CN101162201A - 一种基因芯片的tsa-纳米金标记银染检测法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是一种基因芯片检测方法，特别是一种大幅度提高基因芯片的金标银染检测灵敏度的可视化检测方法。该检测法主要包括以下步骤：将待检测样品的基因标记生物素分子用于与基因芯片杂交。杂交后的芯片首先TSA处理，通过酶的催化作用使大量的酪氨沉积在反应位点周围；再加入链酶亲和素标记的纳米金，将纳米级的金颗粒连接到靶标分子上；使用银染试剂对杂交后的基因芯片进行显色；观察分析信号。本发明提供的方法是在单步金标银染检测的基础上增加一步TSA过程，TSA使用的Biotin－Tyxamine试剂制备方法简单、免除纯化、性能稳定、易于保存。本方法与单步金标银染检测法相比，基因芯片的检测灵敏度可以提高10－100倍。

Description

一种基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法

技术领域

本发明涉及一种基因芯片的检测方法，具体的说，涉及一种大幅度提高基因芯片检测灵敏度的TSA(Tyramine Signal Amplification，酪氨信号放大)-金标银染可视化检测方法。

背景技术

基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列，是90年代以来高科技领域最为重大的科技进展之一，是微电子学、物理学、化学、材料科学与生命科学交叉结合的高新技术。基因芯片是基于核酸互补杂交的原理而研制的，是在固相基质上按特定的排列方式固定大量呈网格状密集排列的基因探针，待分析样品通过与芯片中已知碱基顺序的DNA片段互补杂交，从而确定样品中的核酸序列和性质，对基因表达的量和特性进行分析，是高效地大规模获取相关生物信息的重要手段。基因芯片技术具有高通量、并行化、自动化的特征，在基因表达谱研究、单核苷酸多态性分析、疾病分子检测和大规模药物筛选等生物医学的众多研究领域展现出广阔的应用价值和发展前景。

基因芯片的相关技术包括：靶标和探针样品的处理和标记技术、芯片的制备技术、杂交和检测技术、以及杂交图像的分析技术等。

目前基因芯片的检测普遍采用荧光检测方法，即将荧光材料如荧光素(FITC)、青色素(Cy3、Cy5)直接或间接标记在DNA或RNA分子上，荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。荧光检测法的灵敏度高，与同位素标记法相比，避免了使用对人体有害的放射性物质；但是荧光检测自身存在难以克服的缺陷，如荧光信号易饱和、易淬灭、稳定性差等，而面临的最大问题是检测仪器价格昂贵，从而严重限制了生物芯片的推广应用，尤其是在中小医疗机构的推广应用。

金标银染技术是一种灵敏特异的可视化检测方法，源自现代照相技术、组织化学技术和免疫金技术。金标是将纳米级的金颗粒物理吸附或共价连接在生物大分子上，这种标记具有很高的标记效率和稳定性，但是颗粒太小给信号检测带来了困难；银染技术也叫自显影技术，通过还原银在金标记位点的特异性沉积，大幅提高信号检测的灵敏度，使金标银染技术成为了一种肉眼可见或在光学显微镜下的低放大率可视化方法。

20多年来，金标银染技术被广泛用于原位杂交和免疫组化研究；近几年，该技术在基因芯片研究中的应用已有报道。金标银染技术使芯片实现可视化检测，避免了荧光检测使用昂贵的扫描仪器，大大降低了检测成本。基因芯片的金标银染检测方法已经获得专利授权(ZL专利号：02113147.3)。

作为一种可视化检测方法，金标银染法的检测灵敏度目前还不能满足疾病分子检测的更高要求，尤其是对于待测样本中极少量或单个细菌的检测。如何进一步提高可视化检测的灵敏度是生物芯片推广应用中面临的重要课题。

