CN109913539A - 一种靶向捕获hla基因序列并测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法，包括：1)将变性后的核酸样品与固定于固相载体的核酸探针文库在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子‑探针‑固相载体膜复合体；2)用清洗液清洗步骤1)中结合目标核酸的“探针‑固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后或富集后再进行构建，即得核酸文库；3)将步骤2)所富集得到的或富集后再进行构建的核酸文库用于高通量测序。本发明可快捷地产生高倍数覆盖、单碱基位移的、用于富集HLA基因的核酸探针不可移动地固定于固相载体膜上，且本发明具有操作简便，探针获取灵活，成本低廉的特点，有利于HLA基因型鉴定准确率提高，快速便捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体提供一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法。
背景技术
人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen,HLA),也称主要组织相容性抗原(Major Histocompatibility Complex,MHC),该复合体是目前已知的最复杂的人类基因系统，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb，含有224个基因座，有几十个基因座位，且呈共显性表达，是目前所知人体最复杂的遗传多态系统。同时，每个基因座位又有几十个等位基因，如HLA-I类家族中与免疫排斥相关的A基因、B基因和C基因，分别含有3657、4459、3290个等位基因。HLA表达于人体细胞膜表面，代表每个个体的抗原特异性。因此，HLA与机体免疫系统密切相关，器官或骨髓移植后产生免疫排斥反应的主要原因是HLA配型不合。此外，该类抗原还与免疫功能紊乱、疾病易感性、癌症以及药物反应等密切相关。因此，HLA分型在移植医学、癌症、疾病易感性研究等领域中有着广泛的应用。
纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是由分辨率及准确性较低的血清学鉴定方法。90年代以来，随着分子技术的发展和现代医学需求的提高，HLA进入了分子水平研究阶段，进入到了分辨率及准确性较高的基因分型的发展过程。目前常用的基因分型技术是随着聚合酶链扩增技术(PCR)的应用发展起来的，主要包括限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性寡核甘酸探针(PCR-SSO)、序列特异性引物(PCR-SSP)、基因芯片以及直接测序分型(PCR-SBT)等(何丽,魏茂提,王世鑫.HLA分型方法的研究进展.免疫学杂志,2006(z1):90-93.)。
PCR-RFLP是最早出现的HLA基因分型方法，较血清学方法有精确性好、操作相对高效的特点，而分辨率低、流程复杂是限制其发展的主要因素。PCR-SSP方法是设计一系列特异性引物对扩增出特异基因型别的DNA片段，依据电泳条带判定型别；该方法操作简便，结果易判；然而，随着新等位基因的不断发现和高分辨率需求的提升，需设计出大量序列特异性引物导致成本增高，且易产生模棱两可的结果。PCR-SSO技术通过特异性引物扩增HLA多态性位点，将扩增产物与特异性探针杂交判定型别，该方法灵敏、简便，其不足之处和PCR-SSP相似，需设计一系列探针以获得相对高分辨率分型。PCR-SSO与PCR-SSP是目前低、中分辨率HLA基因分型的主要方法。PCR-RFLP/PCR-SSO/PCR-SSP技术需要根据已有HLA序列设计引物、探针或选择限制性内切酶，无法检出新等位基因，且分辨率有限，而PCR-SBT可较好地解决这些问题。PCR-SBT通过PCR扩增HLA基因片段并对产物测序确定其基因型，是精确、高分辨率并能发现新等位基因的分型方法，为公认的HLA分型金标准，但本方法易出现模棱两可的结果。以上HLA基因分型方法各有优势，但也存在不足，无论从科研或临床应用考虑均期待高效、高分辨率、低廉价格的HLA分型方法出现(邹森,洪坤学.基于二代测序技术的HLA基因分型进展.检验医学与临床,2017,14(1):144-146.)。
随着第二代测序的发展，基因组测序成为了高通量、高深度鉴定相关位点变异，进而识别潜在疾病的最主要手段，同时在科研上具有广泛的应用。在医学诊断上，高通量测序可直接获得大量相关位点变异信息，对于精准医疗具有重大意义。同样，对于HLA分型，具有得天独厚的优势，能同时获得HLA基因的高分辨率分型结果，大大降低模棱两可的概率，真正实现高分辨率分型。然而，类似于HLA基因，占人全基因组的比例不足0.1％，目标只占总体的一小部分，虽然人全基因组测序可以实现HLA分型，但所需要的的测序深度较高，成本巨大。
DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，可将基因组目标区域或感兴趣的目标核酸富集后，提高靶区域所占比例。因此，通过DNA靶向富集技术，富集特定疾病相关目标区域，如人外显子组，或者HLA基因，可大幅降低测序成本，潜力巨大。如外显子组测序，仅实现约占人基因组全长的1％-2％左右的序列的测序(测序结果同样可以对HLA进行分型)，通过捕获后测序，获得外显子区域的序列信息，相较于全基因组测序，成本降低50-100倍。而对HLA基因区域进行捕获，富集出占全基因组0.1％的HLA基因序列，则大幅降低测序成本，同时实现高分辨率的HLA分型。
目前基于二代测序的HLA分型技术，主要为两种，一种为长片段扩增后进行高通量测序，一种为靶向捕获后测序。扩增后测序技术技术较为繁琐且通量低，因为HLA基因较多，因此需要多对引物进行扩增，并对引物进行优化，并且容易出现Drop-out，操作不便。而靶向捕获可一次性针对多基因、多样品，一次性实现所有样品的测序，简洁方便快速。
