CN101111261A

CN101111261A - 糖偶联物疫苗

Info

Publication number: CN101111261A
Application number: CNA2005800474204A
Authority: CN
Inventors: G·德尔古迪斯; K·巴拉尔多
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2008-01-23
Anticipated expiration: 2025-12-23
Also published as: RU2454244C2; ATE492290T1; CA2594524C; JP5737824B2; US20150165019A1; AU2005317683A1; EP1838345B1; WO2006067632A2; GB0428394D0; BRPI0519232A2; CN101111261B; JP2013049717A; EP1838345A2; CA2594524A1; RU2007127993A; JP2008525423A; WO2006067632A3; NZ556486A; JP2015155464A; US20080260773A1

Abstract

本发明提供含有两种或多种单价偶联物相组合的组合物，所述两种或多种单价偶联物各自含有载体蛋白，所述载体蛋白包含偶联糖抗原的两种或多种病原体的T细胞表位。本发明也提供多价偶联物，其包含偶联于同一载体蛋白分子的两种或多种抗原性不同的糖抗原，所述载体蛋白包含两种或多种病原体的T细胞表位。其它组合物包含一种或多种所述单价偶联物和一种或多种所述多价偶联物。本发明还提供了制备所述组合物的方法和所述组合物的应用。实施例包括将N19载体蛋白偶联于脑膜炎球菌寡糖。

Description

糖偶联物疫苗

将本文引用的所有文献以全文纳入本文作参考。

技术领域

本发明属于疫苗领域，涉及含有两种或多种糖抗原与多表位载体蛋白相偶联的新型组合物，所述多表位载体蛋白包含多种病原体蛋白质的T细胞表位。本发明也涉及制备所述组合物的方法和所述组合物的应用。

背景技术

本领域已知多价疫苗。一个例子是多年来已知的脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖四价疫苗[1，2]，此疫苗已获批准用于人类。然而，虽然此疫苗在青少年和成年人中有效，但在婴儿中诱导的免疫应答差，保护力持续时间短，因此不能用于婴儿[如3]。这是因为多糖是T细胞非依赖性抗原，通常诱导的免疫应答不能作加强免疫。故常需关注该多价疫苗能否广泛应用，因为它们可能造成对象的免疫功能显著下降，这称为免疫抑制。给予对象的抗原量超过免疫系统的应答能力时，可能导致此种免疫抑制。这种状况称为抗原过载。免疫抑制的发生也可能由于多价疫苗中的一种抗原组分阻止了免疫系统对其另一种抗原组分产生应答。后一种免疫抑制形式称为疫苗干扰。

在过去20年中，开发了包含细菌荚膜多糖与蛋白质载体相偶联的偶联疫苗。例子包括b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(Hib)偶联疫苗[4]以及针对肺炎链球菌[5]和脑膜炎奈瑟球菌血清组C(MenC)[6]的偶联疫苗。

已经批准的疫苗中所用的载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素的无毒CRM197突变体和脑膜炎奈瑟球菌血清组B的外膜蛋白复合物。由于医学实践中正在引进更多的偶联疫苗，因此婴儿可能接受疫苗本身(如TT或DT)或作为偶联疫苗中的载体蛋白形式的多次载体蛋白注射。由于这些蛋白质对B-和T-细胞具有高水平的免疫原性，这种载体过载可在初免个体中诱导免疫抑制[7]。这种现象称为载体诱导的表位抑制，认为这是由于载体特异性抗体和抗原分子内的竞争所致[8]。理想的是，载体蛋白应能诱导对偶联的B-细胞表位(如多糖)产生强大的辅助作用，而不诱导对其本身的抗体应答。采用在大多数II类主要组织相容性复合物分子结合时有免疫原性的通用表位是达到此目的的一种方法[9]。已在TT和其它蛋白中鉴定到这种表位。然而，仍需要进一步改进。

因此，本发明的目的是提供改进的糖偶联物。

发明内容

已发现：多表位载体蛋白作为糖结合载体特别有用。而且已发现：即使它们包含许多已知的病原体表位，但观察到对这些载体蛋白也只产生低免疫应答，而且预计此种免疫应答与病原体表位数量成比例提高。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了包含两种或多种单价偶联物(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种，见图1A)相组合的组合物。各单价偶联物包含(i)载体蛋白，其含有与(ii)糖抗原相偶联的两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种)病原体的T细胞表位。各偶联物中优选采用相同的载体蛋白。优选地，至少一种载体蛋白表位不衍生自与糖抗原相同的病原体。优选没有任何载体蛋白表位衍生自与糖抗原相同的病原体。

虽然由于各载体蛋白分子上有多个连接位点(图1B)，而可将各单价偶联物中各载体蛋白分子偶联于一种以上糖抗原分子(如1种、5种、10种、20种或更多种)，但偶联于任何给定载体蛋白的各糖抗原优选来自抗原性不同的同一种病原体。例如，MenA的糖抗原不同于MenC、MenW和MenY的糖抗原，因此称这些糖抗原来自抗原性不同的病原体，而Hib的糖抗原都来自抗原性不同的同一种病原体。在一种偶联物中，各糖抗原虽然来自抗原性不同的同一种病原体，但其链长度可以不同。

另外，在一些实施方式中，本发明提供的多价偶联物含有偶联于相同载体蛋白分子的两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种)抗原性不同的糖抗原(图1C)。在这种情况下，糖抗原来自抗原性不同的病原体。因此，例如，在这种偶联组合物中，各载体蛋白分子可偶联有MenA、MenC、MenW、MenY和Hib中的两种或多种糖抗原。本发明也提供了含两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种)这些多价偶联物的组合物。

另外，本发明提供的组合物含有上述一种或多种(如1种、2种、3种、4种、5种、6种或更多种)单价偶联物和一种或多种(如1种、2种、3种、4种、5种、6种或更多种)多价偶联物。

载体蛋白

所述载体蛋白可包含2种或多种T细胞表位(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100种或更多种)。载体蛋白优选包含6种或更多种，或10种或更多种表位。更优选地，载体蛋白包含19种或更多种表位。各载体蛋白可仅含有一个拷贝的特定表位，或可含有一个以上拷贝的特定表位。所述表位优选CD4+T细胞表位。载体蛋白优选包含至少一种细菌表位和至少一种病毒表位。所述表位优选衍生自人群通过天然感染或疫苗接种常常接触的抗原，例如，这些表位可衍生自甲肝病毒、乙肝病毒、麻疹病毒、流感病毒、水痘-带状疱疹病毒、牛型结核菌(Mycobacterium bovis)和麻风分枝杆菌(M.leprae)和/或链球菌(Streptococcus)菌株等的热激蛋白。这些表位宜选自破伤风毒素(TT)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)CSP(PfCs)、乙肝病毒核衣壳(HBVnc)、流感病毒血凝素(HA)、HBV表面抗原(HBsAg)和流感基质(MT)。蛋白的表位载体蛋白中所用表位宜选自P23TT(SEQ ID NO：1)、P32TT(SEQ ID NO：2)、P21TT(SEQ ID NO：3)、PfCs(SEQ ID NO：4)、P30TT(SEQ ID NO：5)、P2TT(SEQ ID NO：6)、HBVnc(SEQID NO：7)、HA(SEQ ID NO：8)、HBsAg(SEQ ID NO：9)或MT(SEQ ID NO：10)。

所述表位宜通过间隔臂连接。间隔臂优选不是表位的短(如1、2、3、4或5个)氨基酸序列。优选的间隔臂包含一个或多个甘氨酸残基，如-KG-。载体蛋白优选含有六-His尾和/或蛋白酶切割序列的N-或C-末端区，六-His尾是用于筛选载体蛋白的免疫亲和标记(例如可采用序列″MDYKDDDD″[SEQ ID NO：12])。蛋白酶解序列优选为因子Xa的识别位点。

所述载体优选不包含抑制性T细胞表位。

所述载体蛋白优选为N19(SEQ ID NO：11)。已证明，大肠杆菌(Escherichia coli)表达的称为N19的遗传工程改造蛋白含有几个人CD4+T-细胞通用表位[10]，当将其与Hib多糖偶联后具有强载体作用[11]。N19的N末端区域由以下部分组成：(i)可用于纯化的六His尾，(ii)克隆过程中用于筛选阳性克隆的兔多克隆抗体可识别的标记肽Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp序列(SEQ ID NO：12)，(iii)易于清除该标记的因子Xa识别位点Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：13)。N19是表1所列前9个表位加流感基质蛋白CD4+表位MT的两个拷贝。这些表位可用Lys-Gly间隔臂隔开，以提供该分子的可屈曲性，允许该多糖随后偶联于Lys残基的伯位ε-氨基。除CD4+表位外，载体蛋白可包含其它肽或蛋白片段，例如免疫调节性细胞因子如白介素-2(IL-2)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的表位。

表1

T细胞表位	来源	aa位置	氨基酸序列(SEQ ID NO)	参考文献
T细胞表位	来源	aa位置	氨基酸序列(SEQ ID NO)	参考文献	P23TT	破伤风毒素	1084-1099	VSIDKFRIFCKANPK(1)	12
P32TT	破伤风毒素	1174-1189	LKFIIKRYTPNNEIDS(2)	12	P23TT	破伤风毒素	1084-1099	VSIDKFRIFCKANPK(1)	12
P32TT	破伤风毒素	1174-1189	LKFIIKRYTPNNEIDS(2)	12	P21TT	破伤风毒素	1064-1079	IREDNNITLKLDRCNN(3)	13
PfCs	恶性疟原虫环孢子蛋白	380-398	EKKIAKMEKASSVFNVVN(4)	14	P21TT	破伤风毒素	1064-1079	IREDNNITLKLDRCNN(3)	13
PfCs	恶性疟原虫环孢子蛋白	380-398	EKKIAKMEKASSVFNVVN(4)	14	P30TT	破伤风毒素	947-967	FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(5)	15
P2TT	破伤风毒素	830-843	QYIKANSKFIGITE(6)	15，16	P30TT	破伤风毒素	947-967	FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(5)	15
P2TT	破伤风毒素	830-843	QYIKANSKFIGITE(6)	15，16	HBVnc	乙肝病毒核衣壳	50-69	PHHTALRQAILCWGELMTLA(7)	17
HA	流感病毒血凝素	307-319	PKYVKQNTLKLAT(8)	16	HBVnc	乙肝病毒核衣壳	50-69	PHHTALRQAILCWGELMTLA(7)	17
HA	流感病毒血凝素	307-319	PKYVKQNTLKLAT(8)	16	HBsAg	乙肝病毒表面蛋白	19-33	FFLLTRILTIPQSLD(9)	18
MT	流感病毒基质蛋白	17-31	YSGPLKAEIAQRLEDV(10)	19	HBsAg	乙肝病毒表面蛋白	19-33	FFLLTRILTIPQSLD(9)	18

糖抗原

优选偶联本发明组合物载体蛋白的糖抗原是细菌糖抗原，具体是细菌荚膜糖抗原。

本发明组合物中可包含的细菌荚膜糖的例子包括脑膜炎奈瑟球菌(血清组A、B、C、W135和/或Y)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尤其是4、6B、9V、14、18C、19F和/或23F)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和/或VIII型，如参考文献20-23中所述的糖抗原)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(可分型菌株：a、b、c、d、e和/或f)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(例如分离自PA01、O5血清型的LPS)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(如血清型5和8)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)或屎肠球菌(E.faecium)(三糖重复)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、克雷伯菌(Klebsiella spp.)等的荚膜糖。本发明组合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖)和真菌荚膜糖，如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)荚膜的荚膜糖。

脑膜炎奈瑟球菌血清组A(MenA)荚膜是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清组B(MenB)荚膜是(α2→8)-连接的唾液酸的均聚物。脑膜炎奈瑟球菌血清组C(MenC)荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可变的O-乙酰化。脑膜炎奈瑟球菌血清组W135糖是含有唾液酸-半乳糖二糖单元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可变的O-乙酰化[24]。脑膜炎奈瑟球菌血清组Y糖类似于血清组W135糖，除了二糖重复单元用葡萄糖代替了半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。它也在唾液酸的7位和9位含有可变的O-乙酰化。