TSA方法也叫CARD(Catalyzed Reporter Deposition，催化报道分子沉积)技术，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信号放大分子酪氨是一个酚基化合物，可以作为辣根过氧化物酶(HRP)的作用底物。TSA的原理是在HRP催化下，大量连接半抗原的酪氨分子的沉积。1992年，Adams将TSA首先引入免疫组化，用于抗原或抗体的检测。与常规的生物素-链酶亲和素方法相比，该技术在理论上可以将检测灵敏度提高1000倍。现在，TSA技术在免疫印迹、酶联免疫吸附分析以及原位杂交等诸多领域都得到了广泛的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对目前生物芯片的金标银染检测方法的灵敏度需要进一步提高的的问题，提供一种大幅度提高金标银染法的检测灵敏度的技术。

本发明的技术解决方案是将TSA技术与金标银染相结合，杂交好的芯片首先进行TSA处理，通过HRP催化酪氨分子的大量沉积以及生物素与链酶亲合素的特异结合，将大量的纳米金颗粒连接到靶标分子上，再通过银染反应得到清晰的可视化信号。本方法可以大幅度提高芯片可视化检测的灵敏度。

具体地说，基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法，其特点在于包括如下步骤：

1.待测基因的纯化，扩增与标记：基因纯化方法参见《分子克隆实验指南》，科学出版社.作者，J.萨姆布鲁克；基因扩增方法采用聚合酶链反应(PCR)或者反转录扩增聚合酶链反应(RT-PCR)；核酸标记方法是对PCR的下游引物采用末端标记法引入生物素，然后进行PCR反应。

2.芯片的制备与杂交：设计待检基因的探针，点制基因芯片；将上述待检基因的PCR产物与基因芯片杂交。为了提高杂交反应的效率，杂交时使用杂交液与PCR产物混合。

3.TSA过程：杂交好的芯片首先点加链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)，通过链酶亲和素与靶标连接的生物素特异结合，在靶标上引入HRP；然后点加生物素标记的酪氨(Biotin-Tyramine)，通过HRP的催化作用使大量的酪氨沉积在反应位点周围。

Biotin-Tyramine试剂依据文献制备：将Tyramine.HCl与Biotin-NHS分别溶于DMF，然后以一定的比例混合室温反应，反应液用乙醇稀释成指定浓度，4℃保存。

4.金标银染过程：芯片点加链酶亲和素标记的纳米金(Streptavidin-Gold)，再次通过Streptavidin与Biotin的特异结合将纳米金连接到靶标分子上；然后点加银染试剂，利用银染试剂的氧化还原反应形成的银颗粒沉积在纳米金上，形成肉眼可见的杂交信号。

5.信号处理过程：杂交信号可以用普通的光学扫描仪进行扫描检测，并可以采用图像分析软件获取信号的灰度值，进行定量分析。

本方法具有如下的优点和效果：

1.本方法可以对细菌或病毒进行高灵敏度的可视化检测，与单步金标银染法相比，检测灵敏度提高10倍到100倍。

2.本方法的样品标记处理采用末端引物标记生物素的方法，具有成本低廉、试剂有效期长、操作简便等优点。

3.本方法的信号显示方法是银颗粒，结果易于保存、对比、以及标准化；同时，与酶显色法相比，该方法具有要求的环境条件低、反应时间短等优点。

4.本方法使用的Biotin-Tyramine试剂，具有制备方法简单、免除纯化分离、性能稳定，易于保存的优点。

附图说明

图1为分别采用TSA-金标银染与单步金标银染检测痢疾杆菌的芯片可视化信号扫描图。

图2为分别采用TSA-金标银染与单步金标银染检测大肠杆菌O157的芯片可视化信号扫描图，比较的是PCR模板取一系列稀释梯度时两种检测方法的杂交信号的强度。

图3为分别采用TSA-金标银染与单步金标银染检测大肠杆菌O157的芯片可视化信号的信号强度比较图。

具体实施方式

实施实例1

用基因芯片检测痢疾杆菌的TSA-金标银染的检测过程

1.自制重要病原微生物检测基因芯片

2.按试剂盒提供的试剂用十二烷基硫酸钠(SDS)煮沸法进行基因抽提：取40微升痢疾杆菌的菌液加10微升DNA提取液，混合均匀后煮沸20分钟，以每分钟13000转离心1分钟，取上清液作为PCR扩增的模板。

