CN100366727C - 一种生产普鲁兰的菌株与利用该菌株生产普鲁兰的方法 - Google Patents

Abstract

一种生产普鲁兰的菌株与利用该菌株生产普鲁兰的方法，涉及利用糖代谢生产细胞外水溶性多糖，属于生物工程技术领域。本发明提供的菌株，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G-58，保藏编号为CGMCC No.1234；用该菌株经过发酵培养和发酵液后处理：热处理、脱色、沉淀、脱盐、干燥等工艺生产普鲁兰。所得产品普鲁兰色泽浅，多糖得率高，具有极佳的粘弹性、乳化性、可塑性、无毒无害，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。所述发酵工艺发酵液色素含量低，可大大简化后处理工艺，发酵液后处理工艺设计合理、操作简单、成本低、得率高、脱色脱盐效果好，水溶性好，产品质量达到要求，为工业化大规模生产价格较低的普鲁兰提供了可能。

Description

一种生产普鲁兰的菌株与利用该菌株生产普鲁兰的方法

技术领域

一种生产普鲁兰的菌株与利用该菌株生产普鲁兰的方法，涉及利用糖代谢生产细胞外水溶性多糖，属于生物工程技术领域。

背景技术

普鲁兰正式命名为短梗霉多糖(pullulan)又称为茁霉多糖或普鲁兰，是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)在培养过程中利用糖代谢产生的细胞外水溶性多糖。其分子是由麦芽三糖以α-1，6-糖苷键连接而成的直链多糖，分子中1，4键与1，6键比例为2∶1，聚合度为100～5000，分子量为(4～200)×104。由于这一独特连接方式，短梗霉多糖具有极佳的粘弹性、乳化性、可塑性，无毒无害，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。

短梗霉多糖膜具有玻璃纸样光泽及透明度和强度，耐油、耐热封，可食；它最特殊的性质是比其他高分子膜的透气性低，氧、氮、二氧化碳和香气等气体几乎不能透过。短梗霉多糖膜作为食品保鲜膜广泛应用于水果、蔬菜、鸡蛋，特别是含油食品，如火腿、方便面、肉等。短梗霉多糖溶液中性，粘度受温度、pH值影响小，有很好的耐盐和耐酸性能，因此可用于高盐食品和调味料的增稠，如酱油、虾酱，增稠效果明显优于刺槐豆胶、卡拉胶等其他多糖。短梗霉多糖在动物消化器官内酶作用下消化得很慢，利用它的低消化性，可制低热量食品和饮料。最近又发现短梗霉多糖具有使双歧杆菌增殖、治疗便秘和抑制肿瘤的作用。

目前只有日本林原公司有少量生产，价格昂贵。制约短梗霉多糖大量生产的首要原因是在发酵过程中，出芽短梗霉会分泌出与黑色素(melanin pigmentation)类似的黑色或墨绿色物质，这种物质牢固地粘附在短梗霉多糖上，很难用一般方法除去，可以用Sevag分馏法除去，但要完全除去黑色素，必须重复多次，而每次分馏会损失大约15％的多糖，最终得率很低，所以必须筛选低色素菌株，以克服黑色素对多糖产品的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一株出芽短梗霉变异株CGMCC No.1234，和利用该菌株生产普鲁兰的方法，其中包括发酵工艺和发酵液后处理工艺。普鲁兰是具有良好成膜性和香味包裹性能的多糖类胶体，是爽口片生产的最好材料。

本发明的技术方案是所述出芽短梗霉变异株，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G-58，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1234。利用该菌株生产普鲁兰的方法为：

A)发酵工艺

菌种为CGMCC No.1234；

种子培养基以g/L计：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.8，K₂HPO₄4，MgSO₄ 0.2，NaCl0.2，酵母膏1.5，pH6；121℃，30min灭菌。

发酵培养基以g/L计：蔗糖50-100，(NH₄)₂SO₄0.4-0.8，K₂HPO₄ 4-8，MgSO₄0.4，NaCl0.2，MnCl₂ 0.005，酵母膏0.3-0.5，pH6.0-7.0；121℃，30min灭菌。

种子培养条件：取28℃培养4天的斜面菌种一环，接种于种子培养基，装液量为在500mL三角瓶中装100mL-120mL，28℃、200r/min摇瓶培养36小时即为种子液。

10升发酵罐培养条件：10升发酵罐，装液量6升，接种量2％；温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度200～600r/min，通气量1.5～6L/min，发酵时间96小时。

