序列”是指存在于分泌性蛋白前体的N-末端的、在蛋白分泌时被识别的序列；而术语“信号肽”是指由这些氨基酸残基构成的肽。

在本发明中，同时具有前体序列(pre-sequence)和原体部分(pro-portion)的蛋白，即初级翻译产物(primary translation product)，可以称为“前蛋白质原(preproprotein)”；而具有原体部分但没有前体部分的蛋白可以称为“蛋白质原(proprotein)”。蛋白质原的原体部分可以称为“原体结构部分(pro-structural portion)”或简称“原体结构(pro-structure)”；而在本说明书中，蛋白质的“原体结构部分/原体结构”和蛋白质的“原体部分”可以互换使用。

本发明的生产方法中使用的细菌可以通过将DNA构建体导入甲醇同化细菌而获得，其中所述DNA构建体包含在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和目的蛋白序列的多肽的核酸序列。

这里，术语“甲醇同化细菌”指能够以甲醇为主要碳源进行生长的细菌，包括属于嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基菌属(Methylobacillus)、噬甲基菌属(Methylophaga)、无色杆菌属(Achromobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)(特开昭45-25273号公报)、精朊杆菌属(Protaminobacter)(特公昭49-125590号公报)、甲烷单胞菌属(Methanomonas)(特开昭50-25790号公报)、微环菌属(Microcyclus)(特开昭52-18886号公报)和甲基杆菌属(Methylobacterium)等的细菌。其中，优选专性甲醇同化细菌，其在以葡萄糖为唯一碳源的条件下不能生长或仅微弱生长。具体地，可以以甲醇为主要碳源进行生长而在以葡萄糖为唯一碳源的条件下不能生长或仅微弱生长的细菌例如有嗜甲基菌属细菌、甲基菌属细菌和噬甲基菌属细菌。其中包括：嗜甲基菌属细菌例如食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)；甲基菌属细菌例如糖原甲基菌(Methylobacillus glycogenes)、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellatus)；噬甲基菌属细菌例如深海噬甲基菌(Methylophaga thalassica)、海噬甲基菌(Methylophaga marina)、嗜碱噬甲基菌(Methylophaga alcaliphila)(Biology of Methylotrophs；Edited by IsraelGoldberg and J.Stefan Roken and published by Butterworth-Heinemann)。此外，还优选具有向菌体外分泌甲醇脱氢酶(MDH)机能的细菌。

食甲基嗜甲基菌例如有AS1菌株(NCIMB 10515)、W3A1(NCIMB 11348菌株)、ATCC 53528菌株等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB 10515)和W3A1(NCIMB 11348菌株)可以从国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)获得。

糖原甲基菌例如有T-11菌株(NCIMB 11375)、ATCC 21276菌株、ATCC21371菌株、ATCC 29475菌株、ATR80菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，vol.42，p67-72)和A513菌株(见Appl.Microbiol.Biotechnol.，(1994)，vol.42，p67-72)。糖原甲基菌NCIMB 11375菌株可以从国立工业、食品和海洋细菌保藏中心(地址：NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG， United Kingdom)获得。

鞭毛甲基菌例如有ATCC 51484菌株、KT菌株(见N.I.Govorukhina等，Microbiology(Russia)56(1987)，pp.849-854)、VKM B-1610菌株等。鞭毛甲基菌VKM B-1610菌株可以从全俄罗斯微生物保藏中心(ALL-RUSSIANCOLLECTION OF MICROORGANISMS)(Russia，142290，Moscow Region，Pushchino，pr.Nauki，5，IBPM)获得。

食甲基嗜甲基菌ATCC 53528菌株，糖原甲基菌ATCC 21276菌株、ATCC 21371菌株、ATCC 29475菌株和鞭毛甲基菌ATCC 51484菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，1，United States of America)获得。

深海噬甲基菌例如有ATCC 33145菌株、ATCC 33146菌株等。海噬甲基菌例如有ATCC 35842株等。嗜碱噬甲基菌例如有ATCCBAA-297^TM等。深海噬甲基菌ATCC 33145菌株、ATCC 33146菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，1，United StatesofAmerica)获得。

上述导入甲醇同化细菌的DNA构建体所包含的“在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子”是指在上述甲醇同化细菌中具有启动子活性的启动子，但不限于源自甲醇同化细菌的启动子，也可以是源自其它微生物的启动子。此外，“在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子”既包括甲醇诱导型启动子，也包括非诱导型启动子。甲醇诱导型启动子例如有甲醇脱氢酶基因的启动子、二羟基丙酮合酶基因的启动子和甲酸脱氢酶基因的启动子等。

在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子具体包括但不限于可甲醇诱导的甲醇脱氢酶基因的启动子(序列号11)、源自大肠杆菌的高表达启动子tac启动子(序列号12)、σE启动子(序列号21)和核糖体蛋白启动子(序列号22)。

此外，启动子序列不限于野生型启动子，并且可以是修饰野生型的序列以高表达目的基因而获得的启动子。例如，可以是在上述野生型启动子序列中发生几个碱基的取代、缺失、添加或插入的序列，只要其在上述细菌中具有启动子活性。此外，为了增加启动子活性，可以在-35区或-10区对启动子进行修饰，也可以调节-35区和-10区之间的间隔区(spacer region)的长度来对启动子进行修饰。这种修饰-35区和-10区的方法例如有EP1,033,407中记载的方法和Nucleic Acids Res.1999 Dec 15；27(24)：4768-74中记载的方法等。

启动子的活性可以由RNA合成起始的频率进行定义。Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中记载了启动子活性的评价方法和能够用于本发明的强启动子的实例。此外，如WO 00/18935中所公开，在目的基因的启动子区引入几个碱基的碱基取代，可以将其修饰为更强的启动子。

在导入甲醇同化细菌的DNA构建体中，在上述启动子的下游以可表达的形式连接有编码包含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列。

“在甲醇同化细菌中发挥功能的信号序列”是指下述序列：当其连接于目的蛋白时，所述甲醇同化细菌能够识别该信号序列并分泌目的蛋白。

信号序列可以是来自与目的蛋白不同的蛋白的信号序列，也可以是目的蛋白的前体蛋白所包含的信号序列。然而，信号序列优选来自于所使用的宿主甲醇同化细菌的分泌性蛋白。此外，用于本发明的目的的信号序列可以包含一部分目的蛋白的N末端侧的氨基酸序列，所述目的蛋白在该信号序列的起源前体蛋白中与该信号序列相连。

当信号序列与目的蛋白的起源不同时，可以将前蛋白原称为“异源融合前蛋白原(heterologous fusion preproprotein)”。例如，当蛋白为胰岛素时，与“前胰岛素原(preproinsulin)”或“胰岛素原(proinsulin)”相对应，可以称为“异源融合前胰岛素原(heterologous fusion preproinsulin)”。

对于信号肽，只要其可以在甲醇同化细菌中发挥功能，没有特别的限制，可以使用源自甲醇同化细菌分泌蛋白的信号序列，也可以使用源自其它细菌、酵母、植物或动物等分泌蛋白的信号序列。比较具体地，例如源自食甲基嗜甲基菌的甲醇脱氢酶(MDH)的信号序列(序列号18的氨基酸序列)。此外，源自其它细菌的信号序列例如有由大肠杆菌的appA基因编码的肌醇六磷酸酶的信号序列(序列号20的氨基酸序列)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)的酸性磷酸酶的信号序列(序列号26的位置1～20)等。编码这些氨基酸序列的碱基序列分别示于序列号17、19和25。

编码信号序列的碱基序列可以是编码野生型信号序列的碱基序列，也可以是发生了取代的编码野生型信号序列的碱基序列，所述取代使其密码子适合在分泌生产蛋白的甲醇同化细菌中使用。

对于可根据本发明的方法进行分泌、回收的“目的蛋白”没有特别限制，只要其通过与在上述甲醇同化细菌中发挥功能的信号序列连接从而可以用甲醇同化细菌进行分泌，所述“目的蛋白”包括各种蛋白，例如源自动植物、微生物的分泌性蛋白和胞内蛋白。本发明的方法同样适用于目前为止无法用埃希氏菌属(Escherichia)细菌等革兰氏阴性细菌进行分泌生产的蛋白。此外，“目的蛋白”优选与宿主甲醇同化细菌起源不同的异源蛋白。

当使用分泌蛋白作为“目的蛋白”时，可以使用具有已将前体序列和原体序列从前体中除去的序列的蛋白，也可以使用包含原体序列的蛋白。然而，“目的蛋白”是由前体蛋白通过切断肽键而除去了构成前体部分和原体部分的至少一个氨基酸的蛋白即可，包括N末端区与天然成熟蛋白的N末端区完全一致的蛋白、与天然成熟蛋白相比在N末端残留有来自前体部分或原体部分的至少一个氨基酸的蛋白以及氨基酸序列短于天然成熟蛋白的蛋白。

对于适用本发明的生产方法的目的蛋白没有特别的限制，例如有下列蛋白的成熟蛋白或蛋白原。

肌醇六磷酸酶(phytase)(EC3.1.3.2 3.1.3.26)

人白细胞介素2(IL2：Genbank登录号(Accession No.)AAK26665等，成熟型为21～153位的氨基酸序列)

蛋白谷氨酰胺酶(protein glutaminase)

转谷氨酰胺酶(Genbank Accession No.AF53 1437等)

干扰素

胰岛素(特开平07-284394等)