本发明组合物包含糖抗原混合物。该组合物优选包含2种、3种、4种或更多种不同的糖抗原。所述抗原可来自抗原性相同或不同的病原体。本发明组合物优选包含一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖抗原，例如该组合物可包含血清组A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶联物。优选这些组合物包含血清组C和Y的糖。其它优选的组合物包含血清组C、W135和Y的糖。尤其优选的组合物包含血清组A、C、W135和Y的糖。

当混合物包含血清组A脑膜炎球菌的糖和至少一种其它血清组的糖时，MenA糖与其它血清组糖的比例(w/w)可以大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。优选1∶2-5∶1的比例，以及1∶1.25-1∶2.5之间的比例。血清组A∶C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)为：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。

本发明的其它优选组合物包含Hib糖偶联物和至少一种脑膜炎奈瑟球菌血清组，优选一种以上脑膜炎奈瑟球菌血清组的糖偶联物。例如，本发明组合物可包含Hib糖和脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和Y中一种或多种(即1、2、3或4种)的糖。本发明也提供上述病原体的糖偶联物的其它组合。

在一些实施方式中，本发明也提供了各偶联物的载体蛋白不相同的偶联物组合。

本发明的其它优选组合物包含第一偶联物和第二偶联物。第一偶联物是上述多表位偶联物，第二偶联物包含的糖抗原所偶联的载体蛋白不同于第一偶联物所用载体蛋白。例如，第二偶联物可以是偶联于载体CRM197的糖抗原。第二偶联物中的糖抗原与第一偶联物中的糖抗原可以相同或不同。

荚膜糖抗原的制备

制备荚膜糖抗原的方法是熟知的。例如，参考文献25描述了脑膜炎奈瑟球菌糖抗原的制备。参考文献26第14章描述了流感嗜血杆菌糖抗原的制备。现有技术描述了肺炎链球菌糖抗原和偶联物的制备。例如，Prevenar^TM是一种7-价肺炎球菌偶联疫苗。参考文献27和28中详细描述了无乳链球菌糖抗原的制备方法。可用已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的几篇参考文献所述。

糖抗原可以经化学修饰。例如，可修饰它们，用封闭基团取代一个或多个羟基。这种方法对脑膜炎球菌血清组A特别有用，其中用封闭基团取代乙酰基可防止水解[29]。这种修饰的糖仍然是本发明意义上的血清组A糖。

糖的化学修饰是与天然情况下发现的荚膜糖相比。例如，糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。根据具体糖，去乙酰化可能或可能不影响其免疫原性，如NeisVac-C^TM疫苗采用去-O-乙酰化的糖，而Menjugate^TM是乙酰化的，但这两种疫苗都有效。可用常规实验评价去乙酰化等的影响。

所用的荚膜糖可以是寡糖形式。通过纯化荚膜多糖的片段化(如通过水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。优选进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30。可通过离子交换色谱或比色测定方便地测定DP[30]。

如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖[31]。可用各种方法，如超滤后离子交换色谱实现此目的。对于脑膜炎球菌血清型A，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖；对于血清组W135和Y，优选去除聚合程度小于4左右的寡糖。

载体-糖偶联物

本发明偶联物可包含少量游离(即未偶联)载体。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式优选不多于组合物中载体蛋白总量的5％，更优选少于2％(以重量计)。

偶联后，可分离游离和偶联糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。[也参见参考文献32和33等]。

可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。优选通过-NH₂基团，例如载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链中的-NH₂基团连接糖抗原与载体。当糖具有游离醛基时，醛基可与载体中的氨基反应，通过还原胺化形成偶联物。也可通过-SH基团，如半胱氨酸侧链中的-SH基团连接。或者，糖抗原可通过接头分子连接于载体。

一般在偶联前活化或官能化糖。活化可包括例如：用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[34，35等])。其它合适技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU(也参见参考文献36的引言)

接头

可用任何已知方法，如参考文献37和38所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将载体蛋白偶联于该己二酸接头基团的另一端[39，40]。其它接头包括B-丙酰胺基[41]、硝基苯基-乙基胺[42]、卤代酰基卤化物[43]、配糖键[44]、6-氨基己酸[45]、ADH[46]、C4-C12部分[47]等。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原性胺化，如参考文献48和49所述。

优选包括以下步骤的方法：将氨基引入糖(如用-NH₂取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后，与载体蛋白反应。

可采用双功能接头提供偶联糖的氨基的第一基团和偶联载体(一般偶联于载体的氨基)的第二基团。

因此，双功能接头中的第一基团能够与糖的氨基(-NH₂)反应。此反应一般包括氨基氢原子的亲电子取代。双功能接头中的第二基团能够与载体的氨基反应。此反应一般也包括氨基的亲电子取代过程。

糖与载体的反应涉及氨基时，优选采用双功能接头X-1-X，其中：两个X基团相同，可与氨基反应；L是接头中的连接部分。优选X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L优选具有式L′-L²-L′，其中L′是羰基。优选的L²基团是含1-10个碳原子(如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)的直链烷基，如-(CH₂)₄-。

其它X基团是与HO-L-OH混合时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。

用于本发明的其它双功能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)和卤代酰基卤化物。

通常加入摩尔过量的接头以修饰糖。

偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。[也参见参考文献50和51等]。

当本发明组合物包含解聚的糖时，优选在偶联之前进行解聚。

其它抗原

本发明组合物可包含一种或多种(如2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)其它抗原，如：

A.细菌抗原

适用于本发明的细菌抗原包括可从细菌中分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。细菌抗原可通过重组表达产生。细菌抗原优选包括在细菌生活周期的至少一个阶段中暴露于细菌表面上的表位。细菌抗原优选在多种血清型之间的保守抗原。细菌抗原包括衍生自一种或多种下述细菌的抗原以及下面鉴定的特定抗原例子。

脑膜炎奈瑟球菌：脑膜炎球菌抗原可包括纯化或衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组如A、C、W135、Y和/或B的蛋白质(如参考文献52-58中鉴定的蛋白质)，糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡[59-62]。脑膜炎球菌蛋白质抗原可选自粘附素、自身转运蛋白、毒素、获铁蛋白(iron acquisition protein)和膜结合蛋白(优选完整的外膜蛋白)。也参见参考文献63-71。

肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。蛋白抗原可选自(例如)参考文献72-77中任一篇所鉴定的蛋白质。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三聚体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。也参见参考文献78-84。

酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)：链球菌血清组A抗原可包含参考文献85或86中鉴定的蛋白质(包括GAS40)、GAS M蛋白片段的融合物(包括参考文献87-89所述融合物)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌血红素相关蛋白(Shp)和链球菌素S(SagA)。也参见参考文献85、90和91。

粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：莫拉菌抗原包括参考文献92和93中鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。也参见参考文献94。

百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日咳杆菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3联用。也参见参考文献95和96。

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌抗原包括任选地偶联于无毒重组绿脓假单胞菌外毒素A的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，如StaphVAX^TM，或衍生自表面蛋白、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、抑制吞噬细胞吞噬、类胡萝卜素、过氧化氢酶产生的表面因子(荚膜、蛋白质A)、蛋白质A、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核细胞膜的膜损伤性毒素(任选地脱毒)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)。也参见参考文献97。

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)：表皮葡萄球菌抗原包括黏液相关性抗原(SAA)。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白。

白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素或其脱毒突变体，如CRM197。此外，考虑将能够调节、抑制ADP核糖基化或与其相关的抗原与本发明组合物组合/共同给予/偶联。这些白喉抗原可用作载体蛋白。

流感嗜血杆菌：流感嗜血杆菌抗原包括B型的糖抗原，或蛋白D[98]。

绿脓假单胞菌：假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)[99]。

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。细菌抗原可衍生自嗜肺军团菌。

无乳链球菌(B型链球菌)：B型链球菌抗原包括参考文献85和100-103中鉴定的蛋白质抗原。例如，该抗原包括蛋白质GBS80、GBS104、GBS276和GBS322。

淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)：淋病球菌抗原包括Por蛋白(或通道蛋白)如PorB[104]，转运结合蛋白如TbpA和TbpB[105]，不透明蛋白(如Opa)，可还原修饰的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制剂[106]。也参见参考文献52-54和107。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：沙眼衣原体抗原包括衍生自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原体，引起失明)，血清型L1、L2和L3(与性病淋巴肉芽肿有关)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原体抗原也可包括在参考文献103和108-110中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH样(CT242)、L7/L12(CT3 16)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。也参见参考文献111。

苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。

杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(引起软下疳)：杜氏嗜血菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。

粪肠球菌或屎肠球菌：抗原包括参考文献112提供的三糖重复(抗原)或其它肠球菌衍生抗原。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。[113-123]。

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)：抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)抗原包括LPS[124]。

大肠杆菌(Escherichia coli)：大肠杆菌抗原可衍生自产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、肠凝聚性大肠杆菌(EAggEC)、扩散粘附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠出血性大肠杆菌(EHEC)菌株的抗原。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)；炭疽杆菌抗原任选其脱毒抗原，选自A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者共享的共同B组分，称为保护性抗原(PA)。参见参考文献125-127。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原[128]、LPS[129]、V抗原[130]。

结核分枝杆菌：结核病抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)的融合蛋白和/或任选地配制到阳离子脂质囊泡中的ESAT-6[131]，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原[132]和/或MPT51抗原[133]。

立克次体：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)[134]，LPS和表面蛋白抗原(SPA)[135]。

单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可衍生自单核细胞增生利斯特菌。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：抗原包括参考文献108和136-141中鉴定的抗原。

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：抗原包括蛋白酶抗原，具体是霍乱弧菌II脂多糖、O1 Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗抗原[142]和/或封闭小带(Zonulaoccludens)毒素(Zot)。

鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，如vax-TyVi)。

布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相关蛋白(Erps)，核心蛋白聚糖结合蛋白(如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13(完整的膜蛋白，[143])结合的抗原以及VlsE抗原性可变蛋白[144]。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括外膜蛋白(OMP)。也参见参考文献145。

克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP(包括OMP A)或任选地偶联于破伤风类毒素的多糖。

其它细菌抗原可以是上述任何一种细菌的荚膜抗原、糖抗原或蛋白质抗原。其它细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制剂。此外，抗原包括活、减毒和/或纯化的任何上述细菌。本发明所用抗原可衍生自革兰阴性菌和/或革兰阳性菌。本发明所用抗原可衍生好氧和/或厌氧性细菌。

B.病毒抗原

适用于本发明的病毒抗原包括灭活(或杀死的)病毒，减毒病毒，分离的病毒制剂，纯化的亚基制剂，分离、纯化或衍生自病毒的病毒蛋白，以及病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可衍生自在细胞培养物或其它基质上增殖的病毒。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在病毒生活周期的至少一个阶段中暴露于病毒表面上的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物之间的保守抗原。病毒抗原包括衍生自一种或多种下述病毒的抗原以及下面鉴定的特定抗原例子。

正粘病毒：病毒抗原可衍生自正粘病毒，如流感病毒A、B和C。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组件(PB1、PB2和PA)。优选抗原包括HA和NA。

流感抗原可衍生自暴发流行期(一年一次)的流感毒株。或者，流感抗原可衍生自可能引起爆发流行的毒株(即与目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或对禽类有致病性并可能水平传播给人群的流感毒株，或对人有致病性的流感毒株)。

副粘病毒：病毒抗原可衍生自副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。[146-148]。

肺炎病毒：病毒抗原可衍生自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒，小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。肺炎病毒优选为RSV。肺炎病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基质蛋白M和M2，核衣壳蛋白N、P和L以及非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺炎病毒抗原包括F、G和M。参见例如参考文献149。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PIV二者的组分。

副粘病毒：病毒抗原可衍生自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎、仙台病毒、猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白质：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。副粘病毒蛋白优选包括HN、F1和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PFV二者的组分。市售腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗(MMR)混合的减毒活腮腺炎病毒。