1.5m³发酵罐培养条件：1.5m³发酵罐，装液量900升，接种量2％；温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度200～600r/min，通气量1.5～6L/min，发酵时间96小时。

最佳的发酵培养基以g/L计为：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.6，K₂HPO₄ 6，MgSO₄0.4，NaCl 0.2，MnCl₂ 0.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min灭菌；

最佳的10升或1.5m³发酵罐培养条件：搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间96小时。

B)发酵液后处理工艺

发酵液经过滤I、离心I、热处理、离心II、脱色、离心III、工业酒精沉淀、离心IV、脱盐、过滤II制得液体普鲁兰产品；或继续干燥制得固体普鲁兰产品。

具体的操作为：

过滤I：8层纱布抽滤，

离心I：3000r/min、30min，

热处理：离心I之后的上清液用于热处理，用NaHCO₃和HCl调pH值，70℃、10min、pH7.0，

离心II：4000r/min、30min，

脱色：活性炭脱色、活性炭用量为0.5％、15℃、pH7.0，

离心III：4000r/min、30min，

工业酒精沉淀：离心III的上清液加入2倍体积工业酒精、搅拌、4℃放置12h，

离心IV：2000r/min、15min，

脱盐：离心IV的沉淀用65％的酒精洗涤3次，

过滤II：8层纱布抽滤，

过滤II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量为20％的水溶液，

蒸发：将上述溶液蒸发至固形物含量60％-70％，即为液体普鲁兰产品；或喷雾干燥，制得固体普鲁兰产品。

分析方法：

发酵液颜色和吸光度测定：采用721型分光光度计测定提取多糖后的溶液中的色素。蒸馏水为空白，波长扫描，波长调至最大透光率(654nm)，再用此波长测各发酵液4000r/min、30min离心去菌体后上清液吸光度。

生物量测定：定量量取发酵液，4000r/min下离心30min，倾出上清液用于糖测定。沉淀的菌体用蒸馏水洗涤离心2次，于100℃下干燥至恒重，用称重法测定生物量。

粗多糖测定：离心上清液加入2倍无水乙醇，搅拌，4℃放置过液，使短梗霉多糖充分沉淀。沉淀液以4500r/min离心30min得短梗霉多糖沉淀，沉淀用95％酒精洗涤3次再依次用无水丙酮、无水乙醚洗涤，70℃干燥至恒重，即得短梗霉多糖粗品，称重，计算产量。

本发明的有益效果：本发明方法提供了一种自行诱变选育的生产普鲁兰的出芽短梗霉变异株CGMCC No.1234，用该变异株进行发酵和发酵液后处理所得产品普鲁兰色泽浅，为浅黄或乳白色，多糖得率高，产品具有极佳的粘弹性、乳化性、可塑性、无毒无害，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。所述发酵工艺发酵液色素含量低，可大大简化后处理工艺，发酵液后处理工艺设计合理、操作简单、成本低、得率高、脱色脱盐效果好，水溶性好，产品质量达到要求，为工业化大规模生产价格较低的普鲁兰提供了可能。

生物材料样品保藏

一种生产普鲁兰的菌株，该菌株为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)G-58，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1234，保藏日期为2004年10月19日。

具体实施方式

实施例1

10升发酵罐培养

菌种为CGMCC No.1234；

种子培养基以g/L计：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.8，K₂HPO₄4，MgSO₄ 0.2，NaCl0.2，酵母膏1.5；pH6；121℃，30min灭菌；

发酵培养基以g/L计为：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.6，K₂HPO₄ 6，MgSO₄ 0.4，NaCl 0.2，MnCl₂ 0.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min灭菌；

种子培养条件：取28℃培养4天的斜面菌种一环，接种于种子培养基，装液量为在500mL三角瓶中装100mL-120mL，28℃、200r/min摇瓶培养36小时得到120mL种子液；

10升发酵罐培养条件：10升发酵罐，装液量6升，接种量按2％计，正好是120mL种子液；温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间96小时。多糖产量达到24.1g/L，糖转化率达到48.2％。

实施例2

1.5m³发酵罐培养

种子培养基、种子培养条件、发酵培养基同实施例1。

1.5m³发酵罐培养条件：1.5m³发酵罐，装液量900升，接种量按2％计，为18升种子液，温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间96小时，多糖产量达到25.6g/L，糖转化率达到51.2％。

