CN109913509A

CN109913509A - 一种高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基及发酵工艺

Info

Publication number: CN109913509A
Application number: CN201810396751.8A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 石姣; 占杨杨; 王欢; 许勇; 周梦林; 马昕; 王勤
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明提供了一种芽胞杆菌利用废弃饼粕、豆渣资源高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基及发酵工艺，通过特定培养基组成及培养条件的配合来实现短支链脂肪酸的高效生产，所述发酵培养基配方为：玉米淀粉10‑100g/L、废弃有机氮源20‑100g/L、氯化铵1‑10g/L、碳酸钙3‑15g/L、磷酸氢二钾1‑10g/L、硫酸镁1‑10g/L、硫酸锰0.005‑0.10g/L，pH 6‑8；所述发酵培养条件为：培养温度25‑40℃，摇床转速180‑240r/min，发酵时间30‑60h。通过利用价格低廉的豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕作为发酵原料，采用该工艺条件下，利用地芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌进行发酵验证均实现了短支链脂肪酸的增产。本发明工艺具有组成简单、环保、经济、产量高、稳定且适用范围广的特点，具有一定应用前景。

Description

一种高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基及发酵工艺

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种芽胞杆菌利用废弃饼粕、豆渣资源高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基及发酵工艺，具有高稳定性且适用范围广，能够实现短支链脂肪酸的经济高效生产。

背景技术

短支链脂肪酸(SCFAs)是一类具有4-6个碳原子的羧酸并且在一个或两个碳上有甲基分支。它们及其衍生物是多用途的平台化学品，可用于制造业，制药业和食品业，具有很高的市场潜力。例如，异丁酸(IBA)可以用于生产增塑剂，表面活性剂，纺织助剂，香料和调味剂。IBA也用于合成甲基丙烯酸，一种工业上重要的生产塑料的单体。异戊酸(IVA)的薄荷酯可以作为镇静剂以及香料 (Ahmad et al.,2000)，而IVA的酰胺衍生物是抗惊厥剂药物。2-甲基丁酸(2MBA) 酯可用作调味剂，也可用于合成药物(如美伐他汀，普伐他汀和洛伐他汀)。

目前，SBCFAs主要由化学合成法生产。然而，化学法合成短支链脂肪酸高度依赖石油化工产品作为原材料，生产过程不仅耗能，而且污染环境。微生物细胞工厂生产高价值化合物正在日益成为化学合成的一种有前途的替代方式。目前文献报道能合成短支链脂肪酸的微生物主要有：大肠杆菌属、假单胞杆菌属、酿酒酵母和芽胞杆菌属。Yu et al(2016)利用酿酒酵母通过遗传改造产短支链脂肪酸可达387.4mg/L。Lang et al(2014)在假单胞杆菌中通过代谢工程改造产异丁酸可达2.68g/L。Zhang et al(2011)利用大肠杆菌也能产异丁酸。但是，这些微生物发酵短支链脂肪酸所用的培养基均包含成本比较高的葡萄糖、蛋白胨和酵母抽提物等原料，而且产量较低，限制了微生物生产短支链脂肪酸的工业化进程。

我国是农业大国，生产大量的豆制品和食用油，这些物质的生产加工过程中能够产生大量的生物质残渣，例如豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕。这些残渣由于富含纤维和蛋白质，被开发利用作为家畜的饲料、鱼虾饲料、发酵基质、膳食纤维制备原料等。但目前我国对生物质残渣的利用率普遍较低，除部分豆渣被用作饲料、少量用于制备膳食纤维外，其余大部分的豆渣都作为废弃物处理。迄今为止，尚无关于芽胞杆菌利用这些廉价易得的废弃生物资源发酵产短支链脂肪酸的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基及发酵工艺，该发酵培养基有效利用废弃饼粕、豆渣资源，发酵工艺通过培养基成分与发酵条件配合，能够实现短支链脂肪酸的经济高效的生产。

本发明第一方面提供了一种高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基，配方为：玉米淀粉10-100g/L、有机氮源20-100g/L、无机氮源1-10g/L、碳酸钙3-15g/L、磷酸氢二钾1-10g/L、硫酸镁1-10g/L、硫酸锰0.005-0.10g/L，pH 6-8；所述有机氮源包括豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕中的一种或几种。