麻疹病毒：病毒抗原可衍生自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可选自一种或多种下述蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。市售麻疹疫苗包括减毒的活麻疹病毒，一般与腮腺炎和风疹(MMR)联用。

小核糖核酸病毒：病毒抗原可衍生自小核糖核酸病毒，如肠道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒。优选抗原衍生自肠道病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。参见参考文献150和151。

肠道病毒：病毒抗原可衍生自肠道病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒，1-22型和24型柯萨奇病毒A，1-6型柯萨奇病毒B，1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71。肠道病毒优选脊髓灰质炎病毒。肠道病毒抗原优选选自一种或多种下述衣壳蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。[152，153]。

披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选抗原衍生自风疹病毒(rubivirus)，如风疹病毒抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原优选选自E1、E2或E3。市售风疹疫苗含有冷适应活病毒，一般与腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)联用。

黄病毒：病毒抗原可衍生自黄病毒，如蜱媒脑炎(TBE)、登革热(1、2、3或4型)、黄热病、日本脑炎、西尼罗河脑炎、圣路易斯脑炎、俄国春夏脑炎、波瓦生脑炎。黄病毒抗原可选自PrM、M、C、E、NS-I、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b或NS5。黄病毒抗原优选选自PrM、M或E。市售TBE疫苗包含灭活的病毒疫苗。

瘟病毒：病毒抗原可衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)病毒。

嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可选自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亚单位疫苗[153，154]。

丙肝病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS345聚蛋白、NS345-核心聚蛋白、核心和/或非结构区肽中的一种或多种[155，156]。

杆状病毒：病毒抗原可衍生自杆状病毒，如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。市售狂犬病病毒疫苗包含用人双倍体细胞或胎猴肺细胞培养的灭活病毒[157，158]。

杯状病毒科：病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺沃克病毒和诺沃克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可衍生自冠状病毒、SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自刺突(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。参考文献159中描述了SARS病毒抗原。

逆转录病毒：病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160、gp120和gp41)、pol、tat、nef、rev vpu、小蛋白(优选p55 gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一种或多种毒株：HIVI_IIb、HIV_SF2、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN、HIV-1_CM235、HIV-1_US4。

呼肠病毒：病毒抗原可衍生自呼肠病毒，如正呼肠病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱传热病毒。呼肠病毒抗原可选自结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3，或者非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4和/或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)和VP7。

细小病毒：病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自VP-1、VP-2、VP-3、NS-1和/或NS-2。细小病毒抗原优选衣壳蛋白VP-2。

δ-肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ-抗原(参见例如，参考文献160)。

戊肝病毒(HEV)：病毒抗原可衍生自HEV。

庚肝病毒(HGV)：病毒抗原可衍生自HGV。

人疱疹病毒：病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人疱疹病毒6(HHV6)，人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可选自糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)，或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可购得减毒的活VZV疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。

乳头状多瘤空泡病毒：抗原可衍生自乳头状多瘤空泡病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。优选将HPV抗原制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可选自VP1、VP2或VP3。

C.真菌抗原

真菌抗原可衍生自下述真菌组的一种或多种真菌。

真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮霉菌(Epidermophyton floccusum)，奥杜安氏小孢子菌(Microsporum audouini)，(Microsporum cards)，犬小孢子菌(Microsporum distortum)，马小孢子菌(Microsporum equinum)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)，矮小小孢子菌(Microsporum nanum)，同心性毛癣菌(Trichophyton concentricum)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，鸡毛癣菌(Trichophytongallinae)，石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum)，(Trichophyton megnini)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，(Trichophyton quinckeanum)，红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，许兰毛癣菌(Trichophyton schoenleini)，断发毛癣菌(Trichophyton tonsurans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，疣状毛癣菌(T.verrucosum)album变种、discoides变种、ochraceum变种，紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状毛癣菌(Trichophyton faviforme)。

真菌病原体包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄曲霉(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、头状芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假丝酵母(Candida albicans)、(Candida enolase)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、克鲁斯假丝酵母(Candida kusei)、(Candidaparakwsei)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、伪热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondi)、卡氏枝孢霉(Cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、(Pythiumn insidiosum)、皮屑芽胞菌(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisae)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、(Scedosporium apiosperum)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、马拉色菌(Malassezia spp.)、着色真菌(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌(Wangiella spp.)、孢子丝菌(Sporothrix spp.)、蛙粪霉(Basidiobolus spp.)、耳霉(Conidiobolus spp.)、根霉(Rhizopus spp.)、毛霉(Mucor spp.)、犁头霉(Absidia spp.)、被孢霉(Mortierella spp.)、小克银汉霉(Cunninghamella spp.)、瓶霉(Saksenaea spp.)、链格孢菌(Alternaria spp.)、弯孢菌(Curvularia spp.)、长蠕孢菌(Helminthosporium spp.)、镰胞菌(Fusarium spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)、青霉(Penicillium spp.)、(Monolinia spp.)、丝核菌(Rhizoctonia spp.)、拟青霉(Paecilomycesspp.)、皮司霉(Pithomyces spp.)和枝孢霉(Cladosporium spp.)。

本领域熟知产生真菌抗原的方法[161]。在优选方法中，提取溶解组分，使之与已基本除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞的不溶性组分分离，其特征在于所述方法包括以下步骤：获得活真菌细胞；获得已基本除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；破碎已基本除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；获得不溶性组分；以及从不溶性组分中提取和分离溶解组分。

D.STD抗原

本发明组合物可包含性传播疾病(STD)产生的一种或多种抗原。这种抗原可预防或治疗STD，如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳[162]。抗原可衍生自一种或多种病毒或细菌性STD。用于本发明的病毒STD抗原可衍生自(例如)HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本发明的细菌STD抗原可衍生自(例如)淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜氏嗜血菌、大肠杆菌和无乳链球菌。上面已描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

E.呼吸道抗原

本发明组合物可包含衍生自引起呼吸道疾病的病原体的一种或多种抗原。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒如正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PrV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、绿脓假单胞菌、百日咳博德特菌、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

F.儿童疫苗抗原

本发明组合物可包含适用于儿童对象的一种或多种抗原。儿童对象一般年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿童用抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中给予多次。儿童用抗原可衍生自可靶向儿童群体的病毒和/或儿童群体易受感染的病毒。儿童用病毒抗原包括衍生自正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)的一种或多种抗原。儿童用细菌抗原包括衍生自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、酿脓链球菌(A型链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、B型流感嗜血杆菌(Hib)、绿脓假单胞菌、无乳链球菌(B型链球菌)和大肠杆菌的一种或多种抗原。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

G.适用于老年人或免疫力减弱个体的抗原

本发明组合物可包含适用于老年人或免疫力减弱个体的一种或多种抗原。这些个体可能需要接种多次较高计量或用佐剂配制的疫苗，以提高他们对靶抗原的免疫应答。目标用于老年人或免疫力减弱个体的抗原包括衍生自一种或多种以下病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A型链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、B型流感嗜血杆菌(Hib)、绿脓假单胞菌、嗜肺军团菌、无乳链球菌(B型链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。上面描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

H.适用于青少年疫苗的抗原

本发明组合物可包含适用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要用先前已给予的儿童用抗原作加强接种。上面描述的儿童用抗原可能适用于青少年。此外，青少年是接受衍生自STD病原体抗原免疫接种的目标人群，以保证在开始性活动之前产生保护性或治疗性免疫力。上面描述了可能适用于青少年的STD抗原。

I.肿瘤抗原

本发明的一个实施方式包括肿瘤抗原或癌抗原。肿瘤抗原可以是(例如)含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。肿瘤抗原也可以是(例如)含糖的肿瘤抗原，如糖脂肿瘤抗原或神经节苷脂肿瘤抗原。肿瘤抗原还可以是(例如)表达含多肽的肿瘤抗原的含多核苷酸的肿瘤抗原，如RNA载体构建物或DNA载体构建物，如质粒DNA。

适用于实施本发明的肿瘤抗原包括各种分子，如(a)含多肽的肿瘤抗原，包括多肽(长度范围可以是(例如)8-20个氨基酸，虽然超出此长度以外的也常见)、脂多肽和糖蛋白，(b)含糖肿瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神经节苷脂、糖脂和糖蛋白；(c)表达抗原性多肽的多核苷酸。

肿瘤抗原可以是(例如)(a)与癌细胞相关的全长分子，(b)它们的同源或修饰形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)它们的片段。肿瘤抗原可以是重组形式。肿瘤抗原包括例如：CD8+淋巴细胞识别的I型-限制性抗原或CD4+淋巴细胞识别的II型-限制性抗原。

本领域已知许多肿瘤抗原，包括：(a)睾丸癌-抗原如NY-ESO-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(可用于(例如)检测黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、NSCLC、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤和膀胱肿瘤)，(b)突变抗原，例如p53(与各种实体瘤如结直肠癌、肺癌、头颈癌有关)、p21/Ras(与(如)黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌有关)、CDK4(与(如)黑色素瘤有关)、MUM1(与(如)黑色素瘤有关)、胱冬酶-8(与(如)头颈癌有关)、CIA0205(与(如)膀胱癌有关)、HLA-A2-R1701、β连环蛋白(与(如)黑色素瘤有关)、TCR(与(如)T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)、BCR-ab1(与(如)慢性髓细胞性白血病有关)、丙糖磷酸异构酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)过度表达的抗原，例如半乳凝集素4(与(如)结直肠癌有关)、半乳凝集素9(与(如)霍奇金病有关)、蛋白酶3(与(如)慢性髓细胞性白血病有关)、WT1(与(如)各种白血病有关)、碳酸酐酶(与(如)肾癌有关)、醛缩酶A(与(如)肺癌有关)、PRAME(与(如)黑色素瘤有关)、HER-2/neu(与(如)乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌有关)、甲胎蛋白(与(如)肝细胞瘤有关)、KSA(与(如)结直肠癌有关)、胃泌素(与(如)胰腺癌和胃癌有关)、端粒酶催化蛋白MUC-1(与(如)乳腺癌和卵巢癌有关)、G-250(与(如)肾细胞癌有关)、p53(与(如)乳腺癌、结肠癌有关)和癌胚抗原(与(如)乳腺癌、肺癌和胃肠道癌症如结直肠癌有关)，(d)共享抗原，例如，黑色素瘤-黑素细胞分化抗原如MART-1/Melan A、gp100、MC1R、黑素细胞刺激激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(与(如)黑色素瘤有关)，(e)前列腺相关抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，与(如)前列腺癌有关，(f)免疫球蛋白独特型(与(如)骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)和(g)其它肿瘤抗原，如含有多肽-和糖-的抗原，包括(i)糖蛋白如唾液酸Tn和唾液酸Le^x(与(如)乳腺癌和结直肠癌有关)以及各种粘液素；糖蛋白可偶联于载体蛋白(如MUC-1可偶联于KLH)；(ii)脂多肽(如连接有脂部分的MUC-1)；(iii)多糖(如Globo H合成六糖)，可偶联载体蛋白(如KLH)，(iv)神经节苷脂如GM2、GM12、GD2、GD3(与(如)脑癌、肺癌、黑色素瘤有关)，也可偶联载体蛋白(如KLH)。

本领域已知的其它肿瘤抗原包括p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原、包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T-细胞嗜淋巴细胞病毒抗原、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791 Tgp72、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。例如，参考文献163和其中引用的参考文献描述了这些和其它细胞组分。

本发明中含多核苷酸的抗原一般包含编码以上所列癌多肽抗原的多核苷酸。优选的多核苷酸抗原包括DNA或RNA载体构建物，如质粒载体(如pCMV)，它们能在体内表达癌多肽抗原。

