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CN101025419A - 测定通过抑制整联蛋白表达所介导的血管生成抑制剂的作用的方法 - Google Patents

测定通过抑制整联蛋白表达所介导的血管生成抑制剂的作用的方法 Download PDF

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CN101025419A
CN101025419A CNA2007100878177A CN200710087817A CN101025419A CN 101025419 A CN101025419 A CN 101025419A CN A2007100878177 A CNA2007100878177 A CN A2007100878177A CN 200710087817 A CN200710087817 A CN 200710087817A CN 101025419 A CN101025419 A CN 101025419A
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CN
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alkyl
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nitrogen
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CNA2007100878177A
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小野尚人
仙波太郎
畑直子
船桥泰博
若林利明
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Original Assignee
Sanitary Material R&d Management Co ltd
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Abstract

测试药物对整联蛋白表达的影响的方法，包括如下步骤：测定施用药物的患者血小板中整联蛋白表达量的步骤，和根据所测定的表达量确定药物对除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响的步骤。

Description

测定通过抑制整联蛋白表达所介导 的血管生成抑制剂的作用的方法
本申请是申请日为2002年2月21日、申请号为02808637.6、发明名称为“测定通过抑制整联蛋白表达所介导的血管生成抑制剂的作用的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及测定影响整联蛋白表达的药物，优选血管生成抑制剂的作用的方法。
背景技术
癌症是表现出高死亡率的疾病，用抗癌剂进行治疗的目的一般是改善患者的QOL和延长生存时间。然而，难以在短时间内确定药物延长生命的效果，因此使用肿瘤减小速度和血液肿瘤抗原水平作为替代标志物以用作疗效指标。
此外，因为在抗癌剂的临床研究中使用确定药拘作用的生命延长时期也需要长期研究，可在较短时间内评价的肿瘤减小速度已用作替代标志物。然而，已有人指出，肿瘤减小速度不是必然起着生命延长指标的作用。因此，除了肿瘤减小速度以外，人们已尝试着使用疾病进展的时间、患病的存活时间、生物标志物等来作为替代标志拘。然而，这些方法仍然没有建立起来。
人们认为，如果表明通过施用药物引起的并且与存活时间延长密切相关的变化的生物标志物可用作替代标志物，则就易于在临床研究中确定出适当的治疗方法，并且标志拘可在治疗期间用作药物疗效的指标。
下面是已经报道过的替代标志物。
Panorex是涉及糖蛋白EpCAM的抗体，其首先是作为结肠癌细胞的肿瘤标志物被发现的，之后经鉴定是粘着分子。其与存活率的关系是作为保留在骨链中的微癌细胞消除的替代标志物测定的(Stephan B.等人，Cllnical Cancer Research，1999，5，3999-4004)，并且平行进行了大规模的III期临床试验。
前列腺特异性抗原已经在前列腺癌的激素治疗中用作替代标志物以确定最佳剂量(Denis L.，&Mahler C.Urology，1996，47(1ASuppl.)，26-32)。
至于血管生成抑制剂作为替代标志物的应用，已经在BMS275291(一种基质金属蛋白酶抑制剂)的I期临床试验中测定了在伤口愈合中(在皮肤上切一个口之后)使用血管生成作为指标的方法。此外，对于另一种基质金属蛋白酶抑制剂，已经报道了在肿瘤位点使用酶活性作为标志物的方法(Clin。Cancer Res.，2000，6(8)，3290-6)。
另外，预计血管生成抑制剂是除癌症之外的疾病的有效治疗剂，这些疾病例如动脉硬化、糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早熟性视网膜病、老年黄斑变性、新血管形成性青光眼、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、牛皮癣、血管瘤、血管纤维瘤等。如果发现了血管生成的替代标志物，就能够通过使用其作为这些疾病中的指标来确定适当的药物剂量、药物效果和给药时间。
整联蛋白是在细胞表面上表达的细胞粘着分子，并且由α-链和β-链构成。整联蛋白参与细胞外基质膜蛋白与细胞之间的粘着以及细胞之间的粘着。当细胞粘着分子与整联蛋白结合时，细胞中的信号系统就开始运转。结果不仅发生了细胞粘着，还发生了细胞延伸、细胞生长、细胞程序死亡、分化、细胞支架定向、细胞迁移、组织形成、癌侵袭和转移、伤口愈合、血液凝集等。
在这些整联蛋白当中，已知整联蛋白α2β1作用于胶原、层粘连蛋白等粘着分于，并在血管生成期间参与血管内皮细胞的管形成(George E等人，Exp.Cell.Res.，1996，224，39-51)。此外，据报道，涉及整联蛋白α1和整联蛋白α2的抗体在体内抑制VEGF引起的血管生成(Donald R.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1997，94，13612-13617)。
整联蛋白αvβ3特异性地存在于处于血管生成状态下的内皮细胞中，并且据报道，在使用小鸡胚胎绒毛尿囊的血管生成模型中，整联蛋白αvβ3中和抗体(LM609)抑制由成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)引起的血管生成(Brook，P.C.等人，Science，1994，264，569-571)。此外，据报道，整联蛋白αvβ3参与由FGF-2和肿瘤坏死因子-α引起的血管生成，整联蛋白αvβ5参与由血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-α引起的血管生成(Friedlander，M.等人，Science，1995，270，1500-1502)。抗整联蛋白αvβ3抗体和整联蛋白αvβ3抑制剂目前正处于临床试验阶段。