本发明第二方面提供了一种高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，步骤包括：

S1、种子培养：将芽胞杆菌接至种子培养基中进行种子培养得到发酵菌种；

S2、发酵培养：将发酵菌种接至上述高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，发酵时间30-60h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过采用价格低廉的豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕作为有机氮源和发酵原料，实现了短支链脂肪酸的高效生产，短支链脂肪酸产量至少达到7.08g/L。同时对豆渣、菜籽饼粕和棉籽饼粕的市场价格进行调研，豆渣的价格在1200元/吨左右小范围波动，菜籽饼粕的平均价格在1500元/吨左右小范围波动，棉籽饼粕的平均价格在2000元/吨左右小范围波动，发酵原料的替换显著的降低了发酵成本，提高了芽胞杆菌发酵生产短支链脂肪酸的经济效益。本发明生产工艺简单、便于推广，培养基成分与发酵条件配合能使芽胞杆菌代谢产物短支链脂肪酸含量大幅提升。本发明工艺具有高稳定的特点，便于扩大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1，无机氮源类型对短支链脂肪酸产量影响；

图2，不同氯化铵浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图3，不同碳酸钙浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图4，不同玉米淀粉浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图5，不同豆渣浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图6，无机盐K₂HPO₃浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图7，无机盐MgSO₄浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图8，无机盐MnSO₄浓度对短支链脂肪酸产量影响；

图9，接种量对短支链脂肪酸产量影响；

图10，种龄对短支链脂肪酸产量影响；

图11，pH对短支链脂肪酸产量影响；

图12，装液量对短支链脂肪酸产量影响；

图13，培养基组成及条件对地衣芽胞杆菌利用不同废弃物生产短支链脂肪酸产量影响；

图14枯草芽胞杆菌利用不同废弃物生产短支链脂肪酸产量；

图15解淀粉芽胞杆菌利用不同废弃物生产短支链脂肪酸产量。

具体实施方式

优选的，所述无机氮源包括硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硝酸钠中的一种或几种。

更加优选的，所述无机氮源为氯化铵。

由于合适的碳源是短支链脂肪酸从头合成的必要条件，合适的氮源能有效提高短支链脂肪酸合成所需底物支链氨基酸(缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸)的合成效率；合适的无机盐成分配比保证了细胞的生长和胞内生化反应的正常运行。所以本发酵培养基及发酵工艺根据芽胞杆菌的生长特点和短支链脂肪酸合成的前体物需求，有针对性的优化了培养基的关键组分，并通过正交实验取得了这些关键成分的优化比例，形成了完整的发酵工艺。

优选的，步骤S1所述芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中的一种或几种。

更加优选的，步骤S1所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168，保藏编号为ATCC23857；所述解淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12，保藏编号为CCTCC No：M 2015234，于2015年4 月15日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学；所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2，保藏编号为 CCTCC No：M 2011344，于2011年10月12日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学。

在本发明的实施例中，以本发明提供的培养基组成和培养条件对地衣芽胞杆菌DW2在不同废弃物豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕条件下分别进行发酵验证，均能高效生产短支链脂肪酸在本发明的实施例中，还以枯草芽胞杆菌168、解淀粉芽胞杆菌LX-12、地衣芽胞杆菌DW2为例进行发酵工艺效果的验证，但上述芽胞杆菌并不局限于前三种，其他芽胞杆菌菌株也能实现近似技术效果。。

优选的，步骤S2所述发酵培养条件还包括：接种量为2％-8％，种龄为6-14 h，装液量30-70ml，发酵pH 6.0-8.0。

优选的，步骤S1所述种子培养基配方为：8-12g/L蛋白胨，4-6g/L酵母浸出粉，8-12g/L氯化钠，pH 7.0-7.2。

优选的，步骤S1所述种子培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240 r/min，培养时间为6-14h。

优选的，还包括步骤S3：将发酵液离心除去菌体、收集上清液。在本发明的几个实施例中，在收集上清液后对短支链脂肪酸含量进行了测定，具体的，取 1mL离心上清液，加入等体积正丁醇，以正丁醇为内标，上述混合液经水相滤膜过滤后，用气相色谱仪(GC，Agilent Technologies 7890B)检测短支链脂肪酸含量。

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本实施例以地衣芽胞杆菌DW2为出发菌株，通过大量实验验证培养基组成及培养条件的配合可实现短支链脂肪酸的高效生产。

所述地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2，保藏编号CCTCC No：M2011344。

本实施例中用到的种子培养基组成：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L 氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L。

本实施例中短支链脂肪酸的检测方法及定量方法：地衣芽胞杆菌在短支链脂肪酸发酵培养基中发酵48h后，将发酵液离心除去菌体、收集上清液，取1mL 离心上清液，并加入等体积正丁醇，以正丁醇为内标，上述混合液经水相滤膜过滤后，用气相色谱仪(GC，Agilent Technologies 7890B)检测短支链脂肪酸含量。

