CN1011245B

CN1011245B - 抗生素do-248-a和do-248-b的生产方法

Info

Publication number: CN1011245B
Application number: CN 85102956
Authority: CN
Inventors: 近藤荣二; 川村义己; 小西乔郎; 松本浩一; 东海林纯一
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1984-04-16
Filing date: 1985-04-19
Publication date: 1991-01-16
Also published as: CN85102956A

Abstract

下列结构式I的抗菌素DO-248-A及DO-248-B具有抗耐酸性菌的活力。DO-248-A，DO-248-B或其可药用的盐类作为抗耐酸性菌的一个活性组份口服或非肠道途径施用于人或动物。DO-248-A及DO-248-B是经过培养玫瑰轮丝链霉菌属的产生抗菌素DO-248-A或DO-248-B的微生物，再从其培养基中收集这两种抗菌素或其中一种而制备得到的。

Description

本发明涉及如下式（Ⅰ）所示的抗生素DO-248-A和DO-248-B以及它们可药用的盐。

式中R是乙基或异丙基

进而，涉及这些抗生素的制备过程和这些抗生素和/或其可药用盐抗耐酸菌的活性组分。

抗生素临床上被用来作为抗结核的药物已有很久的历史。特别是氨基糖苷类，例如：链霉素、卡那霉素;还有以其它的抗结核药物作为复合药物来使用的半合成的大环内脂，如利福平。

此外，T.shi ba所编的第15届肽化学座谈会汇编中也述及了有关现有技术。通常，很难防止由于长期使用抗生素所产生的具有抗性的微生物。而当前所存在的问题是这种具有抗性微生物的产生可以抵抗上面所提到的治疗结核病的药物。

虽然已知抗生素pheganomycins具有α-胍基-3，5-二羟苯基的乙酸基团，〔Proceeding of the 15th Symposium on Peptide Chemistry 121，（1977）〕，而DO-248-A和DO-248-B则是甘氨酸的衍生物，这与六肽或七肽衍生物的抗生素Pheganomycins在化学结构上有明显的区别。

本发明的抗生素DO-248-A和DO-248-B具有抗耐酸细菌，抗卡那霉素抗性细菌、抗利福平抗性细菌的抗菌素活性。而且抗非典型耐酸菌性疾病的病原菌比卡那霉素更有效。作为抗耐酸菌成份的药物使用，抗生素DO-248-A和DO-248-B可以口服或肠胃外注射给人或动物。抗生素DO-248-A和DO-248-B是通过培养轮丝链霉菌属（Streptoverticillium）一种可产生抗生素DO-248-A和DO-248-B的微生物，再从培养基中收集而制备的。

图1-4分别表示DO-248-A，在水溶液中的紫外吸收光谱、在溴化钾固体介质中的红外吸收光谱、¹H-NMR波谱和¹³C-NMR波谱。图5-8则分别表示DO-248-B，水溶液的紫外吸收光谱、在溴化钾介质中的红外吸收光谱、¹H-NMR波谱和¹³C-NMR波谱。

