CN101081870B

CN101081870B - 一种抗肿瘤生物药物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN101081870B
Application number: CN2006100192399A
Authority: CN
Inventors: 屈伸; 孙军; 宗义强
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2026-05-31
Also published as: CN101081870A

Abstract

一种治疗肿瘤的生物药物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白，利用合成的PTD4直接将Apoptin蛋白导入细胞，继而利用Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，从而实现促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的目的，同时利用绿色荧光蛋白(GFP)能发出绿色荧光的特点，在荧光显微镜下能观察到该融合蛋白在细胞内的分布，显示药物在靶部位的聚集情况，从而能够实现对治疗过程的有效监控和适时调整。通过蛋白转导实验证实该融合蛋白能穿透生物膜，通过TUNEL法及DAPI染色证实该融合蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有极大的杀伤能力，且不损伤正常细胞，不会发生导入外源基因的危险，能用于对肿瘤的治疗。

Description

一种抗肿瘤生物药物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术药物，特别是用于治疗肿瘤的生物技术药物。

背景技术

癌症对人类健康和生命的威胁很大，全世界每年约有700万人新患癌症，每年约有500多万人死于癌症。我国目前每年平均约有150万人新患症，每年约有80万人死于癌症。癌症是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症与心脑血管疾病和意外事故一起，构成当今世界所有国家三大死亡原因。因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。寻找新的安全有效的治疗肿瘤的药物和方法，是当前医药领域面临的重要课题。

来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus，CAV)的VP3蛋白(亦称凋亡素，Apoptin)因其肿瘤特异性凋亡诱导效应而引起了人们的关注。体内外研究结果均表明，VP3(本文中的VP3均指鸡贫血病毒的VP3蛋白，即CAV VP3，亦称凋亡素，即Apoptin)能诱导多种肿瘤细胞凋亡^[1]，其诱导的凋亡效应为非p53依赖性^[2]、不受抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL的抑制^[3]。更有意义的是，VP3仅诱导具有致瘤表型细胞或转化表型细胞的凋亡，而对正常细胞无凋亡效应、无细胞毒性^[4]，VP3转基因小鼠能正常生长发育^[5]。人们为利用VP3治疗肿瘤进行了积极的探索：目前，直接导入外源性vp3基因进行基因治疗仍是人们采取的主要策略；同时，针对不同肿瘤尝试了不同策略以实现靶向性治疗^[6-7]，如我们在国际上首次报道了通过受体介导的转移技术实现vp3基因体内肝细胞定向转移和表达，特异性诱导肝癌细胞凋亡，取得了良好的抑瘤效果^[8-9]。但是，如何充分发挥VP3“肿瘤细胞特异性诱导肿瘤细胞凋亡”的特性，避免外源基因导入体内后可能出现的潜在风险如过度表达等，进一步扩展VP3治疗肿瘤的应用范围，仍是亟待解决的问题。

蛋白质转导技术(protein transduction technology)是近年来新兴的一种大分子转移策略：利用一些具有蛋白质转导结构域(protein transduction domain，PTD)的蛋白质或多肽，直接将具有治疗作用的生物大分子“送”入细胞发挥生物学效应^[10]。这种具有穿过细胞膜的能力的多肽称为细胞透膜肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸，如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)。CPP可传送的物质范围很广泛，如蛋白质、DNA、抗体、显像试剂、毒素、纳米药物颗粒、脂质体等^[11]。CPP传送系统既是一个很好的研究细胞内生物过程的工具，也是一个在生物药物传送方面具有潜在价值的研究对象。这一技术正成为肿瘤生物治疗的新思路——利用它可直接将治疗物导入癌细胞，使治疗作用更加可控^[10]。目前相关研究多集中在HIV-TAT(trans-activator of transcription)多肽上。TAT蛋白(86肽)是一种转录激活蛋白，1988年Green^[11]和Frankel^[12]各自独立发现HIV-TAT蛋白具有穿透生物膜的能力^[12-13]；随后发现这一透膜能力是由47-57(或48-60)氨基酸残基之间的肽段所介导，而且TAT多肽与其他蛋白形成的融合蛋白也能透过细胞膜，并能发挥这些蛋白质的生物学功能^[14-16]。Ho等人^[17]利用化学合成法对TAT进行改造，通过氨基酸替换得到了一系列的TAT-PTD多肽，其中PTD4的二级结构更稳定、转导效率更高，可使目标蛋白转导成功率几乎达到100％，且单个细胞的蛋白质导入量是TAT导入量的33倍，但PTD4能否通过生物合成而实现融合蛋白的跨膜运输目前尚未见报道。