3.根据芯片所用基因片断进行基因扩增，其引物采用芯片试剂盒附带的引物，其中反向引物的5`端标记生物素。

表1：用于扩增痢疾杆菌基因片段的引物序列

按芯片指定的条件进行PCR温度循环：94℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒；72℃，5分钟；35循环。循环结束后立即将产物变性：94℃，5分钟，然后-20℃冷冻保存。

4.将点制的基因芯片依次置于0.2％的SDS溶液和蒸馏水中洗涤并凉干，在芯片的每个区点加10微升的PCR产物稀释液(PCR产物用杂交液稀释10倍)，将芯片置于潮湿的杂交盒中，于50℃杂交1小时，使生物素标记的DNA样品与芯片上的特异性探针结合；然后将芯片用A、B、C清洗液(A：1×标准柠檬酸盐水(SSC)+0.2％SDS，B：0.2×SSC，C：0.1×SSC)依次洗涤并晾干。

5.TSA过程：芯片每个区点加10微升的Streptavidin-HRP稀释液(1∶1500，1×PBS-BSA1％稀释)，然后将芯片置于37℃温育30分钟，取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)洗涤并晾干；每个区点加10微升的Biotin-Tyramine稀释液(1∶200，1×PBS-BSA1％+0.5％H₂O₂稀释)，37℃温育30分钟，取出后用PBST洗液洗涤并晾干。

6.芯片的每个区点加10微升的Streptavidin-Gold稀释液(1∶50，1×PBS-BSA1％稀释)，37℃温育30分钟，取出后依次用PBST洗液和去离子水洗涤并晾干；将银染试剂A液和B液混合，每个区立即避光点加20微升的A、B混合液，经大约20分钟显色结束，用去离子水清洗除去芯片表面的银染试剂，晾干。

7.杂交信号用肉眼可见清晰的灰色或黑色圆点，使用普通光学扫描仪扫描记录，可以运用多种芯片杂交信号分析软件对杂交信号进行定量分析。

用基因芯片检测痢疾杆菌的单步金标银染的检测过程是将上述步骤的第5步省略，其他步骤完全相同。

比较PCR产物分别取不同稀释倍数时两种检测方法的杂交信号的强度，计算出相应的灰度值见表1和表2。

表2.痢疾杆菌的PCR产物系列稀释梯度下金标银染的信号灰度值

表3.痢疾杆菌的PCR产物系列稀释梯度下TSA-金标银染的信号灰度值

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实施实例2

用基因芯片检测大肠杆菌O157的TSA-金标银染和单步金标银染的检测过程。与检测痢疾杆菌的过程相同。

表4：用于扩增大肠杆菌O157基因片段的引物序列

Claims (7)

1.一种基因芯片的检测方法，其特征在于包括TSA过程。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于方法为TSA-金标记银染检测法。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)待测基因的纯化、扩增，对扩增的下游引物以末端标记法引入生物素进行核酸标记；

(2)芯片的制备与杂交；

(3)TSA过程；

(4)金标记银染过程；

(5)信号处理。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(3)TSA过程为：

在杂交好的芯片上点加链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶，通过链酶亲和素与靶标连接的生物素特异结合，在靶标上引入HRP；然后点加生物素标记的酪氨，通过HRP的催化作用使大量的酪氨沉积在反应位点周围。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(4)金标记银染过程为：

芯片点加链酶亲和素标记的纳米级金颗粒，通过链酶亲和素与生物素的特异结合将金颗粒连接到靶标分子上；然后点加银染试剂，利用银染试剂的氧化还原反应形成的银颗粒沉积在纳米金上，形成肉眼可见的杂交信号。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(5)信号处理采用光学扫描仪进行扫描检测。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤(5)信号处理采用图像分析软件获取信号的灰度值，进行定量分析。

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