本发明的抗生素DO-248-A和DO-248-B物化性质如下：

（1）DO-248-A

1）元素分析

理论值（%） C₁₄H₂₀N₄O₅·2H₂O

碳46.66 氢6.71 氮15.58

实验值（%）：碳47.01 氢6.15 氮 15.44

2）分子量（通过次级离子质谱测定）

（M+1）⁺325

3）熔点

194-200℃

4）旋光率

〔α〕^22.5D+84.3±1.3（C0.966，水）

5）紫外吸收（见图1）

nm（E^1% _1cm）276（36）

（E^1% _1cm）283（36）

（E^1% _1cm）297（74）

6）红外光谱（见图2）

KBr 3350，1660，1605，

ν cm 1433，1390，1305，

max 1280，1130，1080，

1015，823，803，

7）溶解性

溶于水，易溶于甲醇，乙醇，二甲基甲酰胺，微溶于氯仿，乙酸乙酯，丙酮，不溶于苯、乙醚和己烷。

8）颜色反应

Sakaguch反应：阳性。

9）外观和酸碱性及中性

无色粉末，具两性性质。

10）¹H-NMR〔200MHz.D₂O，外参考标准：四甲基硅（根据DSS的δ值;0.65）（见图3）

δppm（J-Hz）1.23（d6H J＝7），3.35（m1HJ＝7），3.61（ABdLH J＝17）3.83（ABd 1HJ＝17），

5.10（S1H），6.48（S2H）

11）¹³C-NMR（δ值67.4）（见图4）

δppm 20.5（q×2）;25.0（d），44.4（t），59.3（d），108.1（d×2），123.8（s），134.8（s），156.4（s×2）157.3）

（s），171.0（s），177.0（s），

12）氨基酸分析

发现含有甘氨酸和氨。

（2）DO-248-B

1）元素分析

理论值（%） C₁₃H₁₈N₄O₅·2H₂O

碳45.08，氢6.40 氮16.18

实验值（%）碳45.26 氢6.13 氮16.13

2）分子量（通过次级离子质谱测定）

（M+1）⁺311

3）熔点

189-193℃

4）紫外吸收（见图5）

276（36），281.5（36）

^滴276（36），281.5（36）

^滴297（72）

5）红外吸收光谱（见图6）

KBr 3350，1660，1608，1435，

ν cm 1393，1310，1250，1105，

max 1000。

6）颜色反应

Sakaguchi反应;阳性。

7）外观和酸碱性及中性

无色粉末，具两性性质。

8）¹H-NMR（200NHz.D₂O，外参考：四甲基硅（根据DSS的δ值;0.65））（见图7）

δppm（J＝Hz）1.00（t3H J＝7.3），2.52（q2HJ＝7.3），3.61（ABd 1H J＝17），3.83（ABd 1HJ＝17），5.10（S1H）6.50（S2H）

9）¹³C-NMR（25.2MHz.D₂O，内部参考：二噁烷（δ值67.4））

δppm（J＝Hz 13.6（q），16.9（t），44.5（t），59.4（d）;107.4（d×2），120.1（s），134.8（s），156.4（s×2），157.3（s），171.0（s），177.0（s），（见图8）

根据以上DO-248-A和DO-248-B的物化性质和化学结构确定它们结构式如下：（Ⅰ）

（式中R是乙基或异丙基）

DO-248-A结构式Ⅰ中的R基团是异丙基。被命名为N-（α-胍基-3，5-二羟基-4-异丙基苯乙酰）甘氨酸。DO-248-B在结构式Ⅰ中R基团为乙基，被命名为N-（α-胍基-3，5-二羟基-4-乙基苯乙酰）甘氨酸。因此DO-248-A和DO-248-B是一类新的抗生素。

DO-248-A和DO-248-B是利用按常规方法从土壤中分离出的轮丝链霉菌属的一种菌株来生产的。该微生物通过分类研究鉴定与玫瑰轮丝链霉菌（Streptoverticillium roseoverticillatum）Forina和Locci为同一物种。

这种微生物的分类性质如下：

（1）形态学性质，（用酵母抽提物和麦芽抽提物琼脂培养基在28℃培养14天）

这种微生物生长良好并形成一块块气生菌丝，分生孢子吸附在这些菌丝上。显微镜下观察到气生菌丝分枝形成轮状。气生菌丝形成直的孢子链，每个链的气生菌丝多数都少于10条。在电子显微镜下观察菌丝表面光滑，没有发现孢子囊，具鞭毛孢子和菌核。

