CN101139616B - 一种高通量的通过细菌直接侵染将外源基因导入昆虫细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种的新的将外源基因导入昆虫细胞的方式，它是将目标基因通过分子操作克隆到昆虫瞬时表达载体或杆状病毒基因组上，鉴定正确的重组子克隆的菌体，培养到OD值0.5至0.8，收集的菌体和培养的昆虫细胞以100：1—500：1的比例混合后，大肠杆菌进入昆虫细胞并在其中破裂，释放出内容物，质粒携带的外源基因在昆虫细胞中表达。杆状病毒基因组还可以在相应的昆虫细胞宿主中包装成杆状病毒粒子。本发明真正能做到高通量，简便，廉价，高效地将外源基因导入到昆虫细胞中表达以制备抗原，生产蛋白质药物和研究其生物学功能。整个操作过程不需要配制其他试剂；无需专门的仪器设备；无需购买昂贵的转染试剂；也不需要订购高效率的试剂盒来制备高纯度的质粒。

Description

一种高通量的通过细菌直接侵染将外源基因导入昆虫细胞的方法

技术领域

本发明涉及的是基因导入技术，特别是一种高通量的通过细菌直接侵染将外源基因导入昆虫细胞的策略。特别适用于将外源表达质粒(小质粒或杆状病毒大质粒)以细菌为载体导入昆虫细胞以表达蛋白质和研究基因的功能。

背景技术

随着更多物种全基因组序列的测定，将基因的序列信息转换为功能信息成为研究的焦点，这就需要一种高效的方法将基因导入各种表达系统中表达以研究其功能。昆虫表达系统特别是昆虫杆状病毒表达系统因为其表达量高，表达的蛋白质有翻译后修饰，培养条件相对简单等优势受到研究者的亲睐。目前将外源基因导入昆虫细胞中主要有三种方式：第一种是磷酸钙介导的转染，DNA和磷酸钙形成共沉淀，复合物通过内吞作用进入细胞后，有些共沉淀从内吞小体或溶酶体中出来进入胞质中，然后再移至细胞核内。第二种是脂质体介导的转染，DNA通过脂类包被或直接与细胞质膜相互作用，或以非受体介导的内吞作用进入细胞。第三种是电穿孔介导DNA进入昆虫细胞。电流能够可逆性的击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔，促使DNA分子进入胞内。这些方法在一定程度上提高了实验效率，降低了实验成本，但也存在不足，主要表现在以下两个方面：

一、费用昂贵，不适合用于高通量大规模进行功能基因组研究。第一种和第二种方法中用到的试剂，一些公司有试剂盒销售，价格高，特别是对于大规模高通量的功能基因组研究工作来说，样品多，所耗试剂量大，实验成本高。第三种方法则需要特殊设备，如电转化池等。

二、三种方法都需要制备高纯度的质粒，质粒的浓度和纯度会很大程度地影响转染的效率，因此大多数研究者会选择商品化试剂盒来抽提质粒，进一步提高了实验成本。特别是长达100kb以上的杆状病毒质粒，体外操作，不仅步骤烦琐，而且DNA分子容易被机械力损伤，影响有效的DNA分子数量和质量。

利用大肠杆菌将外源基因导入哺乳动物细胞也有报道，在菌体中，存在两个质粒，一个为克隆了感兴趣的目的基因的质粒和另外一个兼容质粒。这个兼容质粒上面克隆了两个基因，inv和hly。基因inv和hly表达的蛋白产物可以协助含有这两个质粒的大肠杆菌进入细胞内并在其中破裂，释放出内容物。其中inv表达的产物侵入素的作用是通过与细胞表面受体结合的方式促使大肠杆菌进入细胞，hly表达的产物李斯特溶菌素o的作用则是帮助大肠杆菌逃逸出吞噬泡。但是这种方式需要额外的质粒帮助，并且克隆了外源基因的载体质粒需要和克隆了inv和hly基因的质粒兼容。另外，所使用的大肠杆菌必须是DAP营养缺陷型，需要在培养基中加入DAP才可以生长。

(参见刊物“Molecular Cloning：ALaboratory Manual 2001年第三版第16章”；“nature biotechnology 1998年第16卷862-866页”。)