发明公开
本发明的目的是提供用于影响整联蛋白，优选整联蛋白α2的表达，并抑制血管生成的药物的替代标志物。
本发明人发现，对于通过抑制整联蛋白α2表达来抑制血管生成的通式(II)化合物(在下文中称为“化合物A”)所代表的药物，在其降低整联蛋白α2表达、减弱血管生成以及由此抑制癌细胞生长的状态下，周围血液中血小板表面上的整联蛋白α2表达也被降低了。
Figure A20071008781700081
他们还发现，位于周围血液中的血小板表面上的整联蛋白α2可用作血管生成抑制的替代标志物，并由此完成了本发明。
也就是说，本发明提供下列内容。
1.测试药物对整联蛋白表达的影响的方法，包括如下步骤：测定施用药物的患者血小板中整联蛋白表达量的步骤，和根据所测定的表达量确定药物对除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响的步骤。
2.依据1的方法，其中所述整联蛋白是整联蛋白α2。
3.依据1的方法，其中所述整联蛋白表达量是通过免疫化学方法测定的。
4.依据3的方法，其中所述免疫化学方法是FACS法。
5.用于定量测定整联蛋白的在如3所定义的方法中使用的试剂。
6.依据1的方法，其中所述整联蛋白表达量是通过测定编码整联蛋白的mRNA的量来测定的。
7.依据6的方法，其中mRNA的量是通过定量PCR测定的。
8.用于定量测定编码整联蛋白的mRNA的在如6所定义的方法中使用的试剂。
9.依据2的方法，其中所述药物是通式(I)所代表的磺酰胺化合拘或其可药用盐或水合物：
Figure A20071008781700082
其中
B代表C6-C10芳环或6-10元杂芳环，每一所述环可以是被取代和部分饱和的；
K代表单键、-CH＝CH-或-(CR4bR5b)m b，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分别代表氢原子或C1-C4烷基，且m b是整数1或2；
R1代表氢原子或C1-C6烷基；
Z代表单键或-CO-NH-；且
R代表C6-C10芳环或6-10元杂芳环，每一所述环可以是被取代和部分饱和的。
10.依据9的方法，其中R代表吲哚、喹啉或异喹啉。
11.依据2的方法，其中所述药拘是通式(Ia)所代表的磺酰胺化合物或其可药用盐或水合物：
Figure A20071008781700091
其中
Aa代表可以被取代的单环或二环芳环；
Ba代表6元不饱和烃环或含有一个氮原子作为杂原子的不饱和6元杂环，每一所述环可以是被取代的；
Ca代表可以被取代的含有一个或两个氮原子的5元杂环；
R1a代表氢原子或C1-C6烷基；
Wa代表单键或-CH＝CH-；
Ya代表碳或氮原子；
Za代表-N(R2a)-，其中R2a代表氢原子或低级烷基，或氮原子。
12.依据11的方法，其中Wa代表单键。
13.依据11的方法，其中Wa代表单键，Za代表-NH-，且Ya代表碳原子。
14.依据11-13任一项的方法，其中Ba代表可以被取代的苯或吡啶。
15.依据11-14任一项的方法，其中Ca代表可以被取代的吡咯。
16.依据11的方法，其中Aa代表可以被取代的苯或吡啶，Ba代表可以被取代的苯，Ca代表可以被取代的吡咯，Wa代表单键，且Za代表-NH-。
17.依据2的方法，其中所述药物是通式(Ib)所代表的含有磺酰胺的杂环化合物或其可药用盐或水合物：
Figure A20071008781700101
其中
Ab代表氢原子；卤素原子；羟基；可以被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)k bNR2bR3b，其中R2b和R3b可相同或不同，并分别代表氢原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且kb是0或1；可以被取代的C2-C4链烯基或炔基；或可具有选自下面提及的组A的取代基的苯基或苯氧基；
Bb代表可具有选自下面提及的组A的取代基的芳基或单环杂芳基，或
Figure A20071008781700102
其中Qb代表可具有一个或两个氮原子的芳环，Mb代表与Qb共享一个双键的C5-C12不饱和单环或多元环，所述环可具有1-4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，Qb和Mb可共享一个氮原子，且Qb和Mb可具有选自下面提及的组A的取代基；
Kb代表单键或-(CR4bR5b)a b，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分别代表氢原子或C1-C4烷基，且mb是整数1或2；
Tb、Wb、Xb和Yb可相同或不同，并分别代表＝C(Db)-，其中Db代表氢原子、卤素原子、羟基、可被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基、氰基、-(CO)n bNR6bR7b，其中R6b和R7b可相同或不同，并分别代表氢原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且nb是0或1，或可以被取代的C2-C4链烯基或炔基；或氮原于；
Ub和Vb可相同或不同，并分别代表＝C(Db)-，其中Db如上所定义，氮原子、-CH2-、氧原子或-CO-；
Zb代表单键或-CO-NH-；
R1b代表氢原子或C1-C4烷基；
代表单键或双键；
组A；卤素原子；羟基；可被卤素原于取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-R8bR9bN(NH)p b-，其中R8b和R9b可相同或不同，并分别代表氢原子或可被卤素原子取代的C1-C4烷基，且p b是0或1，R8b和R9b可以与它们所键合的氮原子一起形成5或6元环，所述环还可以进一步含有氮原子、氧原子或硫原子，并且可以被取代；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基；可被取代的C1-C8酰基；(C1-C4烷基)-S(O)2 b-(C1-C4亚烷基)，其中2 b是整数0、1或2；可被取代的C1-C4烷基或苯基磺酰基氨基；-(CO)q bNR10bR11b，其中R110b和R111b可相同或不同，并分别代表氢原子或可被卤素原子取代的C1-C4烷基或可被C1-C4烷基取代的氨基，且qb是0或1；或可被取代的芳基或杂芳基。
18.依据17的方法，其中Ub和Vb分别代表＝C(Db)-，其中Db如上所定义，或氮原子。
19.依据17或18的方法，其中Zb代表单键。
20.依据17-19任一项的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb当中至少有一个代表氮原子。
