CN109937036A - 包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的糖尿病及/或高血脂症的预防或治疗用药学组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的糖尿病及/或高血脂症的预防或治疗用药学组合物及其用途。

Description

包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的糖尿病 及/或高血脂症的预防或治疗用药学组合物

技术领域

本发明涉及包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的糖尿病及/或高血脂症的预防或治疗用药学组合物。

背景技术

运动训练激活在骨骼肌中引起表达型变化的重构程序，从而提高运动耐受性，适当的运动对使代谢性疾病或心脏病等病理状态好转有效。

特别是AMPK(AMP-activated protein kinase，腺苷酸活化蛋白激酶)、PPAR-δ(Peroxisome Proliferator activated Receptor-δ，过氧化物酶体增殖物激活受体)、PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor Gamma Coactivator-1α，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α)被认为是与运动耐受性所需的骨骼肌表达型变化相关的重要因子。

此时，AMPK作为由α/β/γ亚单位构成的异三聚体(heterotrimeric)复合体，在肌肉收缩及运动时，因作为AMPK高级酶的LKB1及CaMKK(Ca2+/calmodulin-dependent kinasekinase，钙离子/钙调蛋白依赖蛋白激酶)引起的磷酸化而激活，是葡萄糖稳态、食欲及运动生理相关的细胞/器官代谢的主要调节因子。PPAR-δ在骨骼肌代谢的转录控制方面发挥核心作用，PGC-1α作为线粒体生物合成及功能的调节因子，与能量代谢相关，是调节因骨骼肌的耐受性运动而激活的基因的转录共激活因子。

AMPK被认为可以同时靶向多个转录程序，这种转录程序借助于诸如PPAR-δ、PGC-1α的基质而调节，诱发与运动类似的遗传效果。与此相关，曾报告，靶向AMPK-PPAR-δ信号路径的运动-类似药物可以成为对耐受表达型相关肌肉重新编程的新的药剂学战略(非专利文献1)。

另外曾报告，诸如A-769662、二甲双胍(metformin)、5-氨基咪唑-4-羧酰胺-1-α-D-呋喃核糖苷(AICAR)及白藜芦醇(resveratrol)的促进AMPK激活的一些药物，对心功能不全症具有治疗效果。AMPK对心脏病的保护功能可以通过细胞质中活性氧簇生产的减少、血管紧张素Ⅱ的活性抑制、心肌肌钙蛋白I的磷酸化、PGC-1α的激活、eNOS-NAD(P)H氧化酶表达的调节、雌性激素-相关受体的调节及能量平衡与心脏内信号传递的调节等重要功能而达成，AMPK激活可以直接、间接地提高心肌功能。

如上所述，AMPK激活(磷酸化)及与此相关的因子(PPAR-δ、PGC-1α)，诱导骨骼肌内内的葡萄糖摄取(uptake)、能量代谢稳定保持、心功能增大等运动-类似效果，因而以可借助于运动-类似效果而治疗的疾病为标靶，对激活AMPK的药物的要求一直很迫切。

(非专利文献1)Vihang A.Narkar et al.,AMPK and PPARδAgonists AreExercise Mimetics,Cell,Volume 134,Issue 3,8August 2008,Pages 405-415。

发明内容

<要解决的技术问题>

因此，本发明人发现，当使α1-肾上腺素受体(α1-AR)通过作为其激动剂(agonist)的米多君(midodrine)而激活时，可以改善糖尿病及/或高血脂症，对这种作用机制进行锐意研究的结果，确认了如果α1-肾上腺素受体被激活，则活性型-AMPK、PPAR-δ及PGC-1α的表达增加，由此可以在骨骼肌、心肌、肝脏等多器官中引起运动-类似效果，从而完成了本发明。

本发明目的旨在提供一种包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物。

本发明另一目的旨在提供一种在作为有效成分的米多君或其药学上可接受的盐中追加包含胰岛素(insulin)的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物。

本发明又一目的旨在提供一种利用米多君的糖尿病治疗方法。

本发明又一目的旨在提供一种包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于高血脂症治疗或预防的药学组合物。

本发明又一目的旨在提供一种利用米多君的高血脂症治疗方法。

但是，本发明要解决的技术问题不限于以上提及的课题，未提及的其他课题是从业人员可以从以下记载明确理解的。

<解决问题的手段>

一方面，本发明提供一种包含米多君(midodrine)或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物。

所述米多君或其药学上可接受的盐可以诱导AMPK激活。

所述米多君或其药学上可接受的盐可以诱导PPAR-δ或PGC-1α的表达。

所述药学组合物可以追加包含胰岛素(insulin)。

所述药学组合物相对于药学组合物全体重量份，可以包含米多君或其药学上可接受的盐20至40重量份；及胰岛素(insulin)60至80重量份。

在一种形态中，本发明提供一种糖尿病治疗方法，包括将米多君或其药学上可接受的盐，以药剂学上有效的量向个体给药的步骤。

在另一形态中，本发明提供一种用于糖尿病治疗或预防的药剂制备所需的米多君的用途。

另一方面，本发明提供一种包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于高血脂症治疗或预防的药学组合物。