一、不同无机氮源条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础进行浓度的优化。初始发酵培养基成分为(g/L)：玉米淀粉35，豆渣60，氯化铵1，碳酸钙3，保持培养基中除无机氮源外的其他成分不变，分别以5种含氮无机盐NH₄Cl、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃和KNO₃为氮源，以初始培养基中1g/L NH₄Cl的含氮量作为标准，其他氮源根据含氮量调整添加量，使最终氮添加量一致，进行摇瓶发酵实验。发酵结束后测定发酵液中的短支链脂肪酸含量。培养条件：37℃，240r/min，发酵48h测定发酵产物中短支链脂肪酸含量。

不同无机氮源所对应的短支链脂肪酸产量见图1。从图中可以看出：最佳氮源为NH₄Cl，短支链脂肪酸产量为3.53g/L。

二、不同氯化铵浓度条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础，保持培养基中除NH₄Cl以外的其他成分浓度不变，选择2g/L，4g/L，6g/L，8g/L，10g/L的NH₄Cl作为氮源进行比较，发酵实验结束后测定短支链脂肪酸的产量。培养条件：37℃，240r/min，发酵48h。

不同浓度的NH₄Cl所对应的短支链脂肪酸产量见图2。最佳NH₄Cl浓度为2 g/L，短支链脂肪酸产量为4.22g/L

三、不同碳酸钙浓度条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础，保持培养基中除碳酸钙以外的其他成分浓度不变，选择3g/L，6g/L，9g/L，12g/L，15g/L的碳酸钙进行比较，发酵实验结束后测定短支链脂肪酸的产量。培养条件：37℃，240r/min，发酵48h。

不同浓度的碳酸钙所对应的短支链脂肪酸产量见图3。最佳碳酸钙浓度为6 g/L，短支链脂肪酸产量为4.54g/L。

四、不同玉米淀粉浓度条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础，保持培养基中除玉米淀粉以外的其他成分浓度不变，选择15g/L，25g/L，35g/L，45g/L，55g/L，65g/L的玉米淀粉作为氮源进行比较，发酵实验结束后测定短支链脂肪酸的产量。培养条件：37℃，240r/min，发酵48h。

不同浓度的玉米淀粉所对应的短支链脂肪酸产量见图4。最佳玉米淀粉浓度为55g/L，短支链脂肪酸产量为5.61g/L。

五、不同豆渣浓度条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础，保持培养基中除豆渣外的的其他成分不变，选择 20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L的豆渣作为有机氮源进行比较，发酵实验结束后测定短支链脂肪酸的产量。培养条件：37℃，240r/min，发酵48h测定发酵产物中短支链脂肪酸含量。

不同浓度的豆渣所对应的短支链脂肪酸产量见图5。从图中可以看出：最佳豆渣浓度为80g/L，短支链脂肪酸产量为7.48g/L

六、不同无机盐添加量条件下的短支链脂肪酸产量对比

以初始发酵培养基为基础，控制单个变量分别加入不同浓度的K₂HPO₄、 MgSO₄、MnSO₄作为培养基中的无机盐，以去离子水溶解无机盐溶液，培养条件：37℃，240r/min，发酵48h测定发酵产物中短支链脂肪酸含量。发酵结果如图6-图8所示。

由图6可以看出，K₂HPO₄的最佳浓度为1g/L，短支链脂肪酸产量为4.76 g/L。如图7所示，MgSO₄的最佳浓度为1g/L，短支链脂肪酸产量4.78g/L；图 8显示，MnSO₄的最佳浓度为0.05g/L，短支链脂肪酸产量为4.85g/L。最佳无机盐类型及其浓度为：K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄1g/L、MnSO₄ 0.05g/L。

七、培养基优化正交实验

通过上述单因素试验，结合地衣芽胞杆菌DW2的发酵特性，选择显著影响短支链脂肪酸产量的四个因素：玉米淀粉、豆渣、碳酸钙和无机盐(MnSO₄)，并以误差作为一个影响因素设计四因素三水平的正交试验进一步优化发酵培养基并最终确定培养基的配比和浓度。正交试验因素水平见表1，具体试验设计及极差分析结果见表2。其中实验组2的短支链脂肪酸产量最高，达到8.85g/L

表1因素水平表

表2主要因素的正交试验结果

由表2的极差分析可知，在本试验所设定的实验因素水平下，豆渣对地衣芽胞杆菌DW2发酵生产短支链脂肪酸的影响最为显著，其次是玉米淀粉，再是硫酸锰。由均值分析可知，培养基的最佳组合为A1B2C2D2，即玉米淀粉45g/L，豆渣80g/L，碳酸钙6g/L，硫酸锰0.05g/L。