肿瘤抗原可衍生自(例如)突变或改变的细胞组分。改变后，这些细胞组分不再行使其调节功能，因此细胞可能发生不受控制的生长。改变的细胞组分的例子包括ras，p53，Rb，Wilms肿瘤基因编码的改变的蛋白，泛素，粘液素，DCC、APC和MCC基因编码的蛋白，以及受体或受体样结构，如neu、甲状腺激素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、胰岛素受体、表皮生长因子(EGF)受体和集落刺激因子(CSF)受体。参考文献164和其中引用的参考文献描述了这些和其它细胞组分。

此外，细菌和病毒抗原可与本发明组合物联用以治疗癌症。具体说，载体蛋白如CRM197、破伤风类毒素或鼠伤寒沙门菌抗原可与本发明化合物联用以治疗癌症。癌抗原联合疗法的效力和生物利用度高于现有疗法。

可以在(例如)参考文献165(如表3和4)、参考文献166(如表1)和参考文献167-189中找到关于癌症或肿瘤抗原的其它信息。

也可用免疫接种来治疗阿耳茨海默病，如采用Abeta作为抗原[190]。

J.抗原制剂

在本发明的其它方面，提供了吸附抗原的微粒制备方法。该方法包括：(a)通过分散含有(i)水、(ii)去污剂、(iii)有机溶剂和(iv)可生物降解聚合物的混合物提供乳液，所述可生物降解的聚合物选自：聚(α-羟酸)、多羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐或聚氰基丙烯酸酯。相对于有机溶剂，该聚合物在混合物中的浓度一般约为1％-30％，而混合物中去污剂-聚合物的重量比一般约为0.00001∶1-0.1∶1(更一般约为0.0001∶1-0.1∶1，约为0.001∶1-0.1∶1，或约为0.005∶1-0.1∶1)；(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)使抗原吸附于微粒表面上。在某些实施方式中，相对于有机溶剂，可生物降解的聚合物的浓度约为3％-10％。

本文所用微粒由可灭菌、无毒和可生物降解的材料制成。这类材料包括但不限于：聚(α-羟酸)、多羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。优选地，本发明所用微粒衍生自聚(α-羟酸)，具体说，衍生自聚(交酯)(″PLA″)或D，L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(″PLG″或″PLGA″)，或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。该微粒可衍生自具有各种分子量的各种聚合物原料，在共聚物如各种丙交酯乙交酯比例的PLG情况下，选择是主要问题，部分取决于共同给予的大分子。下面更全面地讨论这些参数。

参考文献191中提供了其它制备方法和抗原(尤其是肿瘤抗原)。

医学方法和应用

一旦配制好后，本发明组合物可直接给予对象。治疗对象可以是动物；具体说，可治疗人类对象。可将该组合物配制成专门用于接种儿童和青少年的疫苗。可通过全身和/或粘膜途径给予它们。

一般地，将该组合物制备成溶液或悬液形式的注射剂；适合在注射前用液体载体溶解或悬浮的固体形式。通常通过胃肠道外(如注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内，或者递送至组织间隙)直接递送该组合物。也可将该组合物给予病灶。其它给药方式包括口服给药和肺给药、栓剂和透皮或经皮施用(参见例如参考文献192)，针注射和无针注射。计量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括加强剂量)。

本发明疫苗优选无菌疫苗，优选无热原疫苗。优选用缓冲液使(例如)pH6-pH8，通常约为pH7。当疫苗包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[193]。

本发明疫苗可包含低水平(如＜0.01％)去污剂(如吐温，如吐温80)。本发明疫苗可含有(如)约15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是冻干时。

可凭经验评价各抗原的最佳剂量。然而通常，本发明糖抗原的给药剂量为每剂量各种糖0.1-100μg，典型剂量体积为0.5ml。一般剂量为每剂每种糖5-20μg。以糖计量这些值。

本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即在感染后治疗疾病)疫苗，但一般是预防性疫苗。

本发明提供了用作药物的本发明偶联物。

本发明也提供了诱导患者产生免疫应答的方法，所述方法包括给予患者本发明偶联物。免疫应答优选能产生抵抗脑膜炎球菌丙、肺炎球菌病或流感嗜血杆菌的保护力，包括体液免疫应答和/或细胞免疫应答。患者优选儿童。在已接受脑膜炎球菌、肺炎球菌或流感嗜血杆菌初免的患者中该方法可产生加强应答。

本发明也提供本发明偶联物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其中所述患者已用与偶联于载体的组合物所含糖抗原不同的糖抗原预先治疗。

本发明也提供了偶联物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其中所述患者已用与偶联不同载体的组合物所含抗原相同的糖抗原预先治疗。

所述药物优选为免疫原性组合物(如疫苗)。该药物优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌(如脑膜炎、败血症、淋病等)、流感嗜血杆菌(如中耳炎、支气管炎、肺炎、蜂窝织炎、心包炎、脑膜炎等)或肺炎球菌(如脑膜炎、败血症、肺炎等)引起的疾病。优选预防和/或治疗细菌性脑膜炎。

可用标准动物模型检测这些疫苗(例如参见参考文献194)。

本发明还提供了一种药盒，其装有：a)本发明的第一种偶联物和b)本发明的第二种偶联物。

佐剂

本发明偶联物可与其它免疫调节剂联用。具体说，组合物通常含有佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。这种矿物质组合物可包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献195的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地含有过量磷酸盐)，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附于该盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[196]。

本发明组合物中可包含铝盐，Al³⁺剂量为每剂量0.2-1.0mg。

磷酸铝佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mgAl³⁺/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μgAl³⁺/偶联物/剂。采用磷酸铝并且不需要使抗原吸附于佐剂时，在溶液中包含游离的磷酸根离子(如采用磷酸盐缓冲液)比较有利。

B.油乳剂

适合用作本发明偶联物作为佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献195第10章；也参见参考文献197-199]。将MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。MF59乳剂宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

用于组合物的尤其优选的佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE鲨烯/水乳剂，如含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0％Span 85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-1-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献197和200-201详细描述了亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(如胞壁酰肽)在本发明组合物中的应用。

可采用鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有Span 85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1，因为这能使乳液更稳定。可通过下述方法制备一种这样的乳剂：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5gDL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

可采用含鲨烯、生育酚和Triton去污剂(如Triton X-100)的乳液。

可采用含鲨烯、聚山梨酸酯80和泊洛沙姆401(″Pluronic^TM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP一起使用[202]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％PluronicL121和0.2％聚山梨酸酯80)[203]。优选微流体化。

也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)作为佐剂。

C.皂苷制剂[参考文献195的第22章]

皂苷制剂也可用作本发明偶联物的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献204。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[205]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献195的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献205-207中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[208]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献209和210。

D.病毒小体和病毒样颗粒

病毒小体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白。病毒小体和颗粒通常无病原性、不能复制，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒小体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在参考文献211-216中有进一步描述。病毒小体在(例如)参考文献217中有进一步描述。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献218中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[218]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC-529[219，220]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂质A衍生物。(例如)参考文献221和222中描述了OM-174。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献223、224和225公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献226-231中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[232]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献233-235中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献232和236-238。

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选该蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)菌。参考文献239中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献240中描述了将其用作胃肠道外佐剂。毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。优选A亚单位含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献241-248中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。优选根据参考文献249中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考。

式I、II或III的化合物或其盐也可用作佐剂：

如参考文献250所述，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、′ER 804058′、′ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、′ER 803022′或′ER 804057′，如：

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[251]、IL-23、IL-27[252]等)[253]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-Iα)和MIP-1β[254]。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[255]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[256]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直径约100nm-150μm，更优选约200nm-30μm，最优选约500nm-10μm的微粒)，这些微粒任选经处理而具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

I.脂质体(参考文献195第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献257-259所述。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[260]。这种制剂还包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂和辛苯糖醇[261]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[262]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

参考文献263和264中描述了PCPP(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])制剂。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

M.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献265和266所述。

N.缩氨基硫脲化合物

缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献267所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

O.色胺酮化合物

色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献268所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

P.核苷类似物

可将各种核苷类似物用作佐剂，如(a)Isatorabine(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：

(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献269-271所述的化合物；(f)下式化合物：

式中：

R₁和R₂各自独立地是氢、卤素、-NR_aR_b、-OH、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R₃不存在，或者是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R₄和R₅各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-R_d、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R_4-5：

在

所示键处实现结合。

X₁和X₂各自独立地是N、C、O或S；

R₈是氢、卤素、-OH、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、-NR_aR_b、-(CH₂)_n-O-R_c、-O-(C_1-6烷基)、-S(O)_pR_e或-C(O)-R_d；

R₉是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R_9a，其中R_9a是：

在所示键处实现结合。

R₁₀和R₁₁各自独立地是氢、卤素、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NR_aR_b或-OH；

R_a和R_b各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、C_6-10芳基；

R_c各自独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R_d各自独立地是氢、卤素、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-NH(取代的C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、-N(取代的C_1-6烷基)₂、C_6-10芳基或杂环基；

R_e各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R_f各自独立地是氢、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基；

n各自独立地是0、1、2或3；

p各自独立地是0、1或2；或者

(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。

Q.连接于含磷酸无环主链的脂质

含有连接于含磷酸无环主链的脂质的佐剂包括TLR4拮抗剂E5564[272，273]：

R.小分子免疫增强剂(SMIP)

SMIP包括：

·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；

·1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺；

·2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；

·2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；

·4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑[4，5-c]喹啉-2-酮；

·N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

·1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；

·1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；

·N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。

S.蛋白质体

一种佐剂是由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生自第二种革兰阴性菌脂多糖制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和脂多糖制剂形成稳定的非共价连接佐剂复合物。这种复合物包括″IVX-908″，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖组成的复合物，已用作流感疫苗的佐剂[274]。

T.其它佐剂

参考文献195和275中公开了用作免疫刺激剂的其它物质。

其它有用的佐剂物质包括：

·甲基肌苷5′-单磷酸酯(″MIMP″)[276]。

·多聚水合吡咯双烷类化合物[277]，如下式化合物：

式中，R选自：氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或其药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于：木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-α-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。

·γ菊糖[278]或其衍生物，如algammulin。

·参考文献279所述化合物。

·参考文献280所述化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[281，282]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[283]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[284]。

·Loxoribine(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[285]。

阳离子脂质与(通常为中性)共脂质(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺(″Vaxfectin^TM″)或氨基丙基-二甲基-双十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(″GAP-DLRIE:DOPE″)的制剂。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(顺-9-四癸烯氧基)-1-丙铵盐的制剂[286]。

本发明也可包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下组合可用作本发明佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[287]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[288]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[289]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[290]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem)，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)；和(9)一种或多种无机盐(如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。

定义

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。

可认为本文中所有数值都由″约″限定，除非文中另有说明。

术语″基本上″不排除″完全″，如″基本上不含″Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语″基本上″。

附图简要说明

图1显示了载体和糖抗原的各种可能组合，(A)两种单价偶联物，(B)各载体蛋白分子可结合于一种以上糖抗原分子的一种单价偶联物，和(C)一种以上抗原性不同的糖连接于各载体蛋白分子的多价偶联物。

图2显示了血清抗MenC IgG抗体应答。用剂量递减的N19-MenC或CRM-MenC(2.5、0.625、0.156和0.039μg MenC/剂量)和0.5mg氢氧化铝免疫每组六只BALB/c小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清样品，分别测试以定量MenC-特异性IgG抗体效价。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±1 SD)。

图3显示了如前所述免疫小鼠的各血清样品的抗载体IgG抗体应答。用两种偶联物之一等量的MenC免疫小鼠，接受CRM-MenC的小鼠组和接受N19-MenC的小鼠组的载体蛋白的最终含量稍有不同，这是由于这两种构建物中糖∶蛋白质比例稍有不同。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清样品，分别测试以定量载体-特异性的IgG抗体。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±1 SD)。

图4显示了用剂量递减的N19-MenC或CRM-MenC(2.5μg、0.625μg、0.156μg、0.039μg MenC/剂量)和0.5mg氢氧化铝免疫三次的小鼠血清样品的杀菌活性。显示了在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集的合并血清样品的杀菌抗体效价。结果表示为产生50％以上细菌杀伤的最高血清稀释度的倒数值。