目前基于靶向捕获的HLA分型技术，目前有基于固相载体芯片的富集与基于固相载体磁珠的富集技术。用于核酸杂交的固相载体如玻璃，平板，平皿，微球等均需对固相载体进行修饰后，方可特异性结合核酸，如磁珠，需要对磁珠进行修饰后，进而特异性结合核酸。但核酸的结合具有方向性，所能结合的探针量较低，如目前市场化的基于磁珠靶向核酸分子富集产品，其中某一产品的特性为每毫克磁珠可结合20微克双链DNA，而每毫克磁珠价格在240元左右。而固相载体膜类如尼龙膜和醋酸纤维膜等膜纸类固相载体，均具有较强的核酸吸附能力，如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600微克核酸，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100微克核酸，同时核酸与膜的结合不需要方向性，因此不必对核酸探针进行修饰。而市场上评价最高的带正电的尼龙膜，每平方厘米的价格则在0.3元左右。
同时，由于靶向富集技术的不同，造成探针量、探针来源和探针制备方法等也不同，不仅会造成对目标核酸多样性造成影响，同样会对成本造成影响。已有报导的其他通过富集技术对HLA分型的方法，均需通过人工合成的方式，合成经修饰的单链核酸探针，同时制备经修饰的固相载体。其富集过程也多为先形成核酸探针：靶核酸复合体，再通过核酸复合体：载体富集，获得富集后的靶核酸序列。复合体与载体的结合，则通过核酸探针与固相载体的修饰基团，因此，不可避免的进行探针修饰与固相载体特定基团包被等，故而提高捕获成本，造成步骤的繁琐。
WO 2012083240 A2公开了一种基于芯片杂交并对HLA分型的技术，该方法中，利用合成的探针(17-60nt)对样品中的cDNA进行杂交，并对杂交的信号进行检测，进而直接分析出HLA的基因型。该方法中，探针采用合成的方式，长度短，杂交效率不高，会造成背景高，导致分型准确率低，同时合成的方式，增大了成本，操作不灵活。
US 2016/0312281 A1公开了一种基于磁珠捕获HLA基因并鉴定基因型的技术，该方法中，探针是靶向HLA基因非编码区序列，进而连带将HLA编码区序列富集，之后进行测序并对编码区序列进行分析与基因分型。该方法中，所采用磁珠捕获的方法，需要人工合成探针序列，成本较高。其次，探针所靶向的区域，为HLA非编码区序列，而不是直接为具有分型信息的编码区序列，会造成编码区比例低，大部分为无信息的非编码区序列，造成浪费。
目前以尼龙膜或醋酸纤维膜或类似物等固相载体膜类为介质进行HLA基因的富集，并进行高通量测序，还尚无该方面报道及研究。
发明内容
针对以上技术现状，本发明目的是提供一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法，所述方法包括：
1)将变性后的核酸样品与固定于固相载体的核酸探针文库在杂交条件下，进行杂交，形成目标核酸分子-探针-固相载体膜复合体；
2)用清洗液清洗步骤1)中结合目标核酸的“探针-固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后或富集后再进行构建，即得核酸文库；
3)将步骤2)所富集得到的或再进行构建得到的核酸文库用于高通量测序。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中目标核酸分子与所述核酸探针文库中的核酸分子在杂交条件下结合。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中变性后的核酸样品中含有目标核酸分子，其中所述目标核酸分子为HLA基因来源的核酸分子。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中核酸样品在杂交前由双链核酸经过变性后产生单链核酸样品。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中核酸探针文库由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列衍生而来。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中靶向HLA基因的核酸探针文库由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列衍生而来，其序列相似度与HLA基因的cDNA大于或等于80％。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中所述的与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列可以由本领域技术人员采用本领域技术常识进行获取；作为实施方案之一、采用包括但不限于以下方法获取：通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取核酸序列，并进一步制备成核酸探针文库，或者通过人工合成带修饰或不带修饰的核酸序列。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中的生物合成方式，是指在生物体内，如细菌、酵母、哺乳细胞等，以DNA为模板，通过生物体内一系列的酶促反应，进行DNA的合成。该方式是最为基础的、常用的生物学手段，如质粒的扩增、文库扩增等，利用生物体的生物学特性，快速方便的获得大量核酸分子。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中转化含有与HLA核酸序列相同、互补、或相似的、能在宿主细胞内合成的核酸分子，到细胞内并培养，提取并纯化在宿主细胞内经生物合成的核酸分子，例如，质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒DNA，本领域技术人员可以根据本领域技术常识，由以上所提示例，但不限于此，获得大量由生物合成方式得来的与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列；
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中所述的生物酶促反应是指在体外基于体内合成、加工核酸的原理，利用生物酶在体外以核酸为模板进行核酸的合成，如利用DNA聚合酶、逆转录酶等，此类方法最经典的代表为聚合酶链式反应(PCR)，和/或利用生物酶对核酸进行加工，如核酸酶、限制性内切酶等。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中例如，聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶切、RNA反转录方式获得所述与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列。本领域技术人员可以根据本领域技术常识，由以上所提示例，但不限于此种方式，获得生物酶促反应方式得来的与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列；
