CN109946409A - 一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的检测雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法和应用，属于物质检测的样品前处理技术领域，步骤为：硅胶的酸化预处理，预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶，氯化硅胶与己二酸得到羧基化硅胶，羧基化硅胶与雌激素受体结合元件结合，雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；所述雌激素受体结合元件为与雌激素受体结合的DNA分子。利用雌激素受体结合元件保持雌激素受体的天然活性，可显著提高固相萃取方法的富集净化效率，有助于其与高效液相色谱联用检测方法的广泛应用。
Description
技术领域
本公开属于物质检测的样品前处理技术领域，具体涉及一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
雌激素干扰物是存在于环境中，以某种方式干扰内分泌功能的天然或合成的一类外源性化合物。食品安全国家标准对多种雌激素干扰物的限量标准作了严格规定，雌激素干扰物的检测对于食品安全监管具有重要意义。目前雌激素干扰物的检测方法主要分为生物检测方法与化学检测方法。生物检测方法根据受试材料的不同大致分为三类：动物体内实验，细胞实验及非细胞实验，主要用于初步筛选。
化学检测方法中目前较常用的主要为高效液相色谱、气相色谱、液相色谱串联质谱和气相色谱串联质谱等仪器分析方法。此类方法可以准确测定低浓度的雌激素含量，但由于食品样品基质复杂，基质中存在的大量干扰物会对检测结果的准确性造成影响。因此实际应用中需要同时结合样品前处理技术，如液液萃取、固相萃取等。此类样品前处理技术可实现待测物的提取净化，有效去除食品样品中非待测物的干扰。尤其是固相萃取与液相色谱或液相色谱-质谱的联用方法已广泛用于各类物质的检测，食品安全国家标准中对多种食品危害物的测定均采用此类方法。目前常用的固相萃取方法一般采用硅胶等作为填料，与目标待测物的作用为非特异性吸附，同时对于其他性质类似的干扰物也会存在一定程度的保留，无法实现对目标待测物的特异性富集净化。而采用抗体、分子印迹聚合物等作为固相萃取柱填料的识别分子可实现对目标待测物的特异性结合，但此类识别分子的制备原理决定了其特异性识别只能局限于有限几种雌激素干扰物。
雌激素干扰物大多通过与雌激素受体结合从而发挥对内分泌系统的干扰作用，因此采用雌激素受体作为固相萃取柱填料的识别材料既可有效避免与基质中其他杂质的非特异性结合，还可实现对所有雌激素干扰物的族特异性识别。但雌激素受体非常不稳定，极易失活，在用于制备固相萃取柱时，若采用化学方法交联于固相萃取柱填料上则会丧失大部分活性，对雌激素干扰物的富集净化效果差。
公开内容
针对上述现有技术中存在的问题，本公开的一个方面是提供一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法和应用。
为了解决以上技术问题，本公开的技术方案为：
一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法，步骤为：硅胶的酸化预处理，预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶，氯化硅胶与己二酸反应得到羧基化硅胶，将雌激素受体结合元件偶联于羧基化硅胶上，硅胶上偶联的雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中，得到固相萃取亲和柱；
所述雌激素受体结合元件为一种与雌激素受体结合的DNA分子。
优选的，DNA分子的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’。
本公开将雌激素受体结合元件偶联于羧基化硅胶填料上，然后与雌激素受体特异性结合，整体做成固相萃取亲和柱，固相萃取亲和柱填料上结合的雌激素受体可与雌激素干扰物特异性结合，从而实现对雌激素干扰物的有效富集与净化。将固相萃取亲和柱富集净化方法作为样品前处理步骤，可与高效液相色谱联用，建立灵敏、准确的雌激素干扰物检测方法。基于雌激素受体可以识别雌激素干扰物的原理设计本公开，通过采用雌激素受体结合元件固定雌激素受体，以尽可能地保持雌激素受体的天然活性，提高固相萃取亲和柱的富集净化效率。