21.依据17-20任一项的方法，其中Ab代表卤素原子；可以被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)r bNR12bR13b，其中R12b和R13b可相同或不同，并分别代表氩原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且rb是0或1；或可以被取代的C2-C4链烯基或炔基。
22.依据17-21任一项的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb当中仅有一个代表氨原子。
23.依据17-22任一项的方法，其中Tb、Wb和Yb当中仅有一个代表氮原子。
附图说明
图1表示的是化合拘A对整联蛋白α2表达的影响。
图2表示的是抗整联蛋白α2抗体对管形成的影响。
图3表示的是化合物A对管形成的影响。
图4表示的是化合拘A对肿瘤体积增加的抑制作用。
图5表示的是化合物A对血小板中整联蛋白α2表达的影响。
实施本发明的最佳方式
本发明方法是测试药拘对整联蛋白表达的影响的方法，包括如下步骤：测定施用药物的患者血小板中整联蛋白表达量的步骤，和根据所测定的表达量确定药物对除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响的步骤。
整联蛋白优选是整联蛋白α2。整联蛋白α2是在细胞表面上表达的粘着分子的整联蛋白家族中的一个成员。人整联蛋白α2的序列以登记号NM_002203登记在GenBank中。
上文提及的化合拘A降低整联蛋白α2表达，特别是表现出血管生成抑制作用和抗肿瘤生长作用。因此，化合物A所代表的药物的作用可通过测定血小板上整联蛋白α2的表达量来以较高的灵敏度测定。
给患者施用药拘的剂量和方法没有特别限制，可使用适于该药物的剂量和方法。本发明方法优选用于测定通过系统给药例如口服给药施用的药物的影响。
对于除血小板以外的细胞没有特别限制，但优选其中可发生血管生成的组织的细胞。例如，可提及的是肿瘤组织的血管内皮细胞。此外，它们可优选为其中信号例如关于细胞生长、细胞程序死亡和分化的信号是经由整联蛋白α2传递的成纤维细胞或肿瘤细胞，例如黑素瘤细胞。另外，因为已经在单核细胞、B细胞和T细胞中证实了整联蛋白α2表达，所以还可以提及这些细胞。本发明方法还可用于评价这些细胞的功能。
用于测定血小板中整联蛋白表达量的方法没有特定限制。整联蛋白表达量可通过免疫化学方法等测定，或者可测定编码整联蛋白的mRNA的量。
基于免疫化学方法的测定整联蛋白表达量的方法的实例包括FACS方法。FACS方法是通过使用荧光激活的细胞分类剂测定用荧光标记的抗体进行免疲化学染色的细胞的荧光强度等的方法。
测定编码整联蛋白的mRNA的量的方法的实例包括定量PCR。
下面将以下列顺序详细解释测定表达量的步骤的实施方案：1.分离血小板，2.定量测定血小板表面上的整联蛋白的量，和3.定量测定血小板中的整联蛋白mRNA的量。
1.分离血小板
血小板可通过离心、凝胶过滤、流式细胞术等技术来分离。
1)离心：向血液中加入10％体积的3.8％柠檬酸钠水溶液，并将该混合物以100×g于室温离心10分钟。将上层液用作富含血小板的血浆，并以1500×g离心10分钟。从沉淀中获得血小板。
2)流式细胞术：将用PBS等稀释的血液在流式细胞计中流动，并暴露于激光束或类似光束。根据同时产生的前散射光和侧散射光的强度，可从其它血细胞中分离出血小板。
2.定量测定在血小板表面上的整联蛋白的量
在血小板表面上的整联蛋白的量可通过免疫化学方法，例如免疫组织学染色、ELISA、Western印迹、流式细胞术等来定量测定。在ELISA中，例如，通过涉及血小板表面抗原的抗体将血小板结合在固相上，然后固定在固相上，并洗涤。然后让标记的抗整联蛋白抗体与其反应，并且可由结合的标记拘的量定量测定在血小板表面上的整联蛋白。在Western印迹中，例如，将分离的血小板溶解在含有SDS的缓冲液中，然后进行SDS-PAGE和Western印迹。印迹在膜上的整联蛋白可通过使用标记的抗整联蛋白抗体来定量测定。在这种情况下，如果同时通过使用涉及血小板表面抗原的抗体来定量测定血小板的量，则还可以定量测定每个血小板上的整联蛋白的量。
在流式细胞术中，例如，将金血稀释，并与标记的抗整联蛋白抗体结合。根据前散射光和侧散射光可分离出血小板级份，并且可通过测定血小板上的荧光强度来定量测定血小板上整联蛋白的量。下文中将具体解释流式细胞术，但是本发明的范围并不受该解释的限制。通过使用流式细胞术，可通过使用未分离血小板的全血来定量测定整联蛋白的量。
将4μl血液用396μl含有0.0038％柠檬酸钠水溶液的PBS稀释。将用FITC标记的涉及整联蛋白的抗体，优选涉及整联蛋白α2的抗体，例如对于小鼠，FITC标记的抗小鼠CD49b抗体(BD Pharmingen，Cat.No.BD-558757)，或对于人，FITC标记的抗人CD49b抗体(BDPharmingen，Cat.No.BD-555498)，用含有0.1％BSA至适当浓度的PBS稀释。将10μl抗体加到90μl稀释的血液中。让该混合物在室温反应60分钟，并通过滤器(FALCON，Cat.No.2235).向该残余物中加入900μl PBS，并根据通过使用流式细胞计(BectonDickinson，FACS Calibur)测定的前散射光和侧散射光的强度分离血小板级份。通过测定血小板上的荧光强度未定量测定血小板上的整联蛋白，优选整联蛋白α2。
3.定量测定血小板中整联蛋白mRNA的量
1)提取RNA
通过胍硫氰酸盐方法、苯酚方法等可提取RNA。将分离的血小板溶解在1ml ISOGEN中，并在室温放置5分钟。向该混合物中加入0.2ml氯仿，将该混合物搅拌，然后放置2分钟。将该反应混合物在4℃以13000rpm离心15分钟(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)，并将上清液转移到另一个管中。加入0.5ml异丙醇，将该混合拘在室温放置5分钟。将该混合物在4℃以13000rpm离心10分钟(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)，并弃去上清液。向该沉淀中加入1ml 70％乙醇水溶液，并将该混合物在4℃以15000rpm离心15分钟(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)。弃去上清液，将沉淀溶解在不含RNase的水中。
2)定量测定RNA
可通过Northern印迹分析、斑点印迹分析、RNase保护分析、竞争性RT-PCR、竞争性RT-PCR、定量PCR等技术定量测定RNA。定量PCR是优选的。下面解释定量PCR技术，但是本发明的范围不受该解释的限制。如下所述通过使用TapMan Probe和ABI Prism7700 SequenceDetection System(Perkin-Blmer Applied Biosystems)进行定量PCR。