本发明方法中，所述步骤1)中由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列制备用于捕获的核酸探针文库，所述制备包括但不限于如下：1.若与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列片段较长，如超过10kb，则先通过片段化，使核酸的片段优选在20bp-10kb之间，进一步优选150bp～800bp的片段；后通过物理或化学方式变性核酸，生成用于富集HLA基因序列的核酸探针文库；2.若核酸片段处于20bp-10kb之间，进一步优选150bp～800bp的片段；则直接通过物理或化学方式变性核酸，生成用于富集HLA基因的核酸探针文库；3.可通过转录的方式，由靶向HLA基因的核酸文库制备用于富集HLA基因的核酸探针文库。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列制备用于捕获的核酸探针文库，片段化的方法可为，例如，采用物理、化学、光化学或生物酶法片段化的方法进行片段化，作为实施方案之一，超声波打断、HydroShear、酶切、化学试剂断裂或以上方法的联合使用。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中，通过物理或化学手段变性产生核酸探针文库的方法为，作为实施方案之一，碱变性法、高温加热后骤冷或以上方法的联合使用。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中，还包括通过转录的方式，由靶向HLA基因的核酸文库制备用于富集HLA基因的核酸探针文库，是指所述与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸分子经片段化或不经片段化后，在核酸分子一端或两端连接启动子序列，RNA转录酶可识别该序列并能在体外进行转录生成核酸，作为示例性说明，如T7启动子可被T7RNA聚合酶结合，并在体外进行RNA的合成
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中，由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列制备而来的核酸探针文库，其长度可变，范围优选在20bp-10kb之间。
本领域技术人员根据本领域技术常识可知，目前所述的由人工合成的用于富集目标序列的单链核酸探针，长度具有局限性，一般为20nt-100nt之间，且分辨率取决于合成的探针量。
而在本发明方法中，可通过对核酸文库进行物理或化学方式片段化，片段化的长度可控，因此产生的用于捕获的核酸探针文库针对HLA区域具有甚至大于500倍的高倍数覆盖、单碱基位移的特点，实现高丰度及高多样性HLA基因的富集。
本发明方法中，作为实施方案之一、所述步骤1)中的靶向HLA基因的核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：
1-1)获取并纯化具有与HLA基因序列互补或高度同源序列的基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人工合成序列、酶切产物、PCR产物、DNA转录产物、RNA反转录所得的核酸片段，经片段化或不经片段化，形成20bp～10kb片段范围；优选150bp～800bp的片段；片段化方式为物理、化学、光化学法或生物酶等方式；优选物理法如超声法、HydroShear和/或生物酶法如酶切法。
1-2)将步骤1-1)取得的片段通过物理或化学方式变性，即得用于捕获的核酸探针文库。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中用于衍生探针文库的与人白细胞抗原(HLA)基因cDNA序列相同、互补、或相似的核酸序列来源于HLA-A*01:01:01,B*08:01:01、C*16:01:01、DPA1*02:01:01,DPB1*01:01:01、DQA1*01:03:01、DQB1*03:02:01、DRA*01:01:01,DRB1*13:03:01、DRB3*01:01:02、DRB4*01:03:01、DRB5*01:01:01、E*01:01:01或G*01:01:02的cDNA序列，或它们中的两种或两种以上组合物。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述物理方式变性，作为示例性的说明、如在煮沸下5分钟，后瞬间放置冰中冷却；作为另一实施方案之一，所述化学方式变性包括但不限于可以在室温、碱性条件下变性，得到核酸探针文库；作为实施方案之一、在碱性条件pH10-12下；作为示例性的说明、在0.4M NaOH和1.5M NaCl的碱性溶液的条件下进行变性。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中，将核酸探针文库变性后，通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜进行结合，形成“探针-固相载体膜复合体”。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中所述固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、或醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜；作为示例性的说明，例如包括但不限于带正电的尼龙膜或其衍生物膜、或带中性的醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或中性的纤维素纸或其衍生物膜。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)中，通常不同固相载体膜其所能结合探针的能力是不同的，例如每1cm2的尼龙膜上可结合400-600ug DNA序列核酸的探针，而每1cm2醋酸纤维薄膜上可结合80-100ug DNA序列核酸的探针，本领域技术人员可以根据本领域技术常识及具体使用的探针种类来确定探针的实际使用量，作为实施方案之一，固相载体膜上结合核酸探针的量为1ng-100ug/cm2。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)进一步包括将经转移至并吸附在固相载体膜上的用于捕获的核酸探针文库，通过例如物理、化学、光化学方式与固相载体膜牢固结合。