一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的检测雌激素干扰物的固相萃取亲和柱的制备方法，具体步骤为：
1)层析柱硅胶与盐酸混合后进行加热回流，过滤，洗涤，烘干得到预处理后的硅胶；
2)预处理后的硅胶溶于无水吡啶中，加入磺酰氯混合，将得到的产物进行洗涤、烘干得到氯化硅胶；
3)将步骤2)得到的氯化硅胶与己二酸、甲苯、吡啶混合后加热反应，将得到的产物过滤、洗涤得到羧基化硅胶；
4)将羧基化硅胶活化后与雌激素受体结合元件混合反应，将产物用超纯水、封闭剂A洗涤得到偶联雌激素受体结合元件的硅胶；
5)偶联雌激素受体结合元件的硅胶与雌激素受体混合孵育，将产物用超纯水、封闭剂B洗涤、超纯水洗涤，洗涤后将得到的产品装入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱。
优选的，步骤1)中盐酸质量百分数为8～12％；优选的，1g硅胶对应的盐酸的体积为8～15mL；优选的，回流的温度为100～110℃；优选的，回流的时间为6～10h；优选的，烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h。
硅胶先进行回流酸处理的作用：酸化的主要目的是使硅胶表面形成游离的硅羟基，以增加硅胶表面参与键合反应的硅羟基数量，并除去硅胶表面的金属离子，使硅胶得到净化。因盐酸的沸点较低，易挥发，选择冷凝回流可以避免盐酸的快速挥发，使硅胶与盐酸充分接触，得到充分净化。盐酸浓度过低时，无法充分去掉硅胶表面的金属离子，盐酸浓度过高，在加热搅拌的过程中，盐酸极易挥发，因此选择10％的盐酸。
优选的，步骤2)中1g硅胶对应的无水吡啶、磺酰氯的体积为5～7mL、1.5～2.5mL；优选的，步骤2)中产物进行洗涤的洗涤剂依次为甲苯和无水硫酸钠的混合物、甲醇、丙酮；优选的，步骤2)中烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h。
制备氯化硅胶的作用：硅胶键合固定相的主要途径有两种，一是先将硅胶表面的硅羟基转化为各种活泼的反应性基团，然后利用其上的反应性基团与有机化合物再经进一步的衍生反应，生成硅胶键合相；二是先将有机化合物转化为带有易于与硅羟基反应的特定官能团的化合物，再键合到硅胶表面，得到硅胶键合相。本公开选择的是第一种方法。磺酰氯是实验中常用的氯化剂，常用于芳香族的氯化、羧酸的氯化及其他各种有机和无机化合物的氯化，其他物质的氯化效果不及磺酰氯。
优选的，步骤3)中氯化硅胶与己二酸、甲苯的质量比为1:1:3～6；优选的，1g的氯化硅胶对应的吡啶的体积为5～7mL；优选的，步骤3)中加热反应的温度为100～120℃，加热反应的时间为10～14h。
硅胶表面的硅羟基进行羧基化，可以使硅胶能够稳定地连接雌激素受体结合元件，作为固定结合雌激素受体的基质。
这里加入吡啶的作用：吡啶作为缚酸剂，吡啶呈碱性，选择吡啶做缚酸剂，对氯化硅胶键合羧基具有催化作用，可以更好地促进硅胶键合羧基。
优选的，步骤4)中将羧基化硅胶活化的活化剂为EDC/NHS；优选的，步骤4)中活化的时间为1.5～2.5h。
优选的，步骤4)中所述雌激素受体结合元件为雌激素受体结合DNA，所述雌激素受体结合DNA的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’；优选的，步骤4)中孵育的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤4)中封闭剂A为牛血清白蛋白或卵清蛋白，进一步优选的，牛血清白蛋白的质量百分比为2～4％；优选的，1mg偶联有雌激素受体结合元件的硅胶对应封闭剂A的体积为28～32μL；优选的，偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与封闭剂A反应的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤4)中1mg羧基化硅胶对应的雌激素受体结合元件的质量为6～7μg。
所述DNA分子与雌激素受体进行结合，通过DNA分子使硅胶与雌激素受体的结合更加紧密，有利于形成稳定的固相萃取亲和柱，用封闭剂A封闭硅胶的大分子位点，消除硅胶对雌激素受体的非特异性吸附。