用反转录反应和PCR两个步骤进行操作。如下所述进行第一个步骤-反转录反应：向所获得的RNA中加入dNTP、低聚d(T)16引物、RNase抑制剂和Multiscribe Reverse Transcriptase(Perkin-ElmerApplied Biosystems)，将该混合物在25℃保持10分钟，然后将该混合物在48℃加热30分钟。将该混合物在95℃加热5分钟以终止该反应。
将所获得的cDNA用于第二个步骤的PCR中。在例如包含下列组分的反应系统中进行PCR：2.5ng cDNA、1×TaqMan PCR缓冲液、3mMMgCl2、分别是200μM的dATP、dCTP和dGTP、400μM dUTP、200nM引物对、0.01U/μl AmpErase UNG和0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Blmer Applled Biosystems)。对于反应条件，反应在50℃进行2分钟，在95℃进行10分钟，然后是由在95℃进行20秒的反应、在55℃进行20秒的反应和在72℃进行30秒的反应组成的循环，该循环重复40次。通过使用Primer Expression(Perkin-ElmerApplied Biosystems)来设计引物和探针。为了比较两种或更多种样品，在根据持家基因的mRNA水平进行校正后来使用定量测定的值，其中所述持家基因在每个样本的转录量，优选GAPDH的mRNA水平方面表现出小的差异。
药物对于除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响是根据通过测定如上所述的表达量的步骤所测定的表达量来确定的。该确定可根据血小板中的整联蛋白表达量与除血小板以外的细胞中的整联蛋白表达量的关系来确定。也就是说，如果血小板中的表达量下降，则可以确定出药拘的影响是降低除血小板以外的细胞中的整联蛋白表达。反之，当血小板中的表达量增加时，则可以确定出药拘的影响是增加除血小板以外的细胞中的整联蛋白表达。
此外，本发明还提供了用于本发明方法中的定量测定试剂。
第一个实施方案的定量测定试剂是在用于测试药物对整联蛋白表达的影响的方法中使用的试剂，其中所述方法包括如下步骤：通过免疫化学方法测定施用药拘的患者血小板中整联蛋白表达量的步骤，和根据所测定的表达量确定药物对除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响的步骤。
该实施方案的定量测定试剂的组分可类似于用于整联蛋白的免疫化学定量测定的试剂。根据基于免疫化学方法的测定方法，该实施方案的定量测定试剂可通过选自常用于制备定量测定试剂的那些技术的技术来制得。通常包括抗整联蛋白抗体。抗整联蛋白抗体可用荧光拘质标记。
当定量测定试剂是由两种或更多种组分构成的时，其可以作为试剂盒提供。此外，定量测定试剂可以作为还含有可用于定量测定试剂的载体的组合物来提供。例如，试剂盒可以包括荧光标记的涉及整联蛋白α2的单克隆抗体或涉及整联蛋白α2的单克隆抗体与荧光标记的抗小鼠Ig抗体、稀释剂和固定溶液。
第二个实施方案的定量测定试剂是在用于测试药拘对整联蛋白表达的影响的方法中使用的试剂，其中所述方法包括如下步骤：通过测定编码整联蛋白的mRNA的量来测定施用药拘的患者血小板中整联蛋白表达量的步骤，和根据所测定的表达量确定药拘对除血小板以外的细胞中整联蛋白表达的影响的步骤。
该实施方案的定量测定试剂的组分可类似于用于定量测定编码整联蛋白的mRNA的试剂。根据mRNA定量测定方法，该实施方案的定量测定试剂可通过选自常用于制备定量测定试剂的那些技术的技术来制得。该方法的实例包括基于PCR的方法、杂交等。该试剂通常包括可用作引物或探针的与编码整联蛋白的mRNA互补的核酸。引物和探针可由本领域技术人员根据编码已知整联蛋白的核苷酸序列容易地设计。
当定量测定试剂是由两种或更多种组分构成的时，其可以作为试剂盒提供。此外，定量测定试剂可以作为还含有可用于定量测定试剂的载体的组合物来提供。例如，试剂盒可以包括PCR引物，优选用于定量PCR的标记的引物、对照引物和对照DNA。
药物优选是通式(I)、(Ia)或(Ib)所代表的磺酰胺化合物或其可药用盐或它们的水合物。
在通式(I)中，由B和R代表的可以是被取代和部分饱和的C6-C10芳环或6-10元杂芳环是指具有6-10个碳原子的芳族烃基或含有至少一个氮原子、氧原子和硫作为杂原子的6-10元芳族杂环，每一所述基团可具有一个或多个取代基，并且可以是部分饱和的。其具体实例包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、萘、喹啉、异喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、异吲哚、吲嗪、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑、4，5，6，7-四氢吲哚、1，2，3，4-四氢异喹啉、2，3-二氢苯并呋喃、二氢化茚、四氢萘酮、二氢吲哚、异二氢吲哚、色满、四氢萘等。上述芳环可具有1-3个取代基。当存在两个或更多个取代基时，它们可相同或不同。取代基的实例包括可被低级烷基或低级环烷基取代的氨基；低级烷基；低级烷氧基；羟基；硝基；巯基；氰基；低级烷硫基；卤索；式-aa-ba-代表的基团，其中aa代表单键、-(CH2)k a-、-O-(CH2)k a-、-S-(CH2)k a-或-N(R3a)-(CH2)k a-，其中ka是1-5的整数，R3a代表氢原子或低级烷基，且ba代表-CH2-da，其中da代表可被低级烷基取代的氨基、卤素原子、羟基、低级烷硫基、氰基或低级烷氧基；式-aa-ea-fa代表的基团，其中aa如上所定义，ea代表-S(O)-或-S(O)2-，且fa代表可被低级烷基或低级烷氧基取代的氨基、低级烷基、三氟甲基、-(CH2)m a-ba或-N(R4a)-(CH2)m a-ba，其中ba如上所定义，R4a代表氢原子或低级烷基，且ma是1-5的整数；式-aa-ga-ha代表的基团，其中aa如上所定义，ga代表-C(O)-或-C(S)-，且ha代表可被低级烷基取代的氨基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、-(CH2)n a-ba或-N(R5a)-(CH2)n a-ba，其中ba如上所定义，R5a代表氢原子或低级烷基，且na是1-5的整数；式-aa-N(R6a)-ga-ia代表的基团，其中aa和ga如上所定义，R6a代表氢原子或低级烷基，且ia代表氢原子、低级烷氧基或fa(fa如上所定义)；式-aa-N(R7a)-ea-fa代表的基团，其中aa、ea和fa如上所定义，且R7a代表氢原子或低级烷基；式-(CH2)p a-ja-(CH2)q a-ba代表的基团，其中ja代表氧原子或硫原子，ba如上所定义，且pa和qa可相同或不同，并分别代表1-5的整数；式-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara代表可被低级烷基、低级烷氧基或卤素原子取代的苯基或杂芳基，且ua是0或1-5的整数；式-CONH-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara和ua如上所定义；式-SO2-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara和ua如上所定义；等等。
