CN100354303C

CN100354303C - Gibc基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN100354303C
Application number: CNB2005100111984A
Authority: CN
Inventors: 尚永丰; 吴歌
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2005-01-18
Filing date: 2005-01-18
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2025-01-18
Also published as: CN1807454A

Abstract

本发明涉及GIBC基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在医学中的应用。

Description

GIBC基因及其编码的蛋白和应用

发明领域

本发明涉及GIBC基因(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术

肿瘤细胞的生长和增殖与许多蛋白有关，找出编码这些蛋白的基因，抑制基因表达这些蛋白，可有效阻止肿瘤细胞的生长和增殖，从而达到治疗肿瘤的效果。

发明内容

本发明发现了一种与乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖有关的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可促进乳腺癌、子宫癌、肝癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。

因此，在一个方面，本发明提供了可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。

在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。

在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。

在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤：

培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和

从培养物中分离出重组蛋白。

在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。

在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。

此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还提供了用于PCR扩增的引物，该引物为：

P1：gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag

P2：gcg cgg atc cct aga act cag tca tc。

本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

附图简述

图1是本发明蛋白的结构示意图。

图2是GIBC的原核表达图。

图3是GIBC对肿瘤细胞生长增值的影响，在每组方柱中，左侧为载体，右侧为GIBC。

以下是本发明的详细描述。

基因获取方式：

根据基因芯片检测所获EST序列，再通过生物信息学分析数据，设计了上下游引物，以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增，获取了该基因的ORF。引物设计如下：

P1：gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag

P2：gcg cgg atc cct aga act cag tca tc

此基因被命名为GIBC(G-patch protein Implicated in BreastCarcinogenesis)。

真核表达载体的构建：

以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)载体中，经转化DH5α(Invitrogen)菌株，得到GIBC的真核表达载体。

ups 5’-GGAATTCGCCACCATGGACGAGGAGAGC-3’(EcoRI)

downs 5’-CGGGATCCACGAACTCAGTCATCTTC-3’(BamHI)

原核表达载体的构建：

以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham)载体中，经转化BL21(Invitrogen)菌株，得到GIBC的原核表达载体。

ups 5’-GGAATTCCATGGACGAGGAGAGC-3’

downs 5 ’ -

AAGG AAAA GCGGCCGCTCTAGAACTCAGTCATCTTC-3’

此基因定位与染色体20q13.3，全长为1882bp。表达蛋白约55kD。ORF序列：(1536bp)。编码蛋白：其开放阅读框架编码一个511个氨基酸的蛋白质。根据生物信息学预测，这个蛋白质含有三个主要的结构域，第一个是从第180至第198个氨基酸的C3H1型锌指结构，第二个是从第313至第359个氨基酸的G-patch结构域，第三个是从第119个至第128个氨基酸的多聚谷氨酸结构域。图1是该蛋白的示意图。

同源序列：

H.sapiens KIAA1847 KIAA1847

M.musculus BC021513 cDNA sequence BC021513

R.norvegicu LOC296478 similar to cDNA sequence

s BC021513

D.melanogas CG4709 Drosophila melanogaster CG4709

ter gene

A.gambiae 1281359 Anopheles gambiae str.PEST

ENSANGG0000001...

A.thaliana At2g24830 Arabidopsis thaliana At2g24830

gene

对其进行生物信息学分析，发现其广谱表达。

cDNA sources：NEUROBLASTOMA COT 25-NORMALIZED；PLACENTACOT 25-NORMALIZED；成人脑；肾；淋巴；浆液乳头状癌，高级，2种合并肿瘤；子宫；合并的软骨肉瘤肿瘤细胞；pnet；denis_drash；宫颈；绒毛膜癌；黑素瘤；胃；退行发育术的寡枝神经胶质细胞瘤；肺，细胞系；CNCAP(3)T-225细胞系；小细胞癌；腺癌；用EGFR放大的恶性胶质瘤；结肠肿瘤，RER+；淋巴瘤细胞系；epid_tumor；骨肉瘤，细胞系；正常胎盘；肺肿瘤；大细胞癌；中等分化腺癌；乳房；转移细胞乳头状瘤，细胞系；腺癌细胞系；正常色素视网膜上皮；下丘脑；海马；神经肿瘤；正常神经；混合的肺和脾；混合的脑，肺，睾丸；混合的胰腺和脾；脑；白血球；导管癌，细胞系；成神经细胞瘤，细胞系；平滑肌肉瘤；卵巢(pool of 3)；脾；睾丸；胎儿眼睛，晶状体，眼睛前段，视神经，视网膜，视网膜凹区和斑，RPE和脉络膜；晶状体；腹水；心脏；胃；天然杀伤细胞，细胞系；肝脏；结肠；肺；原发性肺囊性纤维化上皮细胞；郎格罕氏岛；bocio_tumor；testis_normal；鳞状细胞癌，细胞系；腺癌，细胞系；坐骨神经；细胞系泪腺；前列腺；肝脏；视神经；；Aveolar巨噬细胞；人肺上皮细胞；肝脏和脾上皮(细胞系)。