优选的，步骤5)中雌激素受体的浓度为4～6g/L；优选的，步骤5)中偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与雌激素受体的质量比为40:1～2；优选的，步骤5)中孵育的时间为0.5～4h；优选的，步骤5)中封闭剂B为三苯甲胺或苯甲胺；优选的，封闭剂B的浓度为0.02～0.1g/L；优选的，1mg偶联有雌激素受体结合元件的硅胶的质量对应的封闭剂B的体积为28～32μL。
雌激素浓度与雌激素受体结合元件的结合具有饱和度，1μg雌激素受体结合元件可以结合5μg雌激素受体，雌激素受体浓度过高时，雌激素受体无法得到充分结合，雌激素受体浓度过低时，雌激素受体结合元件无法得到充分反应。
利用封闭剂B封闭硅胶的小分子结合位点，消除样品基质中其他小分子干扰物的非特异性吸附，以保证雌激素受体能够特异性结合雌激素干扰物。
本公开的第二个方面是提供一种上述制备方法制备得到的固相萃取亲和柱。
本公开的第三个方面是提供一种上述雌激素干扰物固相萃取亲和柱在检测雌激素干扰物中的应用。
优选的，所述雌激素干扰物为17β-雌二醇(17β-E2)、双酚A(BPA)，己烯雌酚(DES)或农兽药残留中的具有雌激素特性的小分子物质。
利用上述固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法，具体步骤为：
1)将雌激素干扰物加入上述固相萃取亲和柱中，依次用超纯水、洗脱剂洗涤固相萃取亲和柱，收集洗脱液；
2)利用高效液相色谱对步骤1)得到的洗脱液进行检测。
优选的，步骤1)中洗脱剂为甲醇的水溶液，甲醇的质量分数为35～45％。
优选的，步骤2)中高效液相色谱的检测条件为流动相为40～50％乙腈，柱温为25～35℃，流动相流速为0.7～1.3mL/min，进样体积为18～22μL。
本公开的有益效果：
本公开利用雌激素受体结合元件保持雌激素受体的生物学活性，依据固相萃取高效液相联用原理建立灵敏、简便的雌激素干扰物检测方法。不仅可以检测样品中已知雌激素干扰物，也可对样品中的未知雌激素干扰物进行富集净化。
对于普通的硅胶基质的固相萃取柱，其对雌激素干扰物为非特异性吸附，净化效果不理想。而采用抗体、分子印迹聚合物等作为固相萃取柱填料的识别分子可实现对目标待测物的特异性结合，但此类识别分子的制备原理决定了其特异性识别只能局限于有限几种雌激素干扰物。采用雌激素受体作为固相萃取柱填料的识别材料既可有效避免与基质中其他杂质的非特异性结合，还可实现对所有雌激素干扰物的族特异性识别。但雌激素受体非常不稳定，极易失活，在用于制备固相萃取柱时，若采用化学方法交联于固相萃取填料上则会丧失大部分活性，对雌激素干扰物的富集净化效果差。
本公开将雌激素受体结合元件偶联于羧基化硅胶填料上，然后与雌激素受体特异性结合，整体做成固相萃取亲和柱，固相萃取亲和柱与雌激素干扰物反应。雌激素受体在体内产生各种生理作用是通过其与雌激素受体结合元件的结合实现的，因此，采用雌激素受体结合元件作为雌激素受体与填料之间的连接单元可有效避免雌激素受体的失活问题，进而使固相萃取亲和柱的富集净化效果得到显著提高。与高效液相联用进行检测，建立标准曲线，实现对雌激素干扰物的灵敏、准确定量检测。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为雌激素受体结合元件、雌激素受体与雌激素干扰物的结合示意图；
图2为基于雌激素受体结合元件的雌激素干扰物固相萃取的方法示意图；
图3为BSA封闭羧基化硅胶大分子位点的效果对比图；
图4为雌激素受体结合元件与雌激素受体结合时间的优化图；
图5为不同固相萃取柱样品的三苯甲胺封闭效果图；
图6为不同浓度三苯甲胺效果图；
图7为不同固相萃取柱对不同浓度BPA的吸附对比效果图；
图8为不同固相萃取柱对BPA的吸附情况的比较效果图；
图9为不同固相萃取柱对DES的吸附情况的比较效果图；
图10为不同固相萃取柱对17β-E2的吸附情况的比较效果图；
图11为不同固相萃取柱对17β-E2、BPA，DES混合标准品的吸附对比效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合实施例对本公开进一步说明
下述实施例中的雌激素受体结合元件的DNA分子的序列为：
5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’。