本领域技术人员可以根据本领域技术常识，选择不同的固定方式，最终使核酸探针以共价或非共价键与固相载体膜连接；作为实施方案之一，例如，核酸和带正电的尼龙膜形成共价键，在60℃-90℃的真空环境下，通过烘焙使核酸探针与固定相载体膜牢固结合；
本发明方法中，作为另一实施方案之一，在75℃-85℃下与固定相载体膜结合，作为示例性的说明，例如可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下使固定相与探针相结合；作为进一步实施方案之一，或通过紫外照射直至探针与固定相载体膜结合。
本发明通过物理或光化学手段使核酸探针和固定相非特异性、无方向性的结合，并使核酸位置不可变的固定于固相载体膜上。所述无方向性是指核酸探针与固相载体膜的结合，不需要一定是核酸的5’端或3’端与膜结合，而是核酸分子的任何部分都可以和固相载体膜结合，这与在固定相上合成探针、带修饰的探针和修饰的固相载体结合时是不一样的。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤1)中可选择地进一步包括预杂交，所述预杂交是指在未加入核酸样品前，将“探针-固相载体膜复合体”放入所述杂交液中进行预杂交。预杂交可以对固相载体膜进行位点阻断，减少富集时的非特异性核酸。预杂交加入的所述杂交液，本领域技术人员根据本领域技术常识，可加入(或不加入)其他具有提高富集效率的组分，作为实施方案之一，如鲑鱼精子DNA、BSA、Denhardt’s solution等，可对固相载体膜进行位点阻断，减少富集时的非特异性核酸。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤1)中的杂交液作为示例性的说明，优选包括但不限于：通用名称为Church and Gilbert buffer(主成分磷酸钠缓冲溶液、EDTA和SDS)、Modified Church and Gilbert buffer(主成分磷酸钠缓冲溶液、EDTA、SDS和/或BSA)、Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液、Denhardt’s solution和SDS)、含有甲酰胺的Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液和Denhardt’s solution、SDS和甲酰胺)或作为示例性说明、可将Denhardt’s buffer和含有甲酰胺的Denhardt’s buffer中的柠檬酸钠缓冲液更换为SSPE；作为示例性的说明，如Modified Church and Gilbertbuffer(主成分为磷酸钠缓冲溶液、EDTA、SDS和/或BSA)的杂交溶液、或Denhardt’s buffer(主成分为柠檬酸钠缓冲液、Denhardt’s solution和SDS)；作为进一步实施方案之一，所述杂交溶液中含有0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS；作为进一步实施方案之一，所述杂交溶液含有5x柠檬酸钠缓冲液(5x SSC),5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS的溶液。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤1)中，杂交需要在合适温度的杂交液中进行。杂交温度是根据所选择的杂交液进行调整，实现目标核酸分子与核酸探针在该温度和杂交液中能进行结合。温度范围为40摄氏度到70摄氏度，优选55到65摄氏度。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤1)中的核酸样品，若已经构建成为可以进行高通量测序的文库，则其核酸两端含有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列，即样品核酸分子具有核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的形式的序列特征。标签核酸序列是一段已知序列的核酸，用于区分不同的核酸文库，其真正意义上属于核酸接头的一部分，用于区分不同的核酸文库。作为示例性说明，如高通量测序对多个文库同时进行测序时，识别插入片段序列的样本来源，则是通过标签核酸序列。所述具有不同标签核酸序列的样品核酸是指，在富集过程中，可一次性对混合有多个不同样本的核酸文库进行富集，因此通过不同的标签核酸序列区分出核酸所源于的样本。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤2)中具体提高富集效率的组分，作为示例性的说明，包括但不限于如BSA、Denhardt’s solution、与核酸文库中的接头和/或重复序列互补的核酸分子、阻断固相载体膜位点的组分等，作为进一步实施方案之一，所述组分如结合核酸文库中的接头的核酸、human Cot-1 DNA、Homopolymer DNA等核酸组分，作为进一步实施方案之一，所述组分如BSA、BLOTTO、肝素等。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤2)中，清洗固相载体膜时，所用的清洗液为本领域常用的各种清洗液，本领域技术人员根据本领域技术常识可进行调整清洗液种类及清洗次数，达到降低由同源性较低导致的非特异性杂交的效果，作为示例性的说明，包括但不限于：主成分为磷酸钠缓冲液和SDS的清洗液、主成分为柠檬酸钠缓冲液(SSC)和SDS的清洗液与主成分为SSPE和SDS的清洗液，作为示例性的说明，如用0.02M-0.5M磷酸钠缓冲液/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；如用0.1x-2x SSC/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；或含有0.1x-2x SSPE/0.1％-2％(w/v)SDS的清洗液；作为实施方案之一，优选清洗液含有0.04M磷酸钠缓冲溶液/1.6％(w/v)SDS的清洗溶，清洗三次；作为另一实施方案之一，先用含有2xSSC和0.1％(w/v)SDS的溶液(温和型洗脱液)清洗，再用含有0.2x SSC/0.1％(w/v)SDS的溶液(中等型洗脱液)清洗，和/或用含有0.1x SSC/0.1％(w/v)SDS的溶液(剧烈型洗脱液)清洗。