发明内容

本发明的任务是提供一种抗肿瘤生物药物，使其具有能直接进入肿瘤细胞内诱导肿瘤细胞凋亡，并且能够发出荧光，便于观察其在细胞内的分布情况等特点。

本发明提供的抗肿瘤生物药物是蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白(PTD4-GFP-Apoptin，或PTD4-GFP-VP3)，具有序列表中序列8或序列9所示的氨基酸序列，其制备方法，包括以下步骤：

a.构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4；

b.构建含GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP；

c.构建含Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin；

d.PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表达及纯化。

构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4的方法是：根据PTD4多肽氨基酸组成设计其碱基序列，合成两条寡核苷酸片段，将两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA；将该双链插入到pET28a的Nhe I处，转化DH5α，经酶切鉴定、PCR、测序，证明构建成pET28a-PTD4重组质粒。

构建含GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP的方法是：利用PCR方法扩增绿色荧光蛋白的GFP基因，将PCR扩增片段GFP和pET28a-PTD4重组质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切，回收目的片断，连接、转化DH5α，扩增提取质粒，获重组体pET28a-PTD4-GFP。

构建含Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin的方法是：利用PCR方法扩增鸡贫血病毒的Apoptin基因，将PCR扩增片段Apoptin和pET28a-PTD4-GFP重组质粒分别经经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5α，扩增提取质粒，获重组体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin。

PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表达及纯化的方法是：将重组质粒pET28a-PTD4-GFP-Apoptin转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A₆₀₀＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定；将包涵体溶于含8mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，操作步骤按试剂盒要求进行。SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。

本发明重组质粒构建示意图见图1。

本发明提供的抗肿瘤生物药物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白，利用合成的PTD4直接将Apoptin蛋白导入细胞，继而利用Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，从而实现促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长的目的，同时利用GFP(绿色荧光蛋白)能发出绿色荧光的特点，能够在荧光显微镜下观察到该融合蛋白在细胞内的分布，显示药物在靶部位的聚集情况，从而能够实现对治疗过程的有效监控和适时调整。通过蛋白转导实验证实本发明PTD4-GFP及PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白能穿透生物膜，通过TUNEL法及DAPI染色证实本发明PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡，显示本发明以人工方法制备和纯化得到的PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白具有良好的穿透生物膜效应且能诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有极大的杀伤能力，且不损伤正常细胞，不会发生导入外源基因的危险，能用于对肿瘤的治疗。

以本发明提供的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白(PTD4-GFP-Apoptin)为活性成分，加上制药学上可接受的载体和/或添加剂，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂，施于肿瘤部位即可对肿瘤进行治疗，所述的药用载体可以是PBS(磷酸盐缓冲液)、甘油或尿素等。

附图说明

图1为本发明重组质粒构建示意图。

图2为重组体pET28a-PTD4鉴定结果，图中标示分别为：

M1：Mraker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bp；

A：pET28a-PTD4经Nhe I酶切后结果；

B：由步骤1所获得的PTD4片段；

C：pET28a-PTD4PCR结果；

M2：Mraker，分子量标准，从大到小依次为600，500，400，300，200，100bp。

图3为重组体pET28a-PTD4-GFP鉴定结果，图中标示分别为：

M1：Marker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bp；

A：步骤1所获得的GFP片段；

B：pET-28a-PTD4-GFP经BamHI和EcoRI酶切；

C：pET-28a-PTD4-GFP经BamHI酶切。

图4为重组体pET28a-PTD4-GFP-VP3鉴定结果，图中标示分别为：

M3：Mraker，分子量标准，从大到小依次为1500，1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100bp；