所述硅胶可以是层析柱硅胶或凝胶。
实施例1
称取层析柱硅胶20g于三颈烧瓶中，并加入200mL 10％的HCl搅拌，加热至105℃，回流酸化处理8h，过滤，用去离子水洗涤至中性，至于烘箱中，110℃烘干24h，置于干燥器中保存备用。
取预处理后的硅胶5g，加入30mL无水吡啶于干燥的三颈烧瓶中，在匀速搅拌的条件下缓慢滴加约10mL磺酰氯。反应剧烈，产生大量的热，因此将三颈烧瓶置于水浴中以助散热。反应完毕后将产物过滤，依次用甲苯(无水硫酸钠处理)、甲醇、丙酮洗涤数次，放入烘箱中，110℃干燥，置于干燥器中保存备用。
取氯化硅胶5g加入己二酸5g，甲苯1:5和吡啶(缚酸剂)(30mL)，匀速搅拌，110℃下搅拌12h，反应完毕后将产物过滤，依次用甲苯、甲醇、丙酮洗涤数次，干燥后即为羧基化硅胶。
取10mg羧基化硅胶，用EDC/NHS活化2h后与66μg雌激素受体结合元件结合(用66μL超纯水充分溶解)，震荡孵育2h，反应完毕后用超纯水洗涤，洗去未结合的雌激素受体结合元件得到偶联有雌激素受体结合元件的硅胶。
将偶联有雌激素受体结合元件的硅胶用300μL，3％的BSA(牛血清蛋白)封闭2h，尽可能消除硅胶对雌激素受体的非特异性吸附。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的BSA。
将50μL浓度为5mg/mL的雌激素受体与偶联有雌激素受体结合元件的硅胶震荡孵育2h，用考马斯亮蓝法测雌激素受体的结合情况。雌激素受体结合元件与雌激素受体结合的时间2h，使雌激素受体结合元件能够尽可能多地吸附雌激素受体。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的雌激素受体。
将已经偶联有雌激素受体和雌激素受体结合元件的硅胶用300μL浓度为0.03mg/mL的三苯甲胺封闭，将硅胶未反应的羧基尽可能封闭，以消除硅胶对雌激素干扰物的非特异性吸附，使雌激素干扰物能够与雌激素受体特异性结合。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的三苯甲胺。三苯甲胺的浓度0.02mg/mL，使三苯甲胺能够尽可能封闭雌激素干扰物的非特异性结合位点。
图2中的表示出了制备萃取亲和柱的制备过程和进行检测的过程，硅胶分子先与雌激素受体元件(ERE)结合，牛血清蛋白(BSA)对偶联有雌激素受体结合元件的硅胶的大分子位点进行封闭，再与雌激素受体进行结合得到偶联有雌激素受体和雌激素受体结合元件的硅胶，三苯甲胺对偶联有雌激素受体和雌激素受体结合元件的硅胶的小分子位点进行封闭，得到的产品装入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱，雌激素干扰物注入固相萃取亲和柱中进行萃取，经过洗涤、洗脱，对洗脱液进行检测。
试验例1
雌激素受体的吸附。
样品1～样品4如下所示，为偶联雌激素受体结合元件的硅胶，样品5为实施例1中经过BSA封闭大分子位点的偶联雌激素受体结合元件的硅胶，样品1～5分别对雌激素受体进行吸附，雌激素的吸附情况如图3所示，其中1表示对比例1，2表示对比例2，3表示对比例3，4表示对比例4，5表示实施例1。由图3可以得到，样品1对雌激素受体不吸收，样品2硅胶由于没有被封闭位点所以对雌激素受体的吸附量是最多的，样品3由于大分子位点被封闭所以对雌激素受体的吸附量大大减少，样品4由于位点一部分与雌激素受体结合元件结合，所以吸附雌激素受体的量比单独的硅胶吸附量要少，样品5中由于偶联雌激素受体结合元件的硅胶的大分子位点被封闭，所以吸附雌激素受体的量比未封闭的偶联雌激素受体结合元件的硅胶要少。
样品1萃取亲和柱中只有雌激素受体。
样品2硅胶不与雌激素受体元件结合，不经过BSA进行硅胶的大分子位点的封闭，硅胶直接吸附雌激素受体得到萃取亲和柱。
样品3硅胶不与雌激素受体元件结合，经过BSA进行硅胶大分子位点的封闭后吸附雌激素受体得到萃取亲和柱。
样品4硅胶与雌激素受体元件结合，不经过BSA进行硅胶大分子位点的封闭，偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与雌激素受体结合得到萃取亲和柱。
对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、实施例1得到的萃取亲和柱示意如表1所示。
表1不同的萃取亲和柱
实施例2