在通式(I)代表的化合物中，R优选代表吲哚、喹啉或异喹啉。
在上述通式(Ia)中，Aa所代表的“可被取代的单环或二环芳环”是芳族烃环或含有至少一个氮原子、氧原子和硫原子的芳族杂环，每一所述环可在环上具有1-3个取代基。包含在Aa中的芳环的典型实例包括吡咯、吡唑、咪唑、噻吩、呋喃、噻唑、唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、萘、喹啉、异喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、异吲哚、吲嗪、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑等。上述芳环可具有1-3个取代基。当存在两个或更多个取代基时，它们可相同或不同。取代基的实例包括可被低级烷基或低级环烷基取代的氨基；低级烷基；低级烷氧基；羟基；硝基；巯基；氰基；低级烷硫基；卤素；式-aa-ba-代表的基团，其中aa代表单键、-(CH2)k a-、-O-(CH2)k a-、-S-(CH2)k a-或-N(R3a)-(CH2)k a-，其中ka是1-5的整数，R3a代表氢原子或低级烷基，且ba代表-CH2-da，其中da代表可被低级烷基取代的氨基、卤素、羟基、低级烷硫基、氰基或低级烷氧基；式-aa-ea-fa代表的基团，其中aa如上所定义，ea代表-S(O)-或-S(O)2-，且fa代表可被低级烷基或低级烷氧基取代的氨基、低级烷基、三氟甲基、-(CH2)m a-ba或-N(R4a)-(CH2)．a-ba，其中ba如上所定义，R4a代表氢原子或低级烷基，且ma是1-5的整数；式-aa-ga-ha代表的基团，其中aa如上所定义，ga代表-C(O)-或-C(S)-，且ha代表可被低级烷基取代的氨基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、-(CH2)n a-ba或-N(R5a)-(CH2)n a-ba，其中ba如上所定义，R5a代表氢原子或低级烷基，且na是1-5的整数；式-aa-N(R6a)-ga-ia代表的基团，其中aa和ga如上所定义，R6a代表氢原子或低级烷基，且ia代表氢原子、低级烷氧基或fa(fa如上所定义)；式-aa-N(R7a)-ea-fa代表的基团，其中aa、ea和fa如上所定义，且R7a代表氢原子或低级烷基；式-(CH2)p a-ja-(CH2)q a-ba代表的基团，其中ja代表氧原子或硫原子，ba如上所定义，且pa和qa可相同或不同，并分别代表1-5的整数；式-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara代表可被低级烷基、低级烷氧基或卤素原子取代的苯基或杂芳基，且ua是0或1-5的整数；式-CONH-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara和ua如上所定义；式-SO2-(CH2)u a-Ara代表的基团，其中Ara和ua如上所定义；等等。
在上述取代基的实例中，当取代基是被两个烷基取代的氨基时，这些烷基可键合以形成5或6元环。此外，当Aa是具有羟基或巯基的含氮杂环时，这些基团通过共振可以以氧代或硫代基团的形式存在。
Ba代表的“可以被取代的6元不饱和烃环或含有一个氮原子作为杂原子的不饱和6元杂环”是可以部分氢化，并且可以在环上具有一个或两个取代基的苯或吡啶。当存在两个取代基时，它们可相同或不同。
Ca代表的“可以被取代的含有一个或两个氮原子的5元杂环”是可以部分氢化，并且可以在环上具有一个或两个取代基的吡咯、吡唑或咪唑。当存在两个取代基时，它们可相同或不同。
Ba和Ca可具有的取代基的实例包括例如卤素；氰基；低级烷基；低级烷氧基；羟基；氧代基；式-C(O)-ra代表的基同，其中ra代表氢原子、可被低级烷基取代的氧基、低级烷基、低级烷氧基或羟基；可被低级烷基取代的氨基；三氟甲基等。
在上述通式(Ia)中，R1a和R2a以及Aa、Ba和Ca可具有的取代基的定义中的低级烷基是指具有1-6个碳原于的直链或支链烷基。其实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基(戊基)、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、正己基、异己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。在这些基团当中，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基是优选的，甲基、乙基、正丙基和异丙基是最优选的。
在Aa可具有的取代基的定义中的低级环烷基是具有3-8个碳原子的环烷基，其实例包括环丙基、环戊基、环己基等。
在Aa、Ba和Ca可具有的取代基的定义中的低级烷氧基是指衍生自上述低级烷基的低级烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基。在这些基团当中，甲氧基和乙氧基是最优选的。低级烷硫基是指衍生自上述低级烷基的低级烷硫基。卤素原子的实例包括氟原子、氯原子、溴原子等。
在这些化合拘当中，特别优选的化合拘包括：
1)N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺
2)N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-6-氯-3-吡啶磺酰胺
3)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-4-氨磺酰基苯磺酰胺
4)N-(5-溴-3-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺
5)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺
6)N-(4-溴-1 H-吲哚-7-基)-4-氰基苯磺酰胺
7)N-(4-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺
8)N-(3-溴-4-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺
9)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-5-氰基-2-噻吩磺酰胺
1 0)N-(4-溴-3-氯-1H-吲哚-7-基)-2-氨基-5-嘧啶磺酰胺
11)N-(3-氯-1H-吲哚-7-基)-4-氨磺酰基苯磺酰胺等。