酸性磷酸酶

肽合成酶(WO 2004/011653、WO 2004/065610)

粒细胞刺激因子(GCSF)

这其中优选的是在后述的实施例中生产的肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶。

肌醇六磷酸酶(又称磷酸酐磷酸化酶(phosphoanhydride phosphorylase))是水解肌醇六磷酸钙镁(phytin)(又称肌醇六磷酸(inositol hexakisphosphate)、肌醇六磷酸(phytic acid))的酶，其在食品领域、农业领域和医药领域十分有价值。可以利用以下的肌醇六磷酸酶。关于各种肌醇六磷酸酶的氨基酸序列及编码它们的碱基序列的信息，可以参照其Genbank Accession No.获取。源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAC74065(序列号16)成熟蛋白为23～432位的氨基酸序列

源自霉菌的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAU93518、AAU93517、AAG40885、BAB40715

源自芽孢杆菌属(Bacillus)的肌醇六磷酸酶： Genbank Accession No.AAC38573、AAG17903、AAL59320

源自酵母菌的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.CAB70441源自耶尔森氏菌属(Yersinia)的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.YP_070934

源自克雷伯氏菌属(Klebsiella)的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAM23271

源自黄单胞菌属(Xanthomonas)的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAM38967

源自假单胞菌属的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAN77879

源自蘑菇的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.CAC48195、CAC48164、CAC48234

源自玉米的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAB52233

源自大豆的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAK49438

源自甘薯的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAF60315

源自大鼠的肌醇六磷酸酶：Genbank Accession No.AAA42305

酸性磷酸酶是催化酸性条件下磷酸酯水解的酶(EC3.1.3.2)，可以使用例如以下源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶、WO 96/37603中记载的酸性磷酸酶以及它们的突变体。

源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶：Genbank Accession No.AB035805(序列号25)，成熟蛋白为21～259位的氨基酸序列

根据所使用的宿主和/或为了获得所需的活性，可以对编码这些蛋白的基因进行修饰，这其中包括使其编码的氨基酸序列发生至少一个氨基酸的添加、缺失或取代等的修饰。包括修饰技术、基因克隆技术、产生的蛋白的检测技术在内的一般分子生物学方法均是本领域技术人员公知的，可以参考例如Sambrook et al.，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N Clovered.1985)；FM.Ausubel et al.(eds)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)；PCR Technology：Principles and Applicationfor DNA Amplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press等。当生产异源蛋白时，可以使用经如下修饰的基因：将基因中的密码子替换为在进行分泌表达的微生物中使用频率高的密码子。

使用基于已知序列设计的引物进行PCR等，可以获得编码蛋白的基因。此外，还可以采用基于同源性等从微生物、动植物等的染色体中通过杂交等方法分离编码目的蛋白的基因，并且测定其碱基序列的基因等。此外，还可以使用根据已知碱基序列化学合成的基因。序列信息可以从Genbank等数据库获得。

此外，目的蛋白可以是在一个或多个位置上具有一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的蛋白，只要其具有目的蛋白的活性。在本发明中，因氨基酸残基在蛋白的立体结构中的位置或其类型而异，“一个或几个”具体为1至30个，优选1至20个，更优选1至10个。

上述的蛋白质的取代是保持蛋白质活性的保守取代。取代是指去除氨基酸序列中的至少1个残基，并且在该位置上插入其它残基的改变。取代酶蛋白的原有氨基酸并被认为是保守取代的氨基酸的例子包括：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和Met、Ile或Leu取代Val。

编码与上述蛋白基本上相同的蛋白的DNA可以通过对编码这些酶的碱基序列进行修饰而获得，例如采用位点特异突变方法将特定位置的氨基酸残基取代、缺失、插入、添加或倒置(inverted)。此外，上述修饰的DNA也可以通过常规公知的突变处理获得。突变处理包括例如：在体外用羟胺等处理未突变的DNA的方法；通过紫外线照射或使用常规突变处理用诱变剂来处理包含未突变的DNA的微生物例如埃希氏菌属细菌的方法，所述常规诱变处理用诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝酸等；将PCR反应溶液中的脱氧核苷酸的组成比例例如由通常的相等比例改变为不等比例从而人为地引发随机错误的方法，即易错PCR法等。

在适当的细胞中表达具有这种突变的DNA并且考察表达产物的活性，可以获得编码基本上相同的蛋白的DNA。

同样，从编码突变蛋白的DNA或包含该DNA的细胞中可以获得下述DNA，所述DNA在严紧条件下与例如野生型基因碱基序列的互补序列或具有该序列的一部分的探针杂交，并且所述DNA编码具有目的蛋白的活性的蛋白。在本文中术语“严紧条件”是指形成所谓的特异性杂交但不形成非特异性杂交的条件。将该条件明确地数值化是困难的，可以示例性地举出下列条件：同源性高的DNA之间例如具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、更优选95％以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性较上述值低的DNA之间不发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS(优选0.1×SSC、0.1％SDS)相当的盐浓度下杂交的条件。

如上所述的目的蛋白可以直接与信号序列相连，也可以通过接头序列间接与信号序列相连。当包含接头序列时，这样的接头序列可以使用任意序列，只要其不抑制多肽的生产性能和目的蛋白的活性，例如，可以使用多聚组氨酸等用于纯化目的蛋白的序列等。

通过使用限制酶等连接编码信号序列的核酸序列和编码目的蛋白的核酸序列等方法，可以适宜地制备编码包含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列。

此外，当使用的信号序列和目的蛋白源自相同的前体蛋白时，可以采用PCR等扩增编码包含信号序列和目的蛋白的前体蛋白的序列以备使用。作为PCR方法，可以使用各种公知的改进方法，这其中采用交换PCR法(crossover PCR)有利于扩增。

通过将编码含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表达的形式连接于启动子，可以制备导入甲醇同化细菌的DNA构建体。“将编码含信号序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表达的形式连接于启动子”是指将该构建体导入细菌时，编码多肽的mRNA由启动子转录，从而使得该细菌产生该多肽。

所述核酸序列优选以下述形式连接于启动子：在多肽编码序列的起始密码子之前连接，从而使其含有包括转录起始位点在内的5’-非翻译区。5’-非翻译区可以使用启动子的来源序列的5’-非翻译区，例如使用MDH基因启动子时可以使用MDH基因的5’-非翻译区。此外，5’-非翻译区可以使用信号序列编码序列的来源基因的5’-非翻译区，例如使用肌醇六磷酸酶的信号序列时可以使用肌醇六磷酸酶基因的5’-非翻译区。

此外，在使用5’-非翻译区时，可以使用经如下修饰的5’-非翻译区：对核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区、特别是起始密码子邻近上游的序列中的数个核苷酸进行取代，因为已知上述修饰对mRNA翻译效率的影响显著。

此外，为获得如上所述的DNA构建体而进行的操作可以使用易于基因重组的埃希氏菌等革兰氏阴性细菌，也可以直接使用分泌蛋白的微生物进行。

为了对甲醇同化细菌进行修饰以使其包含上述DNA构建体，例如可以导入携带上述DNA构建体的载体。例如，可以将编码所述蛋白的基因片段与在甲醇同化细菌中发挥功能的载体优选多拷贝型载体相连，制备重组DNA，然后导入该重组DNA来转化甲醇同化细菌宿主。

目的启动子、信号序列和蛋白序列，可以例如采用以含有目标序列的动物、植物、微生物的染色体DNA为模板的PCR方法(参见PCR：聚合酶链式反应；White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))获得。染色体DNA，可以例如根据Saito和Miura的方法(参见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；生物工学实验书、日本生物工学会编、97～98页、培风馆、1992年)等，从作为DNA供体的细菌制备。用于PCR的引物，可以基于在Genbank等公共数据库登录的基因序列进行制备，或者可以基于其它的细菌等中序列在已知的基因间保守的区域的信息进行制备。

能够在甲醇同化细菌中自主复制的载体例如可在嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌、甲基菌属(Methylobacillus)细菌中自主复制的质粒。具体而言有广宿主范围载体RSF1010及其衍生物等，例如pAYC32(Chistosterdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，1986，16，161-167)、pMFY42(gene，44，53(1990))、pRP301或pTB70(Nature，287，396，(1980))等。

同样，在本说明书的实施例中使用的pAYCTER3是优选的载体。pAYCTER3是在pAYC32的基础上删除了其链霉素抗性基因(strA，B)的上游区域，并且在该位置插入了pUC19的多克隆位点和大肠杆菌rrnB基因的终止子而获得的质粒。即，pAYCTER3是一种高表达载体，其本身不表达链霉素抗性，但如果在多克隆位点沿strA的正向插入包含启动子序列的DNA，则可通过连读变为链霉素抗性。

为了将上述DNA构建体与携带在甲醇同化细菌中发挥功能的标记的载体相连接从而制备重组DNA，可以用适合于目的基因的末端的限制酶切割该载体。连接通常使用T4 DNA连接酶等连接酶进行。

可以按照至今为止报导的转化方法将如上述制备的重组DNA导入甲醇同化细菌。例如：由处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并且将DNA导入其中的方法(Dubunau and Davidoff-Abelson，J.Mol.Biol.，56，209(1971)；Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))，或者将宿主细胞转化成易于吸纳重组DNA的原生质体或原生质球状态从而将重组DNA导入DNA受体细菌的方法(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979))。