A：pcDNA-vp3的PCR结果；

B：pET28a-PTD4-GFP-VP3经EcoR I和Sal I酶切的结果；

C：pET28a-PTD4-GFP-VP3经EcoR I酶切的结果；

M1：Marker，分子量标准，从大到小依次为7000，5500，3500，2000，1000，500bp。

图5为PTD4-GFP融合蛋白PAGE结果，图中标示分别为：

M：蛋白质分子量标准，从上到下依次为：116.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，25.0kDa，18.4kDa，14.4kDa；

1：未诱导表达的细菌总蛋白；

2：IPTG诱导表达的细菌总蛋白；

3：纯化的PTD4-GFP融合蛋白。

图6为PTD4-GFP-VP3融合蛋白PAGE结果，图中标示分别为：

4：包涵体中的细菌蛋白；

5：未诱导表达的细菌总蛋白；

6：IPTG诱导表达的细菌总蛋白；

7：纯化的PTD4-GFP-VP3融合蛋白。

图7为PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的荧光显微镜观察的结果；

图8为PTD4-GFP融合蛋白的透膜效应实验的光学显微镜观察的结果；

图9为PTD4-GFP-VP3融合蛋白的透膜效应实验的荧光显微镜观察的结果；

图10为PTD4-GFP-VP3融合蛋白的透膜效应实验的光学显微镜观察的结果；

图11为PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导HepG₂细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察FITC激发结果；

图12为PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导HepG₂细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察DAPI激发结果；

图13为PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导HepG₂细胞凋亡的激光共聚焦显微镜观察FITC和DAPI共激发结果；

图14为PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导HepG₂细胞凋亡的激光共聚焦显微镜光镜下结果。

具体实施方式

实施例1

构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4

1.利用人工合成的寡核苷酸片段退火法制备PTD4序列

(1)根据Ho的报道^[17]，PTD4多肽由11个氨基酸组成，按照原核生物密码子的特点自主设计其碱基序列如下：

S1：5′-CTAGTTATGCCCGCGCGGCAGCACGACAAGCTCGAGCCC-3′

S2：5′-CTAGGGGCTCGAGCTTGTCGTGCTGCCGCGCGGGCATAA-3′

两条寡核苷酸片段由上海生物工程公司合成。

将两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA。

2.构建重组体pET28a-PTD4

(1)原核表达载体pET-28a(+)购置Novagen公司。

(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。

将上述方法获得的双链插入到pET28a的Nhe I处，转化DH5α，经酶切鉴定、PCR、测序，证明构建成pET28a-PTD4重组质粒。DNA序列测定由上海博亚完成。PCR鉴定引物为：

P1：GGCAGCACGACAAGCTCGAG

P2：AACCCCTCAAGACCCGTTTAGAG，片段大小为：298bp

PCR扩增反应条件

循环参数为95℃变性5min，94℃1min、50℃1min、72℃1min，循环扩增次数30次，最后72℃延伸10min。

重组体pET28a-PTD4鉴定结果见图2，从图2的结果可以判断重组体pET28a-PTD4构建成功。

实施例2

构建含GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP

1.利用PCR方法扩增绿色荧光蛋白的GFP基因

(1)pEGFP-C1购自CLONETECH公司。

(2)PCR引物序列如下：

P3：5′-ACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3′；

P4：5′-GCGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′

两条引物5′端分别含有限制性内切酶BamH I和EcoR I的识别位点。

(3)PCR扩增反应条件

循环参数为94℃5min，94℃55sec、62℃55sec、72℃1min，循环扩增30次，最后72℃保温10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确。

2.构建原核表达载体pET28a-PTD4-GFP

(1)原核表达载体pET28a-PTD4的构建见步骤(一)。

(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。

PCR扩增片段GFP和pET28a-PTD4重组质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切，回收目的片断，连接、转化DH5α，扩增提取质粒。