实施例3

以实施例1或实施例2所得发酵液进行后处理，后处理条件为：发酵液经过滤I、离心I、热处理、离心II、脱色、离心III、工业酒精沉淀、离心IV、脱盐、过滤II制得液体普鲁兰产品；或继续干燥制得固体普鲁兰产品。

具体的操作为：

过滤I：8层纱布抽滤，

离心I：3000r/min、30min，

热处理：离心I之后的上清液用于热处理，用NaHCO₃和HCl调pH值，70℃、10min、pH7.0，热处理前，吸光度为0.295，热处理后，吸光度为0.300；热处理前，多糖含量为31.5g/L，热处理后，多糖含量为29.8g/L，多糖得率为94.5％。

离心II：4000r/min、30min，

脱色：活性炭脱色、活性炭用量为0.5％、15℃、pH7.0，脱色前，吸光度为0.300，脱色后，吸光度为0.265；脱色前，多糖含量为29.3g/L，脱色后，多糖含量为28.7g/L，多糖得率为98％。

离心III：4000r/min、30min，

工业酒精沉淀：离心III的上清液加入2倍体积工业酒精、搅拌、4℃放置12h，

离心IV：2000r/min、15min，

脱盐：离心IV的沉淀用65％的酒精洗涤3次，

过滤II：8层纱布抽滤，

过滤II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量为20％的水溶液，

蒸发：将上述溶液蒸发至固形物含量60％-70％，即为液体普鲁兰产品；或喷雾干燥，制得固体普鲁兰产品。

Claims (4)

1.一种生产普鲁兰的菌株，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)G-58，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1234。

2.一种利用权利要求1所述的菌株生产普鲁兰的方法，其特征是：

A)发酵工艺

菌种为CGMCC No.1234；

种子培养基以g/L计：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.8，K₂HPO₄4，MgSO₄ 0.2，NaCl0.2，酵母膏1.5，pH6；121℃，30min灭菌；

发酵培养基以g/L计：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.4-0.8，K₂HPO₄ 4-8，MgSO₄0.4，NaCl 0.2，MnCl₂ 0.005，酵母膏0.3-0.5，pH6.0-7.0；121℃，30min灭菌；种子培养条件：取28℃培养4天的斜面菌种一环，接种于种子培养基，装液量为在500mL三角瓶中装100mL-120mL，28℃、200r/min摇瓶培养36小时即为种子液；

10升发酵罐培养条件：10升发酵罐，装液量6升，接种量2％；温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度200～600r/min，通气量1.5～6L/min，发酵时间96小时；

1.5m³发酵罐培养条件：1.5m³发酵罐，装液量900升，接种量2％；温度28℃，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度200～600r/min，通气量1.5～6L/min，发酵时间96小时；

B)发酵液后处理工艺

发酵液经过滤I、离心I、热处理、离心II、脱色、离心III、工业酒精沉淀、离心IV、脱盐、过滤II制得液体普鲁兰产品；或继续干燥制得固体普鲁兰产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其中的发酵工艺为：

发酵培养基以g/L计：蔗糖50，(NH₄)₂SO₄ 0.6，K₂HPO₄ 6，MgSO₄ 0.4，NaCl0.2，MnCl₂ 0.005，酵母膏0.4，pH6.5；121℃，30min灭菌；

10升或1.Sm³发酵罐培养条件：搅拌速度400r/min，通气量3L/min，发酵时间96小时。

4.根据权利要求2所述的方法，其中的发酵液后处理工艺为：

过滤I：8层纱布抽滤，

离心I：3000r/min、30min，

热处理：离心I之后的上清液用于热处理，用NaHCO₃和HCl调pH值，70℃、10min、pH7.0，

离心II：4000r/min、30min，

脱色：活性炭脱色、活性炭用量为0.5％、15℃、pH7.0，

离心III：4000r/min、30min，

工业酒精沉淀：离心III的上清液加入2倍体积工业酒精、搅拌、4℃放置12h，

离心IV：2000r/min、15min，

脱盐：离心IV的沉淀用65％的酒精洗涤3次，

过滤II：8层纱布抽滤，

过滤II得到的沉淀溶于水，配制成固形物含量为20％的水溶液，

蒸发：将上述溶液蒸发至固形物含量60％-70％，即为液体普鲁兰产品；

或喷雾干燥，制得固体普鲁兰产品。