本发明方法，作为实施方案之一，所述步骤2)中的洗脱溶液为水、TE缓冲溶液、0.4M NaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中将捕获的含有HLA基因序列的核酸文库从固相载体膜上的洗脱，是指将经富集后的核酸文库，从“探针-固相载体膜复合体”上分离，其本质是核酸的变性，即破坏探针核酸和目标核酸之间的杂交，变性成为独立的单链，核酸即被洗脱。
本领域技术人员根据本领域技术常识可用不同方法及洗脱液对目标核酸进行洗脱，作为示例性的说明，包括但不限于物理方法如在洗脱液中加热至80℃～100℃加热对经富集的核酸文库进行洗脱，化学方法如用pH值10-12的碱性洗脱液对经富集的核酸文库进行洗脱，或物理化学方法的联合使用，如在45摄氏度的0.4M NaOH溶液中洗脱，在100摄氏度0.1％(w/v)SDS溶液中洗脱；作为实施方案之一，进一步用加热至98摄氏度的水或TE缓冲液洗脱；作为另一实施方案之一，进一步用加热至45摄氏度的0.4M NaOH洗脱半小时。
本发方法中、所述清洗液的目的主要在于除去与探针核酸杂交不紧密的一些背景噪音，如降低由同源性较低导致的非特异性杂交；而洗脱液是使核酸从探针上洗掉。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中所述的含有HLA基因序列的核酸文库经洗脱后的纯化，通过本领域常规方式纯化，例如Beads、纯化柱，作为实施方案之一，使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)、Agencourt AMPure XP(Beckman CoulterCompany)进行纯化。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤3)中，如果富集得到的核酸序列满足于下游测序分析，则可不进行文库的扩增，如果核酸的量较少或核酸序列不满足测序所要求的序列形式，则需进行PCR扩增或桥式PCR扩增含有HLA基因序列的核酸文库，进而用于下游测序分析。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤3)中所述核酸文库可进行高通量测序是指所述文库可的序列特征符合高通量测序平台所要求的序列特征，具有接头序列和/或具有不同(或相同)标签核酸序列，本领域技术人员根据本领域技术常识针对不同的测序平台，通过，例如前期设计接头、扩增等方式，实现该平台所要求的序列特征。作为实施方案之一，例如illumina Hiseq2500平台，要求待测序的核酸序列具有核酸接头-插入片段核酸-核酸接头的序列特征，更进一步来说，核酸接头的序列特征为：P5序列-(标签序列)-测序引物序列-未知序列的插入片段-测序引物序列-标签序列-P7序列。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤3)中的高通量测序平台为illuminaHiseq2500，实现经过富集的含有HLA基因序列的核酸文库的高通量测序。
本发明方法中，作为实施方案之一，提供一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法(参见流程图1)，所述方法进一步包括如下：
(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获得含有与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补或相似的核酸序列，其相似度与HLA基因的cDNA达80％以上；
(2)将与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补或相似的核酸序列经片段化或不片段化，并变性制备成核酸探针文库，并转移至固相载体膜上；
(3)经物理和/或化学方式处理，使附着在固相载体膜上的核酸探针与固相载体膜牢固结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；
(4)将预杂交或未经预杂交的“探针-固相载体膜复合体”放入杂交液中；
(5)将含有HLA基因序列的核酸样品文库变性；
(6)将变性后的含有核酸样品文库的溶液，加入到含有“探针-固相载体膜复合体”的杂交液中，并加入具有提高富集效率的组分，在杂交温度范围为40摄氏度到70摄氏度下，进行HLA基因序列的富集；
(7)用清洗液清洗经杂交后的固相载体膜；
(8)用洗脱液从固相载体膜上洗脱并纯化核酸，得到经富集的核酸文库；
(9)所得的核酸文库，最终进行高通量测序。
本发明方法中，作为实施方案之一，本发明提供一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取并纯化含有与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列，其序列相似度与HLA基因的cDNA大于80％。核酸序列可为基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人工合成序列、酶切产物、PCR产物、DNA转录、RNA反转录所得的核酸片段；
(2)将所述核酸片段制备生成核酸探针文库，若核酸片段较长，如超过10kb，则先通过片段化；若核酸片段处于20bp-10kb之间，则直接进行步骤(4)，或通过转录的方式，由核酸片段转录生成用于富集HLA基因序列的核酸探针文库；
(3)将步骤(2)较长的核酸片段通过酶切、超声波等技术手段进行片段化，片段化范围为20bp-10kp；优选150bp-800bp；
(4)将核酸片段通过加热/骤冷变性或碱变性法变性15分钟，使核酸片段成为核酸探针文库；
(5)将包含探针核酸的溶液直接转移到所述固相载体膜上；
(6)将步骤(5)的固相载体膜，放入真空箱中，真空下室温使其自然干燥约40分钟或至干燥，使探针核酸固定至固相载体膜；
(7)将步骤(6)的固相载体膜，在真空箱中，真空状态下80℃烘焙1-2小时，优选1小时，使单链核酸探针与固相载体膜牢固结合；