所述米多君或其药学上可接受的盐可以诱导AMPK激活。

所述米多君或其药学上可接受的盐可以诱导PPAR-δ或PGC-1α的表达。

在一种形态中，本发明提供一种高血脂症治疗方法，包括将米多君或其药学上可接受的盐，以药剂学上有效的量向个体给药的步骤。

在另一形态中，本发明提供一种用于高血脂症治疗或预防的药剂制备的米多君的用途。

在本发明中，α1-肾上腺素受体(α1-AR)激动剂只要是作用于α1-肾上腺素受体并使之激活的物质，则没有特别的限制。肾上腺素受体有称为α1、α2、β的三种类型，在本发明中，虽然可以无限制地利用使α1型受体激活的公知的化合物，但优选地，可以为米多君(midodrine)或其药学上可接受的盐。

米多君化合物以亚美天(amatine)、普罗亚美天(proamatine)、管通(gutron)等商标名销售，其IUPAC(国际理论和应用化学联合会)名为(RS)-N-[2-(2,5-二甲氧基苯基)-2-羟乙基]氨基乙酰胺((RS)-N-[2-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-hydroxyethyl]glycinamide)，用下述化学式I表示。

[化学式I]

米多君是给药后在生物体内变化成标靶化合物的药物前体(prodrug)，生物体内给药后，变化成作为活性代谢产物的脱甘氨酸米多君(desglymidodrine)，激活α1-肾上腺素受体，接着，通过诱导AMPK激活、PPAR-δ或PGC-1α的表达，可以最终诱导运动-类似效果。

以所述化学式1表示的化合物，可以形成“药学上可接受的盐”。适合的药学上可接受的盐，如同酸附加盐，只要是本发明所属技术领域通常使用的，则不特别地限制。作为优选的药学上可接受的酸加成盐，例如可以为诸如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸或溴酸的无机酸；诸如乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、嘌呤酸、马来酸、丙二酸、邻苯二甲酸、琥珀酸、乳酸、枸橼酸、柠檬酸、葡萄糖酸、酒石酸、水杨酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、亚甲基双羟萘酸、天门冬氨酸或谷氨基酸的有机酸。作为可以用于制备有机碱加成盐的有机碱，例如可以为三(羟甲基)甲胺、二环己基胺等。作为可以用于氨基酸加成碱制备的氨基酸，例如可以为丙氨酸、甘氨酸等的天然氨基酸。

所述米多君(midodrine)或其药学上可接受的盐可以诱导AMPK激活。

AMPK发挥感知生物体内能量状态并将其保持在既定水平的能量传感器(energysensor)作用，例如在细胞内的能量因代谢应激或运动而减少的情况下，即，在ATP枯竭、AMP/ATP比率增加的情况下被激活，促进消耗ATP的过程(例如，与脂肪酸氧化相应的过程)。AMPK的激活在诸如肌肉的主要标靶脏器中诱导代谢上的重要结果，特别是被认为在骨骼肌中促进脂肪酸的氧化和糖吸收。

所述米多君或其药学上可接受的盐可以诱导PPAR-δ或PGC-1α的表达。

PPAR-δ调节AMPK，促进细胞内异化的能量代谢，在对抗炎症作用等保持生物体代谢平衡(稳定性)方面发挥必不可少的作用。

PGC-1α作为线粒体增殖的主要调节物质，被认为对诸如运动、饥饿、寒冷等的巨大代谢变化作出反应而诱导表达，受到AMPK、PPAR-δ、NAD-dependent deacetylase sirtuin-1(SIRT1)等的调节。

本发明的有效成分可以诱导运动-类似效果，所述运动-类似效果可以是需要AMPK激活的疾病的预防或治疗效果。

在本发明中，所谓运动-类似效果，意味着增加肌肉的胰岛素灵敏度及增进氧化磷酸化功能、改善心脏功能(增加收缩力)、增进氧化磷酸化功能、减少胆固醇、减少脂肪蓄积及体重等运动时发挥的生理效果，没有特别的限制。

在本发明中，所谓需要AMPK激活的疾病，作为因AMPK的非激活而会发生的多样疾病，没有特别的限制，例如，可以为包括糖尿病及/或高血脂症的代谢性疾病。

在本发明中，“药学组合物”可以追加包括原有治疗活性成分、其他辅助剂、药剂学上可接受的载体等成分。所述药剂学上可接受的载体包括盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油及乙醇等。

所述组合物可以分别根据通常的方法，制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等经口剂型、外用剂、栓剂及无菌注射溶液的形态使用。

在本发明中，“给药量”根据患者的体重、年龄、姓别、健康状态、饮食、给药次数、给药方法、排泄率及疾病的轻重程度等，其范围可以多样地调节，这是普通技术人员不言而喻的。

在本发明中，所谓“个体”意味着需要治疗疾病的对象，更具体而言，意味着人类或非人类的灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马及牛等哺乳类。

在本发明中，“药学上的有效量”根据包括给药的疾病种类及轻重程度、患者的年龄及性别、对药物的敏感度、给药时间、给药路径及排出比率、治疗时间、同时使用的药物在内的要素及其他医学领域周知的要素而决定，作为全部考虑所述要素而可以在无副作用的情况下获得最大效果的量，可以由从业人员容易地决定。