八、不同培养条件下的短支链脂肪酸产量对比

在以上试验确定的最佳培养基组成的基础上，通过单因子实验设计对可能影响短支链脂肪酸产量的培养条件(如：接种量、种龄、装液量及培养基初始pH) 进行优化对比实验。具体设定为接种量2％、4％、6％、8％(v/v)，初始pH 6、6.5、7.0、7.5、8.0，装液量30、50、70(mL)，种龄为6、8、10、12、14(h)。优化后培养基组成为：玉米淀粉45g/L、豆渣80g/L、NH₄Cl2g/L、CaCO₃ 6g/L、 K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO4 0.05g/L，培养基用去离子水定容。

从图9-图12的实验结果可以得出如下结论：1、接种量(4％，v/v)有利于短支链脂肪酸生产。2、种龄为10h，更有利于短支链脂肪酸生产。3、pH为6.5 时，更有利于短支链脂肪酸生产。4、装液量为30mL，更有利于短支链脂肪酸的生产。

通过上述实验，得到芽胞杆菌利用豆渣高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，本实施例中采用的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌DW2，采用的具体工艺包括以下步骤：

(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌DW2；

(2)种子培养：

种子培养基为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；

种子培养：培养温度为37℃，250mL三角瓶中装液量为50mL，摇床转速 240r/min，培养时间为10h；

(3)发酵培养

发酵培养基组成：玉米淀粉45g/L、豆渣80g/L、NH₄Cl 2g/L、CaCO₃ 6g/L、 K₂HPO₄1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO4 0.05g/L，培养基用去离子水定容。

发酵培养条件：培养温度37℃，摇床转速240r/min，发酵时间48h，接种量4％，种龄10h，装瓶量30mL(250mL锥形瓶)，pH 6.5。

(4)收集发酵液并检测

将发酵液离心除去菌体、收集上清液，取1mL离心上清液，并加入等体积正丁醇，以正丁醇为内标，上述混合液经水相滤膜过滤后，用气相色谱仪(GC， Agilent Technologies7890B)检测短支链脂肪酸含量。气相色谱参数如下：

Agilent DB-WAX(30m×320μm×0.33μm)，FID检测器，N₂作载气，流量为1.0 mL/min，不分流进样，进样量为1μl；进样器温度230℃，检测器温度240℃；柱温箱升温程序为50℃保持2min，以10℃/min升温至110℃保持2min，以 5℃/min升温至150℃保持0.5min，以20℃/min升温至230℃保持1min。

通过检测，地衣芽胞杆菌DW2在本实施例提供的特定的培养基和培养条件下，短支链脂肪酸产量达到8.85g/L，见图13。

实施例2

本实施例以废弃物菜籽饼粕作为有机氮源，通过特定培养基组成及培养条件的配合实现了短支链脂肪酸的高效生产

(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌DW2；

(2)种子培养：

(3)发酵培养

发酵培养基组成：玉米淀粉45g/L、菜籽饼粕80g/L、NH₄Cl 2g/L、CaCO₃ 6g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO4 0.05g/L，培养基用去离子水定容。

(4)收集发酵液并检测

将发酵液离心除去菌体、收集上清液，取1mL离心上清液，并加入等体积正丁醇，以正丁醇为内标，上述混合液经水相滤膜过滤后，用气相色谱仪(GC， Agilent Technologies7890B)检测短支链脂肪酸含量。气相色谱参数如下： Agilent DB-WAX(30m×320μm×0.33μm)，FID检测器，N₂作载气，流量为1.0 mL/min，不分流进样，进样量为1μl；进样器温度230℃，检测器温度240℃；柱温箱升温程序为50℃保持2min，以10℃/min升温至110℃保持2min，以 5℃/min升温至150℃保持0.5min，以20℃/min升温至230℃保持1min。

通过检测，地衣芽胞杆菌DW2在本实施例提供的培养基和培养条件下，短支链脂肪酸产量达到6.42g/L，见图13。

实施例3

本实施例以废弃物棉籽饼粕，菜籽饼粕作为有机氮源，通过特定培养基组成及培养条件的配合实现了短支链脂肪酸的高效生产

(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌DW2；

(2)种子培养：

(3)发酵培养

发酵培养基组成：玉米淀粉45g/L、棉籽饼粕80g/L、NH₄Cl 2g/L、CaCO₃ 6g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO4 0.05g/L，培养基用去离子水定容。