图5显示了血清抗MenA和抗MenC抗体应答。在0.06mg磷酸铝存在下，单用或联用的剂量递减的N19-MenA和N19-MenC或CRM-偶联物(0.625、0.156和0.039μg MenA和/或MenC/剂量)免疫每组六只BALB/c小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清样品，测定抗MenA和MenC-特异性IgG抗体效价。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±1 SD)。

图6显示了剂量逐渐提高的N19四价联合偶联疫苗对血清组特异性抗体应答的影响。以0.06mg磷酸铝作为佐剂，用剂量递减的N19-MenACWY(实线)或CRM-MenACWY(虚线)(2-0.074μg各MenPS/剂量)免疫每组六只BALB/c小鼠。第0、21和35天免疫接种，在各次免疫之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)测定血清抗MenA、抗MenC、抗MenW和抗MenY特异性IgG抗体效价。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±1SD)。

图7显示了用每剂量0.074μg各PS(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)免疫小鼠两次(免疫2次后)和三次(免疫3次后)，获自小鼠的单份血清对C和W-135的杀菌活性。效价表示为产生至少50％细菌杀伤的最高血清稀释度的倒数值。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±SD)。

图8显示了用材料和方法中详述的N19-MenACWY或CRM-MenACWY免疫后，小鼠产生的抗MenC抗体的动态亲合力概况。用改进的ELISA法测定合并血清的高亲合力IgG效价。结果表示为亲合力指数(AI)，其对应于各次免疫后(第1次免疫后、第2次免疫后、第3次免疫后)用75mMNH₄SCN洗脱的各组结合抗体的百分数。

图9显示了第三次免疫后获得的合并血清对载体及其母体蛋白的抗体应答。图中各点代表如上所述三次免疫后各组的抗体效价(±1 SD)。

图10显示了血清抗MenA抗体应答。用剂量递减的偶联于N19或CRM的MenA与偶联于CRM或N19的MenCWY相混合制备的四价制剂(N19-MenA+CRM-MenCWY，反之亦然CRM-MenA+N19-MenCWY)免疫每组六只BALB/c小鼠三次。对照组接受只含有一种载体蛋白的四价制剂(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)。小鼠接受以0.06mg磷酸铝作为佐剂的剂量递减的四价制剂(0.67μg-0.074μg各MenPS/剂量)。为了简便，我们仅报告接种最高(0.67μg)和最低(0.074μg)免疫剂量后获得的结果。

图11显示了用剂量递减的上述双载体或单载体制剂免疫三次后BALB/c小鼠的血清杀菌活性。测定了第二次(免疫2次后)和第三次(免疫3次后)免疫后收集的合并血清样品的杀菌抗体效价。结果表示为产生大于50％细菌杀伤的最高血清稀释度的倒数。

图12显示了抗荚膜IgG抗体应答。在0.06mg磷酸铝存在下用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67或0.22μg各MenPS/剂量)偶联物免疫BALB/c或C57BL/6小鼠组两次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后和免疫2次后)收集血清样品，测定MenA、MenC、MenW、MenY-特异性IgG抗体效价。图中各点代表各时间点各组的平均抗体效价(±1 SD)。

图13显示了抗荚膜IgG抗体应答。在0.06mg磷酸铝的存在下用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67μg各PS/剂量)免疫BALB/c H-2d、BALB/B H-2b、B10.BRH-2 k、B10.D2N H-2 q和B10.D1 H-2 d小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清样品，测定MenA、MenC、MenW、MenY-特异性IgG抗体效价。图中各柱代表平均抗体效价，符号对应于各时间点各组的每只小鼠。

图14显示了用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67μg各MenPS/剂量)和0.06mg磷酸铝免疫三次具有不同遗传背景的小鼠的血清杀菌活性。显示了第三次免疫后(免疫3次后)收集的合并血清样品的杀菌抗体效价。结果表示为产生大于50％细菌杀伤的最高血清稀释度的倒数。

图15显示了N19表位-特异性T细胞增殖反应。检测用N19-MenACWY(6μgN19/剂量)免疫3次的小鼠脾细胞在存在0.9-30μM三种肽(P2TT、P23TT、P30TT)之一和0.312-10μg/ml游离或偶联于PS的N19蛋白时的体外细胞增殖，如图所示。结果表示为刺激指数(SI)＝(cpm实验/cpm未刺激背景)。^*＝N19浓度为0.312-10μg/ml

图16显示了N19表位-特异性T细胞增殖反应。检测用N19-MenACWY(6μgN19/剂量)免疫两次的小鼠脾细胞在存在0.12-30μM各个肽(P2TT、P21TT、P23TT、P30TT、P32TT、HA、HBsAg)和0.004-1μMN19时的体外细胞增殖，如图所示。结果表示为刺激指数(SI)＝(cpm实验/cpm未刺激背景)。^*＝N19浓度为1-0.004μM

图17显示了用N19-MenACWY免疫的同类系小鼠的T-细胞增殖反应。在0.06mg磷酸铝存在下用N19-MenACWY(6μgN19/剂量)免疫具有不同H-2单倍型的小鼠品系三次。测试脾细胞在1.7-15μM N19肽(见表1)和0.1-10μg/ml游离或偶联于MenPS的N19蛋白存在时的体外细胞增殖。结果表示为刺激指数(SI)＝(cpm实验/cpm未刺激背景)。SI＞2被认为是阳性。

图18显示了P23TT、HA和HBsAg特异性T细胞的激活。用增殖试验测定对同源肽和N19蛋白的刺激指数。用50μl含有用CFA 1∶1乳化的50μg单种肽在尾根部免疫每组三只小鼠。7天后，摘取淋巴结，测定LN细胞在不同浓度的同源肽或N19蛋白存在下的增殖能力。结果获自每只小鼠一式三份培养物。结果表示为以实验组cpm/背景cpm平均值计算的刺激指数(SI)。

实施本发明的方式

1.糖偶联物制备

1.1多表位蛋白N19的表达和纯化。

在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上37℃O/N培养携带重组质粒pQE-N19的大肠杆菌菌株。然后将培养的细菌接种到500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃ O/N培养。然后将500ml稀释加入到发酵罐中的5升培养基中。在优化条件下培养。当OD_600nm值达到4.2时，加入1mM IPTG(异丙基-硫代半乳糖苷)诱导该多表位蛋白表达3.5小时，直到OD_600nm为7.2。在加入IPTG前的时间零点(t₀ OD 4.2)和表达终止时间点(t_终止OD 7.2)收集两份细菌培养上清样品。将获得的沉淀重悬于样品缓冲液，对应于不同细菌培养物OD作连续稀释后加到12.5％SDS-PAGE上。用JA10转头(Beckman，Fullerton，CA)以5000g 4℃离心全部细菌培养物20分钟。将60g获得的细胞沉淀悬浮于500ml裂解缓冲液(6M盐酸胍，100mM NaH₂PO₄，2mM TCEP(Pierce)pH8)中，室温搅拌1小时，然后37℃孵育1小时。用J20转头(Beckman)以12000rpm室温离心20分钟收集溶解有蛋白质的上清液，进行固相金属亲和色谱(IMAC)。样品吸附于IMAC柱之前，加入先前证明是纯化必需的1mM TCEP(三(2-羧基乙基)盐酸膦，Pierce)，以避免共同纯化通过二硫键共价结合于N19的污染物。将溶解物加到装有360ml镍活化IDA(亚氨基二乙酸)螯合琼脂糖快流(Pharmacia，Uppsala，Sweden)XK50柱上，然后，用5体积裂解缓冲液洗涤该柱。然后，加入300ml梯度液，即含有1mM TCEP的6M盐酸胍pH8至8M脲pH8。用3体积缓冲液B(8M脲，100mM NaH₂PO₄，pH7)洗涤该柱，用1800ml缓冲液B配的0-200mM咪唑梯度液洗脱蛋白质。在12.5％SDS-PAGE(BioRad)上定量分析从该柱收集的组分，用Bradford蛋白测定法(BioRad蛋白实验)定量。

对含有纯化重组蛋白的所选梯度组分进行阳离子交换色谱(CEC)。将600ml合并组分加到装有120ml SP-琼脂糖快流树脂(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的XK50柱上。用5体积缓冲液C(7M脲，20mM NaH₂PO₄ pH7，10mM β-巯基乙醇)洗涤该柱，用1300ml缓冲液C配的0-500mM NaCl梯度液洗脱蛋白质。合并用12.5％SDS-PAGE分析选择的含有纯化重组蛋白的梯度液各组分(BioRad)，用10mMNaH₂PO₄，150mM NaCl，10％甘油透析。按照厂商说明书用microBCA法测定最终蛋白浓度(Pierce)。在12.5％SDS-PAGE(BioRad)上分析蛋白质。测定各条带的光密度进行完整性评价(Image Master ID Elite v4.00 LabScan Computer Program)。由质量控制部门(Chiron Vaccine Siena)用鲎变形细胞裂解物(LAL)动态比浊法测定最终蛋白质制剂中的内毒素水平。

1.2产生寡糖。

用脑膜炎球菌疫苗生产中所述的标准方法(291)自脑膜炎奈瑟球菌菌株纯化脑膜炎球菌血清组A、C、W、Y多糖。然后，使纯化荚膜多糖解聚并活化，以偶联载体蛋白，如前所述(292，293)。简言之，我们在本文中描述了脑膜炎球菌血清组C寡糖的制备方法。用10mM乙酸钠缓冲液pH5.0水解纯化的MenC荚膜多糖，以降低其平均聚合度(DP)。80℃进行该反应～12小时，直到DP达到10。在水解期间可通过分析起始多糖溶液中的总唾液酸含量(在水解期间恒定)和氧化后各链末端基团释放的甲醛在线跟踪DP。此实时DP测定得以外推(得到)水解的最终时间。用Q-琼脂糖FF离子交换色谱对寡糖进行筛分，该色谱柱上能保留分子量较高的多糖，而用5mM乙酸钠缓冲液，100mM NaCl，pH6.5洗脱柱上的低分子量寡糖(DP＜6)。然后，用0.7M四丁基溴化铵(TAB)(带正电的抗衡离子)洗脱所需寡糖组分，TAB取代柱上带负电的寡糖。然后在3K截取膜上用水渗滤除去过量TAB并浓缩制剂中的MenC寡糖。渗滤后，通过旋转蒸发步骤干燥残余物。然后，还原胺化MenC寡糖，产生具有末端伯胺基的寡糖。使反应混合物含有10％DMSO、90％甲醇、50mM乙酸铵和10mM氰基硼氢化钠，在加盖水浴中50℃孵育24小时。然后，旋转蒸发反应混合物，以降低胺化反应混合物中的甲醇含量，以避免在以后渗滤步骤中可能与硅管和渗滤膜发生的相互反应。通过用8体积0.5M NaCl、然后4倍体积20mM NaCl浓缩渗滤纯化试剂(氰基硼氢化物，DMSO，甲醇)中的胺化寡糖。真空下干燥纯化胺化寡糖，为活化步骤作准备。将MenC寡糖溶解于水，然后加入DMSO混合物中。加入三乙胺(TEA)，以保证寡糖伯氨基和己二酸的二-N-羟基琥珀酰亚胺(双-NHS)酯充分去质子化。加入摩尔过量的双NHS，以有利于一种寡糖聚合物与双NHS酯各分子形成共价连接。在该反应混合物中加入丙酮沉淀活化寡糖，这种方法也用于分离寡糖与DMSO、双NHS酯和TEA。真空干燥沉淀，称重并储存于-20℃，直到用于偶联。