发明内容

本发明的目的是提供一种的新的将外源基因导入昆虫细胞的方式，真正能做到高通量，简便，廉价，高效地将外源基因导入到昆虫细胞中表达以制备抗原，生产蛋白质药物和研究其生物学功能。整个操作过程不需要配制其他试剂；无需专门的仪器设备；无需购买昂贵的转染试剂；也不需要订购高效率的试剂盒来制备高纯度的质粒。

本发明是这样实现的。将感兴趣的目标基因通过分子操作克隆到昆虫瞬时表达载体或杆状病毒基因组上，鉴定正确的重组子克隆的菌体培养到OD值0.5至0.8，收集的菌体和培养的昆虫细胞以100∶1-500∶1的比例混合后，大肠杆菌进入昆虫细胞并在其中破裂，释放出内容物，质粒携带的外源基因在昆虫细胞中表达，杆状病毒基因组还可以在相应的昆虫细胞宿主中包装成杆状病毒粒子。

具体的做法是，根据研究的目的，如果是瞬时表达，通过常用的分子克隆操作将基因克隆到昆虫瞬时表达载体上；如果需要大量表达纯化蛋白质产物，通过Bac-to-Bac^TM，直接连接或gateway等方法将基因克隆到杆状病毒基因组上。通过酶切，PCR鉴定正确的重组子质粒转化到大肠杆菌中(也可以在鉴定之前保存菌体)。培养细菌到OD值0.5至0.8后收集菌体，用Grace培养基清洗菌体一次后用培养基重悬菌体。昆虫细胞在感染时汇集度应达到30％至80％左右。将大肠杆菌重悬液以100∶1-500∶1比例加入细胞培养瓶中。两个小时后换液一次，用庆大霉素，氯霉素，四环素等抗生素杀死未进入昆虫细胞的菌体。进入细胞的大肠杆菌在昆虫细胞中破裂，外源基因在昆虫细胞中表达，杆状病毒基因组还可以在相应的昆虫细胞宿主中包装得到杆状病毒粒子。

本发明中使用的昆虫细胞系可以是BmN-swu1，Sf9，S2，Sf21，High Five等昆虫细胞系，其中BmN-swu1细胞系的感染效率最高，也不排除大肠杆菌可侵染其它昆虫细胞的可能性。

本发明中使用的大肠杆菌菌株可以是XL10-Gold，DH10B，BL21(DE3)，JM109，DH5α，DH10β等分子克隆、蛋白表达常用菌株，不需要改造，也不需要外源质粒的帮助。

本发明不仅可以将外源质粒导入昆虫细胞，也可以将外源的蛋白质及RNA导入昆虫细胞中。

本发明与现有的技术相比具有明显的优势：

一、实验所需要的侵染用的大肠杆菌可以在简单的实验条件下短时间内大量制备，无需额外制备高纯度的质粒，无需购买昂贵的转染试剂和质粒抽提试剂盒，大大节约了实验成本。

二、操作过程简便，只需要将重悬的大肠杆菌菌液和昆虫细胞混合即可，不需要配制其他的试剂，也不需要特殊的设备。

三、所用的大肠杆菌菌株不是特定的，现有的通用的大肠杆菌如XL10-gold，DH10B，BL21(DE3)，JM109，DH5α，DH10β等均可使用，无需任何改造，也不要其它质粒的帮助。

四、细菌侵染策略不仅可以将外源质粒导入昆虫细胞，也可以将外源蛋白质及RNA导入昆虫细胞中。

具体实施方式

下面以实施例对本发明进一步说明：

实施例1：

利用该方法将克隆了DsRed基因的重组的杆状病毒呈递到BmN-swu1细胞中，成功地检测到了红色荧光蛋白的表达，收获的病毒粒子可以扩增。

在质粒pDsRed2-1上设计括增红荧光蛋白基因DsRed的PCR引物，用高保真DNA聚合酶括增红荧光蛋白基因，定向克隆到转移载体pFastBac1上。得到的重组子转化大肠杆菌DH10Bac，荧光蛋白表达单元转座到家蚕杆状病毒基因组BmNPV Bacmid上面。挑取通过PCR鉴定后的重组杆状病毒克隆培养到OD值0.5至0.8后，收集菌体，用Grace培养基清洗菌体一次后，再用培养基重悬菌体，并将菌体加入细胞培养瓶中。两个小时后，换新鲜的Grace培养基培养，并加入终浓度为25μg/ml的氯霉素和10μg/ml的四环素杀死未进入昆虫细胞的细菌。72个小时后用激光共聚焦显微镜观察，经激光激发，可以观察到有50％左右的细胞发出红色荧光，五天后收集杆状病毒粒子重新感染BmN-swu1细胞，观察到几乎所有的细胞发出明显的红色荧光。