此外，可以使甲醇同化细菌的染色体DNA上存在单拷贝或多拷贝的本发明的DNA构建体，实现构建含有本发明的DNA构建体的甲醇同化细菌的目的。可以采用下述方法在甲醇同化细菌的染色体DNA上以单拷贝或多拷贝的形式导入本发明的DNA构建体：利用在染色体DNA上存在多个拷贝的序列作为靶标的同源重组，或者使用噬菌体等进行的在染色体DNA上的随机插入。关于在染色体DNA上存在多个拷贝的序列，可以利用转座子、重复序列和存在于转座因子末端的反向重复序列等。此外，载体的扩增和染色体上的多拷贝化可以与上述表达调控序列的修饰进行组合。

在以甲醇为碳源的液体培养基中培养如上述获得的甲醇同化细菌，使该细菌分泌所述目的蛋白并回收分泌的目的蛋白，可以进行蛋白的生产。

在本说明书中，“分泌”蛋白质或肽是指将蛋白质或肽分子转运至细菌菌体外(细胞外)，其不仅包括蛋白质或肽最终在培养基中处于完全游离状态的情况，还包括蛋白质或肽仅部分存在于菌体外的情况，以及蛋白质或肽存在于菌体表层的情况。

本发明中优选的分泌程度是可以从培养基或菌体回收目的蛋白。

将甲醇同化细菌培养在以甲醇为碳源的培养基中。以甲醇为碳源的培养基例如有添加了0.001～30％甲醇的培养基。所述培养基还可以含有甲醇以外的碳源，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖类，甘油、山梨糖醇等醇类，延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。

作为除甲醇以外的其它培养基成分，可以添加在通常的培养中使用的氮源、无机离子等培养基成分。为了获得较高的生长，视需要还可以添加维生素、氨基酸等有机微量营养元素。作为氮源，可以使用氨气、氨水、铵盐或其它。作为无机离子，可以视需要适宜地使用钙离子、镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子等。培养例如可以在pH5.0～9.0、15℃～45℃的适合范围内，在需氧条件下进行，培养时间可以是约1～7天。在这样的条件下培养甲醇同化细菌，可以在菌体内大量产生并有效分泌目的蛋白。

当使用MDH基因启动子等可甲醇诱导的启动子时，可以在诱导条件下进行培养，以提高多肽的产量。可以采用通常用于诱导MDH基因启动子等的条件进行诱导。通常，在甲醇中培养甲醇同化细菌时，无需特别诱导，MDH启动子即可发挥功能。

根据本领域技术人员公知的方法，可以从培养后的培养基中分离、纯化本发明的分泌到培养基中的蛋白。例如，在通过离心分离等除去菌体后，采用适合的已知方法例如盐析、乙醇沉淀、超滤、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、亲和层析、中高压液相层析、反相层析或疏水层析或它们的组合，可以进行蛋白的分离和纯化。而且，当多肽包含纯化用序列时，可以利用该序列进行纯化。

在通过本领域技术人员公知的方法例如提高盐浓度或使用表面活性剂来溶解蛋白质之后，按照与分泌到培养基中的情况相同的方式，也可以分离和纯化本发明的分泌到菌体表层的蛋白。此外，在某些情况下也可以不进行溶解处理而使用分泌到菌体表层的蛋白，例如将其作为固定化酶。

以下通过实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例并不在任何意义上构成对本发明的限制。

实施例

实施例1：源自大肠杆菌K-12菌株的β-内酰胺酶在食甲基嗜甲基菌ATCC53528中的分泌表达

(1)在甲基同化细菌中发挥功能的表达质粒pAYCTER3的构建

采用本领域技术人员公知的方法对序列号3和序列号4记载的合成DNA进行退火，以制备多位点接头(polylinker)，所述序列号3和序列号4记载的合成DNA被设计成含有pUC19的多克隆位点的序列。该多位点接头被设计成具有与用限制酶EcoRI和BglII切割后相同的末端形式。然后，合成序列号5和序列号6记载的引物，采用PCR方法，从按常规方法(Saito和Miura的方法，[Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)])制备的大肠杆菌K-12菌株的染色体DNA中扩增出编码rrnB的终止序列的区域。在序列号3的引物中设计由限制酶BglII识别的序列，并且在序列号4的引物中设计由限制酶BclI识别的序列。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。用限制酶BglII和BclI消化该PCR片段，然后将其与前述多位点接头连接，得到约400 bp的DNA片段。使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(由TAKARA BIO INC.制造)进行连接反应，反应条件采用制造商建议的方案。接下来，用限制酶EcoRI和BamHI切割公知的质粒pAYC32(J.Gen.Microbiol.，137，169-178(1991))，回收切出的约9.2 kbp的片段，通过将前述的DNA片段插入其中，构建在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中发挥功能的表达质粒pAYCTER3。该pAYCTER3的结构缺失pAYC32中的strA基因的5’侧上游序列，取而代之的是pUC19多克隆位点和rrnB终止子，并且包含源自大肠杆菌的β-内酰胺酶基因。

(2)β-内酰胺酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达

用在上述(1)中构建的用pAYCTER3转化的食甲基嗜甲基菌ATCC53528，选择在含25mg/l氨苄西林和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基(硫酸铵5g、K₂HPO₄ 1.9g、NaH₂PO₄·2H₂O 1.56g、硫酸镁200mg、氯化钙72mg、硫酸铜5μg、硫酸锰25μg、硫酸锌23μg、三氯化铁9.7mg、琼脂15g，溶于1L H₂O，调至pH 7.0)上生长的菌株。接下来，用含25mg/l氨苄西林和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，培养条件为37℃、48小时。培养结束后，对携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，可以检测出培养物上清液中含有与β-内酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白测序仪PPSQ-21A(由岛津制作所制造)测定该蛋白的N末端序列，结果确定其为β-内酰胺酶的成熟序列，从而确认了β-内酰胺酶分泌至培养物上清液中的事实。

实施例2：源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达

(1)源自食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶基因的获取

源自食甲基嗜甲基菌W3A1菌株的甲醇脱氢酶基因的序列既已测定(Genbank Accession No.U41040)。参考该序列，合成序列号1和序列号2所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA中扩增出编码甲醇脱氢酶序列的区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。

然后，将扩增出的约1.0kb的DNA片段使用Random Primer DNALabeling Kit Ver 2.(由TAKARA BIO INC.制造)和[α-32P]dCTP按试剂盒附带的说明书进行反应，由此制备DNA探针。使用制备的探针和食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA，按照如分子克隆第二版(Molecular Cloning2^nd edition)(J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，p9.31(1989))中描述的常规方法进行Southern印迹杂交，确认了在用限制酶PvuII切出的约5.5kb的片段中存在甲醇脱氢酶基因。因此，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)，通过琼脂糖凝胶电泳回收用限制酶PvuII消化食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA所得的约5.5kb的片段，将该片段插入pUC18(由TAKARA BIO INC.制造)的SmaI位点，然后将所得质粒导入大肠杆菌JM109(由TAKARA BIO INC.制造)的感受态细胞中，由此制备文库。

使用之前制备的甲醇脱氢酶的DNA探针，采用分子克隆第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p1.91(1989))的菌落杂交方法进行文库筛选，获取携带克隆了甲醇脱氢酶基因片段的质粒的菌株，从该菌株回收质粒，将其命名为pUMDH。测定克隆于pUMDH的片段的碱基序列，确认了食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶基因具有显示与食甲基嗜甲基菌W3A1菌株的甲醇脱氢酶基因95％以上同源性的碱基序列(序列号13)。碱基序列测定结果表明：约5.5kb的PvuII片段包含全长甲醇脱氢酶基因及其5’侧上游约2.5kb。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(terminator cycle sequencing kit；由PEApplied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。

(2)源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶基因的获取与分泌表达质粒的构建

源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶基因的序列既已测定(GenbankAccession No.AE000200：序列号15)。参考该序列，合成序列号7和序列号8所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的大肠杆菌K-12菌株的染色体DNA中扩增出编码肌醇六磷酸酶序列(成熟型)的区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。

然后，使用序列号9和序列号10所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA中扩增出甲醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与肌醇六磷酸酶的融合基因，序列号10所示的引物包含编码肌醇六磷酸酶N末端侧氨基酸序列的序列。

然后，混合前述扩增出的编码大肠杆菌K-12菌株肌醇六磷酸酶序列(成熟型)的区域和前述扩增出的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号9和序列号8的引物进行交换PCR，扩增出与食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶基因的启动子区域和信号序列区域相连的肌醇六磷酸酶的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约2.4kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，将其插入pHSG398(由TAKARA BIO INC.制造)的SmaI位点，从而得到pHSGMappA。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。接下来，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收pHSGMappA的BamHI-KpnI片段，使用DNA blunting Kit(由TAKARA BIO INC.制造)将片段的末端平端化。接下来，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收实施例1(1)中构建的pAYCTER3的EcoRI片段，使用DNA blunting Kit(由TAKARA BIO INC.制造)将所述片段的末端平端化，然后插入已平端化的BamHI-KpnI片段，从而得到pAYCMappA。按照前述方法对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的异源融合基因。