称取硅胶20g于三颈烧瓶中，并加入200mL，10％的HCl搅拌，加热至110℃，回流酸化处理8h，过滤，用去离子水洗涤至中性，至于烘箱中，110℃烘干24h，置于干燥器中保存备用。
取预处理后的硅胶5g，加入30mL无水吡啶于干燥的三颈烧瓶中，在匀速搅拌的条件下缓慢滴加约10mL磺酰氯。反应剧烈，产生大量的热，因此将三颈烧瓶置于水浴中以助散热。反应完毕后将产物过滤，依次用甲苯(无水硫酸钠处理)、甲醇、丙酮洗涤数次，放入烘箱中，110℃干燥，置于干燥器中保存备用。
取氯化硅胶(5g)加入己二酸(5g)，甲苯25mL和吡啶(缚酸剂)(30mL)，匀速搅拌，120℃下搅拌12h，反应完毕后将产物过滤，依次用甲苯、甲醇、丙酮洗涤数次，干燥后即为产品。
取10mg羧基化硅胶，用EDC/NHS活化2h后与66μg雌激素受体结合元件结合，震荡孵育2h，反应完毕后用超纯水洗涤，洗去未结合的雌激素受体结合元件得到偶联有雌激素受体结合元件的硅胶。
将偶联有雌激素受体结合元件的硅胶用300μL，3％的BSA(牛血清白蛋白)封闭2h，尽可能消除硅胶对雌激素受体的非特异性吸附。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的BSA。
将50μL浓度为5mg/mL的雌激素受体与偶联有雌激素受体结合元件的硅胶震荡孵育2h，用考马斯亮蓝法测雌激素受体的结合情况。雌激素受体结合元件与雌激素受体结合的时间2h，使雌激素受体结合元件能够尽可能多地吸附雌激素受体。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的雌激素受体。
将已经偶联有雌激素受体和雌激素受体结合元件的硅胶用300μL浓度为0.03mg/mL的三苯甲胺封闭，将硅胶未反应的羧基尽可能封闭，以消除硅胶对雌激素干扰物的非特异性吸附，使雌激素干扰物能够与雌激素受体特异性结合。反应完毕后，用超纯水洗涤三次，洗去未结合的三苯甲胺。三苯甲胺的浓度为0.02mg/mL，使三苯甲胺能够尽可能封闭雌激素干扰物的非特异性结合位点。
实施例中的固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物过程如下：
将已经封闭好的偶联有雌激素受体与雌激素受体结合元件的硅胶转移到固相萃取空柱管中，利用恒流泵将雌激素干扰物的标准液，注入到固相萃取柱中，雌激素受体与雌激素干扰物结合。用超纯水洗涤三次，洗去未结合的雌激素干扰物，最后用40％甲醇-水溶液作为洗脱剂，将雌激素受体吸附的雌激素干扰物洗脱下来，以备检测。
利用高效液相色谱对雌激素干扰物进行检测，流动相为45％乙腈，柱温为30℃，流动相流速为1mL/min，进样体积为20μL，紫外检测波长为280nm(根据不同雌激素干扰物的最大吸收波长不同进行调整)。建立标准曲线，对雌激素干扰物进行定量检测。
实施例3
与实施例1不同的是雌激素受体结合元件与雌激素受体孵育结合的时间为0.5h。
实施例4
与实施例1不同的是雌激素受体结合元件与雌激素受体孵育结合的时间为1h。
实施例5
与实施例1不同的是雌激素受体结合元件与雌激素受体孵育结合的时间为3h。
实施例6
与实施例1不同的是雌激素受体结合元件与雌激素受体结合的时间为4h。
由实施例1、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6得到的固相萃取柱对雌激素干扰物进行萃取，萃取过程如上所述，结果如图4所示，由图4可知雌激素受体与雌激素受体结合元件孵育2h后结合量已不变，说明两者已充分结合，且雌激素受体在体外时间较长易失活。
实施例7
与实施例1不同的是三苯甲胺的浓度为0.04mg/mL。
实施例8
与实施例1不同的是三苯甲胺的浓度为0.06mg/mL。
实施例9
与实施例1不同的是三苯甲胺的浓度为0.08mg/mL。
实施例10
与实施例1不同的是三苯甲胺的浓度为0.1mg/mL。
试验例2
封闭剂B(三苯甲胺)对偶联雌激素受体结合元件和雌激素受体的硅胶对雌激素干扰物吸附量的影响。
样品1为实施例1中的经过三苯甲胺封闭小分子位点的偶联雌激素受体结合元件和雌激素受体的硅胶，样品2与样品1的区别为样品未经过三苯甲胺封闭小分子位点的偶联雌激素受体结合元件和雌激素受体的硅胶，样品1和样品2分别对双酚A进行萃取，萃取过程如上所示，得到的结果如图5所示，该图为三苯甲胺封闭效果对照图，1为未用三苯甲胺封闭时硅胶对双酚A吸附量，2为三苯甲胺封闭后硅胶对双酚A的吸附量，2中双酚A的吸附量明显减少，说明三苯甲胺封闭效果明显，可以减少硅胶对双酚A的非特异性吸附。