（2）培养性质：

表1

培养基生长情况气生菌丝培养基气可溶性

形成情况颜色生菌丝色素

蔗糖氮源琼良好良好粉红无色剂无

脂培养基粉红

葡萄糖天门冬酰良好良好粉红到亮红无

胺琼脂培养基淡粉红

甘油天门冬酰良好良好粉红淡红无

胺琼脂培养基

无机盐淀粉良好良好粉白色暗红无

琼脂培养基到淡红

酪氨酸琼良好良好淡粉红暗红棕黑色

脂培养基到粉红（少量）

营养性琼良好良好灰棕色灰棕色

脂培养基

酵母麦芽抽提良好良好淡粉红到红桔黄棕色

物琼脂培养基淡棕色黄色

燕麦片琼良好良好淡粉红到亮红无

脂培养基淡灰色

Benmef 良好良好淡粉色暗红黄棕色

琼脂培养基到淡橙色桔黄（少量）

颜色依标准颜色指导（日本颜色研究所）判定。

（3）物理性质：

明胶液化作用阴性

黑色素生成作用阳性

酪氨酸酶反应弱阳性

凝乳作用阴性

牛奶胨化作用弱阳性

淀粉水解性阳性

（4）碳源的利用

碳源种类生长情况

L-阿拉伯糖 +

D-木糖 +

D-葡萄糖 ++

D-果糖 ++

蔗糖 +

肌醇 ++

L-鼠李糖 +

棉子糖 +

D-甘露醇 ++

对照（无糖类） +

++：表示生长良好，+表示生长情况一般。

在对照组中（无糖）这种微生物被确认为生长情况一般。

（5）生长温度

这种微生物可在15-45℃生长，最适的生长温度是26-32℃。

（6）细胞壁的组成

发现细胞壁中的二氨基庚二酸是以LL-型存在的。

根据上述一系列性质，该微生物显然属于轮丝链霉菌属（Streptovertillium）。

以下文献研究的是与这种微生物最接近的几种微生物。

（1）Waxman.S.A：The Actinomycetes vol.2 1961

（文献1）（放线菌素，第二卷，1961年）

（2）ElWood B，Shirling and David Gottlieb：International Journal of Systematic Bacteriology vol18 69-189，279-392（1968），Vol 19，391-512（1969）vol.22，265-394（1972）

（文献2）（国际系统细菌学年鉴）

18卷69页-189页 279页-392页1968年

19卷391-512页 1969年

22卷265-394页 1972年

（3）Bergey′s Manual of Deteminative Bacter ioLogy，the eight edition（1974）

（文献3）（伯杰氏鉴定细菌手册第八版1974年）

（4）其它有关新的放线菌素的论文

分析结果，这种微生物与以下三种微生物最接近。

（1）轮丝链霉菌hiroshimense（文献2，18卷130-134页（1968年）;文献3，835页）

（2）玫瑰轮丝链霉（文献2，18卷168页（1968）;文献3，835页）

（3）轮丝链霉菌bierticillatus（文献2，18卷300页（1968年）;文献3，834页）

这种微生物经检验并同上述三种微生物比较，发现它与上述三种微生物相似，并与其中玫瑰轮丝链霉菌最接近，因为这两种微生物除凝乳性质不同外其它特性都一样。因此菌株DO-248被鉴定是属于上述菌种，并命名为：玫瑰链霉菌DO-248。这个菌株以FERM 7561号于1984年3月26日贮存在日本的Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki pref。的工业科学技术部发酵研究所，于1985年3月22日按布达佩斯条约以第FERM BP-745号入册保存，并于1985年8月6日以CGMCC No.0034保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

本发明包括从属于轮丝链霉菌（包括上述DO-248菌株）可产生抗生素DO-248-A和DO-248-B的菌株中制备DO-248-A和DO-248-B的每一个步骤。

从可产生抗生素DO-248-A和DO-248-B的微生物中制备DO-248-A和DO-248-B的过程如下。这个过程可根据一般发酵生产的流程进行。也就是产生DO-248-A和DO-248-B的微生物在含有几种营养成份的培养基中通气培养。培养条件和培养基的成份与普通生产抗生素使用情况相同。培养基含碳源、氮源和无机盐。如一般培养基。偶尔根据需要加入维生素和代谢物前体等等。碳源如葡萄糖、蔗糖、淀粉、葡聚糖、甘油、糖蜜、有机酸和它们的类似物、可单独或混合使用。氮源例如：大豆蛋白、玉米浸汁、肉膏、酵母膏、棉子粉、蛋白胨、麦胚、硫酸铵、硝酸铵等，可单独或混合使用。无机盐可根据需要加入培养基例如，碳酸钙、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钴、几种磷酸盐等。