重组体鉴定结果见图3，从图3的结果可以判断重组体pET28a-PTD4-GFP构建成功。

实施例3

构建含vp3基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP-VP3

1.利用PCR方法扩增鸡贫血病毒的vp3基因

(1)构建含vp3基因的真核表达载体pcDNA-vp3，具体方法参见：王宇哲，田俊，屈伸等，鸡贫血病毒vp3基因的构建及体外凋亡诱导效应的研究，同济医科大学学报，2001，30(4)：300-4。^[18]

(2)PCR引物序列如下：

P5：5′-AGGAATTCATGAACGCTCTCCAAG-3′

P6：5′-GCGTCGACTTACAGTCTTATACGCC-3′

两条引物5′端分别含有限制性内切酶EcoR I和Sal I的识别位点。

(3)PCR扩增反应条件

循环参数为94℃5min，94℃55sec、60℃50sec、72℃55sec，循环扩增30次，72℃保温10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定无误。

2.构建含vp3基因的原核表达载体pET28a-PTD4-VP3

(1)原核表达载体pET28a-PTD4-GFP的构建见步骤(二)。

(2)构建方法采用常规的基因克隆方法。

PCR扩增片段vp3和pET28a-PTD4-GFP重组质粒分别经经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5α，扩增提取质粒。

重组体鉴定结果见图4，从图4的结果可以判断重组体pET28a-PTD4-GFP-VP3构建成功。

实施例4

PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白的表达及纯化

1.原核表达菌株E.coli BL21(DE3)PlysS购置Novagen公司。镍亲和层析柱购置Promega公司。IPTG购置BBI公司。BCA蛋白测定试剂盒购置Pierce公司。

2.融合蛋白表达过程

将纯化后的二种重组质粒pET28a-PTD4-GFP、pET28a-PTD4-GFP-VP3分别转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)PlysS。在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A₆₀₀＝0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定。

3.融合蛋白纯化过程

将包涵体溶于含8mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，操作步骤按试剂盒要求进行。SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。

4.PTD4-GFP融合蛋白鉴定结果见图5和图6。图5的电泳结果说明得到纯的PTD4-GFP融合蛋白；图6的电泳结果说明得到纯的PTD4-GFP-VP3融合蛋白。

实施例5

本发明融合蛋白的体外透膜效应实验

1.实验材料：

(1)PTD4-GFP及PTD4-GFP-VP3的PBS(磷酸盐缓冲液：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na₂HPO₄，0.024％KH₂PO₄)溶液。

(2)实验细胞为人源肝癌细胞系HepG₂购置CCTCC。

2.实验方法

将人源肝癌细胞HepG₂接种于培养板中，细胞贴壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP及PTD4-GFP-VP3孵育细胞，2h后吸去培养液，PBS洗三次，然后置于荧光显微镜下观察。

3.实验结果

PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白分别加入到体外培养的HepG₂细胞中，2h后在细胞中可见明显的绿色荧光，见图7、图8、图9和图10。

结合图7、图8、图9和图10的结果，表明PTD4-GFP、PTD4-GFP-VP3融合蛋白均成功透过细胞膜进入HepG₂细胞中，说明本发明合成的PTD4具有介导融合蛋白透膜的功能。

实施例6

本发明融合蛋白PTD4-GFP-VP3诱导HepG₂细胞凋亡效应的实验

1.实验材料：

(1)PTD4-GFP-VP3的PBS(磷酸盐缓冲液：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na₂HPO₄，0.024％KH₂PO₄)溶液。

(2)实验细胞为人源肝癌细胞系HepG₂购置CCTCC。TUNEL检测试剂盒购置Promega公司。

2.实验方法

将处理过的盖玻片置于六孔板内，人源肝癌细胞HepG₂以合适密度接种于六孔板中，细胞贴壁后，用1μmol/L的融合蛋白PTD4-GFP-VP3孵育细胞4-5天，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定30min，TUNEL检测细胞凋亡(FITC染色)并用DAPI复染，操作过程按照说明书进行。置于激光共聚焦显微镜下观察。