(3)肌醇六磷酸酶基因在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的表达

用上述(2)中构建的pAYCMappA(通过将源自食甲基嗜甲基菌ATCC53528的甲醇脱氢酶的启动子序列和信号序列与源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，选择在含25mg/l氨苄西林和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基(硫酸铵5g、K₂HPO₄ 1.9g、NaH₂PO₄·2 H₂O 1.56g、硫酸镁200mg、氯化钙72mg、硫酸铜5μg、硫酸锰25μg、硫酸锌23μg、三氯化铁9.7mg、琼脂15g，溶于1L H₂O，调至pH 7.0)上生长的菌株。接下来，用含25mg/l氨苄西林和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，分别于37℃培养48小时。培养结束后，对携带pAYCMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，结果仅在携带pAYCMappA的菌株的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性。酶活性测定采用已经报导的方法进行(J AOAC Int.1994 May-Jun；77(3)：760-4.)。其结果，对于携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCMappA的食甲基嗜甲基菌ATCC53528，检出其培养物上清液中的酶活性为60 FTU/mL(37℃、pH 5.5)，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。

实施例3：源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC53528中的分泌表达

(1)源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶基因的获取与分泌表达用质粒的构建

源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶基因的序列既已测定(GenbankAccession No.AB035805：序列号25)。参考该序列，合成序列号27和序列号28所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的摩氏摩根氏菌菌株的染色体DNA中扩增出编码酸性磷酸酶序列(成熟型)的区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食甲基嗜甲基菌甲醇脱氢酶的融合基因，序列号27所示的引物包含编码甲醇脱氢酶信号序列的C末端侧氨基酸序列的序列。

然后，使用序列号9和序列号29所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA中扩增出甲醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域。使用PyrobestDNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。

然后，混合前述扩增出的编码摩氏摩根氏菌菌株酸性磷酸酶序列(成熟型)的区域和前述扩增出的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶的启动子区域和信号序列区域的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号9和序列号28的引物进行交换PCR，扩增出与食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶基因的启动子和信号序列相连的酸性磷酸酶的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约1.8kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARABIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该片段，并且将其插入pHSG398(由TAKARA BIO INC.制造)的SmaI位点，从而得到pHSGMphoC。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(dye terminator cycle sequencing kit；由PEApplied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。接下来，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收pHSGMphoC的BamHI-KpnI片段，使用DNA blunting Kit(由TAKARA BIO INC.制造)将所述片段的末端平端化。接下来，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收实施例1(1)中构建的pAYCTER3的SmaI片段，然后将已末端平端化的BamHI-KpnI片段插入，从而得到pAYCMphoC。按照前述方法对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的异源融合基因。

(2)酸性磷酸酶基因在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的表达

用上述(1)中构建的pAYCMphoC(通过将源自食甲基嗜甲基菌ATCC53528的甲醇脱氢酶的启动子序列和信号序列与源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，选择在含25mg/l氨苄西林和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基上生长的菌株。接下来，用含25mg/l氨苄西林和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCMphoC或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，分别于37℃培养48小时。培养结束后，对携带pAYCMphoC或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，仅在携带pAYCMphoC的菌株的培养物上清液中检出了具有目标分子量即约25kDa的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，使用底物pNPP测定其磷酸酶活性，其结果：对于携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCMphoC的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了酸性磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。

实施例4：源自更换了信号序列的大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达

(1)源自更换了信号序列的大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的分泌表达质粒的构建

使用序列号30和序列号31所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色体DNA中扩增出甲醇脱氢酶的启动子区域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。序列号30所示的引物中包含限制酶HindIII的识别序列。

为了利用源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的信号序列，使用序列号32和序列号33所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的大肠杆菌K-12菌株的染色体DNA中扩增出包含信号序列的肌醇六磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食甲基嗜甲基菌甲醇脱氢酶的融合基因，序列号32所示的引物包含编码甲醇脱氢酶启动子序列的C末端侧氨基酸序列的序列，并且序列号33所示的引物包含限制酶KpnI的识别序列。

然后，混合前述扩增出的编码大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶序列的区域和前述扩增出的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶的启动子区域的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号30和序列号33的引物进行交换PCR，扩增出与食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶基因的启动子相连的大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列和成熟基因的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约2.4kb的扩增片段。使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收该HindIII-KpnI片段，并且将其插入实施例1(1)的pAYCTER3的HindIII-KpnI位点，从而得到pAYCAappA。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE AppliedBiosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。

另一方面，为了利用源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶的信号序列，使用序列号34和序列号28所示的引物，采用PCR方法，从按前述的Saito和Miura的方法制备的摩氏摩根氏菌菌株的染色体DNA中扩增出包含信号序列的酸性磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与食甲基嗜甲基菌甲醇脱氢酶的融合基因，序列号34所示的引物包含编码甲醇脱氢酶的启动子序列的C末端侧氨基酸序列的序列。

混合前述扩增出的酸性磷酸酶基因和前述的甲醇脱氢酶的启动子区域的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号30和序列号28的引物进行交换PCR，扩增出与食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶基因的启动子相连的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的信号序列和成熟基因的融合基因。进一步，以该融合基因为模板，使用序列号30和序列号35所示的引物扩增出食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶基因的启动子和摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的信号序列部分。为了构建与大肠杆菌肌醇六磷酸酶的融合基因，序列号35所示的引物包含编码肌醇六磷酸酶成熟型序列的N末端侧氨基酸序列的序列。

混合前述扩增出的甲醇脱氢酶的启动子区域与酸性磷酸酶的信号序列的融合基因和在实施例2(2)中扩增出的肌醇六磷酸酶基因的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号30和序列号33的引物进行交换PCR，扩增出与食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶基因的启动子相连的摩氏摩根氏菌酸性磷酸酶的信号序列与大肠杆菌肌醇六磷酸酶成熟基因的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约2.4kb的扩增片段。用限制酶HindIII和KpnI处理该扩增片段，使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收HindIII-KpnI片段，并且将其插入实施例1(1)中获得的pAYCTER3的HindIII-KpnI位点，从而得到pAYCCappA。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。

(2)与大肠杆菌肌醇六磷酸酶的信号序列及摩氏摩根氏菌酸性磷酸酶的信号序列相连的大肠杆菌成熟型肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的表达

用上述(1)中构建的pAYCAappA(通过将源自食甲基嗜甲基菌ATCC53528的甲醇脱氢酶的启动子序列和源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的信号序列与成熟型序列的基因相连接来获得)、和pAYCCappA(通过将源自食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶的启动子序列和源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的成熟型序列的基因相连接来获得)及作为对照的pAYCTER3分别转化食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，选择在含25mg/l氨苄西林和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基上生长的菌株。接下来，用含25mg/l氨苄西林和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，分别于37℃培养48小时。培养结束后，对携带pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，结果仅在携带pAYCAappA和携带pAYCCappA的菌株的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性，其结果：对于携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCAappA和携带pAYCCappA的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，分别在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。酶活性的测定方法与前述实施例2中记载的方法相同。

实施例5：源自大肠杆菌K-12菌株的更换了启动子的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表达

(1)源自大肠杆菌K-12菌株的更换了启动子的肌醇六磷酸酶的分泌表达质粒构建

为了利用tac启动子，以pKK223-3(由Pharmacia制造)为模板，使用序列号36和序列号37所示的引物，采用PCR方法，扩增出tac启动子区域。所使用的tac启动子的序列如序列号12所示。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。序列号36所示的引物中包含限制酶EcoRI的识别序列。

以实施例2(2)得到的pAYCMappA为模板，使用序列号38和序列号39所示的引物，采用PCR方法，扩增出源自食甲基嗜甲基菌的甲醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶(成熟型)的融合基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)进行PCR反应，反应条件采用制造商建议的方案。为了构建与tac启动子的融合基因，序列号38所示的引物包含tac启动子的一部分的序列，而序列号39所示的引物包含限制酶EcoRI的识别序列。

然后，混合前述扩增出的编码tac启动子序列的区域和前述扩增出的编码源自食甲基嗜甲基菌的甲醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶(成熟型)的融合基因的区域的PCR反应液1μl作为模板，使用序列号36和序列号39的引物进行交换PCR，扩增出与tac启动子相连的源自食甲基嗜甲基菌的甲醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的成熟基因的融合基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约1.6kb的扩增片段。用EcoRI处理该扩增片段，然后使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收所述EcoRI片段，并且将其插入实施例1(1)获得的pAYCTER3的EcoRI位点，从而得到pAYCPtacMappA。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE Applied Biosystems制造)。

(2)与tac启动子相连的源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的表达

用上述(1)中构建的pAYCPtacMappA(通过将tac启动子序列和源自食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的甲醇脱氢酶的信号序列与源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶的成熟型序列的基因相连接得到)及作为对照的pAYCTER3分别转化食甲基嗜甲基菌ATCC 53528菌株，选择在含25mg/l氨苄西林和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基上生长的菌株。接下来，用含25mg/l氨苄西林和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCPtacMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，分别于37℃培养48小时。培养结束后，对携带pAYCPtacMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC53528的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，仅在携带pAYCPtacMappA的菌株的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性，其结果：对于携带pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCPtacMappA的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528，在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。酶活性的测定方法与前述实施例2中记载的方法相同。实施例6：源自大肠杆菌K-12菌株的β-内酰胺酶在糖原甲基菌ATCC 29475中的分泌表达