本发明的组合物，只要能够到达标靶组织，则在“给药方法”方面没有限制。例如，包括经口给药、动脉注射、静脉注射、经皮注射、鼻腔内给药、经支气管给药或肌肉内给药等。每日给药量为约0.0001至100mg/kg，优选地为0.001至10mg/kg，优选每日分成一次至数次给药。

在本发明的一个实施例中，米多君及胰岛素混合给药时，细胞内葡萄糖吸收增加，确认了对糖尿病的预防或治疗有效。

在本发明的一个实施例中，分析了α1-AR刺激效果在心肌细胞、骨骼肌细胞中对运动-类似基因的表达产生的效果，将其与使用表现出与人类代谢症候群类似症状的动物-自发性高血压大鼠(SHR)而在in vivo中对心脏、骨骼肌及肝脏产生的效果进行了比较。

结果表明，与人类的代谢症候群相应的自发性高血压大鼠(SHR)，在借助于米多君而刺激α1-AR时，在心脏、骨骼肌、肝脏中引起AMPK、PPAR-δ、PGC-1α的激活及表达增加。

另外，确认了在刺激α1-AR时，在心肌中对AMPK刺激的PPAR-δ及PGC-1α激活的比率，高于骨骼肌和肝脏中的数值。这种结果意味着与运动-类似AMPK-PPAR-δ激活相关，独立于因α1-AR刺激而引起的肌肉收缩效果，率先报告了药理学上进行刺激的心肌收缩作用有助于心脏AMPK-PPAR-δ-PGC1α激活。

在本发明中，通过in vitro及in vivo实验，率先阐明了与肌肉运动无关，通过米多君的α1-AR刺激，在骨骼肌中激活AMPK-PPAR-δ-PGC-1α表达。这种运动相关基因表达是维持耐力运动(endurance exercise)所需的适应反应之一，对此已有报告。

在本发明中，在通过米多君的α1-AR刺激时，在肝脏中确认了诱导AMPK-PPAR-δ-PGC-1α激活。本发明确认了借助于米多君和胰岛素的复合给药而葡萄糖吸收增加，由此可知对糖尿病的预防或治疗有效。

而且，原有糖尿病治疗剂由于副作用而发生体重增加及心功能不全，但使用米多君时，在降低血糖的同时，一同发挥减少体重、预防心功能不全及抗炎症效果，与原有糖尿病治疗剂相比，对糖尿调节非常有利。

在本发明中确认了作为α1-AR激动剂的米多君，与借助α1-AR刺激而使AMPK激活相独立地，使PPAR-δ及PGC-1α的表达增加，提高心脏功能，这是因为，运动训练使心脏间期缩短增加至40-50％，使收缩及松驰两者的速度全部提高。

因此判断认为，α1-AR激动剂通过对心脏收缩的直接刺激的三重效果及其运动效果，另外，通过在包括心脏、肌肉及肝脏在内的多个器官中的由α1-AR刺激引起的称之为运动-类似AMPK-PPAR-δ激活的间接效果，提高心脏功能，从而有助于在in vivo中提高运动耐受性。

如上所述，在本发明中率先阐明，借助于通过米多君的α1-AR刺激，出现AMPK-PPAR-δ激活的心脏运动-类似效果，附加地还出现称立为PPAR-δ及PGC-1α表达增加的使其他运动-类似程序启动的AMPK-独立心脏运动效果。

在本发明的一个实施例中，分析了通过米多君的α1-AR刺激效果，在心肌细胞、骨骼肌细胞中对运动-类似基因的表达产生的效果，将其与使用表现出与人类代谢症候群类似症状的动物-自发性高血压大鼠(SHR)而在in vivo中对心脏、骨骼肌及肝脏产生的效果进行了比较。

另外，观察了α1-AR刺激效果对心脏功能/大小、脂联素及脂肪水平等产生的效果。

结果表明，与人类代谢症候群相应的自发性高血压大鼠(SHR)，在借助于米多君而刺激α1-AR时，在心脏、骨骼肌、肝脏中引起AMPK、PPAR-δ、PGC-1α的激活及表达增加，在无心脏肥大或追加性血压上升的情况下增加心脏收缩性。

另外，确认了在通过米多君的α1-AR刺激时，血液中胆固醇水平减小，在心肌中对AMPK刺激的PPAR-δ及PGC-1α激活的比率，高于骨骼肌和肝脏中的数值。这种结果与运动-类似AMPK-PPAR-δ激活相关联，意味着独立于借助α1-AR刺激的肌肉收缩效果，率先报告了药理学上进行刺激的心肌收缩作用有助于心脏AMPK-PPAR-δ-PGC1α激活。

另外，在本发明中阐明了米多君比其他运动-类似效果诱发药物(阿替洛尔)更有效的事实。这是因为米多君具有提高心脏收缩性的双重效果，相反，其他药物没有对心肌收缩的直接能量代谢作用，而只发挥运动-类似效果。另外，其他运动-类似剂为了提高各自的功能而混合多种药物使用，但α1-AR激动剂具有以一种物质便同时在多个器官中表现出这种运动效果的优点。