通式(Ia)代表的磺酰胺衍生拘可以与酸或碱形成盐。本发明还包括通式(Ia)代表的化合物的盐。与酸形成的盐的实例包括与无机酸形成的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐和硫酸盐，以及与有机酸例如乙酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、苯甲酸、甲磺酸、对甲苯磺酸形成的盐，与碱形成的盐的实例包括无机盐例如钠盐、钾盐和钙盐，以及与有机碱例如三乙胺、精氨酸和赖氨酸形成的盐。
在本发明中，Qb代表的“可具有一个或两个氮原子的芳环”是指芳烃或含有一个或两个氮原子的6元芳族杂环。包含在Qb中的芳环的实例包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪等。此外，M代表的“可具有1-4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子的C5-C12不饱和单环或多环”是与Qb共享一个双键的不饱和单环或多环。其实例包括芳烃例如苯和萘，不饱和烃例如环戊烯、环己烯、环庚烯、环辛烯、环戊二烯、环庚二烯和环辛二烯，和不饱和杂环例如四氢吡啶、吡咯、呋喃、噻吩、唑、异唑、噻唑、异噻唑、吡唑、咪唑、三唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、三嗪、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、吲唑烷、萘啶、苯并呋喃、苯并吡喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并唑、苯并噻唑、吡咯并吡啶、吡啶并嘧啶和咪唑并吡啶。此外，表达语“Qb和Mb可共享一个氮原子”是指氮原子包含在两个环的稠合点上。以该方式形成的环的实例包括吲唑烷、咪唑并[1，2-a]吡啶、咪唑并[1，5-a]吡啶、吡唑并[1，5-a]嘧啶等。
在本发明中，R1b、R4b和R5b中的C1-C4烷基或Ab、Db、R1b、R2b、R3b、R6b、R7b、R8b、R9b、R10b、R11b、R12b、R13b、R14b、R15b、G1B、G2b和组A中可被卤素原子取代的C1-C4烷基中的C1-C4烷基是指具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，其实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。表达语“可被卤素原子取代”是指这些烷基可被选自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子的卤素原子取代。实例包括一氟甲基、一氯甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-或2-一氟乙基、1-或2-一氯乙基、1-或2-一溴乙基、1，2-二氟乙基、1，2-二氯乙基、1，1，2，2，2-五氟乙基、3，3，3-三氟丙基等。在这些基团当中，一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-或2-一氟乙基、1，2-二氟乙基、1，1，2，2，2-五氟乙基等是优选的。
在本发明中，Ab、Db和组A中可被卤素原子取代的C1-C4烷氧基中的C1-C4烷氧基是指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，其实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。表达语“可被卤素原子取代”是指烷氧基可被选自氟原于、氯原子、溴原子和碘原于的卤素原于取代。实例包括-氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-或2-一氟乙氧基、1-或2-一氯乙氧基、1-或2-一溴乙氧基、1，2-二氟乙氧基、1，1，2，2，2-五氟乙氧基、3，3，3-三氟丙氧基等。在这些基团当中，一氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-或2-一氟乙氧基、1，2-二氟乙氧基、1，1，2，2，2-五氟乙氧基等是优选的。
在本发明中，存在于Ab和Db中的C2-C4链烯基或炔基是指具有2-4个碳原子的链烯基或炔基。其实例包括乙烯基、烯丙基、2-或3-丁烯基、1，3-丁二烯基、乙炔基、2-丙炔基、2-甲基乙炔基、2-或3-丁炔基等。
在本发明中，存在于Bb和组A中的芳基是指芳烃。其实例包括苯基、萘基等。此外，杂芳基是含有一个或多个氨原子、氧原子和硫原子的单环或多环。其实例包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、呋喃基、噻吩基、唑基、异唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、酞嗪基等。
在本发明中，在R8b和R9b的定义中的表达语“R8b和R9b可以与它们所键合的氮原子一起形成5或6元环，并且所述环还可以含有氮原子、氧原子或硫原子”是表示，R8b和R9b可以与它们所键合的氮原子一起形成吡咯烷基、哌啶基、吗啉代、硫代吗啉代、哌嗪基等。
在本发明中，在组A中，在可被一-或二(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基、(C1-C4烷基)-S(O)2 b-(C1-C4亚烷基)、C1-C4烷基或可被取代的苯基磺酰基氨基以及可被C1-C4烷基取代的C1-C4烷基中的烷基是指如上所定义的烷基。亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、甲基亚甲基、1-或2-甲基亚乙基、1-、2-或3-甲基亚丙基、二甲基亚甲基等。
此外，C1-C8烷酰基是指甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等。
在本发明中，存在于Jb中的“可具有保护基的氨基”中的保护基没有特别限制，只要所述保护基是已知用作常规有机合成中的氨基保护基即可。其实例包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、2，2，2-三氯乙基、亚苄基、二苯甲基、三苯甲基等。此外，可具有保护基的数基中的保护基和R16b中的数基的保护基没有特别限制，只要所述保护基是已知用作常规有机合成中的羧基保护基即可。其实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丁基、甲氧基甲基、2，2，2-三氯乙基、新戊酰氧基甲基、苄基等。
在本发明中，关于表达语“可被取代”或“可具有取代基”的取代基的实例包括卤素原子；可被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；羟基；羟基(C1-C4烷基)；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基；C2-C4链烯基或炔基；氰基；C1-C8酰基；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基；羧基；(C1-C4烷氧基)羰基；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基甲酰基等。