纯化其它PS的方法基本相同，反应时间和温度稍有修改[294]。

1.3将N19偶联于脑膜炎球菌寡糖。

纯化、筛分和活化后，使寡糖随后与N19蛋白偶联[295]。开始偶联实验之前，我们初步评价了该多糖与Ni活化树脂的潜在非特异性吸附。在典型的偶联实验中，将343.2nmol N19载体蛋白溶解于盐酸胍pH8，100mM Na₂HPO₄，并吸附于预先填装的用相同缓冲液平衡的5ml Ni-活化琼脂糖快流树脂(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。用50ml 100mM磷酸盐缓冲液pH7.5洗涤树脂除去盐酸胍，然后将1ml 100mM含有6864nmol活化脑膜炎球菌寡糖(MenA、MenC、MenW或MenY)的磷酸盐缓冲液pH7.5加入该柱，室温下反复循环2小时。用50ml 100mM Na₂HPO₄ pH7.5洗涤该柱，以去除过量未偶联的寡糖。最后，用300mM咪唑，pH7，100mM NaH₂PO₄洗脱偶联产物，在7.5％SDS-PAGE上分析。合并含偶联物的选出组分，用PBS透析。分析该糖偶联物的糖和蛋白质含量。通过测定唾液酸定量MenC、MenW和MenY偶联物的糖含量(143)，同时通过甘露糖胺-1-磷酸色谱测定MenA偶联物的糖含量(121)。用microBCA试验测定蛋白质含量(Pierce，Rockford，IL)。由糖-蛋白质重量比计算糖基化程度。由生产部(Chiron Vaccine Siena)制备在本研究中用作参比的CRM偶联疫苗(CRM-MenA、CRM-MenC、CRM-MenW、CRM-MenY)。

2.小鼠品系。

除非另有说明，采用每组六只雌性7周龄小鼠BALB/c。在另一实验中，采用具有以下H-2单倍型的四只同类系7-周龄雌性小鼠：与BALB/c(H-2^d)和B10.BR(H-2^k)同类的BALB/B(H-2^b)，与C57BL/6(H-2^b)同类的B10.D2N(H-2^q)、B10.D1(H-2^d)。小鼠购自Charles River(Calco，Italy)或Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)。

3.小鼠免疫方案和制剂。

如下所述，在第0、21和35天用0.5ml以0.9％NaCl缓冲液稀释的糖含量为基础的单价、二价、四价或双载体偶联疫苗(N19或CRM偶联物)的不同制剂皮下免疫小鼠。在第1天(免疫前)、第20天(第1次免疫后)、第34天(第2次免疫后)和第45天(第3次免疫后)采取单份血清样品，冷冻于-20℃待用。收集用N19-偶联物免疫的小鼠的脾脏，如本文细胞介导免疫应答章节所述，评价T-细胞增殖。

3.1单价脑膜炎球菌C偶联疫苗。

用0.5mg氢氧化铝作佐剂的剂量递减的N19-MenC或CRM-MenC(2.5-0.039μgMenC/剂量)免疫小鼠。如下所述测定抗体效价。

含有N19的偶联物的免疫原性高于含有CRM的偶联物(图2)。两次免疫后，N19-构建物诱导的血清抗MenC IgG抗体效价显著高于三种剂量的CRM-MenC偶联物诱导的抗体效价(如0.625μg N19-MenC免疫两次后与0.625μg CRM-MenC免疫三次后相比[P＜0.01]；0.156μg N19-MenC免疫两次后与0.156μg CRM-MenC免疫三次后相比[P＜0.05])。此外，三次剂量后，较低量的N19偶联物足以诱导显著高于CRM-MenC偶联物所诱导的抗MenC IgG抗体(如0.156μg N19-MenC与0.625μg CRM-MenC相比[P＜0.01])。

用CRM-偶联物两次和三次免疫诱导了对CRM的强烈抗载体抗体应答，即使是最低的测试剂量(即0.3μg和更低)。相反，N19-特异性抗体应答总是可以忽略，仅在最高剂量(即6μg)下可以检测到(即使效价非常低)(图3)。这些低效价抗N19抗体不能识别固相的破伤风类毒素。这些结果明确显示，N19多表位的强辅助作用不伴随诱导显著水平的抗其本身或天然蛋白的抗体。

由于对MenC的保护性免疫力主要依赖于在补体存在下杀伤细菌的杀菌抗体，所以测定了诱导抗体的功能活性。与ELISA所获结果相符，图4显示了N19偶联物能够在低于CRM-偶联物所用剂量的免疫剂量下诱导杀菌抗体。值得注意的是，用最高剂量免疫一次后，N19-MenC偶联物诱导的杀菌抗体的效价类似于两个剂量的CRM-MenC偶联物诱导的效价。用剂量较低的N19-MenC免疫两次的小鼠产生的杀菌抗体效价高于用CRM-MenC免疫的小鼠。这些CRM-MenC免疫的小鼠需要第三个剂量方能达到杀菌作用的抗体效价，相当于N19偶联物诱导的效价。因此，与CRM相比，N19显示了更强的载体作用，在较少注射次数和较小剂量时能诱导对MenC有显著功能活性的抗体。

3.2二价脑膜炎球菌AC偶联疫苗。

以0.06mg磷酸铝作佐剂，分别用N19-MenA和N19-MenC或联用、或者分别用CRM-MenA和CRM-MenC或联用(0.625、0.156或0.039μg各MenPS/剂量)免疫小鼠。用ELISA测定抗体效价，如下所述。

如图5的上图所示，不出所料，一起给予含有N19或CRM载体的MenA和MenC偶联物时，与给予单价偶联物相比对MenA的免疫原性显著降低(如0.156μgN19-MenA与N19-MenAC免疫2次后相比[P＜0.05]；0.625μg N19-MenA与N19-MenAC免疫3次后相比[P＜0.05]；0.625μg CRM-MenA与CRM-MenAC免疫2次后相比[P＜0.05]；0.156μg CRM-MenA与CRM-MenAC免疫3次后相比[P＜0.05])。然而，含有N19或CRM载体的两种二价制剂在两次和三次免疫后诱导的抗MenA的抗体效价相当(无统计学差异)。单价和二价偶联疫苗中的N19载体能够诱导更快的抗MenA抗体应答，在第一个剂量后已经产生抗体应答，而CRM偶联物不能诱导任何可检测的抗体效价。同时，注射N19偶联物两次后，倾向于引发比CRM偶联物更高的抗体应答，但仅在最低剂量的单价疫苗中有统计学显著性差异(如0.039μgN19-MenA与CRM-MenA免疫2次后相比[P＜0.05])。

测定抗MenC抗体应答时(图5的下图)，比较单价和二价制剂时没有观察到两次或三次剂量后效价降低。降低单价疫苗的免疫剂量一次给药后，用CRM偶联物不能获得抗MenC抗体水平，而用N19偶联物获得的抗体水平保持稳定。通过比较用二价疫苗一次免疫后获得的效价，CRM偶联物显示不能产生显著的抗MenC抗体应答，而N19偶联物以剂量反应方式诱导较高水平(抗体)。

3.3四价脑膜炎球菌ACWY偶联疫苗。

将含糖量相等的N19-MenA、N19-MenC、N19-MenW和N19-MenY(N19-MenACWY)混合在一起制备四价制剂。作为参比，我们采用临床级批次的CRM偶联疫苗(Chiron Vaccine，Siena)，该疫苗是临用前将液体CRM-MenCWY与冻干CRM-MenA相混合而配制的。小鼠接受以0.06mg磷酸铝作佐剂的剂量递减的四价制剂(2μg-0.074μg各MenPS/剂量)。

图6显示用所有给定剂量的N19-MenACWY免疫两次或三次对四种血清组荚膜多糖中任意一种产生了相似的IgG效价。比较三次免疫后对CRM偶联物的抗体应答与两次免疫后对N19偶联物的抗体应答时，没有发现对所有四种血清组的显著性差异。第二个剂量后，偶联N19时抗血清组A和C的抗体效价显著高于偶联CRM时获得的抗体效价(抗MenA和抗MenC的IgG：所有给定剂量的N19与CRM免疫2次后相比：P＜0.05)。在第一次免疫后，N19偶联物诱导产生了对所有四种多糖的抗体，而CRM偶联物则不。特别是抗MenC抗体，如图6的图B所示，用N19偶联物在所有给定剂量时获得的抗体效价显著较高(所有给定剂量的N19与CRM免疫1次后相比：[P＜0.05])。图A和C中显示，当N19偶联物给予一次时，抗MenA和MenW的抗体效价在最高剂量时显著较高(2μg N19与CRM免疫1次后相比：[P＜0.05])。两种偶联物诱导的抗体主要是IgG1(数据未显示)。重要的是，我们注意到，与用CRM偶联物相比，尤其是第一剂量和第二剂量后，用N19偶联物免疫时应答小鼠(responder mice)的数目较多，而第三剂量后，所有小鼠都产生应答(表2)。

表2：各组小鼠对四种PS抗原(MenACWY)产生应答的小鼠的百分数。

	对PS产生应答的小鼠的％
	对PS产生应答的小鼠的％									MenA		MenC		MenW		MenY
	免疫1次后									MenA		MenC		MenW		MenY
	免疫1次后								PS剂量	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	83	0	100	0	83	0	100	33	PS剂量	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	83	0	100	0	83	0	100	33	0.67μg	67	17	100	0	67	17	100	17
0.22μg	17	0	83	0	50	0	50	33	0.67μg	67	17	100	0	67	17	100	17
0.22μg	17	0	83	0	50	0	50	33	0.074μg	0	0	83	0	0	17	67	17
	免疫2次后								0.074μg	0	0	83	0	0	17	67	17
	免疫2次后									N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	100	67	100	100	100	83	100	100		N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	100	67	100	100	100	83	100	100	0.67μg	100	50	100	83	100	83	100	83
0.22μg	100	83	100	100	100	100	100	100	0.67μg	100	50	100	83	100	83	100	83
0.22μg	100	83	100	100	100	100	100	100	0.074μg	100	33	100	67	100	83	100	100
	免疫3次后								0.074μg	100	33	100	67	100	83	100	100
	免疫3次后									N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	100	83	100	100	100	83	100	100		N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM	N19	CRM
2μg	100	83	100	100	100	83	100	100	0.67μg	100	83	100	83	100	67	100	83
0.22μg	100	100	100	100	100	100	100	100	0.67μg	100	83	100	83	100	67	100	83
0.22μg	100	100	100	100	100	100	100	100	0.074μg	83	100	100	100	100	67	100	100

N19-MenACWY能高度有效地诱导抗所有四种Men多糖的杀菌抗体。具体说，与CRM偶联物相比，给予两次N19偶联物后，所有给定剂量产生的抗C组杀菌效价明显较高。逐渐提高剂量，N19载体的效能突出，由于限制了剂量，与CRM偶联物诱导的抗体相比，N19偶联物诱导的抗所有四种多糖的杀菌抗体效价更高。具体分析用最低剂量(0.074μg)免疫小鼠的单份血清抗MenC和MenW的杀菌抗体效价。图7显示，就ELISA效价而言，在两次或三次剂量后用N19偶联物获得的血清杀菌抗体(SBA)效价也相当。用N19偶联物免疫2次后，抗MenC杀菌效价已经显著高于注射CRM偶联物三次后获得的杀菌效价(SBA抗MenC：N19免疫2次后与CRM免疫3次后相比：[P＜0.05])。用N19-或CRM-偶联物免疫2次或3次后，比较抗MenW杀菌效价时，我们发现，N19偶联物诱导的杀菌抗体效价显著更高(SBA抗MenWN19与CRM免疫2次后相比：[P＜0.05]；N19与CRM免疫3次后相比：[P＜0.05])。

用仅检测高亲和力抗体的该量抗原结合试验详细分析血清组A和C抗体的功能活性[296]。图8的结果显示，一次免疫后用2μgN19偶联物获得的抗MenC抗体已经具有高亲合力。两次免疫足以诱导几乎所有抗体有效地亲合力成熟。用剂量较低的N19偶联物或CRM偶联物免疫的其它小组显示相似的成熟特征，仅在两个剂量后，高亲合力抗体的比例从基线增加到约50％(为了简化，仅显示了用最高和最低剂量免疫的小组)。