另外，在本发明中阐明，在经米多君处理的大鼠中，左心室射血分数象经阿替洛尔处理的动物一样增加，但心脏中磷酸化的AMPK则在实验组之间存在差异。尽管α-1AR对心脏表现出友好效果，但判断认为α-1AR刺激的程度在长期预后方面很重要，这是因为心脏α-1AR驱动的高强度持续增强，将针对收缩性功能障碍、渐进纤维化及母细胞蛋白质基因的再激活，引起病理性重构。

另外，在本发明中阐明，尽管α1-AR刺激，但未出现心脏肥大，进而，根据本发明，在左心室质量方面，经米多君处理的组小于经阿替洛尔处理的组，这可以作为心脏ATI表达的差异进行说明。

另外，在本发明中通过in vitro及in vivo实验率先阐明，与肌肉运动无关，α1-AR刺激在骨骼肌中激活AMPK-PPAR-δ-PGC-1α表达。这种运动相关基因表达，是维持持久耐力运动(endurance exercise)所需的适应反应之一，对此已有报告。

另外，在本发明中确认了在通过米多君的α1-AR刺激时，在肝脏中诱导AMPK激活，总胆固醇、LDL-胆固醇及HDL-胆固醇水平显著减少，由此可知，对高血脂症的预防或治疗有效。

另外，在本发明中确认了在通过米多君的α1-AR刺激时，脂肪细胞内脂肪含量减少，脂肪合成/蓄积被抑制，体重及腹部脂肪减少。

而且，对高血脂症的效果，与作为降低胆固醇药剂的他汀类(statin)作为副作用而出现糖尿不同，使用米多君时，在减少胆固醇的同时预防糖尿，因而可以作为无副作用且效果优秀的新的高血脂症治疗剂而应用。

再一方面，本发明提供包含米多君的降血糖用保健食品。

再一方面，本发明提供包括米多君的高血脂症改善用保健食品。

本发明的保健食品可以在米多君中添加各种辅助材料及食品添加物。此时，保健食品可以在食品总重量中含有米多君0.1至90重量％。

作为食品添加物，例如可以利用单糖/二糖/多糖/糖醇等多糖类、索马甜/甜叶菊提取物/糖精/阿斯巴甜等香味剂、营养剂、维生素、食用电解质、增味剂、着色剂、增进剂(例，奶酪、巧克力等)、果胶酸、海藻酸、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸化剂等。

本发明的保健食品的剂型可以为多样形态，因而其形态不特别限制。因此，可以以在饮料、颗粒、片剂、粉剂、丸剂、胶囊中选择的某一种剂型形成。具有饮料、颗粒、片剂、粉剂、丸剂、胶囊剂型的保健食品，携带简便，随时随地易于摄取。

作为本发明保健食品剂型的一个示例，饮料可以由米多君0.1至40重量％、净化水60至99.9重量％组成。另外，作为添加物，还可以在饮料中添加牛黄酸、柠檬酸、维生素C等。

此外，象通常的饮料一样，作为追加成分，可以含有多种香味剂。作为香味剂，可以使用索马甜、甜叶菊提取物等天然香味剂。

颗粒、片剂、粉剂、丸剂、胶囊等剂型可以含有米多君1至50重量％，还可以追加含有其他胶粘剂、香料、维生素、碳水化合物等。

<发明的效果>

本发明的包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的组合物，增加在维护与调节生物体内能量代谢活性方面发挥核心作用的p-AMPK、PPAR-δ、PGC-1α的表达，从而可以提高骨骼肌细胞内的葡萄糖吸收率，调节线粒体的代谢障碍，可以有效地用于糖尿病的预防及治疗。

另外，本发明的包含米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分的组合物，不仅可以抑制脂肪细胞内脂肪含量和脂质蓄积，减小腹部脂肪量和体重，而且可以调节线粒体的代谢障碍，可以有效地用于高血脂症的预防及治疗。

而且，本发明的米多君可以用作降血糖及/或高血脂症改善用保健食品。

附图说明

图1的(A)及图1的(B)是显示分别在小鼠骨骼肌细胞株(C2C12)和小鼠心肌细胞株(HL1)中，当借助于米多君而激活α1-肾上腺素受体(α1-AR)时，作为AMPK活性型(磷酸化型)的p-AMPK及PPAR-δ的蛋白质表达增加的蛋白质印迹结果。

图2a是通过免疫印迹，在基础4周龄对照组大鼠(I)、米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄对照组大鼠(Ⅳ)的骨骼肌中，确认α1-AR的蛋白质表达状态的结果，图2b至2e是通过免疫印迹，在所述大鼠组的心肌、骨骼肌、脂肪及肝脏中分别确认AMPK-PPAR-δ-PGC1α的蛋白质表达状态的结果。

图3a是在基础4周龄大鼠(I)、米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄对照组大鼠(Ⅳ)的骨骼肌中测量SDH(succinate dehydrogenase)酶活性度的结果，图3b是在所述组的骨骼肌组织中，对细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)的免疫组织化学染色的结果。