培养可按常规制备抗生素的方法进行，本发明中，液体培养特别可取，并且液面下通气培养进行大规模生产也很好。培养基的PH范围从大约5.5到大约8.5，发酵的温度从大约20℃到大约40℃，最好是在25℃到32℃之间。培养时间在很大的程度上依赖于发酵的规模，大规模发酵生产培养时间最好在20-80小时。

无论在发酵前或发酵过程中，都可根据需要加入消泡剂植物油或其类似物。

培养完毕，DO-248-A和DO-248-B可根据常规方法从培养基中分离回收。例如，可以用以下方法制备：过滤、离心、吸附、解吸、使用几种活性吸附剂层析，用几种有机溶剂抽提或根据需要结合使用。

本发明提供的DO-248-A和DO-248-B对于耐酸菌包括核杆菌是有效的。下文叙述DO-248-A抗菌活性的试验结果。

试验方法：

耐酸杆菌（0.01mg）如表2所示，在2.0ml Dubos吐温白蛋白液体培养基中培养，培养基中加入通过双倍稀释方法确定的最小抑制浓度（MICμg/ml）的DO-248-A（化合物A）、卡那霉素（KM）和利福平（RFP）。分枝杆菌在28℃培养，其它所有微生物都在37℃培养。通常在两个星期后鉴定，但偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌在一星期后鉴定，蟾蜍分枝杆菌在五星期后鉴定。

如表2所示，本发明的抗生素DO-248-A可有效地抑制具有卡那霉素和利福平抗性的细菌，还可以比卡那霉素和利福平更有效地抑制分枝杆菌鸟分枝杆菌-它可引起不易医治的非典型的耐酸性疾病。DO-248-B与DO-248-A效果相同，因此这些抗生素和其可药用的盐，可以作为抑制耐酸菌的活性组分，用于人和动物。

DO-248-A和DO-248-B或其可药用盐，可口服或经非肠道给予人或动物。药物可以片剂，胶囊、粉末、液体等形式口服。药物用普通可药用的赋形剂配制，如稳定剂、香味剂、湿润剂、防腐剂、表面活性剂、调味剂，香料等等。也可以注射剂、栓剂等形式非肠道给药。