为了评价四种多糖共享的载体蛋白对诱导载体蛋白本身抗体的影响，我们检测了所用两种载体蛋白的抗体(图9)。此外，我们分析了所产生的抗载体抗体是否也能结合母体蛋白。图9的图A显示，用CRM偶联物产生的抗体同样能良好地识别CRM的母体蛋白DT。相反，N19偶联物的抗体不与其母体蛋白，如产生N19表位的破伤风类毒素(TT)和流感病毒血凝素(HA)发生交叉反应。应注意，N19中含有TT的10个表位(五个重复两次)，占该序列的50％以上。

3.4双载体四价脑膜炎球菌ACWY偶联疫苗。

通过将偶联N19或CRM的MenA与偶联CRM或N19的MenCWY混合在一起制备四价制剂(N19-MenA+CRM-MenCWY和反之亦然 CRM-MenA+N19-MenCWY)。对照组接受含有一种载体的四价制剂(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)。小鼠接受以0.06mg磷酸铝作佐剂的剂量递减的四价制剂(0.67μg-0.074μg各Men多糖/剂量)。用下述方法测定抗体效价。

第一次给予N19-MenACWY后产生的抗MenA效价与两次给予CRM基疫苗后获得的效价相当(图6)。而且，用N19偶联物免疫两次的小鼠产生的抗MenA杀菌效价显著高于用CRM偶联物免疫产生的杀菌效价(图10)。我们观察到，当N19-MenA与CRM-MenCWY同时给予时，或反之交换MenA上的载体时，抗体应答显著高于含唯一载体的四价制剂(如0.67μg：N19-MenA+CRM-MenCWY与N19-MenACWY免疫2次后相比：[P＜0.05]；0.67μg：N19-MenA+CRM-MenCWY与CRM-MenACWY免疫3次后相比：[P＜0.01]；0.22μg：CRM-MenA+N19-MenCWY与CRM-MenACWY免疫2次后相比：[P＜0.001])。然而我们注意到，降低这两种双载体制剂的免疫剂量时，抗MenA的IgG抗体效价显著降低，但其杀菌效价在两次或三次免疫后不显著降低(图10)。而且，这两种双载体疫苗在所有剂量下诱导的杀菌效价相当(图11)。值得注意的是，所有制剂中存在N19只需一次免疫就一致地诱发抗体应答，而单独CRM则没有这种作用(图10)。

3.5具有不同遗传背景的小鼠品系。

在初步实验中，用0.67或0.22μgN19-MenACWY或CRM-MenACWY和0.06mg磷酸铝免疫两组BALB/c和C57BL/6小鼠两次。在另一实验中，用含有如上所述制备的0.06 mg磷酸铝的四价制剂N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67μg各Men多糖/剂量)免疫同类系小鼠三次。BALB/c小鼠用作对照。

根据BALB/c小鼠获得的上述结果，我们决定仅用两种不同剂量的含有N19或CRM的四价制剂免疫小鼠两次，测定对抗四种多糖的抗体应答(图12)。再次证明在BALB/c小鼠中，在该四价疫苗中与CRM相比，N19尤其是诱导抗MenA抗体的更强载体(BALB/c 0.22μg N19与CRM免疫2次后相比：[P＜0.001])。我们观察到，含有N19或CRM的两种偶联物在C57BL/6中的免疫原性低于在BALB/c小鼠中的免疫原性，抗体应答更加可变。而且，与在BALB/c中所观察的结果相比，N19对所有四种多糖的载体效应是否较佳证据较少。然而，N19偶联物在第一次免疫后已经能够一致地引发对所有四种多糖的抗体效价，而CRM偶联物没有这种效果。

如图13所示，在BALB/c H-2^d和B10.D1 H-2^q品系小鼠中，N19和CRM偶联物对四种偶联物的免疫原性较高。通常，与用CRM偶联物相比，用N19偶联物免疫时应答的小鼠更多。与CRM-偶联物相比，与BALB/c小鼠单倍型相同的B10.D2NH-2^d小鼠是更佳的N19-偶联物接受者。另一方面，与N19-偶联物相比，与BALB/c小鼠同类的BALB/B H-2^b是CRM-偶联物的更佳接受者。另一方面，CRM偶联物在B10.BR H-2k小鼠中不能引发对四种多糖中任意一种的抗体应答，而N19偶联物能够引发。显然，在所有测试小鼠品系中，第一次给予N19偶联物后引发对四种多糖的显著抗体应答，在低免疫力品系中有少许例外。用于此研究的遗传背景不同的大多数小鼠能产生对四种多糖的抗体，表明用N19-偶联物免疫后产生的免疫应答缺乏任何明显的遗传限制。

如图14所示，与ELISA测定的IgG应答相符，用N19和CRM偶联物获得的杀菌效价也是BALB/c H-2^d接受者较高。我们观察到，N19偶联物在所有测试品系小鼠中诱导的抗四种多糖的杀菌效价高于CRM偶联物，除了在BALB/B小鼠中抗MenA的效价。用血清杀菌试验评价所产生抗体的杀菌活性，进一步证实N19的载体作用比CRM更佳。

4.酶联免疫吸附实验(ELISA)方案。

4.1脑膜炎球菌血清组A、C、W-135和Y多糖-特异性IgG。

按照已描述的试验测定各小鼠单份血清中的MenA、MenC、MenW和MenY特异性免疫球蛋白G(IgG)效价[297]。4℃在5μg/ml甲基化人血清白蛋白存在下用5μg/ml纯化脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W或Y多糖分别包被Nunc Maxisorp 96孔平底板过夜。用含有0.33％Brij-35的PBS(PBS-Brij)洗涤该板三次，然后用200μl/孔PBS(含有5％FCS和0.33％Brij-35)(PBS-FCS-Brij)室温下饱和1小时。用PBS-FCS-Brij稀释单份血清，分别测定对四种多糖的抗体效价。4℃孵育平板过夜。第二天，用PBS-Brij洗涤平板，加入用PBS-FCS-Brij稀释的偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(Sigma Chemical Co.，SA Louis，Mo.)，37℃孵育该平板2小时。用1mg/ml对硝基苯基-磷酸(Sigma Chemical Co.，SA Louis，Mo.)的二乙醇胺溶液显示结合抗体。孵育20分钟后，读取405nm吸光度。得到的免疫前血清值一致地低于0.1 OD值。用平行线分析法最大程度降低平板之间的差异，结果表示为相对于内部参比血清的效价。用参比线试验计算IgG效价[298]，表示为EU/ml的对数。

4.2脑膜炎球菌血清组A和C多糖特异性同种型IgG1/IgG2a

为了测定抗MenA和抗MenC特异性IgG1和IgG2a抗体，如上所述4℃用5μg/ml甲基化的人血清白蛋白和5μg/ml纯化的MenA或MenC的PBS溶液包被平板过夜，进行IgG ELISA。然后用PBS-FCS-Brij室温洗涤和封闭平板1小时。用PBS-FCS-Brij在两块平板中从1∶100开始平行稀释血清样品，37℃孵育2小时。加入生物素-偶联的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc.)。37℃孵育2小时后，将辣根过氧化物酶-偶联的链霉抗生物素蛋白(DAKO)加入各孔中，37℃孵育该平板1小时。用底物二盐酸邻苯二胺使平板显色(Sigma)。计算的效价为OD为0.5(450nm)时血清稀释度的倒数。

4.3 N19-、TT-、HA-或CRM-、DT-特异性IgG抗体。

如前所述[299，300]，测定合并血清中的N19、CRM197载体蛋白和其母体蛋白，即破伤风类毒素(TT)、流感嗜血杆菌血凝素(HA)和白喉类毒素(DT)的抗体效价。简言之，用分别含有2μg/ml N19、TT、HA或CRM197或5μg/ml DT抗原的200μl PBS溶液4℃包被96孔板(Nunc Maxisorp)过夜。然后用PBS-BSA 1％37℃洗涤和封闭平板1小时。用PBS-BSA 1％-吐温20 0.05％在平板中从1∶100开始稀释血清样品，37℃孵育2小时。用偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG和对硝基苯基-磷酸进行检测。如上所述显示抗原-特异性抗体的存在。用平行线分析法最大程度降低平板之间的差异，结果表示为相对于内部参比血清的效价。

4.4脑膜炎球菌血清组A和C IgG抗体的亲合力。

按照已经建立的方法[301，302]，用合并血清的ELISA洗脱试验评价脑膜炎球菌血清组A和C特异性IgG抗体的亲合力，采用75mM硫氰酸铵[NH₄SCN]作为离液剂。试验验证包括抗原稳定性的评价，随后用4 M NH₄SCN孵育[303]。4℃用5μg/ml纯化的脑膜炎奈瑟球菌血清组A和C多糖分别包被Nune Maxisorp 96孔平底板过夜。吸弃溶液，用PBS-Brij洗涤各孔三次，用封闭缓冲液(PBS-FCS-Brij)室温封闭1小时。用洗涤缓冲液(PBS-Brij)洗涤平板。用稀释缓冲液PBS-FCS-Brij稀释测试和参比血清，在一块微孔板中一式两份地两倍连续稀释。37℃孵育2小时后，洗涤平板3次。

将其中一份的血清样品与用血清稀释缓冲液PBS-FCS-Brij配的75mM NH₄SCN一起室温孵育15分钟，另一份单用稀释缓冲液孵育。洗涤后，平板用偶联碱性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma Chemical Co.，SA Louis，Mo.)孵育，方法与上述ELISA试验相同。参照标准ELISA曲线对应于100％结合抗体，以ELISA单位计算用75mM NH₄SCN洗脱后保持与平板结合的抗体量。用与时间有关的％结合抗体代表高亲合力IgG效价。

5.对脑膜炎球菌菌株A、C、W和Y的血清杀菌试验。

以前报道了测定杀菌抗体效价的方法(94)。在巧克力琼脂平板上37℃、5％CO₂培养脑膜炎奈瑟球菌血清组A(菌株F8238)、C(菌株11)、W(菌株240070)或Y(菌株240539)靶菌株过夜(从冻存母液开始)。将600nm吸光度为0.05-0.1的菌落悬浮于7ml含有0.25％葡萄糖的Mueller Hinton肉汤中，37℃、5％CO₂振摇孵育1.5小时使600nm吸光度达到～0.24-0.4。用GBSS缓冲液(Gey平衡盐溶液)(SIGMA)和1％BSA(试验缓冲液)稀释细菌细胞悬液，产生约10⁵CFU/ml。在96-孔平底组织培养-处理平板(Costar，Inc.，Cambridge，Mass.)中用缓冲液连续两倍稀释(起始稀释度4的倒数)热灭活(56℃30分钟)的单份血清样品或合并血清样品(50μl)。温和地混合等体积细胞悬液与合并的小兔补体(25％)，取25μl加入连续稀释血清。各孔的最终溶液体积为50μl。对照包括(i)细菌-补体-缓冲液(补体依赖性对照)和(ii)热灭活的测试血清-细菌-缓冲液(补体不依赖性对照)。加入小兔补体后，立即用倾斜法将10μl对照加到Mueller-Hinton琼脂平板上(时间零点，t0)。37℃、5％CO₂孵育所有含血清组靶菌株的微量滴定板1小时。孵育后，取10μl各样品点加到Mueller-Hinton琼脂平板上形成圆点，而通过倾斜法加入10μl对照(时间1，t1)。37℃、5％CO₂孵育琼脂平板18小时，计对应于t0和t1的菌落数。t1时的菌落是补体或血清的最终毒性的对照，必须是t0菌落的1.5倍。杀菌效价表示为与血清和补体孵育之前(t0)存在的靶细胞数量相比产生≥50％杀伤时血清稀释度的倒数。如果其后面至少两种血清稀释产生≥90％细菌杀伤则认为该效价可信。