图4是以ELISA方法，在基础4周龄大鼠(I)、米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄对照组大鼠(Ⅳ)的心肌、骨骼肌及肝脏中测量ATP水平的结果。

图5是在小鼠骨骼肌细胞(C2C12细胞)中确认米多君对胰岛素的葡萄糖吸收产生的效果的结果。

图6是测量由4周龄大鼠构成的3个组的1个月间心脏搏动数的结果。

图7是在大鼠组的肝脏中确认HMG-CoA reductase蛋白质(HMGCR)的表达水平的结果。

图8a是确认脂肪细胞内脂肪含量的结果，图8b是确认米多君对抑制脂肪合成/蓄积的PPAR-δ、p-AMPK、PGC-1α蛋白质表达产生的效果的结果。

图9是确认米多君对体重(A)及腹部脂肪量(B)产生的效果的结果。

具体实施方式

下面为了帮助本发明的理解，列举实施例进行详细说明。不过，下述实施例只是对本发明内容进行举例，并非本发明范围限定于下述实施例。本发明的实施例提供用于向该技术领域的技术人员更完整地说明本发明。

实施例1：细胞培养及动物实验准备

1-1：细胞培养

大鼠骨骼肌细胞株(L6)、小鼠心肌细胞株(HL1)及小鼠脂肪前体细胞株(3T3-L1)在37℃CO2培养器内，将各细胞分株于6孔板(well plate)或24孔板。

然后，L6及HL1细胞在包含10％FBS(fetal bovine serum)、1％抗生剂的培养基(DMEM)中，在培养皿底面生长直至达到80％左右饱和后，将培养基更换为包含1％FBS的培养基，分化4天时间，在分化第三天进行药物处理。利用L6及HL1细胞的所有in vitro实验，在药物处理后24小时后执行。

3T3-L1细胞在包含10％FBS(fetal bovine serum)、1％抗生剂的培养基(DMEM)中，生长至100％全部充满培养皿底面后，更换为新培养基后再培养48小时，然后加入分化培养基和药物，培养48小时时间。分化培养基的组成如下：0.0125umole/ml地塞米松(dexamethasone)，12.5umole/ml 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine)，10ug/ml胰岛素(insulin)，10％FBS。分化培养基处理48小时时间后，更换为含有10ug/ml胰岛素和10％FBS的胰岛素培养基，处理48～96小时时间。然后，更换为只含有10％FBS的普通培养基，培养24～48小时时间后进行实验。

1-2：动物实验

自发性高血压大鼠(Spontaneously HypertensⅣe Rat；SHR)作为表达了遗传性高血压的实验动物，被认为表达与人类原发性高血压最类似的高血压。SHR大致在4～6周龄血压开始上升，在8～12周龄，高血压正式表达。SHR经常伴随诸如心脏肥大、心功能不全及肾病等的高血压性标靶脏器的损伤，因而作为原发性高血压，特别是作为具有心脏病变的高血压的动物模型，广泛用于相关研究。

将3周龄的自发性高血压大鼠(SHRs)在标准化的条件(21℃、41％至62％湿度)下放置，且施加规则的昼/夜(10/14小时)周期，使之自由接近水及食物。所有动物实验按高丽大学动物科学规则执行(KUIACUC-2012-100)。实验过程及容纳条件受到高丽大学动物实验委员会的认可。

适应1周后，大鼠如下分配到四组之一(每组6只大鼠)：组I(基础对照组(basalcontrol)，在4周龄杀死)，组Ⅱ(米多君给药4周时间)，组Ⅲ(阿替洛尔(atenolol)给药4周时间)，及组Ⅳ(在4周期间未给药的对照组(control))。组I及组Ⅳ不进行任何药物给药，给予标准维持食物(K-H4颗粒，sniff)，组Ⅱ给予包含米多君的饮用水(0.3mg/kg/d)以及相同的食物，组Ⅲ给予包含阿替洛尔的饮用水(1mg/kg/d)以及相同的食物。

组I中的大鼠在4周龄实施安乐死，相反，其他组的大鼠在4周期间给予处方药物后，在8周龄实施安乐死。血液样本从下腔静脉采集，心脏、大动脉、肝脏、骨骼肌肉及内脏脂肪(腹部脂肪)整齐地切开并用于实验。收集的脏器在-80℃冰箱或用于浸泡固定的10％福尔马林中保管。

实施例2：实验方法

2-1：用于ATP测量的ELISA方法

将从实施例1-2的大鼠分离的肝组织0.02g，在500μl的PBS中进行均质化。将均质液在1500×g(或5000rpm)下离心分离15分钟时间后，对上清液执行测量。将基准物质或样本100μl，喷洒于抗体预先涂布的微量滴定板中的适当井孔后，将残余溶液10μl添加于样本。将50μl的结合物添加于各井孔并混合后，将盖上盖子的板在37℃下培养1小时时间。分别将50μl的基质A及B添加于各个井孔，在37℃下培养15分钟时间。在各个井孔中添加静止溶液后，使用微孔板判读器，在450nm下测量光学密度。