(8)将步骤(7)的固相载体膜，转移至含有杂交液的杂交瓶中，置于65摄氏度杂交箱中，进行预杂交，时间取决于所使用的固相载体膜，作为示例性说明，如尼龙膜可以为30分钟，醋酸纤维膜可以为6小时；
(9)在98摄氏度变性含有HLA基因序列的核酸样品与阻断剂探针，所述核酸文库若含有接头序列和或标签核酸序列、具备进行高通量测序的序列特征，则所述阻断剂探针是与所述核酸文库中的接头序列互补的单链核酸，取出后立即置于冰上，保持核酸变性状态；(10)将步骤(9)变性后特定核酸文库，转移至步骤(8)的杂交瓶中，在杂交箱中65摄氏度旋转过夜；
(11)将步骤(10)杂交后的固相载体膜，转移至含有10倍于固相载体膜体积的清洗液密封管中，置于63摄氏度杂交箱中，清洗15分钟，共清洗三次；
(12)将步骤(11)清洗三次的固相载体膜，转移至含有500ul 1xTE缓冲液的1.5ml离心管中，置于100摄氏度水浴中，煮沸5分钟，使富集后的DNA洗脱；
(13)将步骤(12)的固相载体膜取出，后将离心管液体置于室温冷却，所得溶液含有所述的经过富集的含有HLA基因序列的核酸文库；
(14)将步骤(13)的核酸文库纯化并处理为可进行高通量测序的文库，后用于高通量测序。
本发明的有益效果包括如下：
(1)本发明采用通过生物合成方式和/或生物酶促反应获取并制备具有与HLA基因序列互补或相似度达80％以上的核酸探针文库，用于HLA基因的富集并进行下游测序。本发明所采用的HLA分型技术与传统HLA分型技术相比，具有通量高、高分辨率、一次性捕获多个HLA基因的优势，简单快捷，省时省力，并且成本与目前现有技术持平甚至更低。
(2)本发明所采用的靶向核酸富集技术，与现有的核酸富集技术相比，更易操作，成本更低。
首先，探针的获得方式是由生物合成方式和/或生物酶促反应获得而来的，可从已有的生物体或核酸分离得到，进而制备成核酸探针文库，如生物合成方式，通过提取在特定宿主细胞中经生物合成的、具有与HLA基因序列互补或相似度达80％或以上的核酸片段(如基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体及以上各种DNA文库等)，后经或不经片段化后，变性成为所述核酸探针文库，用于HLA基因序列的富集。生物酶促反应所得到的产物如聚合酶链式反应(PCR)产物、人工合成序列、酶切产物、DNA转录、RNA反转录等，利用生物酶如DNA聚合酶、限制性内切酶、反转录酶等模拟细胞内的方式，在体外进行核酸的合成或加工，产生具有与HLA基因序列互补或高度同源的核酸文库。或将由生物合成方式得到的核酸文库，经构建成为具有特定可扩增核酸接头的文库，再经生物酶促反应制备生成核酸探针文库。上述探针的制备技术，与现有靶向核酸富集技术中，通过人工合成探针的方式相比，具有周期短、成本低廉的优势。
其次，本发明采用固相载体膜富集HLA基因序列，所述固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜和其它以固相载体膜为基础的、通过物理手段或化学处理即可非特异性的牢固结合核酸的膜纸类固相载体。该类固相载体膜不需要进行过度的修饰使其特异性结合特定的核酸修饰基团，因此成本较低。相较于市场主要的试剂盒，通过在单链核酸探针上修饰的生物素，将目标-探针核酸复合物结合于磁珠载体上修饰的链霉素后，后进行富集目标核酸来说，固相载体成本极其低廉。
(3)本发明采用的技术过程中，所述固相载体膜可通过物理手段，如高温加热，非特异性且无方向性的结合并固定核酸探针，也正是因为本发明此优点的特殊效果，因此才可通过生物合成方式和/或生物酶促反应来简洁化制备探针，除去不必要的修饰，如基于磁珠或芯片的固相载体富集技术中，需要人工合成探针并修饰生物素Biotin，大幅降低成本，适于各实验室独立开展，操作过程简单。
(4)本发明所富集的HLA基因序列，最终将应用于高通量测序服务，通过高通量测序，获得所富集的HLA基因序列的具体信息，能应用于HLA基因分型。
附图说明
图1：为本发明的流程图；
图2：实施例1中，以外显子为单位，对14个基因的核酸探针与IMGT HLA数据库(3.26版本)中的相应的HLA基因的cDNA序列，进行相似度分析；
图3：实施例1中与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列，经片段化后的片段范围大小；
图4：实施例1中核酸探针文库的探针为单碱基位移；
图5：实施例4中被捕获后的样本文库经测序后，靶向区域的碱基覆盖比例，碱基被覆盖是指该碱基处含有测序短读(reads)的第一个碱基；
图6：应用实施例4中高通量测序数据，对5个HLA基因(HLA-A/B/C/DQB1/DRB1)进行鉴定后，所得到的鉴定正确率，共31个样本。
具体实施方式
以下实施例和/或实验例仅用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
实施例1 获得片段后的双链核酸文库并质检
一、探针性能分析
1.对选取的14个基因的cDNA序列，与IMGT HLA数据库(3.26版本)中的相应的HLA基因的序列进行相似度分析。
2.以外显子为单位进行相似度比较，相似度最低为85％，该结果说明数据库中这14个基因的cDNA序列均能被捕获，结果见附图2。
二、双链核酸文库的制备：
1.将14种核酸溶液，按照相同的分子数量进行混合，包括了HLA-I类家族基因和HLA-II类家族基因，其中HLA-I类家族基因为HLA-A*01:01:01,B*08:01:01,C*16:01:01,E*01:01:01,G*01:01:02、HLA-II类家族基因为DPA1*02:01:01,DPB1*01:01:01,DQA1*01:03:01,DQB1*03:02:01,DRA*01:01:01,DRB1*13:03:01,DRB3*01:01:02,DRB4*01:03:01,DRB5*01:01:01；
2.取5μg混合溶液，用超声仪(Bioruptor)使核酸片段化，条件为开30s/关90s,6个循环，所产生片段范围为150bp-800bp；
3.取适量超声后的溶液，通过Agilent bioanalyzer 2200进行检测超声后片段大小，大小在150bp-800bp范围内(附图3)；
三、双链核酸文库质量控制：
1.取500ng片段化后的文库，用UltraTMDNA Library Prep Kit forIllumina(E7645，NEB)构建样品DNA文库。
2.对构建好的文库，进行定量(Agilent bioanalyzer 2200)；