实施例2：

利用该方法将egfp基因呈递到Sf9细胞中，成功地检测到了绿色荧光蛋白的表达。

分析质粒pET-30a和pIRES-egfp的序列，分别用EcoRV和XhoI酶切这两个质粒，pET-30a在多克隆位点处切开，pIRES-egfp上面的egfp基因则被这两个酶切下来，分别回收pET-30a酶切后的片段和egfp片段，在solutionI的作用下，egfp基因定向克隆到了pET-30a载体上，位于T7启动子下游。酶切及PCR鉴定正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取平板上的单菌落培养至OD值0.5至0.8后后，收集菌体，用Grace培养基清洗菌体一次后，再用培养基重悬菌体，并将菌体加入培养瓶中。两个小时后，更换新鲜的培养基培养，并加入终浓度为50μg/ml的庆大霉素杀死未进入Sf 9的细菌，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达。12个小时后激光共聚焦显微镜观察，经激光激发，可以观察到有70％左右的细胞发出绿色荧光。

pDsRed2-1，pIRES-egfp购置于Clontech公司，pET-30a及菌株BL21(DE3)购置于Novagen.公司，pFastBac1及菌株DH10B购置于Invitrogen公司，家蚕细胞系BmN-swu1由西南大学鲁成院士赠送，家蚕杆状病毒基因组BmNPV Bacmid由日本Shizuoka大学Enoch Y.Park教授赠送。

Claims (2)

1.一种高通量的通过细菌直接侵染将外源基因导入昆虫细胞的方法，其特征在于：将瞬时表达的目标基因通过常用的分子克隆操作将基因克隆到昆虫瞬时表达载体上，或者将需要大量表达纯化的蛋白质产物，通过Bac-to-Bac^TM，直接连接或gateway方法将其编码基因克隆到杆状病毒基因组上，通过酶切，PCR鉴定正确的重组子质粒转化到大肠杆菌中，培养细菌到OD值0.5至0.8后收集菌体，用Grace培养基清洗菌体一次后用培养基重悬菌体，昆虫细胞在感染时汇集度应达到30％至80％，将大肠杆菌重悬液以100∶1-500∶1比例加入细胞培养瓶中，两个小时后换液一次，用抗生素杀死未进入昆虫细胞的菌体，进入细胞的大肠杆菌在昆虫细胞中破裂，释放出内容物，质粒携带的外源基因在昆虫细胞中表达，杆状病毒基因组还能够在相应的昆虫细胞宿主中包装成杆状病毒粒子；

其中，上述方法中所用的目标基因为DsRed基因，杆状病毒基因组为家蚕杆状病毒基因组BmNPV Bacmid，昆虫细胞系是BmN-swul细胞系，大肠杆菌菌株是DH10Bac，抗生素为25μg/ml的氯霉素和10μg/ml的四环素。

2.一种高通量的通过细菌直接侵染将外源基因导入昆虫细胞的方法，其特征在于：将瞬时表达的目标基因通过常用的分子克隆操作将基因克隆到昆虫瞬时表达载体上，或者将需要大量表达纯化的蛋自质产物，通过Bac-to-Bac^TM，直接连接或gateway方法将其编码基因克隆到杆状病毒基因组上，通过酶切，PCR鉴定正确的重组子质粒转化到大肠杆菌中，培养细菌到OD值0.5至0.8后收集菌体，用Grace培养基清洗菌体一次后用培养基重悬菌体，昆虫细胞在感染时汇集度应达到30％至80％，将大肠杆菌重悬液以100∶1-500∶1比例加入细胞培养瓶中，两个小时后换液一次，用抗生素杀死未进入昆虫细胞的菌体，进入细胞的大肠杆菌在昆虫细胞中破裂，释放出内容物，质粒携带的外源基因在昆虫细胞中表达，杆状病毒基因组还能够在相应的昆虫细胞宿主中包装成杆状病毒粒子；

其中，上述方法中所用的目标基因为egfp基因，昆虫瞬时表达载体为pET-30a载体，昆虫细胞系是Sf9细胞系，大肠杆菌菌株是BL21(DE3)，抗生素为50μg/ml的庆大霉素。