2-2：SDH(succinate dehydrogenase，琥珀酸脱氢酶)酶活性度测量

在井孔内按每PBS(phosphate buffer saline)溶液1ml添加蛋白质分解酶抑制剂混合物10μl，准备成每井孔达到500μl，将混合1M磷酸缓冲溶液25μl×25＝625μl、0.2M琥珀酸钠125μl×25＝3125μl、NBT 25μl×25＝625μl、D.W 235μl×25＝5875μl而制成的培养溶液准备成每井孔达到410μl，在反应20分钟之前，加热到37℃。在从实施例1-2的大鼠分离的骨骼肌肉组织每0.02g上，加入预先准备的PBS 500μl，用粉碎机磨碎，且在短时间内分开磨碎，以防止温度上升、酶被破坏。在13000rpm、4℃下离心分离5分钟时间后，收得上清液，移入新试管。将培养溶液410μl预先放入试管，加入样本90μl，使之发生酶反应。在另外的试管中加入蒸馏水(DW)410μl，添加样本90μl后，测量了稀释液的吸光度。将前面准备的酶反应试管和其他试管分别放入37℃水中，反应30分钟时间后，将试管插入冰中，使反应终止，然后在96孔板中各喷注200μl，利用550nm测量吸光度，将结果值应用于如下公式，计算琥珀酸脱氢酶(SDH)的酶活性度。

酶活性度＝(酶反应吸光度值-酶液稀释液吸光度值)/蛋白质定量值(布拉德福德595nm)

2-3：蛋白质印迹

蛋白质在利用PREP^TM蛋白质提取溶液(iNtRON Biotechnology,Seongnam-si,Gyeonggi-do,Korea)而从细胞收取后，将蛋白质20～30ug加载于10％SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)胶上并分离后，转移(transfer)到硝化纤维纸(GEHealthcare，英国)。分离膜在包含5％(w/v)脱脂牛奶、0.05％(v/v)tween-20的TBS(Tris-buffered saline)中，在4℃下封闭(blocking)一夜或在室温下封闭2小时时间后，投入AMPKα(全体形态的α亚单位)、磷酸化的AMPKα(在Thr172下磷酸化)、对PPAR-δ及PGC-1α的1次抗体(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA,USA)，在室温下培养2小时或在4℃下培养一夜后，利用结合了辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)的抗-兔2次抗体(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)使之反应。检测试剂(detectionreagent)使用Clarity Western ECL Substrate试剂盒(Bio-rad,Hercules,CA,USA)。影像使用Kodak GBX显像及固定试剂(Kodak,Rochester,NY,USA)而手动取得。X-线胶片从Agfa(Mortsel,Belgium)购入。细胞来源各蛋白质的含量使用布拉德福德方法测量。

2-4：细胞内葡萄糖吸收率测量

在以实施例1-1的方法培养的小鼠骨骼肌细胞(C2C12细胞)中，分别进行胰岛素100μM/L、米多君30μM/L、米多君30μM/L及胰岛素100μM/L混合物(1:2(w/w))处理后，利用2-脱氧葡萄糖(2-deoxy glucose)测量了葡萄糖吸收(uptake)水平。

2-5：心脏功能及体重测量

对实施例1-2的8周龄大鼠肌肉注射舒泰(zoletil)(8mg/kg)及xylzine(2mg/kg)进行麻醉后，将大鼠倒向左侧放置，获得M型超声影像。所有检查使用具备12MHz换能器的vivid 7(GE Medical Systems,Milwaukee,WI,USA)执行。在乳头肌水平取得关于左心室的最佳二维缩短影像后，在执行M型跟踪的同时，执行心电图记录，按100mm/s的速度记录。从对M型跟踪的至少3次连续心脏周期，利用超声波心动描记术，应用(American Society forEchocardiography)测量方法，测量了心脏壁厚度、左心室射血分数(收缩功能)及质量。

体重以与所述测量心脏功能的大鼠相同的大鼠为对象进行了测量。

另外，以实施例1-2的4周龄大鼠为对象，经过1个月，测量了心脏搏动数。

2-6：血液生化学及脂联素测量

为了从实施例1-2的大鼠来源血液，测量总胆固醇、HDL(high densitylipoprotein，高密度脂蛋白)胆固醇、LDL(low density lipoprotein，低密度脂蛋白)胆固醇及甘油三酯的浓度，使用了酶显色法(罗氏诊断有限公司，德国曼海姆)。

实施例1-2的大鼠来源血液内脂联素，使用大鼠脂联素检测ELISA试剂盒(艾伯特，剑桥，英国)进行了测量。测量的脂联素水平相对于内脏脂肪重量(g)进行了定量。

2-7：抑制脂肪细胞脂肪含量的确认

使以实施例1-1的方法培养的小鼠来源脂肪前体细胞(3T3-L1)分化成脂肪细胞后，分别进行米多君30μM/L、米多君30μM/L及GSK0660(PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor)β/δinverse agonist)50μM/L混合物(1:2(w/w))处理后，利用显微镜(OLYMPUS IX71)目视观察脂肪细胞内脂肪含有程度。

2-8：统计分析

连续的变数记录为平均±标准偏差(SD)。横跨4个组的变数的全部差异值，使用秩和(Kruskal-Wallis)检验进行了分析。两个组之间的差异值使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U)进行了评价。不足0.05的p-数值视为在统计上有意义。所有统计分析使用SPSS(ver.20.0；SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)执行。