3.进行高通量测序并分析，每个基因的序列数量基本一致，片段化后的核酸，呈单碱基位移的形式，表明多样性高(附图4)。
实施例2 构建DNA样品文库
1.所述DNA样品，共31个样品，从中华骨髓库申请，所述DNA样品已知HLA基因型的样品，所采用的方法为PCR-SBT。
2.取500ng DNA样品，用超声仪(Bioruptor)使DNA片段化，条件为开30s/关90s,5个循环，所产生片段范围为300bp-600bp；
3.取5μl超声后溶液，加1μl 6x loading Buffer，通过琼脂糖凝胶电泳检验超声后片段大小，大小在300bp-600bp范围内；
4.对剩余样品，用UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina(E7645，NEB)构建样品DNA文库，插入片段大小范围300-600bp。
实施例3 富集HLA基因序列
一、单链核酸探针文库的制备：
1.单链核酸探针文库的制备来源为实施例1中的双链核酸文库；
2.使用碱变性法对上述双链核酸文库进行变性,在室温配制：
24μl 500ng/μl DNA文库
12μl 3M NaCl
1.44μl 10N NaOH
3.室温放置15分钟，所得即为单链核酸探针文库。
二、转移单链核酸探针至固相载体膜，使探针与带正的电尼龙膜牢固结合：
1.用剪刀裁剪约0.3cm2带正电荷的尼龙膜(NG0312，RPN3038，GE)；
2.用移液枪转移步骤一中，经变性后含有单链核酸探针的溶液至尼龙膜上；
3.将尼龙膜转移至真空箱内，在真空环境下室温干燥40分钟或至尼龙膜干燥；
4.将尼龙膜转移至真空箱内，温度调至80摄氏度，在真空环境下对尼龙膜烘焙1小时，使单链核酸探针与尼龙膜牢固结合。
三、变性DNA样品文库：
1.所述DNA样品文库为实施例2中的DNA样品文库。
2.将DNA样品文库与有助于提高杂交效率的组分混合：
20μl 50ng/μl DNA样品文库，共1μg
5ul 1μg/μl human Cot-1 DNA
8ul Blocker探针
3.混匀后置于98摄氏度加热5分钟，使文库双链DNA变性成单链；
4.取出后立即置于冰上，使DNA保持单链状态。
四、HLA核酸序列的富集：
1.配制杂交液：
混匀至澄清；
2.将步骤二中，单链核酸探针牢固结合的尼龙膜置于含有1毫升杂交液的杂交瓶中，将杂交瓶置于65摄氏度杂交箱内，预杂交0.5小时，后更换新鲜杂交液并预热至65摄氏度；
3.将步骤三中的混合溶液，转移至含有尼龙膜与杂交液的杂交瓶中，65摄氏度杂交24小时；
4.配制清洗液：
磷酸钠缓冲液 0.04M
SDS 1.6％
混匀至澄清，预热至63摄氏度；
5.将尼龙膜转移至含有4毫升预热的清洗液的5毫升离心管中，63摄氏度清洗15分钟，共清洗三次；
6.将清洗三次后的尼龙膜，转移至含有500微升TE缓冲液的1.5毫升离心管中；
7.加热1.5毫升离心管至98摄氏度，对富集后的核酸进行洗脱，5分钟后将尼龙膜取出，剩余溶液冷却至温室。
五、对富集后的核酸样品文库纯化：
1.将步骤四中的剩余液体进行纯化(QIAquick PCR Purification Kit)，用30μlTE缓冲液进行洗脱；
2.纯化后的DNA，即为所得。
六、(可选)进行捕获第二次：
1.重复捕获第二次，可进一步提高目标核酸分子占核酸样品的比例；
2.扩增配制PCR体系：
3.PCR条件如下：
4.重复步骤一到步骤五。
实施例4 高通量测序及数据分析
1.对实例3中的产物通过Agilent bioanalyzer 2200进行定量；
2.对实施例3中的31个样本进行高通量测序，使用illumina测序平台Hiseq2500进行2x125bp的测序；
3.获得raw data，处理并分析数据，对关键参数进行统计；
4.碱基覆盖度是指示靶向捕获效果的一个重要指标，同时，5个HLA-A/B/C/DRB1/DQB1基因是目前骨髓移植或器官移植中所必须鉴定的5个基因，因此，对31个样本的5个HLA-A/B/C/DRB1/DQB1的碱基覆盖度进行分析，分析结果表明，在0.25M测序深度下，平均73％的碱基均有比对上的reads的第一个碱基，结果见附图5。
实施例5 样品HLA基因分型
1.基于实例4中的数据，共31个样本，通过我们自主开发的HLA基因分型算法鉴定出样品的HLA基因型，目前主要对14个基因HLA-A*01:01:01,B*08:01:01,C*16:01:01,DPA1*02:01:01,DPB1*01:01:01,DQA1*01:03:01,DQB1*03:02:01,DRA*01:01:01,DRB1*13:03:01,DRB3*01:01:02,DRB4*01:03:01,DRB5*01:01:01,E*01:01:01,G*01:01:02进行分型；
2.实施例4中的31个样本，5个基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQB1、HLA-DRB1)有参考基因型，为中华骨髓库通过PCR-SBT方法所鉴定。基于我们的高通量测序数据，鉴定结果(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQB1、HLA-DRB1)与中华骨髓库所提供的参考基因型一致，鉴定的正确率达100％(附图6)。
Claims (17)
1.一种靶向捕获HLA基因序列并测序的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将变性后的核酸样品与固定于固相载体的核酸探针文库在杂交条件下进行杂交，形成目标核酸分子-探针-固相载体膜复合体；
2)用清洗液清洗步骤1)中结合目标核酸的“探针-固相载体膜复合体”，然后再用洗脱液从固相载体膜上洗脱、并纯化经富集后或富集后再进行构建，即得核酸文库；