(1)在糖原甲基菌ATCC 29475中发挥功能的表达质粒pAYCTER-tet的构建糖原甲基菌ATCC 29475菌株具有氨苄西林和链霉素抗性，但对四环素敏感，因此将四环素抗性基因导入实施例1(1)中制备的分泌表达质粒pAYCTER3。以pRK310(见Plasmid.1985 Mar；13(2)：149-53)为模板，使用序列号23和序列号24的引物，采用PCR方法，扩增出四环素抗性基因。通过琼脂糖凝胶电泳检测出约1.5kb的扩增片段。用限制酶BamHI处理该扩增片段，然后使用EASYTRAP Ver.2(由TAKARA BIO INC.制造)从琼脂糖凝胶中回收所述片段，并且将其插入实施例1(1)得到的pAYCTER3的BamHI位点，从而得到pAYCTER-tet。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。序列号23和序列号24所示的引物包含限制酶BamHI的识别序列。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE AppliedBiosystems制造)。

(2)β-内酰胺酶在糖原甲基菌ATCC 29475中的分泌表达

用在上述(1)中构建的pAYCTER-tet转化糖原甲基菌ATCC 29475，选择在含5mg/l四环素和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基(硫酸铵5g、K₂HPO₄ 1.9g、NaH₂PO₄·2 H₂O 1.56g、硫酸镁200mg、氯化钙72mg、硫酸铜5μg、硫酸锰25μg、硫酸锌23μg、三氯化铁9.7mg、琼脂15g，溶于1L H₂O，调至pH 7.0)上生长的菌株。接下来，用含5mg/l四环素和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC 29475，培养条件为30℃、48小时。培养结束后，对携带pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC29475的菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，可以检测出培养物上清中含有与β-内酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白测序仪PPSQ-21A(由岛津制作所制造)测定该蛋白的N末端序列，结果确定其为β-内酰胺酶的成熟型序列，从而确认了β-内酰胺酶分泌至培养物上清液中的事实。

实施例7：源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶在糖原甲基菌ATCC29475中的分泌表达

(1)糖原甲基菌ATCC 29475中源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的分泌表达质粒的构建

为了在糖原甲基菌ATCC 29475菌株中分泌表达源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶，将实施例6(1)中制备的四环素抗性基因的BamHI处理片段插入实施例5(1)中制备的肌醇六磷酸酶分泌表达质粒pAYCPtacMappA的BamHI位点，从而得到pAYCPtacMappA-tet。对插入片段进行碱基序列测定的结果确认构建了如预想的融合基因。碱基序列的测定使用染料终止循环测序试剂盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA测序仪373A(由PE AppliedBiosystems制造)。

(2)源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶在糖原甲基菌ATCC 29475中的表达

用上述(1)中构建的pAYCPtacMappA-tet或作为对照的实施例6(2)中构建的pAYCTER-tet分别转化糖原甲基菌ATCC 29475，选择在含5mg/l四环素和1％甲醇的SEIIA琼脂培养基上生长的菌株。接下来，用含5mg/l四环素和2％甲醇的SEIIA液体培养基培养选出的携带pAYCPtacMappA-tet或pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC 29475，分别于37℃培养48小时。培养结束后，对携带pAYCPtacMappA-tet或pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC29475的各菌体的培养物上清液进行SDS-PAGE，结果仅在携带pAYCPtacMappA-tet的菌株的培养物上清液中检出了具有目标分子量的蛋白。然后，以各菌体的培养物上清液为粗酶液，测定其肌醇六磷酸酶活性，其结果：对于携带pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC 29475，在其培养物上清液中未检出酶活性；而对于携带pAYCPtacMappA-tet的糖原甲基菌ATCC29475，在其培养物上清液中检出了酶活性，从而确认了肌醇六磷酸酶分泌至培养物上清液中的事实。酶活性的测定方法与前述实施例2中记载的方法相同。

工业实用性

通过本发明可以廉价、高效地进行蛋白质的分泌生产。特别是可以高效地分泌生产具有产业价值的蛋白质，例如肌醇六磷酸酶等。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，INC.)

<120>C627-C6042

<130>蛋白质的生产方法

<150>JP2005-139798

<151>2005-05-12

<160>39

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>1

aacgggtggc tactacagcc agcacaacag                   30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

ttttcagcca cgatcaggtt gccgttttcg                   30

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>3

aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagctta    57

<210>4

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的DNA

<400>4

gatctaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcg    57

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

ctatgatcat ttgcctggcg gcagtagcgc                                  30

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

cttagatctc aaaaagagtt tgtagaaacg c                                31

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

cagagtgagc cggagctgaa gct                                 23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

acagttcttc gtttgtcatc agc                                 23

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

ctgttcctgc acctgcatgg catggc                              26

<210>10

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

agcttcagct ccggctcact ctgtgccaca gccaggccgg aaatgc      46

<210>11

<211>1000

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>甲醇脱氢酶启动子

<400>11

ctgttcctgc acctgcatgg catggcgcgc caataccctg ttttctttca gtgtacgctc  60

aagatcttgc tctaccaggc attgctcggt catatcgacc agataaccat gaatctgggc  120

agcatcatga atatcttcag ccgggacgta aataaagcgg gcgccgacat agcaaggcaa  180

cccatccggc cgacggatct gcagtttatt gaaattgatt tccttgtgat gctgcaactg  240

cagcacaaac tccggccaat gaaaagaaaa cagacggctg gcattgcggt tggtgctgag  300

cgggcggcag atacggtcaa aagcacgatt atgcatgcca atattgcctt caacatccag  360

caccacgttg cccgtcaggt cgccatcaaa aagcgtgata tagagttgct ggctgttgcg  420

taactgcatt tcagtttgtt tgcggcgctg aatttctgcg tggatctcct gcatgcgtcg  480

ctggctgaac cacacactca gtaacacaaa cacaaacagg gtgagcggga tttcatccag  540

ttgggcatat tcataggtca gcagccaggc ggtgacacgt tcggccaagt caaattgtga  600

cgacaaaaca aaagtcagtg ccacgcctgc gatcacgatg agcgtgtcac gactggagcg  660

gcttaatttg cccagctttt gaatgtcagt aatcacaggg atagaccggt tataagaatg  720

catgatgagg tgaccaaata cttccaaatt gcttctgcac gcgaatatga gggtcatgta  780

cagacatgcg cactatagac cacattcatt gccattgccc cgtgaaaaat tccctttatt  840

ggccggtctg taggaatgaa ttcttgaatc catcataggg aatctttcat ctattgcctt  900

tgttagaaat tattaacaat tcggttcgtg aagtgcggca ttcggggggg tgtctgccac  960

aacacttaaa aaacgcattc ttaagagatt gggagaaagt                        1000

<210>12

<211>151

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223>tac启动子

<400>12

cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa  60

tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa  120

tttcaccctg caggcaaagg agatgagcgt a                                 151

<210>13

<211>1722

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>甲醇脱氢酶基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1722)

<223>

<400>13

atg gca gat gca gac ctg gac aag cag gtg aat aca gcc ggt gct tgg     48

Met Ala Asp Ala Asp Leu Asp Lys Gln Val Asn Thr Ala Gly Ala Trp

1               5                   10                  15

cca att gca acg ggt ggc tac tac agc cag cac aac agt ccg ctg gca     96

Pro Ile Ala Thr Gly Gly Tyr Tyr Ser Gln His Asn Ser Pro Leu Ala

            20                  25                  30

caa att aac aaa tcc aac gtt aaa aac gtc aaa gca gcc tgg tca ttt    144

Gln Ile Asn Lys Ser Asn Val Lys Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser Phe

        35                  40                  45

tca acg ggt gtc ttg aat ggt cac gaa ggt gcg cca ttg gtc atc ggt    192

Ser Thr Gly Val Leu Asn Gly His Glu Gly Ala Pro Leu Val Ile Gly

    50                  55                  60

gac atg atg tat gtg cac tcc gct ttt cca aac aat act tat gcg ctg    240

Asp Met Met Tyr Val His Ser Ala Phe Pro Asn Asn Thr Tyr Ala Leu

65                  70                  75                  80

aat ctg aac gat cca ggc aag att gtc tgg caa cac aag cct aag caa    288

Asn Leu Asn Asp Pro Gly Lys Ile Val Trp Gln His Lys Pro Lys Gln

                85                  90                  95

gat gct tcc acc aaa gcc gtg atg tgc tgt gac gtg gtt gac cgt ggt    336

Asp Ala Ser Thr Lys Ala Val Met Cys Cys Asp Val Val Asp Arg Gly

            100                 105                 110

ctg gct tac ggc gcg ggg caa att gtt aaa aaa caa gcc aac ggt cac    384

Leu Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Ile Val Lys Lys Gln Ala Asn Gly His