通式(Ib)代表的含有磺酰胺的杂环化合物可以与酸或碱形成盐。本发明还包括通式(Ia)代表的化合物的盐。与酸形成的盐的实例包括与无机酸形成的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐和硫酸盐，以及与有机酸例如乙酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸形成的盐。另外，与碱形成的盐的实例包括无机盐例如钠盐、钾盐和钙盐，以及与有机碱例如三乙胺、精氨酸和赖氨酸形成的盐。
如果存在的话，这些化合物的水合物以及光学异构体都包括在化合物的范围内。此外，还包括在体内通过代谢例如氧化、还原、水解和结合而由这些化合物形成的，并表现出血管生成抑制作用的化合物。另外，本发明还包括在体内经过代谢例如氧化、还原和水解而生成本发明化合物的化合物。
用于本发明的化合物可通过多种不同方法制得。例如，某些方法具体公开在日本专利特开平7-165708和8-231505中。
实施例
用下列实施例来更具体地解释本发明。然而，本发明的范围并不限于下列实施例。
[参考实施例1]化合物A对整联蛋白α2表达的影响
从人脐带中分离出人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)，并在EGM培养基(2％FCS，不含氢化可的松，Clonetics)中培养。将细胞在I-型胶原包被的烧瓶(Sumilon)中传代培养，并使用第4代-第6代传代培养物。抗人整联蛋白α2抗体(A2-IIE10)购自Upstate BiotechnologyInc。抗人CD31抗体(JC/70A)和FITC标记的鬼子抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段购自Dako。
将细胞接种在25-cm2细胞培养瓶中，并在CO2培养箱中于37℃培养。3小时后，用含有化合物A(5、50、500ng/ml)的相同培养基替换培养基，再培养48小时。收集细胞，将2×105个细胞漂浮在100μlPBS(0.1％BSA，0.05％NaN3)中。加入1μg初级抗体，将该细胞在4℃培养30分钟，用PBS洗涤，然后与FITC标记的次级抗体培养30分钟。用PBS洗涤该细胞，然后用CellFix(Becton Dickinson)固定。使用FACS Calibur(Becton Dickinson)测定每份样本的2×104个细胞的荧光值。通过使用不含初级抗体的对照样本的荧光值校正每份样本的荧光值来获得细胞表面分子的表达量(依据下列公式)。
RMFI(相对平均荧光强度)＝样本MFI(平均荧光强度)/背景MFI
如图1所示，化合物A(50、500ng/ml)降低了HUVEC上的整联蛋白α2的表达量。
[参考实施例2]抗整联蛋白α2抗体与化合物A对管形成的影响
将I型胶原凝胶置于24孔平板的每个孔中并凝胶化，将悬浮在含有10ng/ml EGF(GIBCO BRL)和20ng/ml bFGF(GIBCO BRL)或20ng/ml VEGF(Wako Pure Chemical Industries)的不含血清的培养基(Human Bndothelial-SFM Basal Growth Medium，GIBCO BRL)中的HUVEC以1-1.2×105个细胞/孔的密度接种。将细胞在37℃培养过夜，并覆盖上用于胶凝的I型胶原凝胶。然后加入含有药物(抗整联蛋白α2抗体或化合物A)的上述不含血清的培养基(含有EGF和bFGF或VEGF)，并将该细胞在37℃再培养4天。对于抗整联蛋白α2抗体的作用，使用96孔平板来进行该实验。
培养后，用MTT给细胞着色，在显微镜下拍摄由HUVEC形成的管。通过扫描仪将照片电子化，通过使用图像分析软件Mac SCOPE 2.56(MITANI)测定管的长度来定量测定由HUVEC形成的管。
如图2所示，表明抗整联蛋白α2抗体抑制了由bFGF诱导的HUVEC的管形成，这意味着整联蛋白α2参与由bFGF诱导的管形成。此外，如图3所示，化合物A抑制由bFGF或VEGF诱导的HUVEC的管形成。同时考虑参考实施例2的结果，可以认为化合物A通过抑制整联蛋白α2表达来抑制管形成。
[实施例1]化合拘A的肿瘤体积增加抑制作用与血小板整联蛋白α2表达抑制作用的关系
将100μl KP-1(人胰腺癌细胞株)在PBS中的悬浮液(5×107个细胞/ml)移植到小鼠(SLC KSN，雌性，Lot.No.085605376)的皮下组织内。从移植后一周开始，每天口服施用2次0.5％甲基纤维素水溶液(载体)或者100或200mg/kg化合物A(悬浮在0.5％甲基纤维素中)。每天测定体重和肿瘤体积。每天用乙醚将小鼠麻醉，用毛细管从眼底采集血液。将4μl血液用396μl含有0.0038％柠檬酸钠水溶液的PBS稀释。用含有0.1％BSA的PBS将FITC标记的抗小鼠CD49b抗体(Pharmingen，Cat.No.09794D，Lot.No.M006073)稀释30倍。将10μl抗体加到90μl稀释的血液中。让该混合物在室温反应60分钟，并流经滤器(FALCON，Cat.No.2235)。向残余物中加入900μl PBS，使用流式细胞仪(Becton Dickinson，FACSCalibur)基于前散射光和侧散射光分离出血小板级份，并测定血小板上的荧光强度。
如图4所示，化合物A在100mg/kg和200mg/kg的剂量抑制了KP-1肿瘤体积增加。同时考虑到参考实施例1和2的结果，可以认为化合物A通过抑制整联蛋白α2表达抑制了管形成，并且抑制由肿瘤诱导的血管生成，导致肿瘤体积的增加被抑制。
如图5所示，化合物A降低了同时测定的血小板中的整联蛋白α2的表达量。在现察到肿瘤体积增加被抑制的100mg/kg和200mg/kg的剂量现察到了血小板中整联蛋白α2表达量的下降。因此，这证实了血小板中的整联蛋白α2表达量可用作化合物A的肿瘤体积增加抑制作用的替代标志物。
工业实用性
依据本发明，通过使用血小板中的整联蛋白表达量作为替代标志物，能够监测通过抑制整联蛋白表达来表现出其药拘效力的药拘例如血管生成抑制剂的效力。因为血小板易于作为样本收集，所以高效监测变得可能。

Claims (21)

1.抗整联蛋白α2抗体在制备用于确定药物对整联蛋白α2表达影响的方法中的试剂的应用，其中所述方法包括如下步骤：通过免疫化学方法测定由施用药物的患者收集得到的血小板中整联蛋白α2表达量的步骤，和根据所测定的表达量的下降确定药物对除血小板以外的整联蛋白α2表达细胞中整联蛋白α2表达的影响的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述整联蛋白α2表达细胞是选自内皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞中的细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫化学方法是流式细胞术法。