通过实施例1、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10得到的萃取效果如图6所示，由图6可以得到三苯甲胺的浓度对封闭结果影响较小，三苯甲胺的浓度为20mg/mL时吸附雌激素干扰物的效果最好，三苯甲胺的封闭效果较稳定。
试验例3
不结合雌激素受体与结合雌激素受体的偶联雌激素受体结合元件的硅胶对双酚A的吸附效果对比。
样品1为实施例1制备的固相萃取亲和柱，样品2与样品1的区别为样品是未结合雌激素受体的偶联雌激素受体结合元件的硅胶，样品2的制备过程为实施例1中制备过程中去掉与雌激素受体进行结合的过程，其中包括三苯甲胺封闭小分子位点的过程，样品1和样品2分别进行相同的雌激素干扰物的萃取过程，得到的结果如图7所示，图中a为样品2，b为样品1，图7中的横坐标为双酚A的浓度，由图7可以得到偶联雌激素受体和雌激素受体结合元件的硅胶对BPA的吸附效果远远高于不结合雌激素受体的偶联雌激素受体结合元件的硅胶。
试验例4
不同的固相萃取柱制备过程对双酚A吸附的对比，固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物过程如上所示，其中高效液相色谱的紫外线波长为278nm。
样品3为实施例1得到的固相萃取亲和柱，样品1与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，也没有吸附雌激素受体，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品2与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品4为与样品3不同在于制备过程中硅胶与雌激素受体结合元件耦合，硅胶经过BSA封闭大分子位点，没有吸附雌激素受体，三苯甲胺封闭小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品1、样品2、样品3、样品4对雌激素干扰物双酚A的萃取情况如图8所示，其中1表示样品1，2表示样品2，3表示样品3，4表示样品4。由图8可知，硅胶的大分子位点、小分子位点被封闭后，只有结合雌激素受体的硅胶对雌激素干扰物的吸附效果较好，但是硅胶如果不先与雌激素受体结合元件结合则硅胶与雌激素受体的结合强度不强，则吸附得到的BPA的效果较不好。
试验例5
不同的固相萃取柱制备过程对己烯雌酚吸附的对比，固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物过程如上所示，对应的高效液相色谱的紫外线波长为254nm。
样品3为实施例1得到的固相萃取亲和柱，样品1与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，也没有吸附雌激素受体，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品2与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品4为与样品3不同在于制备过程中硅胶与雌激素受体结合元件耦合，硅胶经过BSA封闭大分子位点，没有吸附雌激素受体，三苯甲胺封闭小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品1、样品2、样品3、样品4对雌激素干扰物己烯雌酚的萃取情况如图9所示，其中1表示样品1，2表示样品2，3表示样品3，4表示样品4。由图9可知，硅胶的大分子位点、小分子位点被封闭后，只有结合雌激素受体的硅胶对雌激素干扰物的吸附效果较好，但是硅胶如果不先与雌激素受体结合元件结合则硅胶与雌激素受体的结合强度不强，则吸附得到的DES的效果较不好。吸附量之所以为负数是因为实验过程中存在一定的误差，吸附量几乎为0。
试验例6
不同的固相萃取柱制备过程对17β-雌二醇吸附的对比，固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物过程如上所示，对应的高效液相色谱的紫外线波长为280nm。