        115                 120                 125

ttg ctg gcg ttg gat gcc aaa act ggc aaa atc aac tgg gaa gta gaa    432

Leu Leu Ala Leu Asp Ala Lys Thr Gly Lys Ile Asn Trp Glu Val Glu

    130                 135                 140

gtg tgt gat cca aaa gtg ggt tca aca ctg aca caa gcg cct ttt gtg    480

Val Cys Asp Pro Lys Val Gly Ser Thr Leu Thr Gln Ala Pro Phe Val

145                 150                 155                 160

gct aaa gac acg gta ttg atg ggg tgt tca ggt gct gag ctg ggt gta  528

Ala Lys Asp Thr Val Leu Met Gly Cys Ser Gly Ala Glu Leu Gly Val

                165                 170                 175

cgt ggt gct gtg aac gcc ttt gac ctg aaa aca ggt gaa ttg aaa tgg  576

Arg Gly Ala Val Asn Ala Phe Asp Leu Lys Thr Gly Glu Leu Lys Trp

            180                 185                 190

cgt gca ttt gca acc ggt tct gat gac tct gtt cgc ctg gcc aaa gac  624

Arg Ala Phe Ala Thr Gly Ser Asp Asp Ser Val Arg Leu Ala Lys Asp

        195                 200                 205

ttc aac agt gca aac cca cat tac ggt caa ttc ggc ctg ggg act aaa  672

Phe Asn Ser Ala Asn Pro His Tyr Gly Gln Phe Gly Leu Gly Thr Lys

    210                 215                 220

acc tgg gaa ggc gat gcc tgg aaa att ggt ggc ggt acc aac tgg ggt  720

Thr Trp Glu Gly Asp Ala Trp Lys Ile Gly Gly Gly Thr Asn Trp Gly

225                 230                 235                 240

tgg tat gcc tat gac cct aaa ttg aac ctg ttc tac tac ggt tca ggt  768

Trp Tyr Ala Tyr Asp Pro Lys Leu Asn Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly

                245                 250                 255

aac ccg gcc cca tgg aac gaa acc atg cgt cct ggc gac aac aag tgg  816

Asn Pro Ala Pro Trp Asn Glu Thr Met Arg Pro Gly Asp Asn Lys Trp

            260                 265                 270

acg atg acc atc tgg ggt cgt gac ctc gac acc ggc atg gcg aaa tgg  864

Thr Met Thr Ile Trp Gly Arg Asp Leu Asp Thr Gly Met Ala Lys Trp

        275                 280                 285

ggc tac caa aaa acg ccg cat gat gag tgg gac ttt gct ggt gtg aat  912

Gly Tyr Gln Lys Thr Pro His Asp Glu Trp Asp Phe Ala Gly Val Asn

    290                 295                 300

cag atg gtg ctg act gat caa cca gtc aac ggc aaa atg acg ccg ctg  960

Gln Met Val Leu Thr Asp Gln Pro Val Asn Gly Lys Met Thr Pro Leu

305                 310                 315                 320

ctg agc cac atc gac cgt aac ggt atc ttg tac aca ctg aac cgc gaa  1008

Leu Ser His Ile Asp Arg Asn Gly Ile Leu Tyr Thr Leu Asn Arg Glu

                325                 330                 335

aac ggc aac ctg atc gtg gct gaa aaa gtg gac ccg gct gtc aac gtg  1056

Asn Gly Asn Leu Ile Val Ala Glu Lys Val Asp Pro Ala Val Asn Val

            340                 345                 350

ttc aaa aaa gtg gac ctg aaa act ggg aca cca gtc cgt gac ccg gaa  1104

Phe Lys Lys Val Asp Leu Lys Thr Gly Thr Pro Val Arg Asp Pro Glu

        355                 360                 365

ttc gcg aca cgt atg gac cat aaa ggc acc aac att tgt cca tcc gcg  1152

Phe Ala Thr Arg Met Asp His Lys Gly Thr Asn Ile Cys Pro Ser Ala

    370                 375                 380

atg ggc ttc cac aac cag ggt gtt gac tct tac gat cca gaa agc cgc  1200

Met Gly Phe His Ash Gln Gly Val Asp Ser Tyr Asp Pro Glu Ser Arg

385                 390                 395                 400

acc ttg tac gct ggc ctg aac cac att tgt atg gat tgg gag ccg ttc  1248

Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Asn His Ile Cys Met Asp Trp Glu Pro Phe

                405                 410                 415

atg ctg cca tac cgt gcc ggt cag ttc ttc gtt ggt gca acg ctg gcg  1296

Met Leu Pro Tyr Arg Ala Gly Gln Phe Phe Val Gly Ala Thr Leu Ala

            420                 425                 430

atg tac cct ggc ccg aac ggc cca acc aag aaa gaa atg ggt cag att  1344

Met Tyr Pro Gly Pro Asn Gly Pro Thr Lys Lys Glu Met Gly Gln Ile

        435                 440                 445

cgt gca ttt gac ctg acc act ggt aaa gct aaa tgg act aag tgg gag  1392

Arg Ala Phe Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ala Lys Trp Thr Lys Trp Glu

    450                 455                 460

aaa ttc gcg gct tgg ggc ggt act ttg tac acc aaa ggt ggc ctg gtt  1440

Lys Phe Ala Ala Trp Gly Gly Thr Leu Tyr Thr Lys Gly Gly Leu Val

465                 470                 475                 480

tgg tat gca acg ctg gat ggt tac ctg aaa gcc ttg gat aac aaa gac  1488

Trp Tyr Ala Thr Leu Asp Gly Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Asn Lys Asp

                485                 490                 495

ggt aaa gag ctg tgg aac ttc aag atg cca tct ggt ggt atc gga tcg  1536

Gly Lys Glu Leu Trp Asn Phe Lys Met Pro Ser Gly Gly Ile Gly Ser

            500                 505                 510

cca atg act tac tcc ttt aaa ggc aag caa tac atc ggc agc atg tac  1584

Pro Met Thr Tyr Ser Phe Lys Gly Lys Gln Tyr Ile Gly Ser Met Tyr

        515                 520                 525

ggt gtt ggc ggc tgg cct ggc gtg ggt ctg gtg ttt gac ctg aca gac  1632

Gly Val Gly Gly Trp Pro Gly Val Gly Leu Val Phe Asp Leu Thr Asp

    530                 535                 540

ccg agt gct ggt ttg ggt gcg gtg ggt gcg ttc aga gaa ctg caa aac  1680

Pro Ser Ala Gly Leu Gly Ala Val Gly Ala Phe Arg Glu Leu Gln Asn

545                 550                 555                 560

cac aca caa atg ggc ggt ggc ctg atg gtg ttc agc ctg taa          1722

Ths Thr Gln Met Gly Gly Gly Leu Met Val Phe Ser Leu

                565                 570

<210>14

<211>573

<212>PRT

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>甲醇脱氢酶蛋白

<400>14

Met Ala Asp Ala Asp Leu Asp Lys Gln Val Asn Thr Ala Gly Ala Trp

1               5                   10                  15

Pro Ile Ala Thr Gly Gly Tyr Tyr Ser Gln His Asn Ser Pro Leu Ala

            20                  25                  30

Gln Ile Asn Lys Ser Asn Val Lys Asn Val Lys Ala Ala Trp Ser Phe

        35                  40                  45

Ser Thr Gly Val Leu Asn Gly His Glu Gly Ala Pro Leu Val Ile Gly

    50                  55                  60

Asp Met Met Tyr Val His Ser Ala Phe Pro Asn Asn Thr Tyr Ala Leu

65                  70                  75                  80

Asn Leu Asn Asp Pro Gly Lys Ile Val Trp Gln His Lys Pro Lys Gln

                85                  90                  95

Asp Ala Ser Thr Lys Ala Val Met Cys Cys Asp Val Val Asp Arg Gly

            100                 105                 110

Leu Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Ile Val Lys Lys Gln Ala Asn Gly His

        115                 120                 125

Leu Leu Ala Leu Asp Ala Lys Thr Gly Lys Ile Asn Trp Glu Val Glu

    130                 135                 140

Val Cys Asp Pro Lys Val Gly Ser Thr Leu Thr Gln Ala Pro Phe Val

145                 150                 155                 160

Ala Lys Asp Thr Val Leu Met Gly Cys Ser Gly Ala Glu Leu Gly Val

                165                 170                 175

Arg Gly Ala Val Asn Ala Phe Asp Leu Lys Thr Gly Glu Leu Lys Trp

            180                 185                 190

Arg Ala Phe Ala Thr Gly Ser Asp Asp Ser Val Arg Leu Ala Lys Asp

        195                 200                 205

Phe Asn Ser Ala Asn Pro His Tyr Gly Gln Phe Gly Leu Gly Thr Lys

    210                 215                 220

Thr Trp Glu Gly Asp Ala Trp Lys Ile Gly Gly Gly Thr Asn Trp Gly

225                 230                 235                 240

Trp Tyr Ala Tyr Asp Pro Lys Leu Asn Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Gly

                245                 250                 255

Asn Pro Ala Pro Trp Asn Glu Thr Met Arg Pro Gly Asp Asn Lys Trp

            260                 265                 270

Thr Met Thr Ile Trp Gly Arg Asp Leu Asp Thr Gly Met Ala Lys Trp

        275                 280                 285

Gly Tyr Gln Lys Thr Pro His Asp Glu Trp Asp Phe Ala Gly Val Asn

    290                 295                 300

Gln Met Val Le u ThrAsp Gln Pro Val Asn Gly Lys Met Thr Pro Leu

305                 310                 315                 320

Leu Ser His Ile Asp Arg Asn Gly Ile Leu Tyr Thr Leu Asn Arg Glu

                325                 330                 335

Asn Gly Asn Leu Ile Val Ala Glu Lys Val Asp Pro Ala Val Asn Val

            340                 345                 350

Phe Lys Lys Val Asp Leu Lys Thr Gly Thr Pro Val Arg Asp Pro Glu

        355                 360                 365

Phe Ala Thr Arg Met Asp His Lys Gly Thr Asn Ile Cys Pro Ser Ala

    370                 375                 380

Met Gly Phe His Asn Gln Gly Val Asp Ser Tyr Asp Pro Glu Ser Arg

385                 390                 395                 400

Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Asn His Ile Cys Met Asp Trp Glu Pro Phe