4.权利要求1的方法，其中所述药物是通式(I)所代表的磺酰胺化合物或其可药用盐或水合物：
其中
B代表C6-C10芳环或6-10元杂芳环，每一所述环可以是被取代和部分饱和的；
K代表单键、-CH＝CH-或-(CR4bR5b)m b-，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分别代表氢原子或C1-C4烷基，且mb是整数1或2；
R1代表氢原子或C1-C6烷基；
Z代表单键或-CO-NH-；且
R代表C6-C10芳环或6-10元杂芳环，每一所述环可以是被取代和部分饱和的。
5.权利要求4的方法，其中R代表吲哚、喹啉或异喹啉。
6.权利要求1的方法，其中所述药物是通式(Ia)所代表的磺酰胺化合物或其可药用盐或水合物：
Figure A2007100878170002C2
Aa代表可以被取代的单环或二环芳环；
Ba代表6元不饱和烃环或含有一个氮原子作为杂原子的不饱和6元杂环，每一所述环可以是被取代的；
Ca代表可以被取代的含有一个或两个氮原子的5元杂环；
R1a代表氢原子或C1-C6烷基；
Wa代表单键或-CH＝CH-；
Ya代表碳或氮原子；
Za代表-N(R2a)-，其中R2a代表氢原子或碳原子数为1～6的直链或支链烷基，或氮原子。
7.权利要求6的方法，其中Wa代表单键。
8.权利要求6的方法，其中Wa代表单键，Za代表-NH-，且Ya代表碳原子。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中Ba代表可以被取代的苯或吡啶。
10.权利要求6-8任一项的方法，其中Ca代表可以被取代的吡咯。
11.权利要求6的方法，其中Aa代表可以被取代的苯或吡啶，Ba代表可以被取代的苯，Ca代表可以被取代的吡咯，Wa代表单键，且Za代表-NH-。
12.权利要求1的方法，其中所述药物是通式(Ib)所代表的含有磺酰胺的杂环化合物或其可药用盐或水合物：
Figure A2007100878170003C1
其中
Ab代表氢原子；卤素原子；羟基；可以被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)k bNR2bR3b，其中R2b和R3b可相同或不同，并分别代表氢原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且kb是0或1；可以被取代的C2-C4链烯基或炔基；或可具有选自下面提及的组A的取代基的苯基或苯氧基；
Bb代表可具有选自下面提及的组A的取代基的芳基或单环杂芳基，或
Figure A2007100878170004C1
其中Qb代表可具有一个或两个氮原子的芳环，Mb代表与Qb共享一个双键的C5-C12不饱和单环或多环，所述环可具有1-4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子，Qb和Mb可共事一个氮原子，且Qb和Mb可具有选自下面提及的组A的取代基；
Kb代表单键或-(CR4bR5b)m b-，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分别代表氢原予或C1-C4烷基，且mb是整数1或2；
Tb、Wb、Xb和Yb可相同或不同，并分别代表＝C(Db)-，其中Db代表氢原子、卤素原子、羟基、可被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基、氰基、-(CO)n bNR6bR7b，其中R6b和R7b可相同或不同，并分别代表氢原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且nb是0或1，或可以被取代的C2-C4链烯基或炔基；或氮原子；
Ub和Vb可相同或不同，并分别代表＝C(Db)-，其中Db如上所定义，氮原子、-CH2-、氧原子或-CO-；
Zb代表单键或-CO-NH-；
R1b代表氢原子或C1-C4烷基；
Figure A2007100878170004C2
代表单键或双键；
组A：卤素原子；羟基；可被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-R8bR9bN(NH)p b-，其中R8b和R9b可相同或不同，并分别代表氢原子或可被卤素原子取代的C1-C4烷基，且pb是0或1，R8b和R9b可以与它们所键合的氮原子一起形成5或6元环，所述环还可以进一步含有氮原子、氧原子或硫原子，并且可以被取代；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基；可被取代的C1-C8酰基；(C1-C4烷基)-S(O)8 b-(C1-C4亚烷基)，其中sb是整数0、1或2；可被取代的C1-C4烷基或苯基磺酰基氨基；-(CO)q bNR10bR11b，其中R10b和R11b可相同或不同，并分别代表氢原子或可被卤素原于取代的C1-C4烷基或可被C1-C4烷基取代的氨基，且qb是0或1；或可被取代的芳基或杂芳基．
13.权利要求12的方法，其中Ub和Vb分别代表＝C(Db)-，其中Db如上所定义，或氮原子。
14.权利要求12的方法，其中Zb代表单键。
15.权利要求12-14任一项的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb当中至少一个代表氮原子。
16.权利要求12的方法，其中Ab代表卤素原子；可以被卤素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)r bNR12bR13b，其中R12b和R13b可相同或不同，并分别代表氢原子或可以被卤素原子取代的C1-C4烷基，且rb是0或1；或可以被取代的C2-C4链烯基或炔基。
17.权利要求15的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb当中仅有一个代表氮原子。
18.权利要求17的方法，其中Tb、Wb和Yb当中仅有一个代表氮原子。
19.权利要求1的方法，其中所述除血小板以外的整联蛋白α2表达细胞是其中可发生血管生成的组织的细胞，并且对整联蛋白α2表达的抑制是以血管生成抑制作用的形式确定的。
20.权利要求1的方法，其中所述除血小板以外的整联蛋白α2表达细胞是肿瘤细胞，并且对整联蛋白α2表达的抑制是以肿瘤生长抑制作用的形式确定的。
21.如权利要求4的方法，其中所述的药物是N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺或其药学上可接受的盐，或其水合物。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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