3)将步骤2)所富集得到的或再进行构建得到的核酸文库用于高通量测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中目标核酸分子能与所述核酸探针文库中的核酸分子在杂交条件下结合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的变性后的核酸样品中含有目标核酸分子，其中所述目标核酸分子为HLA基因来源的核酸分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述变性的核酸样品为在杂交前由双链核酸经过变性后产生单链核酸样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中核酸探针文库由与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列衍生而来。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的核酸探针文库为与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、或相似的核酸序列，其序列相似度与HLA基因的cDNA大于或等于80％。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的核酸探针文库的制备通过以下步骤制得：
1-1)获取并纯化具有与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补、相似的核酸序列，如基因组DNA、质粒、柯斯质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、人工合成序列、酶切产物、PCR产物、DNA转录产物、RNA反转录所得的核酸文库，经片段化或不经片段化，形成20bp～10kb片段范围；优选150bp～800bp的片段；片段化方式为物理、化学、光化学法或生物酶等方式；优选物理法如超声法、HydroShear和/或生物酶法，优选酶切法；
1-2)将步骤1-1)取得的片段通过物理或化学方式变性，即得核酸探针文库。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，将核酸探针文库变性后，通过物理、化学和/或光化学方式与固相载体膜进行结合，形成“探针-固相载体膜复合体”。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中固相载体膜为尼龙膜或其衍生物膜、醋酸纤维素膜或其衍生物膜、或纤维素纸膜或其衍生物膜；优选为中性或带正电的尼龙膜、醋酸纤维素膜、或纤维素纸膜。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的杂交条件是指在温度范围为40摄氏度到70摄氏度的杂交液中进行杂交，以实现目标核酸分子与核酸探针在该温度和杂交液中能进行结合，其中优选温度为55到65摄氏度。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的杂交液为含有磷酸钠缓冲溶液、EDTA、BSA和SDS的溶液，或含有柠檬酸钠缓冲液(SSC)、Denhardt solution、SDS和/或甲酰胺的溶液，或含有SSPE、Denhardt solution、SDS和/或甲酰胺的溶液；优选杂交液为含0.5M磷酸钠缓冲溶液、1mM EDTA、1％(w/v)BSA和7％(w/v)SDS的溶液，或含有5x柠檬酸钠缓冲液(5x SSC),5×Denhardt solution和1％(w/v)SDS的溶液。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的清洗液为含有磷酸钠缓冲溶液和SDS的溶液；或含有0.2～2x SSC和1％(w/v)SDS的溶液；优选清洗液为含有0.04M磷酸钠缓冲溶液和1.6％(w/v)SDS的溶液；或含有2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液；含有0.2x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液；或含有0.1x SSC和0.1％(w/v)SDS的溶液。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的洗脱溶液为水、TE缓冲溶液、0.4M NaOH溶液、或0.1％(w/v)SDS溶液。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中进一步包括于80℃～100℃的洗脱液如水溶液、TE缓冲液或0.1％(w/v)SDS溶液中洗脱，或在pH 10-12的洗脱液如0.4M NaOH溶液中对被富集的核酸进行洗脱。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的核酸文库如不能直接进行高通量测序，则将核酸文库构建为具备进行高通量测序的文库，然后进行高通量测序。
16.根据权利要求1～15所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括如下：
(1)通过生物合成方式和/或生物酶促反应获得含有与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补或相似的核酸序列，其相似度与HLA基因的cDNA达80％或以上；
(2)将与人白细胞抗原(HLA)基因序列相同、互补或相似的核酸序列经片段化或不片段化，并变性制备成核酸探针文库，并转移至固相载体膜上；
(3)经物理和/或化学方式处理，使附着在固相载体膜上的核酸探针与固相载体膜牢固结合，形成“探针-固相载体膜复合体”；
(4)将预杂交或未经预杂交的“探针-固相载体膜复合体”放入杂交液中；
(5)将含有HLA基因序列的核酸样品文库变性；
(6)将变性后的含有核酸样品文库的溶液，加入到含有“探针-固相载体膜复合体”的杂交液中，并加入具有提高富集效率的组分，在杂交温度范围为40摄氏度到70摄氏度下，进行HLA基因序列的富集；
(7)用清洗液清洗经杂交后的固相载体膜；
(8)用洗脱液从固相载体膜上洗脱并纯化核酸，得到经富集的核酸文库；
(9)所得的核酸文库，最终进行高通量测序。
17.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中与人白细胞抗原(HLA)基因cDNA序列相同、互补、或相似的核酸序列来源为HLA-A*01:01:01、B*08:01:01,C*16:01:01、DPA1*02:01:01,DPB1*01:01:01、DQA1*01:03:01、DQB1*03:02:01、DRA*01:01:01、DRB1*13:03:01、DRB3*01:01:02、DRB4*01:03:01、DRB5*01:01:01、E*01:01:01或G*01:01:02的cDNA序列，或它们中的两种或两种以上组合物。
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