通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。

利用MTT法检测不同浓度的GIBC对MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞等肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，GIBC有促进肿瘤细胞增殖的作用。

通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。

实施例

实施例1：用PCR方法从人乳腺癌文库克隆编码GIBC蛋白的基因

用乳腺癌文库(Clontech公司)为模板，用下列引物进行PCR扩增：

Primer1：5’-gat agc ggc cgc atg gac gag gag ag-3’

Primer2：5’-gcg cgg atc cct aga act cag tca tc-3’

扩增反应条件：在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/LdNTP，20pmol引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在PTC-100型PCR仪(MJR公司)上按下列条件反应25个周期：94℃ 30sec；56℃1min；72℃2min。扩增产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒纯化，用DNA限制性内切酶NotI和BamHI(NEB公司)进行切割(37℃12Hours)。由博亚公司进行测序得到一1536bp序列。

实施例2：GIBC在原核细胞中的表达及纯化

pGEX-4T-3-GIBC可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-GIBC的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞：挑取单克隆到适量培养基中，37℃250rpm培养至A₆₀₀ 0.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-GIBC转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下：

(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100mL的锥形瓶中生长过夜。

(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。

(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。

(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。

(5)用25mLPBS重悬细胞。超声10分钟。

(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。

(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。

(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。

(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。

电泳结果如图2所示。

实施例3：MTT法检测不同浓度的GIBC对肿瘤细胞增殖的影响

MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察SIP对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下：

将培养到对数生长期的MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×10⁴个。次日按照浓度梯度加入SIP(25、50、100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlL1 mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。结果如图3所示，说明本发明的蛋白具有促进肿瘤细胞增殖的作用。

GIBC序~1

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>GIBC基因其编码的蛋白和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1536

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1533)

<223>

<400>1

atg gac gag gag agc ctg gag tcg gcc ttg cag acc tac cgt gcg cag 48

Met Asp Glu Glu Ser Leu Glu Ser Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Ala Gln

1 5 10 15

ctg cag cag gtg gag ctg gcc ttg ggc gcc ggc ctg gat tcg tct gag 96

Leu Gln Gln Val Glu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Leu Asp Ser Ser Glu

20 25 30

cag gct gac ctg cgc cag ctg cag ggg gac ctg aag gag ctc atc gag 144

Gln Ala Asp Leu Arg Gln Leu Gln Gly Asp Leu Lys Glu Leu Ile Glu

35 40 45

ctc acc gag gcc agc ctg gtg tct gtc agg aag agc agg ttg ttg gcc 192

Leu Thr Glu Ala Ser Leu Val Ser Val Arg Lys Ser Arg Leu Leu Ala

50 55 60

gcg ctg gac gaa gag cgc ccg ggc cgc cag gaa gat gct gag tac cag 240

Ala Leu Asp Glu Glu Arg Pro Gly Arg Gln Glu Asp Ala Glu Tyr Gln

65 70 75 80

gct ttc cgg gag gcc atc act gag gcg gtg gag gca cca gca gcg gcc 288

Ala Phe Arg Glu Ala Ile Thr Glu Ala Val Glu Ala Pro Ala Ala Ala

85 90 95

cgt ggg tcc gga tca gag acc gtt cct aaa gca gag gcg ggg cca gaa 336

Arg Gly Ser Gly Ser Glu Thr Val Pro Lys Ala Glu Ala Gly Pro Glu

100 105 110

tct gcg gca ggt ggg cag gag gag gaa gag gga gag gac gag gaa gag 384

Ser Ala Ala Gly Gly Gln Glu Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Glu Glu

115 120 125

ctg agt ggg aca aag gtg agc gcg ccc tac tac agc tcc tgg ggc act 432

Leu Ser Gly Thr Lys Val Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Ser Trp Gly Thr