实施例3：实验结果

3-1：在in vitro中对骨骼肌细胞或心肌细胞给药米多君时，对AMPK磷酸化的效果验证

为了在in vitro中确认对AMPK及AMPK磷酸化(激活)的α1-AR刺激效果，在实施例1-1中培养的小鼠骨骼肌细胞株(C2C12)和小鼠心肌细胞株(HL1)中，利用作为α1-AR激动剂的米多君30μM进行处理后，以实施例2-3的方法执行了蛋白质印迹。

其结果如图1的(A)及图1的(B)所示，骨骼肌细胞的AMPK借助于α1-AR刺激而表达，磷酸化的AMPK表达根据米多君浓度而增加，可知α1-AR刺激与AMPK激活有关。另外，因米多君给药引起的α1-AR刺激，除骨骼肌之外，在心肌细胞中也以相同形态出现AMPK的表达及磷酸化反应。

如上所述，米多君在骨骼肌肉进行作用而出现的变化(AMPK激活)，在心肌中也一样，在提高原来已知的心肌收缩功能的同时出现(AMPK激活+心肌收缩增加)，因而可知，由于α1-AR刺激，出现了追加的心肌运动效果。即，在in vitro实验中，迄今仅仅了解了只单纯增加心肌细胞收缩力的可能性，但在本实施例的结果中，在骨骼肌及心肌细胞中，AMPK增加及磷酸化增加，预想了运动效果相关作用。

3-2：心肌、骨骼肌、脂肪及肝脏中AMPK、PPAR-δ、PGC-1α蛋白质表达验证

为了在骨骼肌中确认α1-AR的存在，在基础4周龄对照组大鼠(I)、米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄对照组大鼠(Ⅳ)的骨骼肌中，针对α1-AR的蛋白质表达状态，以实施例2-3的方法执行免疫印迹并确认，结果如图2a所示，在组Ⅳ中，α1-AR出现最高的表达。

另外，在所述4组的大鼠来源心肌、骨骼肌、脂肪及肝脏中，针对AMPK、PPAR-δ、PGC-1α蛋白质的表达状态，分别以实施例2-3的方法执行免疫印迹并确认，结果如图2b(心肌)、图2c(骨骼肌)、图2d(脂肪)及图2e(肝脏)所示，在心肌的情况下，磷酸化的AMPK蛋白质的表达为组I高于组Ⅳ(p<0.05)，米多君给药组Ⅱ与对照组组Ⅳ相比，在心肌、骨骼肌、脂肪中出现显著更高的AMPK表达，但阿替洛尔给药组Ⅲ与同龄对照组组Ⅳ相比，在相应器官中未出现更高的AMPK蛋白质表达。

特别之处在于，在心肌中，与AMPK增加相比，PGC-1α和PPAR-δ的增加远远更大，但在骨骼肌中，与AMPK增加相比，PGC-1α和PPAR-δ的增加远远更小。这意味着，心肌的运动效果在AMPK激活的同时直接使PGC-1α和PPAR-δ的表达增加，相反，骨骼肌由于运动相对不多，因而与AMPK相比，PGC-1α和PPAR-δ不增加。

3-3：骨骼肌的线粒体氧化酶表达变化

以实施例2-2的方法，在骨骼肌中测量了作为线粒体氧化过程(TCA回路)酶的SDH酶活性度，结果如图3a所示，可知在米多君给药组Ⅱ中增加最高。

另外，针对作为线粒体氧化过程酶的细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)，在骨骼肌组织中进行了免疫组织化学染色，结果如图3b，可知在米多君给药组Ⅱ中增加最高。

从这种结果可知，米多君增进代谢作用。

3-4：组织内ATP水平比较

针对基础4周龄大鼠(I)、米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄对照组大鼠(Ⅳ)，在心脏、骨骼肌及肝脏中，利用ELISA方法，以实施例2-1的方法测量ATP水平并进行了比较。

结果，如图4所示，在米多君或阿替洛尔给药组的心脏组织中，尽管心脏的更高收缩活性，但观察到ATP水平高于对照组SHRs的数值。

3-5：细胞内葡萄糖吸收效果验证

在小鼠骨骼肌细胞(C2C12细胞)中，确认了米多君对胰岛素的葡萄糖吸收产生的效果，结果如图5所示，确认了与单独使用胰岛素相比，当处理胰岛素与米多君的混合物时，葡萄糖吸收率显著增加。

从这种结果可知，米多君对治疗糖尿病有效。

3-6：在in vivo动物模型中，对心脏功能及体重的米多君给药效果验证

米多君给药时，如果在in vivo心肌中，AMPK、PPAR-δ(Peroxisome Proliferatoractivated Receptor-δ)及PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorGamma CoactⅣator-1α)增加，则可以视为在骨骼肌中运动效果已经证明的AMPK-PPAR-δ-PGC1α同时表达级联反应，对提高心肌收缩功能产生影响，因而以实施例2-5的方法，在invivo中确认了心脏功能及体重。