                405                 410                 415

Met Leu Pro Tyr Arg Ala Gly Gln Phe Phe Val Gly Ala Thr Leu Ala

            420                 425                 430

Met Tyr Pro Gly Pro Asn Gly Pro Thr Lys Lys Glu Met Gly Gln Ile

        435                 440                 445

Arg Ala Phe Asp Leu Thr Thr Gly Lys Ala Lys Trp Thr Lys Trp Glu

    450                 455                 460

Lys Phe Ala Ala Trp Gly Gly Thr Leu Tyr Thr Lys Gly Gly Leu Val

465                 470                 475                 480

Trp Tyr Ala Thr Leu Asp Gly Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Asn Lys Asp

                485                 490                 495

Gly Lys Glu Leu Trp Asn Phe Lys Met Pro Ser Gly Gly Ile Gly Ser

            500                 505                 510

Pro Met Thr Tyr Ser Phe Lys Gly Lys Gln Tyr Ile Gly Ser Met Tyr

        515                 520                 525

Gly Val Gly Gly Trp Pro Gly Val Gly Leu Val Phe Asp Leu Thr Asp

    530                 535                 540

Pro Ser Ala Gly Leu Gly Ala Val Gly Ala Phe Arg Glu Leu Gln Asn

545                 550                 555                 560

His Thr Gln Met Gly Gly Gly Leu Met Val Phe Ser Leu

                565                 570

<210>15

<211>1299

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223>肌醇六磷酸酶基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1299)

<223>

<400>15

atg aaa gcg atc tta atc cca ttt tta tct ctt ctg att ccg tta acc     48

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1               5                   10                  15

ccg caa tct gca ttc gct cag agt gag ccg gag ctg aag ctg gaa agt     96

Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser

            20                  25                  30

gtg gtg att gtc agt cgt cat ggt gtg cgt gct cca acc aag gcc acg    144

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr

        35                  40                  45

caa ctg atg cag gat gtc acc cca gac gca tgg cca acc tgg ccg gta    192

Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val

    50                  55                  60

aaa ctg ggt tgg ctg aca ccg cgc ggt ggt gag cta atc gcc tat ctc    240

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu

65                  70                  75                  80

gga cat tac caa cgc cag cgt ctg gta gcc gac gga ttg ctg gcg aaa    288

Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Lcu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys

                85                  90                  95

aag ggc tgc ccg cag tct ggt cag gtc gcg att att gct gat gtc gac    336

Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp

            100                 105                 110

gag cgt acc cgt aaa aca ggc gaa gcc ttc gcc gcc ggg ctg gca cct    384

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro

        115                 120                 125

gac tgt gca ata acc gta cat acc cag gca gat acg tcc agt ccc gat    432

Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp

    130                 135                 140

ccg tta ttt aat cct cta aaa act ggc gtt tgc caa ctg gat aac gcg    480

Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala

145                 150                 155                 160

aac gtg act gac gcg atc ctc agc agg gca gga ggg tca att gct gac    528

Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp

                165                 170                 175

ttt acc ggg cat cgg caa acg gcg ttt cgc gaa ctg gaa cgg gtg ctt    576

Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu

            180                 185                 190

aat ttt ccg caa tca aac ttg tgc ctt aaa cgt gag aaa cag gac gaa    624

Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu

        195                 200                 205

agc tgt tca tta acg cag gca tta cca tcg gaa ctc aag gtg agc gcc    672

Scr Cys Ser Lcu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala

    210                 215                 220

gac aat gtc tca tta acc ggt gcg gta agc ctc gca tca atg ctg acg     720

Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr

225                 230                 235                 240

gag ata ttt ctc ctg caa caa gca cag gga atg ccg gag ccg ggg tgg     768

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp

                245                 250                 255

gga agg atc acc gat tca cac cag tgg aac acc ttg cta agt ttg cat     816

Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His

            260                 265                 270

aac gcg caa ttt tat ttg cta caa cgc acg cca gag gtt gcc cgc agc     864

Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser

        275                 280                 285

cgc gcc acc ccg tta tta gat ttg atc aag aca gcg ttg acg ccc cat     912

Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His

    290                 295                 300

cca ccg caa aaa cag gcg tat ggt gtg aca tta ccc act tca gtg ctg     960

Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu

305                 310                 315                 320

ttt atc gcc gga cac gat act aat ctg gca aat ctc ggc ggc gca ctg    1008

Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu

                325                 330                 335

gag ctc aac tgg acg ctt ccc ggt cag ccg gat aac acg ccg cca ggt    1056

Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly

            340                 345                 350

ggt gaa ctg gtg ttt gaa cgc tgg cgt cgg cta agc gat aac agc cag    1104

Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln

        355                 360                 365

tgg att cag gtt tcg ctg gtc ttc cag act tta cag cag atg cgt gat    1152

Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp

    370                 375                 380

aaa acg ccg ctg tca tta aat acg ccg ccc gga gag gtg aaa ctg acc    1200

Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr

385                 390                 395                 400

ctg gca gga tgt gaa gag cga aat gcg cag ggc atg tgt tcg ttg gca    1248

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala

                405                 410                 415

ggt ttt acg caa atc gtg aat gaa gca cgc ata ccg gcg tgc agt ttg    1296

Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

            420                 425                 430

taa                                                                1299

<210>16

<211>432

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<223>肌醇六磷酸酶蛋白

<400>16

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1               5                   10                  15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser

            20                  25                  30

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr

        35                  40                  45

Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val

    50                  55                  60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys

                85                  90                  95

Lys Gly Cys Pro Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp

            100                 105                 110

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro

        115                 120                 125

Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp

    130                 135                 140

Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala

145                 150                 155                 160

Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp

                165                 170                 175

Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu

            180                 185                 190

Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu

        195                 200                 205

Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala

    210                 215                 220

Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr

225                 230                 235                 240

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp

                245                 250                 255

Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His

            260                 265                 270

Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser

        275                 280                 285

Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His

    290                 295                 300

Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu

305                 310                 315                 320

Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu

                325                 330                 335

Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly

            340                 345                 350

Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln

        355                 360                 365

Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp

    370                 375                 380

Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr

385                 390                 395                 400

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala

                405                 410                 415

Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

            420                 425                 430

<210>17

<211>81

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>编码甲醇脱氢酶的信号序列的基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<223>

<400>17

atg aaa ctg aaa tca tcc cgt gcc gtt gtt ggc gct ttg gtt ggg ggc    48

Met Lys Leu Lys Ser Ser Arg Ala Val Val Gly Ala Leu Val Gly Gly

1               5                   10                  15

ttg ttt gca agc att tcc ggc ctg gct gtg gca                        81

Leu Phe Ala Ser Ile Ser Gly Leu Ala Val Ala

            20                  25

<210>18

<211>27

<212>PRT

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>甲醇脱氢酶的信号序列

<400>18

Met Lys Leu Lys Ser Ser Arg Ala Val Val Gly Ala Leu Val Gly Gly

1               5                   10                  15

Leu Phe Ala Ser Ile Ser Gly Leu Ala Val Ala

            20                  25

<210>19

<211>66

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>编码肌醇六磷酸酶的信号序列的基因

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(66)

<223>

<400>19

atg aaa gcg atc tta atc cca ttt tta tct ctt ctg att ccg tta acc    48

Met Lys Ila Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1               5                   10                  15

ccg caa tct gca ttc gct                                            66

Pro Gln Ser Ala Phe Ala

            20

<210>20

<211>22

<212>PRT

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>肌醇六磷酸酶的信号序列

<400>20

Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr

1               5                   10                  15

Pro Gln Ser Ala Phe Ala

            20

<210>21

<211>864

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>σE基因的启动子

<400>21

gatcaaaaac gatttggcat gcggatggta aaggcaggtg gggtgaaact gcacaaattc    60

caggttggct acccggcaac cggcccgcca tcccatcgca atcccgtcac cggtactgat    120

gtctgggttg gtggtatata agtagacctt gcctgcgccg cctgttgcca tcacggtgta    180

ttgtgcggag agagtaatca ccttgccgga ctggttgttg agcacatagg cgcccaggca    240

acggttgggg ccgtccgttg cggtctgctt gaagagttta tgcgtggtga tcagatcgac    300

tgcaatgtga tgttcaagga tggtgatatt cgggtgctcg cgcacacggt cggtcaaggt    360

tgtctgcacc gcttgtccgg tggcatcagc gacatgcacc acgcggcgat ggctatggcc    420

gccttcacgc gtcaggtgca ggcggtcatc ttcagcctcg cgggtaaaat taaccccttg    480

ctgtaataac cattcaatac tggcacggcc attggtgacc accatgcgcg tgacctcgct    540

gtcacataat ccagcgccgg catccaatgt atctttaata tgggcttcta ctgaatcctc    600

gttgttaaga actgcagcaa tccccccctg cgcccagttg ctggcactca tggttaattc    660

acgtttgctc agtatgcata ccctatgatt atctgccagg cgtaaggcca atgactggcc    720

tgccagacca ctgccaataa tcagcacatc gaacatttta ttcataggat ggtggggtca    780

atggaacttt gaagagatgt tcaggtcata tcaattgcca acattgctat ttgacattgt    840

aggcaaaaaa taagggatga gacg                                           864

<210>22

<211>1276

<212>DNA

<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)