用斯氏t检验(2尾)比较组间和不同时间之间的抗体效价。P值＜0.05时认为有统计学显著性。

6.细胞介导的免疫应答。

6.1对N19-MenACWY初免的BALBc小鼠用N19-表位、N19或N19-偶联物(刺激)的体外增殖试验。

为了评价用N19-偶联物免疫是否能使载体-表位特异性T细胞初敏，在最后一次免疫10天后摘取上述用四价N19-MenACWY(～6或2μg蛋白/剂量)免疫二或三次的小鼠脾脏，测试用组成N19的一种肽或者游离或偶联的N19体外刺激后它们的增殖能力[304]。用于此试验的纯化N19不含可能产生干扰的可检测的LPS。合并各组小鼠的脾脏，手工分散。洗涤和计数后，用RPMI(GIBCO BRL Life Technologies)在平底96-孔细胞培养板(Corning NY)中以5×10⁵细胞/孔密度培养细胞，RPMI添加了25mM HEPES缓冲液、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μM 2-巯基乙醇、0.15mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素、丙酮酸钠和非必需氨基酸的混合物(GIBCOBRL Life Technologies 1％的100×母液)和5％胎牛血清(Hyclone)。在每孔存在0.12-30μM(两倍或三倍稀释)(～0.15-50μg/ml)各个肽的情况下一式三份培养细胞，或者将用相同培养基稀释的0.004-1μM游离或偶联的N19加入三复孔，使每孔总体积200μl。用完全培养基或10μg/ml Concanvalin A作对照，以证明细胞的增殖能力。37℃、5％CO₂孵育平板。五天后，用每孔0.5μCi[³H]胸苷(Amersham Biosciences 1mCi/ml母液)脉冲处理细胞18小时，用Filtermate收集仪收获，用液体闪烁计数器(PackardBioscience)计数。增殖试验的结果表示为刺激指数(SI)，用刺激的实验培养物每分钟计数(cpm)与未刺激对照培养物(背景)每分钟计数的比率计算。对三复孔培养物作平行测定。SI＞2时判为阳性。

为了测定N19在小鼠系统中的强效T细胞辅助作用是否由N19中原来包含的某种CD4+表位所介导，评价用N19-MenACWY(6μgN19/剂量)免疫两次或三次BALB/c小鼠脾细胞的T-细胞增殖。用不同浓度的游离或偶联多糖的N19肽或用完整N19体外刺激脾细胞。如图15所示，在游离或偶联的N19存在时淋巴细胞显著增殖。我们也观察到，在所有我们的实验中，用P23TT肽刺激T细胞均增殖(图15和16)。用其它测试肽，我们观察到P30TT、P32TT、HA和HBsAg诱导了T细胞增殖，即使仅在较高浓度时出现。用C57BL/6小鼠进行此试验时，这些表位都不刺激淋巴细胞增殖，N19仅在最高浓度时刺激细胞。

而且，我们在同类系小鼠中检测了N19-特异性T细胞的活化研究是否存在任何MHC-限制模式。通过测定在不同浓度的1)游离N19或2)偶联多糖的N19，或3)一种N19组成肽或4)游离多糖组分存在时遗传背景不同的小鼠脾细胞增殖反应，体外分析活化情况。我们观察到，游离N19在所有品系小鼠中诱导T细胞活化，但N19偶联物在测试品系中产生有差异的增殖反应(图17)。评价背景基因(BALB或B10)对H-2反应的影响时，我们观察到H-2^d单倍型小鼠产生不同表位的特异性T细胞。在两种遗传上不相关的小鼠(BALB/c H-2^d和B10.BR H-2^k)中产生P23TT表位的记忆T细胞。另一方面，具有不同H-2^d单倍型的同类系小鼠(BALB或B10)产生不同的表位-特异性T细胞增殖反应，这表明MHC复合物以外的遗传因素也影响该反应。然而，遗传背景相同的小鼠(BALB)产生了P30TT表位反应性T细胞。总之，尽管这些肽的H-2限制水平不同，但用N19偶联物(免疫的)所有品系小鼠对所有四种多糖都能产生良好的抗体应答。而且，我们观察到，四种多糖中任何一种都能够在任何测试品系小鼠中诱导增殖，表明它们是非T-细胞依赖性抗原，与载体蛋白的偶联不会干扰其特性，如诱导多糖特异性T细胞活化的能力。

6.2评价小鼠表位-特异性T-细胞增殖：免疫方案和增殖试验。

95％纯的合成肽(P2TT、P21TT、P23TT、P30TT、P32TT、HA和HBsAg)购自Primm s.r.l.(意大利)。每只小鼠用50μl体积在尾根部皮下免疫每组三只BALB/c小鼠，50μl体积中含有用完全弗氏佐剂(CFA)乳化的50μg单一肽(P2TT、P30TT、P23TT、P32TT、HA、HBsAg)或N19。7天后，处死小鼠，取出各组小鼠腹股沟和主动脉周淋巴结并合并，制备单细胞悬液。在平底96孔细胞培养板(Costar Corp.，Cambridge，Mass.)中用完全培养基(上述补充后的RPMI，用于脾细胞)以3×10⁵细胞/孔密度培养脾细胞。将三种不同浓度(15、7.5和3.75mM所有肽；10、1和0.1μg/ml N19)的用相同培养基稀释的N19或同源肽加入单只小鼠的或合并的培养细胞的三复孔中。37℃、5％CO₂孵育5天后，用0.5μCi[³H]胸苷脉冲细胞16小时，然后如上所述收获细胞。在这些实验中将衍生自肺炎衣原体表面蛋白的不相关肽CH60(计算机预测能结合HLA-A2)用作阴性对照。

图18显示，用单种肽免疫BALB/c小鼠产生对P23TT、HA、HBsAg肽和N19的特异性T细胞应答，但对不相关CH60肽则不。用P32TT免疫的小鼠不能对相同肽产生应答。佐剂对照小鼠的细胞对ConA刺激产生增殖反应，但对任何肽或N19不产生增殖反应，从而证明这些肽不是促分裂性肽。尽管是人表位，但这些发现可解释N19在小鼠系统中也具有强载体作用。

应理解，通过实施例只是描述了本发明，可对实施例作一些修改但仍属于本发明的范围和构思。

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[304]Valmori，D.等(1992)J Immunol 149：717-21。

序列表

SEQ ID NO：1(P23TT)

1 VSIDKFRIFC KANPK

SEQ ID NO：2(P32TT)

1 LKFIIKRYTP NNEIDS

SEQ ID NO：3(P21TT)

1 IREDNNITLK LDRCNN

SEQ ID NO：4(PfCs)

1 EKKIAKMEKA SSVFNVVN

SEQ ID NO：5(P30TT)

1 FNNFTVSFWL RVPKVSASHL E

SEQ ID NO：6(P2TT)

1 QYIKANSKFI GITE

SEQ ID NO：7(HB Vnc)

1 PHHTALRQAI LCWGELMTLA

SEQ ID NO：8(HA)

1 PKYVKQNTLK LAT

SEQ ID NO：9(HBsAg)

1 FFLLTRILTI PQSLD

SEQ ID NO：10(MT)

1 YSGPLKAEIA QRLEDV

SEQ ID NO：11(N19)

Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Ile Glu Gly Arg Lys Gly Val Ser Ile Asp

20 25 30

Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Asn Pro Lys Lys Gly Leu Lys Phe

35 40 45

Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Lys Gly Ile

50 55 60

Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Lys

65 70 75 80

Gly Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn

85 90 95

Val Val Asn Ser Lys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu

100 105 110

Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Lys Gly Gln Tyr Ile

115 120 125

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Lys Gly Gly Ser Pro

130 135 140

His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met

145 150 155 160

Thr Leu Ala Lys Gly Ser Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys

165 170 175

Leu Ala Thr Lys Gly Ser Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile

180 185 190

Pro Gln Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile

195 200 205

Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Lys Gly Ser Val Ser Ile Asp Lys Phe

210 215 220

Arg Ile Phe Cys Lys Ala Asn Pro Lys Lys Gly Leu Lys Phe Ile Ile

225 230 235 240

Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Lys Gly Ile Arg Glu

245 250 255

Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Lys Gly Glu

260 265 270

Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val Val

275 280 285

Asn Ser Lys Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

290 295 300

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Lys Gly Gln Tyr Ile Lys Ala

305 310 315 320

Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Lys Gly Gly Ser Pro His His

325 330 335

Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu

340 345 350

Ala Lys Gly Ser Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala

355 360 365

Thr Lys Gly Ser Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln

370 375 380

Ser Leu Asp Lys Gly Ser

385 390

SEQ ID NO：12(免疫亲和标记)

1 MDYKDDDD

SEQ ID NO：13(因子Xa识别位点)

1 IEGR

Claims

1.一种含有两种或多种单价偶联物的组合的组合物，其中所述两种或多种单价偶联物各自包含(i)载体蛋白，其包含偶联于(ii)糖抗原的两种或多种病原体的T细胞表位。

2.一种包含偶联同一载体蛋白分子的两种或多种抗原性不同的糖抗原的多价偶联物，其中所述载体蛋白包含两种或多种病原体的T细胞表位。

3.一种组合物，其包含两种或多种权利要求2所述的多价偶联物。

4.一种组合物，其包含一种或多种权利要求2所述的多价偶联物和一种或多种权利要求1所述的单价偶联物。

5.如权利要求1、3或4所述的组合物，其特征在于，所述两种或多种偶联物中的载体蛋白相同。

6.如权利要求1、3或4所述的组合物，其特征在于，各偶联物中的载体蛋白相同。

7.如权利要求1、3、4、5或6所述的偶联物，其特征在于，至少一种载体蛋白表位不衍生自糖抗原的同一病原体。

8.如权利要求1或3-7中任一项所述的偶联物，其特征在于，没有一种载体蛋白表位衍生自所述糖抗原的同一病原体。

9.如权利要求1或4-8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述单价偶联物中的所述载体蛋白分子偶联一个以上所述糖抗原分子。

10.如权利要求1或4-8中任一项所述的组合物，其特征在于，各单价偶联物中的各载体蛋白分子偶联于一种以上糖抗原分子。

11.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述载体蛋白包含6个表位。

12.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述载体蛋白包含19个表位。

13.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述载体蛋白包含至少一种CD4⁺T细胞表位。

14.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述载体蛋白包含至少一种细菌表位和至少一种病毒表位。

15.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述至少一种载体蛋白表位衍生自甲肝病毒、乙肝病毒、麻疹病毒、流感病毒、水痘-带状疱疹病毒、牛型结核菌和麻风分枝杆菌和/或链球菌菌株的热激蛋白。

16.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述至少一种载体蛋白表位选自破伤风毒素(TT)、恶性疟原虫CSP(PfCs)、乙肝病毒核衣壳(HBVnc)、流感病毒血凝素(HA)、HBV表面抗原(HBsAg)或流感病毒基质(MT)蛋白。

17.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述至少一种载体蛋白表位选自P23TT(SEQ ID NO：1)、P32TT(SEQ ID NO：2)、P21TT(SEQID NO：3)、PfCs(SEQ ID NO：4)、P30TT(SEQ ID NO：5)、P2TT(SEQ ID NO：6)、HBVnc(SEQ ID NO：7)、HA(SEQ ID NO：8)、HBsAg(SEQ ID NO：9)或MT(SEQID NO：10)。

18.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，其特征在于，所述至少一种糖抗原衍生自脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌、克雷伯菌、白假丝酵母和/或新型隐球菌。

19.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，还包含佐剂。

20.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物，还包含非糖抗原。

21.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物在治疗中的应用。

22.如前述任一项权利要求所述的偶联物或组合物在诱导免疫应答中的应用。

23.如权利要求1-20中任一项所述的偶联物或组合物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用。

24.如权利要求1-20中任一项所述的偶联物或组合物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其特征在于，所述患者已用与偶联载体的所述组合物中所含糖抗原不同的糖抗原预先治疗。

25.如权利要求1-20中任一项所述的偶联物或组合物在制造诱导患者产生免疫应答的药物中的应用，其特征在于，所述患者已用与偶联不同载体的所述组合物中所含糖抗原相同的糖抗原预先治疗。

26.一种药盒，其包括：a)本发明的第一种偶联物和b)本发明的第二种偶联物。