样品3为实施例1得到的固相萃取亲和柱，样品1与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，也没有吸附雌激素受体，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品2与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品4为与样品3不同在于制备过程中硅胶与雌激素受体结合元件耦合，硅胶经过BSA封闭大分子位点，没有吸附雌激素受体，三苯甲胺封闭小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品1、样品2、样品3、样品4对雌激素干扰物17β-E2的萃取情况如图10所示，其中1表示样品1，2表示样品2，3表示样品3，4表示样品4。由图10可知，硅胶的大分子位点、小分子位点被封闭后，只有结合雌激素受体的硅胶对雌激素干扰物的吸附效果较好，但是硅胶如果不先与雌激素受体结合元件结合则硅胶与雌激素受体的结合强度不强，则吸附得到的17β-E2的效果较不好。吸附量之所以为负数是因为实验过程中存在一定的误差，吸附量几乎为0。
试验例7
不同的固相萃取柱制备过程对17β-雌二醇、双酚A、己烯雌酚混合吸附的对比，固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物过程如上所示，对应的高效液相色谱的紫外线波长为(280、278、254)nm。液相可同时设置四组不同的波长。
样品3为实施例1得到的固相萃取亲和柱，样品1与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，也没有吸附雌激素受体，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品2与样品3不同在于制备过程中硅胶没有和雌激素受体结合元件耦合，然后硅胶经过BSA、三苯甲胺封闭大分子、小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品4为与样品3不同在于制备过程中硅胶与雌激素受体结合元件耦合，硅胶经过BSA封闭大分子位点，没有吸附雌激素受体，三苯甲胺封闭小分子位点得到的固相萃取亲和柱，样品1、样品2、样品3、样品4对混合雌激素干扰物的萃取情况如图11所示，其中1表示样品1，2表示样品2，3表示样品3，4表示样品4，a为BPA，b为17β-E2，c为DES。由图11可知，硅胶的大分子位点、小分子位点被封闭后，只有结合雌激素受体的硅胶对雌激素干扰物的吸附效果较好，但是硅胶如果不先与雌激素受体结合元件结合则硅胶与雌激素受体的结合强度不强，则吸附得到的混合雌激素干扰物的效果较不好。且由此图可以看出，雌激素受体对雌激素干扰物的吸附能力为DES＞17β-E2＞BPA，这与雌激素受体对三者的亲和力作用一致。吸附量之所以为负数是因为实验过程中存在一定的误差，吸附量几乎为0。
由附图11可知本公开的基于雌激素受体结合元件的固相萃取柱对雌激素干扰物17β-雌二醇、双酚A、己烯雌酚都具有较好的检测效果。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种雌激素干扰物固相萃取亲和柱及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcaggtcac agtgacctga tcaaagttaa tg 32
Claims (10)
1.一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的雌激素干扰物固相萃取亲和柱的制备方法，其特征在于：步骤为：硅胶的酸化预处理，预处理后的硅胶与磺酰氯反应得到氯化硅胶，氯化硅胶与己二酸得到羧基化硅胶，羧基化硅胶与雌激素受体结合元件结合，雌激素受体结合元件与雌激素受体结合后装填入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；
所述雌激素受体结合元件为一种与雌激素受体结合的DNA分子；
优选的，DNA分子的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’。
2.一种利用雌激素受体结合元件提高富集净化效率的检测雌激素干扰物的固相萃取亲和柱的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
1)硅胶与酸液混合后进行加热回流，过滤，洗涤，烘干得到预处理后的硅胶；