<220>

<223>核糖体蛋白基因的启动子

<400>22

gatctggcac aaacattgaa caattaggca gtctcccttt ccaaattaaa tcgtgtattg     60

gataaaatag cgtttgttac gcacagactg agcatttttt ctgttaggta atcaatgggc    120

atattgaaca aacttccagg tggagtacgc taccccagcc ataaagaatg gcagttatta    180

aaaaaactgc caaaatggtg gctggtgggg acagtactgt tcgcagcccc tattgtgcat     240

gcctggtggc aagacggtga tttgctgacg catgatattg agcgtacctc catgtttctg     300

ggcctgctgt ttaccttctg gttttttata ggcgcgatga tgattggcct gatagtgatc     360

attatcatga aagggccagg ctatgtatca gacccttatt acctacccaa ggaagacaaa     420

agcctggaga atccacccag agaggaataa gtgcttgatt gcaacatgaa aatcagttta     480

taatcgcctg tttttcaacc ttgccacact ttgttcgtga ccttttaagt gttttgacac     540

aaaaagggtt ggctctgaag gtggctttaa accacaagga aatctcatgc gacactatga     600

aatcgtgttt attgttcacc ctgaccagag tgaacaagtg cctgcgatga ttgagcgtta     660

ccgcgcacaa atcacaggca atggcggcaa catccaccgt ctggaagact ggggccgccg     720

tcaacttgcc tacccaattc aaaaagtaca caaagcgcac tatgtgttga tgaacatcga     780

gtgcagccag gaagtgctgg aagagctgga gcatggcttc aaatttaacg atgctgtatt     840

acgtcacctg accatctcga ctaaaacagc cgtcacagca ccaagcccaa tgatgaaaga     900

ggaaaaatcc aaaaccatcg taggtgatgc acctgctgcg accactgagg cagctgctta     960

agggttgtga atacgctggt gattgcggca accattcact ctgttgaagc gttgcgttac    1020

acaccggcag gcttaccctt gttgcgattg caattgcaac atgattcaga acagcaagaa    1080

gccgggatga atcgcaaggt gcagtgtcag ttacccgcag tactgattgg tgaaaaagcc    1140

aatctgccat tgcaaagcgg cgatcaaatc aaagtaaaag ggtttttggc acaacgcagt    1200

gcaaagagca cacaggtggt actgcacata caagagttac agcgaataca gtattaaaga    1260

atttaaggag tttcaa                                                    1276

<210>23

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>23

cccggatccg cacggatcac tgtattcggc tgcaacttt                            39

<210>24

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR 引物

<400>24

cccggatccc cgtgttgcta ggatggttgt  tcttggatca                          39

<210>25

<211>750

<212>DNA

<213>摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(747)

<220>

<223>编码酸性磷酸酶的基因

<400>25

atg aag aag aat att atc gcc ggt tgt ctg ttc tca ctg ttt tcc ctt     48

Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu

1               5                   10                  15

tcc gcg ctg gcc gcg atc ccg gcg ggc aac gat gcc acc acc aag ccg     96

Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

            20                  25                  30

gat tta tat tat ctg aaa aat gaa cag gct atc gac agc ctg aaa ctg    144

Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu

        35                  40                  45

tta ccg cca ccg ccg gaa gtc ggc agt att cag ttt tta aat gat cag    192

Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln

    50                  55                  60

gca atg tat gag aaa ggc cgt atg ctg cgc aat acc gag cgc gga aaa    240

Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys

65                  70                  75                  80

cag gca cag gca gat gct gac ctg gcc gca ggg ggt gtg gca acc gca    288

Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala

                85                  90                  95

ttt tca ggg gca ttc ggc tat ccg ata acc gaa aaa gac tct ccg gag    336

Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu

            100                 105                 110

ctg tat aaa ctg ctg acc aat atg att gag gat gcc ggt gat ctt gcc    384

Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

        115                 120                 125

acc cgc tcc gcc aaa gaa cat tac atg cgc atc cgg ccg ttt gcg ttt    432

Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg lle Arg Pro Phe Ala Phe

    130                 135                 140

tac ggc aca gaa acc tgt aat acc aaa gat cag aaa aaa ctc tcc acc    480

Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr

145                 150                 155                 160

aac gga tct tac ccg tca ggt cat acg tct atc ggc tgg gca acc gca    528

Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

                165                 170                 175

ctg gtg ctg gcg gaa gtg aac ccg gca aat cag gat gcg att ctg gaa    576

Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu

            180                 185                 190

cgg ggt tat cag ctc gga cag agc cgg gtg att tgc ggc tat cac tgg    624

Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

        195                 200                 205

cag agt gat gtg gat gcc gcg cgg att gtc ggt tca gcc gct gtc gcg    672

Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala

    210                 215                 220

aca tta cat tcc gat ccg gca ttt cag gcg cag tta gcg aaa gcc aaa    720

Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys

225                 230                 235                 240

cag gaa ttt gca caa aaa tca cag aaa taa                            750

Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys

                245

<210>26

<211>249

<212>PRT

<213>摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)

<220>

<223>酸性磷酸酶

<400>26

Met Lys Lys Asn Ile Ile Ala Gly Cys Leu Phe Ser Leu Phe Ser Leu

1               5                   10                  15

Ser Ala Leu Ala Ala Ile Pro Ala Gly Asn Asp Ala Thr Thr Lys Pro

            20                  25                  30

Asp Leu Tyr Tyr Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ile Asp Ser Leu Lys Leu

        35                  40                  45

Leu Pro Pro Pro Pro Glu Val Gly Ser Ile Gln Phe Leu Asn Asp Gln

    50                  55                  60

Ala Met Tyr Glu Lys Gly Arg Met Leu Arg Asn Thr Glu Arg Gly Lys

65                  70                  75                  80

Gln Ala Gln Ala Asp Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Ala

                85                  90                  95

Phe Ser Gly Ala Phe Gly Tyr Pro Ile Thr Glu Lys Asp Ser Pro Glu

            100                 105                 110

Leu Tyr Lys Leu Leu Thr Asn Met Ile Glu Asp Ala Gly Asp Leu Ala

        115                 120                 125

Thr Arg Ser Ala Lys Glu His Tyr Met Arg Ile Arg Pro Phe Ala Phe

    130                 135                 140

Tyr Gly Thr Glu Thr Cys Asn Thr Lys Asp Gln Lys Lys Leu Ser Thr

145                 150                 155                 160

Asn Gly Ser Tyr Pro Ser Gly His Thr Ser Ile Gly Trp Ala Thr Ala

                165                 170                 175

Leu Val Leu Ala Glu Val Asn Pro Ala Asn Gln Asp Ala Ile Leu Glu

            180                 185                 190

Arg Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Ser Arg Val Ile Cys Gly Tyr His Trp

        195                 200                 205

Gln Ser Asp Val Asp Ala Ala Arg Ile Val Gly Ser Ala Ala Val Ala

    210                 215                 220

Thr Leu His Ser Asp Pro Ala Phe Gln Ala Gln Leu Ala Lys Ala Lys

225                 230                 235                 240

Gln Glu Phe Ala Gln Lys Ser Gln Lys

                245

<210>27

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>27

gcatttccgg cctggctgtg gcagcgatcc cggcgggcaa cgatgccacc    50

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>28

ttatttctgt gatttttgtg caaattcc                            28

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>29

tgccacagcc aggccggaaa tgcttgcaaa caagc                     35

<210>30

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>30

ggcaagcttct gttcctgca cctgcatggc atggcgcgc                 39

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>31

actttctccc aatctcttaa gaatgcg                              27

<210>32

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>32

ttcttaagag attgggagaa agtatgaaag cgatcttaat cccatt         46

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>33

ggcggtacca cagttcttcg tttgtcatca gc                          32

<210>34

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>34

ttcttaagag attgggagaa agtatgaaga agaatattat cgccggttgt c     51

<210>35

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>35

agcttcagct ccggctcact ctgggccagc gcggaaaggg aaaac            45

<210>36

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>36

ttggaattcc ccgttctgga taatgttttt tgc                      33

<210>37

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>37

tacgctcatc tcctttgcct gcaggg                              26

<210>38

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>38

tgcaggcaaa ggagatgagc gtaatgaaac tgaaatcatc ccgtgc        46

<210>39

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>39

gccgaattca cagttcttcg tttgtcatca gc                       32

Claims (3)

1.一种蛋白质的生产方法，该方法包括通过在以甲醇为主要碳源的液体培养基中培养携带DNA构建体的专性甲醇同化细菌，使该细菌分泌目的蛋白，其中所述DNA构建体包含在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列和以可表达的形式连接于该启动子序列的、编码包括信号序列和所述目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白，

其中所述分泌指将目的蛋白由细胞内排出或释放到菌体外，不包括目的蛋白在细胞内的蓄积，

其中所述在甲醇同化细菌中发挥功能的启动子序列是食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶的启动子区域，

其中所述信号序列为选自食甲基嗜甲基菌ATCC 53528甲醇脱氢酶的信号序列区域、源自大肠杆菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的信号序列、源自摩氏摩根氏菌菌株的酸性磷酸酶的信号序列或扩增自pKK223-3的tac启动子的信号序列，

其中所述专性甲醇同化细菌为食甲基嗜甲基菌ATCC 53528菌株，

其中所述目的蛋白是肌醇六磷酸酶或酸性磷酸酶。

2.根据权利要求1的方法，其中所述启动子序列为具有序列号11的碱基序列的启动子。

3.根据权利要求1的方法，其中所述信号序列具有选自序列号18和20的氨基酸序列。