表2

试验微生物最小抑制浓度（μg/ml）

种系化合物A 卡那霉素利福平

M.结核分枝杆菌 H37Rv 0.05 0.025 ＜0.001

″ R-15^1）0.10 ＜0.001 ＞25

″ R-18^2）0.025 ＞25 ＞25

M.牛结核分枝杆菌 BCG 0.05 0.00156 ＜0.001

M.坎萨分枝杆菌 KMC1101 0.00313 6.25 0.0125

M.海鱼分枝杆菌 KM1202 12.5 3.13 1.56

M.淋巴结核分枝杆菌 KMC2102 0.2 0.0125 0.00313

M.戈登分枝杆菌 KMC2201 0.00625 0.39 0.0125

M.szulgai KMC2401 3.13 1.56 0.025

M.蟾蜍分枝杆菌 KMC2301 0.39 0.10 0.00625

M.猴分枝杆菌 KMC1302 6.25 12.5 ＞25

M.鸟结构分枝杆菌 KMC3101 0.78 3.13 0.20

M.胞内分枝杆菌 KMC3209 0.025 0.05 ＜0.001

M.非色素分枝杆菌 KMC3602 12.5 ＞25 25

M.偶发分枝杆菌 KMC4101 ＞25 25 3.13

M.龟分枝杆菌 KMC4201 ＞25 ＞25 6.25

M.鸟胞内结核分枝杆菌临床分 0.10 6.25 3.13

离的品

系16

1）利福平抗性系

2）卡那菌素和利福平抗性系

药用剂量根据病情，性别、年龄、体重有很大变化，但一个正常成人每天用量大约0.2-8克为适。本发明的抗耐酸菌药物可以同其它的抗耐酸菌的药物以相同的方法并用。

本发明的研究物质DO-248-A和DO-248-B的制备方法举例如下，但这不应理解成本发明仅局限于此。

例1

（a）发酵步骤

S-培养基：0.5%可溶性淀粉，0.5%葡萄糖，0.5%多胨（Polypeptone），0.5%肉膏、0.25%酵母膏，0.25%氯化钠，去离子水（灭菌前将培养基PH调至7.0）。

X-培养基：2%粗淀粉，2%葡萄糖，5%酵母膏，0.25%氯化钠，0.25%碳酸钙，0.0005%MgCl·4H₂O，0.0005%CuSO₄·5H₂O，0.0005%ZnSO₄·7H₂O

用铂环将玫瑰轮丝链霉菌DO-248菌株（FERM BP-745）接种于500ml的Sakaguchi氏培养瓶中，瓶内装有100ml上述S培养基，在28℃摇动培养48小时。再将上述培养液每4ml接种于装有100mLX-培养基的500ml Sakaguchi氏瓶中，28℃摇动培养4天，得到43.8升培养液。

（b）分离步骤

以上过程制备的43.8升培养液加入1.2公斤助滤剂Hyflosuper Cel

Jhons-Manville Sales公司）过滤除去细胞。滤液（39升）通过一个装有4.36升合成吸附剂HP-20的柱（150-300μm，Mitsubishi Chemical Industries有限公司）吸附所需成份。用水洗柱，再用甲醇洗脱活性成分，然后减压浓缩。活性组分的前半部分污染有很多水溶性杂质，将这部分经过装有580ml合成吸附剂CHP-20P的层析柱纯化（75-150μm Mitsubishi Chemical Industries有限公司）合并活性组分，冰冻干燥成25克棕色粉末粗制品，然后将25克粗制品吸附在470克硅胶柱上，氯仿∶甲醇∶水（15∶10∶1）来洗脱以除去杂质，再用甲醇洗脱得到活性组分;真空蒸发干燥。将3.18克含活性成分的黄褐色蒸干残留物溶于少量水中，通过700mL的Sepha-dex LH-20（Pharmacia AB）层析柱，水洗涤后，用甲醇洗脱，洗脱液真空蒸发干燥。得到1.22%粉末，再溶于少量的水，用Toyopearl HW-50C（100-500微米Togo Soda Mfg有限公司）柱吸附活性级分，用水洗柱后用甲醇洗脱。活性成分真空蒸发干燥（根据这种纯化过程杂质不能完全除去，但是DO-248-B作为少量成分，可以前半部分得到相当的量）。合并每种粗制粉末通过反相层析柱（Lodar Lichronrep RP-18

，40-63微米25×310毫米Merck Co）用甲醇∶水（1∶1）除去杂质，活性成分在真空中脱水得到445mg黄色粉末。最后用Nucleosil

10C₃（10×250mm，M.Nargel CO.Ltd.）型号的半收集柱进行反相高效液相层析将产物分离，用14-15分钟和7-8分钟分别洗脱DO-248-A和DO-248-B，以每分钟3ml的流速用甲醇∶水（1∶2）洗脱，使用了紫外245nm波长检测器。

洗脱液分别冰冻干燥得到116mg的无色DO-248-A粉末，及16mgDO-248-B无色粉末。

例2

1）发酵步骤

S培养基：0.5%可溶性淀粉，0.5%葡萄糖，0.5%多胨，0.5%肉膏，0.25%酵母膏，0.25%NaCl，去离子水（消毒前调PH至0.7）

A培养基

2%粗淀粉 2%葡萄糖 2%脱脂大豆粉

1%Baotosoyton（商品名） 0.25%氯化钠，水（消毒前调PH至7.0）

向装有800ml由上述成份组成的S培养基的2升Erlenmeyer瓶倾斜加入玫瑰轮丝链霉菌DO-248（FERMPB-745）的种子培养液，在28℃以每分钟180转培养24小时。