2)预处理后的硅胶溶于有机溶剂A中，加入磺酰氯混合，将得到的产物进行洗涤、烘干得到氯化硅胶；
3)将步骤2)得到的氯化硅胶与己二酸、有机溶剂B、吡啶混合后加热反应，将得到的产物过滤、洗涤得到羧基化硅胶；
4)将羧基化硅胶活化后与雌激素受体结合元件混合反应，将产物用超纯水、封闭剂A洗涤得到羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件；
5)羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体混合孵育，将产物用超纯水、封闭剂B洗涤、超纯水洗涤，洗涤后将得到的产品装入固相萃取空柱管中得到固相萃取亲和柱；
优选的，步骤1)中盐酸质量百分数为8～12％；优选的，1g硅胶对应的盐酸的体积为8～15mL；优选的，回流的温度为100～110℃；优选的，回流的时间为6～10h；优选的，烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h；
优选的，步骤2)中1g硅胶对应的无水吡啶、磺酰氯的体积为5～7mL、1.5～2.5mL；优选的，步骤2)中产物进行洗涤的洗涤剂依次为甲苯和无水硫酸钠的混合物、甲醇、丙酮；优选的，步骤2)中烘干的温度为100～120℃，烘干的时间为22～26h；
优选的，步骤3)中氯化硅胶与己二酸、甲苯、吡啶的质量比为1:1:5:6；优选的，步骤3)中加热反应的温度为100～120℃，加热反应的时间为10～14h；
优选的，步骤4)中将羧基化硅胶活化的活化剂为EDC/NHS；优选的，步骤4)中活化的时间为1.5～2.5h；
优选的，步骤4)中所述雌激素受体结合元件为雌激素受体结合DNA，所述雌激素受体结合DNA的序列为5’-GTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTAATG-3’；
优选的，1mg羧基化硅胶对应的雌激素受体结合元件的质量为6～7μg；优选的，步骤4)中孵育的时间为1.5～2.5h；优选的，步骤4)中封闭剂A为牛肉血清蛋白或卵清蛋白中，进一步优选的，牛肉血清蛋白的质量百分比为2～4％；优选的，1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件对应封闭剂A的体积为28～32μL；优选的，偶联有雌激素受体结合元件的硅胶与封闭剂A反应的时间为1.5～2.5h；
优选的，步骤5)中雌激素受体的浓度为4～6mg/mL；优选的，步骤5)中孵育的时间为0.5～4h。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件与雌激素受体的质量比为40:1～2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤5)中封闭剂B为三苯甲胺；优选的，封闭剂B的浓度为0.02～0.1mg/mL；优选的，1mg羧基化硅胶偶联雌激素受体结合元件的质量对应的封闭剂B的体积为28～32μL。
5.权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到的固相萃取亲和柱。
6.权利要求5所述的固相萃取亲和柱在检测雌激素干扰物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述雌激素干扰物为17β-雌二醇、双酚A、己烯雌酚或农兽药残留中的具有雌激素特性的小分子物质。
8.利用权利要求5所述的固相萃取亲和柱进行检测雌激素干扰物的方法，其特征在于：具体步骤为：
1)将雌激素干扰物注入上述固相萃取亲和柱中，依次用超纯水、洗脱剂洗涤固相萃取亲和柱，收集洗脱液；
2)利用高效液相色谱对步骤1)得到的洗脱液进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤1)中洗脱剂为甲醇的水溶液，甲醇的质量分数为35～45％。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2)中高效液相色谱的检测条件为流动相为40～50％乙腈，柱温为25～35℃，流动相流速为0.7～1.3mL/min，进样体积为18～22μL。
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