结果，如下述表1所示，从8周龄大鼠的超声搏动数据显示出，米多君给药大鼠组Ⅱ及阿替洛尔给药大鼠组Ⅲ的左心室性能高于未给药对照组Ⅳ的相应数值。

左心室质量在组Ⅱ中最低，但心脏质量在组之间未观察到有意义的差异，组Ⅲ出现最高体重。

另外，在由4周龄大鼠构成的3个组(蓝色：对照组，红色：米多君给药组，绿色：阿替洛尔给药组)中，经1个月测量了心脏搏动数，结果，在实验末尾，阿替洛尔组最低(图6)。

【表1】

3-7：对脂联素表达及脂肪变化曲线的米多君给药效果验证

以实施例2-6的方法确认了米多君长期给药对脂联素(adiponectin)表达及脂肪变化曲线产生的效果。

为了确认α1-AR刺激如何激活AMPK，测量了作为AMPK上游分子的脂联素水平，结果如下述表2所示，与组Ⅳ相比，组Ⅱ每内脏脂肪重量单位，出现显著最高的血清脂联素水平。

【表2】

如图2e所示，肝脏中磷酸化AMPK蛋白表达，与大动脉、骨骼肌、脂肪等的其他脏器结果类似，在组Ⅱ中最高，在组Ⅳ中相对较低。另外，如图7所示，在肝脏中，作为AMPK下部衔接要素的胆固醇合成酶HMG-CoA reductase蛋白质(HMGCR)的表达，在组Ⅱ、III中最低，在作为对照组的组Ⅳ中较高。

与实际血液中的脂肪变化曲线相关联，如下表3所示，总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇与药物给药组(组Ⅱ及Ⅳ)相比，在对照组(组I及Ⅳ)中更高，但甘油三酯水平在各组之间没有什么差异。

从这种结果可知，米多君对治疗高血脂症有效。

【表3】

3-8：脂肪细胞脂肪含有抑制、体重及腹部脂肪减少效果验证

对脂肪前体细胞(3T3-L1)进行米多君处理，结果如图8a所示，在脂肪细胞中的脂肪含量减少，添加GSK0660(PPAR(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor)β/δinverse agonist)50μM/L的混合物(1:2(w/w))时，米多君的效果减小。另外，将经米多君处理的脂肪细胞，以实施例2-3方法进行免疫印迹，结果如图8b所示，对脂肪合成/蓄积进行抑制的PPAR-δ、p-AMPK、PGC-1α蛋白质表达增加。

在实施例1-2的米多君给药大鼠(Ⅱ)、阿替洛尔给药大鼠(Ⅲ)及未给药8周龄高血压对照组大鼠(Ⅳ)中分别测量了体重，测量了摘除的腹部脂肪(内脏脂肪)的重量，结果如图9所示，在米多君给药时，体重和腹部脂肪均减少。

从这种结果确认了在使用米多君时，血糖减少，而且同时出现体重减少、心功能不全预防效果。

另外可知，作为α1-AR激动剂的米多君或其药学上可接受的盐所引起的α1-AR刺激，在骨骼肌及肝脏中引起在运动时出现的生理效果，在不伴随心脏肥大或血压上升的同时，提高左心室的射血分数，在自发性高血压大鼠早期生活中的初期高血压时期，使生化反应发生变化。这与直接受刺激的心肌收缩、心脏运动-类似效果及AMPK激活相关联。

前述本发明的说明只是示例，在不变更本发明技术思想或必需特征的情况下，能够容易地变形为其它具体形态，这是本发明所属技术领域的技术人员可以理解的。因此，以上记述的实施例，应理解为在所有方面只是示例性的，而非限定性的。

Claims (14)

1.一种用于糖尿病治疗或预防的药学组合物，其特征在于，包括米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述米多君或其药学上可接受的盐诱导AMPK激活。

3.根据权利要求1所述的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述米多君或其药学上可接受的盐诱导PPAR-δ或PGC-1α的表达。

4.根据权利要求1所述的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物追加包含胰岛素。

5.根据权利要求4所述的用于糖尿病治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述药学组合物相对于药学组合物全体重量份，包含米多君或其药学上可接受的盐20至40重量份；及胰岛素60至80重量份。

6.一种糖尿病治疗方法，包括将米多君或其药学上可接受的盐，其特征在于，以药剂学上有效的量向个体给药的步骤。

7.一种用于糖尿病治疗或预防的药剂制备所需的米多君的用途。

8.一种包含米多君的降血糖用保健食品。

9.一种用于高血脂症治疗或预防的药学组合物，其特征在于，包括米多君或其药学上可接受的盐作为有效成分。

10.根据权利要求8所述的用于高血脂症治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述米多君或其药学上可接受的盐诱导AMPK激活。

11.根据权利要求8所述的用于高血脂症治疗或预防的药学组合物，其特征在于，

所述米多君或其药学上可接受的盐诱导PPAR-δ或PGC-1α的表达。

12.一种高血脂症治疗方法，其特征在于，包括将米多君或其药学上可接受的盐，以药剂学上有效的量向个体给药的步骤。

13.一种用于高血脂症治疗或预防的药剂制备所需的米多君的用途。

14.一种包含米多君的高血脂症改善用保健食品。