3.实验结果

融合蛋白PTD4-GFP-VP3与HepG₂细胞孵育4-5天，TUNEL检测细胞凋亡并用DAPI复染，激光共聚焦显微镜下明显可见细胞核皱缩，边集，说明其融合蛋白能引起细胞凋亡，见图11、图12、图13和图14。

结合图11、图12、图13和图14的结果，说明PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导HepG₂细胞发生凋亡效应。

实施例7

以本发明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白为活性成分，加上PBS(磷酸盐缓冲液：0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na₂HPO₄，0.024％KH₂PO₄)溶液，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。

实施例8

以本发明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白为活性成分，加上PBS溶液和10％的甘油，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。

实施例9

以本发明提供的PTD4-GFP-VP3融合蛋白为活性成分，加上一定量的尿素(如4M)，按常规方法制备成抗肿瘤药物制剂。

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以下为本发明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列，表中序列依次分别是：

序列1是PTD4的DNA序列(只显示了编码链的序列，以下同)；

序列2是PTD4的氨基酸序列；

序列3是Apoptin的DNA序列；

序列4是Apoptin的氨基酸序列；

序列5是Apoptin的氨基酸序列；

序列6是GFP的DNA序列；

序列7是表达PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的DNA序列；

序列8是PTD4-GFP--Apoptin融合蛋白的氨基酸序列；

序列9是凝血酶酶切后的PTD4-GFP--Apoptin融合蛋白的氨基酸序列。

序列表

<110>华中科技大学

<120>一种治疗肿瘤的生物药物PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白及制备方法

<130>1

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tatgcccgcg cggcagcacg acaagctcga gcc 33

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala

1 5 10

<210>3

<211>366

<212>DNA

<213>Chicken anemia virus

<400>3

atgaacgctc tccaagaaga tactccaccc ggaccatcaa cggtgttcag gccaccaaca 60

agttcacggc cgttggaaac ccctcactgc agagagatcc ggattggtat cgctggaatt 120

acaatcactc tatcgctgtg tggctgcgcg aatgctcgcg ctcccacgct aagatctgca 180

actgcggaca attcagaaag cactggtttc aagaatgtgc cggacttgag gaccgatcaa 240

cccaagcctc cctcgaagaa gcgatcctgc gacccctccg agtacagggt aagcgagcta 300

aaagaaagct tgattaccac tactcccagc cgaccccgaa ccgcaaaaag gcgtataaga 360

ctgtaa 366

<210>4

<211>121

<212>PRT

<213>Chicken anemia virus

<400>4

Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu

20 25 30

Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly

35 40 45

Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn

50 55 60

Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln

65 70 75 80

Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg

85 90 95

Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro

100 105 110

Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu

115 120

<210>5

<211>717

<212>DNA

<213>Aequorea victoria

<400>5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210>6

<211>239

<212>PRT

<213>Aequorea victoria

<400>6

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210>7

<211>1230

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagtt atgcccgcgc ggcagcacga caagctcgag cccctagcat gactggtgga 120

cagcaaatgg gtcgcggatc catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg 180

cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag 240

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 300

ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc 360

cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac 420

gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg 480

aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag 540

gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc 600

atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 660

gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc 720

gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac 780

gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc 840

atggacgagc tgtacaagga attcatgaac gctctccaag aagatactcc acccggacca 900

tcaacggtgt tcaggccacc aacaagttca cggccgttgg aaacccctca ctgcagagag 960

atccggattg gtatcgctgg aattacaatc actctatcgc tgtgtggctg cgcgaatgct 1020

cgcgctccca cgctaagatc tgcaactgcg gacaattcag aaagcactgg tttcaagaat 1080

gtgccggact tgaggaccga tcaacccaag cctccctcga agaagcgatc ctgcgacccc 1140

tccgagtaca gggtaagcga gctaaaagaa agcttgatta ccactactcc cagccgaccc 1200

cgaaccgcaa aaaggcgtat aagactgtaa 1230

<210>8

<211>409

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala

20 25 30

Arg Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met

35 40 45

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

50 55 60

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

65 70 75 80

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

85 90 95

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

115 120 125

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

130 135 140

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

145 150 155 160

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

165 170 175

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

180 185 190

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

195 200 205

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

210 215 220

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

225 230 235 240

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

245 250 255

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

260 265 270

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe

275 280 285

Met Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe

290 295 300

Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu

305 310 315 320

Ile Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly

325 330 335

Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn

340 345 350

Ser Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln

355 360 365

Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg

370 375 380

Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro

385 390 395 400

Arg Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu

405

<210>9

<211>392

<212>PRT

<213>人工序列

<400>9

Gly Ser His Met Ala Ser Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg

1 5 10 15

Ala Pro Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Met Val

20 25 30

Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu

35 40 45

Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly

50 55 60

Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr

65 70 75 80

Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr

85 90 95

Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His

100 105 110

Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr

115 120 125

Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys

130 135 140

Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp

145 150 155 160

Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr

165 170 175

Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile

180 185 190

Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln

195 200 205

Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val

210 215 220

Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys

225 230 235 240

Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr

245 250 255

Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Met

260 265 270

Asn Ala Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg

275 280 285

Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu Ile

290 295 300

Arg Ile Gly Ile Ala Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys

305 310 315 320

Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp Asn Ser

325 330 335

Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro

340 345 350

Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val

355 360 365

Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu Ile Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg

370 375 380

Thr Ala Lys Arg Arg Ile Arg Leu

385 390

Claims

1.蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin，其氨基酸序列如序列表中序列8或序列9所示。

2.含有蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin基因的原核表达载体，所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。

3.权利要求1所述的融合蛋白在制备抗肝癌药物中的应用。

4.权利要求1所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制备方法，包括以下步骤：

a.构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4；

b.构建含PTD4-GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP；

c.构建含PTD4-GFP-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin，所述的PTD4-GFP-Apoptin基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示；

d.PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表达及纯化。

5.根据权利要求4所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制备方法，其特征在于所说的构建含PTD4序列的原核表达载体pET28a-PTD4的方法是：根据PTD4多肽氨基酸组成设计其碱基序列，合成两条寡核苷酸片段，将两条寡核苷酸片段等摩尔混合，95℃10min，然后室温放置1h复性，形成编码PTD4的双链DNA；将该双链插入到pET28a的Nhe I处，转化DH5α，经酶切鉴定、PCR、测序，证明构建成pET28a-PTD4重组质粒。

6.根据权利要求4所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制备方法，其特征在于所说的构建含GFP基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP的方法是：利用PCR方法扩增绿色荧光蛋白的GFP基因，将PCR扩增片段GFP和pET28a-PTD4重组质粒分别经BamH I和EcoR I双酶切，回收目的片断，连接、转化DH5α，扩增提取质粒，获重组体pET28a-PTD4-GFP。

7.根据权利要求4所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制备方法，其特征在于所说的构建含PTD4-GFP-Apoptin基因的原核表达载体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin的方法是：利用PCR方法扩增鸡贫血病毒的Apoptin基因，将PCR扩增片段Apoptin和pET28a-PTD4-GFP重组质粒分别经经EcoR I和Sal I双酶切，回收目的片段，连接、转化DH5α，扩增提取质粒，获重组体pET28a-PTD4-GFP-Apoptin。

8.根据权利要求4所述的蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的制备方法，其特征在于所说的PTD4-GFP-Apoptin融合蛋白的表达及纯化的方法是：将重组质粒pET28a-PTD4-GFP-Apoptin转化表达菌株大肠杆菌BL21PlysS，在5ml含0.05mg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃震荡培养，到A₆₀₀＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度1.0mM诱导8小时，超声破菌，离心收集包涵体，以未诱导菌作对照，经12.5％SDS-PAGE鉴定；将包涵体溶于含8mol/l尿素的上样缓冲液中，经镍亲和层析柱纯化，操作步骤按试剂盒要求进行，SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白，合并含目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩、过滤除菌，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。

9.蛋白转导域4-绿色荧光蛋白-凋亡素融合蛋白PTD4-GFP-Apoptin的基因，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。