130 135 140

ctg gag tat cac aac gcc atg gtg gtg gga acg gaa gag gcg gag gat 480

Leu Glu Tyr His Asn Ala Met Val Val Gly Thr Glu Glu Ala Glu Asp

145 150 155 160

ggc tcg gcg ggt gtc cgt gtg ctt tac ctg tac ccc act cac aag tct 528

Gly Ser Ala Gly Val Arg Val Leu Tyr Leu Tyr Pro Thr His Lys Ser

165 170 175

ctg aag ccg tgc ccg ttc ttc ctg gag gga aag tgc cgc ttt aag gag 576

Leu Lys Pro Cys Pro Phe Phe Leu Glu Gly Lys Cys Arg Phe Lys Glu

180 185 190

aac tgc agg ttc tcc cat ggg cag gtg gtc tct ctg gat gag ctg cgc 624

Asn Cys Arg Phe Ser His Gly Gln Val Val Ser Leu Asp Glu Leu Arg

195 200 205

ccc ttc cag gac cca gac ctg agc tcc ctg cag gcc ggc tct gcg tgt 672

Pro Phe Gln Asp Pro Asp Leu Ser Ser Leu Gln Ala Gly Ser Ala Cys

210 215 220

ctg gcc aag cac cag gat ggc ctc tgg cac gca gca cgc atc acc gat 720

Leu Ala Lys His Gln Asp Gly Leu Trp His Ala Ala Arg Ile Thr Asp

225 230 235 240

gtg gac aac ggc tac tac aca gtc aag ttt gac tcg ctg ctg ctg agg 768

Val Asp Asn Gly Tyr Tyr Thr Val Lys Phe Asp Ser Leu Leu Leu Arg

245 250 255

gag gcc gtg gtg gag ggg gac ggc atc ctg ccc cca ctg cgc aca gag 816

Glu Ala Val Val Glu Gly Asp Gly Ile Leu Pro Pro Leu Arg Thr Glu

260 265 270

gcc aca gag tcc gac tca gac agc gac ggt acg ggt gac tcc agc tat 864

Ala Thr Glu Ser Asp Ser Asp Ser Asp Gly Thr Gly Asp Ser Ser Tyr

275 280 285

gcc aga gtg gtg ggg tca gat gct gtg gac tct ggg acc tgc agc tct 912

Ala Arg Val Val Gly Ser Asp Ala Val Asp Ser Gly Thr Cys Ser Ser

290 295 300

gcc ttt gct ggc tgg gag gtg cac acg cga ggt ata ggc tcc aga ctc 960

Ala Phe Ala Gly Trp Glu Val His Thr Arg Gly Ile Gly Ser Arg Leu

305 310 315 320

ctc acc aag atg ggc tat gag ttt ggc aag ggt ttg ggc cga cac gcg 1008

Leu Thr Lys Met Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Gly Leu Gly Arg His Ala

325 330 335

gaa ggc cgg gtg gag ccc atc cat gct gtg gtg ttg cct cga ggg aag 1056

Glu Gly Arg Val Glu Pro Ile His Ala Val Val Leu Pro Arg Gly Lys

340 345 350

tcg ctg gac cag tgt gtg gag acc ctg cag aag cag acc agg gtt ggc 1104

Ser Leu Asp Gln Cys Val Glu Thr Leu Gln Lys Gln Thr Arg Val Gly

355 360 365

aag gct ggc acc aac aag ccc ccc agg tgc cgg gga aga ggg gcc agg 1152

Lys Ala Gly Thr Asn Lys Pro Pro Arg Cys Arg Gly Arg Gly Ala Arg

370 375 380

cct ggg ggc cgc cca gct cct cgg aat gtg ttt gac ttc ctc aat gaa 1200

Pro Gly Gly Arg Pro Ala Pro Arg Asn Val Phe Asp Phe Leu Asn Glu

385 390 395 400

aag ctg caa ggt cag gct cct ggg gcc cta gaa gcc ggg gcg gcc cca 1248

Lys Leu Gln Gly Gln Ala Pro Gly Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Pro

405 410 415

gcg ggg agg agg agc aag gac atg tac cat gcc agc aag agt gcc aag 1296

Ala Gly Arg Arg Ser Lys Asp Met Tyr His Ala Ser Lys Ser Ala Lys

420 425 430

cgg gcc ctg agc ctg cgg ctc ttc cag act gag gag aag atc gag cga 1344

Arg Ala Leu Ser Leu Arg Leu Phe Gln Thr Glu Glu Lys Ile Glu Arg

435 440 445

acc cag cgg gac atc agg agc atc cag gag gct ctc gcc cgc aac gct 1392

Thr Gln Arg Asp Ile Arg Ser Ile Gln Glu Ala Leu Ala Arg Asn Ala

450 455 460

ggc cgg cat agc gtg gcg tca gcc cag ctg cag gag aag ctg gca gga 1440

Gly Arg His Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln Glu Lys Leu Ala Gly

465 470 475 480

gcc cag cgc cag ctg ggg cag ctc cgg gct cag gaa gcc ggc ctg cag 1488

Ala Gln Arg Gln Leu Gly Gln Leu Arg Ala Gln Glu Ala Gly Leu Gln

485 490 495

cag gag cag agg aag gca gac acc cac aag aag atg act gag ttc tag 1536

Gln Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thr His Lys Lys Met Thr Glu Phe

500 505 510

<210>2

<211>511

<212>PRT