在30升的瓶中，装入20升由上述成分组成的A培养基，再分别在每个瓶中装入800ml上述刚制成的培养基，培养5天，条件为28℃，每分钟转动180-300转，通气20升/分。

b）分离步骤

将上面步骤提供的培养基调到PH3.0，并用Scharbles型离心机离心，得到1001上清液，上清以每分钟700ml的流速经过10升的Dowex ×50×4（NH⁺ ₄型）（US.Dow Chemical Co）层析柱。层析柱用水洗，然后用0.3N的氨水洗脱即得到35升的活性组分。在除去氨后，将活性组分调PH至9.0，然后以每分钟150mL的流速经过一个5升的Dowex 1×2（CL^-型）层析柱。层析柱用含5%氯化钠的50%甲醇洗脱，这样得到的13升的活性组分在真空中蒸发。将剩余的溶液调PH至7.0，并经过一个2.5升的HP-20（Mitsubishi Chemical Industries有限公司）层析柱，层析柱经水洗后，再用50%的甲醇洗脱，所得2.7升活性组分再蒸发。这样得到产物冻干即可获得2.25克DO-248的粗粉。

b）DO-248-A的纯化步骤

以下DO-248-A纯化过程中的监测和定量是通过高效液相层析检测其在230毫微米处的吸收而进行的。所用层析柱为Nucleosil

10C₈（M.Nargel有限公司产品）的4×250纳米层析柱，溶剂为20mM，pH7.0的磷酸缓冲液和乙腈以5∶1之比的混合液，在这种条件下DO-248 -A的滞留体积为8.00ml。

将上面步骤（约含105mg DO-248-A）提供的粗粉末12.0克）溶解在约40ml的200mM的磷酸缓冲液（PH7.0）中，在除去少量杂质后，将溶液经过QAE-Sephadex A-25（Pharmacia AB）柱（200ml）。当用200ml20mM的磷酸缓冲液过柱后，用600ml该缓冲液和含1M氯化钠同样缓冲液进行线性浓度梯度洗脱。洗脱液用上述高效液相层析检测，收集含DO-248-A的组分。收集的洗脱液再经过一个CHP-20P（Mitsubishi，Chemical Industries有限公司）层析柱（100ml），此柱先用水洗然后用300ml水和300ml80%的甲醇进行线性浓度梯度洗脱，洗脱液用高效液相层析柱检测，收集含DO-248-A的组分。收集的洗脱液在真空中蒸发，然后冷冻干燥就得到100mg纯度为70%的粉末。约50mg这种干粉再经过一次高效液相层析收集柱（50mg Nucl eosil 30C₁₈20×250mm）并用50mM PH7.0的磷酸缓冲液与甲醇以9∶1的混合液展层，淋洗部分用在230nm处的吸收检测收集含所需物质那个峰的各组分。收集液再经过CHP-20P柱（40ml）并用水及50%的甲醇洗脱，用高效液相层析检测，收集含DO-248-A的洗脱液，真空中蒸发，然后冷冻干燥即可得60mg无色的DO-248-A粉末。

Claims

1、一种制备结构如式(Ⅰ)的抗生素DO-248-A和/或DO-248-B的方法。

其中R是异丙基或乙基，它包括在培养基中培养能产生抗生素DO-248-A和/或DO-248-B的玫瑰轮丝链霉素(Streptoverticillium roseovertic-illatum)CGMCC0034，并且从培养基中回收抗生素DO-248-A和/或DO-248-B。

2、一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养基为液体培养基。

3、一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养基的pH被调至约5.5-8.5。

4、一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养基是在温度约为20-40℃进行的。

5、一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养是在温度约为25-32℃进行的。

6、一种根据权利要求1所述的方法，其中所述的培养约进行20-80小时。