(4)收集发酵液并检测

通过检测，地衣芽胞杆菌DW2在本实施例提供的培养基和培养条件下，短支链脂肪酸产量达到9.08g/L，见图13。

实施例4

根据前述实施例中利用废弃饼粕、豆渣资源高效生产短支链脂肪酸的应用步骤，本实施例又另外提供了12种实施案例，出发菌株均为地衣芽胞杆菌DW2，并在表3中分别列举了实验组1-实验组12的发酵培养基的配方。

表3实验组1-实验组12的发酵培养基配方

其中，上述实施案例中种子培养基及无机盐组成和浓度均相同，种子培养基为：8g/L蛋白胨；6g/L酵母浸出粉；8g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂20g/L。无机盐组成和浓度：K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO₄ 0.05g/L。另外，上述实施案例的发酵培养条件也是相同的，发酵培养条件：培养温度37℃，摇床转速240r/min，发酵时间48h，接种量4％，种龄10h，装瓶量30mL(250 mL锥形瓶)，pH 6.5。

本发明人采用气相色谱(GC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中短支链脂肪酸的产量进行测定。具体步骤为：将发酵液离心除去菌体、收集上清液，取1mL离心上清液，并加入等体积正丁醇，以正丁醇为内标，上述混合液经水相滤膜过滤后，用气相色谱仪(GC，Agilent Technologies 7890B)检测短支链脂肪酸含量。气相色谱参数如下：Agilent DB-WAX(30m×320μm×0.33μm)，FID 检测器，N₂作载气，流量为1.0mL/min，不分流进样，进样量为1μl；进样器温度230℃，检测器温度240℃；柱温箱升温程序为50℃保持2min，以10℃/min升温至110℃保持2min，以5℃/min升温至150℃保持0.5min，以20℃/min 升温至230℃保持1min。根据短支链脂肪酸标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中短支链脂肪酸的产量(见表4)。

表4实验组1-12发酵的菌液中短支链脂肪酸的产量

从表4可看出，在一定的种子发酵和生产发酵条件下，采用本发明的发酵工艺均能高效生产短支链脂肪酸。

实施例4

本实施例以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168为出发菌株，保藏编号 ATCC23857，通过特定培养基组成及培养条件的配合有效实现了短支链脂肪酸的增产。

采用的具体工艺包括以下步骤：

(1)出发菌株：枯草芽胞杆菌168；

(2)种子培养；

(3)发酵培养

发酵培养基组成：玉米淀粉45g/L、豆渣或棉籽饼粕或菜籽饼粕80g/L、 NH₄Cl 2g/L、CaCO₃ 6g/L、K₂HPO₄ 1g/L、MgSO₄ 1g/L、MnSO4 0.05g/L，培养基用去离子水定容。

(4)收集发酵液并检测

通过检测，枯草芽胞杆菌168在本实施例提供的培养基和培养条件下，短支链脂肪酸产量至少达到7.08g/L，见图14。

实施例5

本实施例以解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12为出发菌株，保藏编号CCTCC No：M 2015234，通过特定培养基组成及培养条件的配合有效实现了短支链脂肪酸的增产。

采用的具体工艺包括以下步骤：

(1)出发菌株：解淀粉芽胞杆菌LX-12；

(2)种子培养；

(3)发酵培养

(4)收集发酵液并检测

通过检测，解淀粉芽胞杆菌LX-12在本实施例提供的培养基和培养条件下，短支链脂肪酸产量至少达到7.58g/L，见图15。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基，其特征在于：配方为：玉米淀粉10-100g/L、有机氮源20-100g/L、无机氮源1-10g/L、碳酸钙3-15g/L、磷酸氢二钾1-10g/L、硫酸镁1-10g/L、硫酸锰0.005-0.10g/L，pH 6-8；所述有机氮源包括豆渣、菜籽饼粕、棉籽饼粕中的一种或几种。

2.如权利要求1所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基，其特征在于：所述无机氮源包括硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钾、硝酸钠中的一种或几种。

3.如权利要求2所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基，其特征在于：所述无机氮源为氯化铵。

4.一种高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤包括：

S2、发酵培养：将发酵菌种接至权利要求1所述高效生产短支链脂肪酸的发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，发酵时间30-60h。

5.如权利要求4所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤S1所述芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中的一种或几种。

6.如权利要求5所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤S1所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168，保藏编号为ATCC23857；所述解淀粉芽胞杆菌为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-12，保藏编号为CCTCC No：M 2015234；所述地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)DW2，保藏编号为CCTCC No：M 2011344。

7.如权利要求4所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤S2所述发酵培养条件还包括：接种量为2％-8％，种龄为6-14h，发酵pH 6.0-8.0。

8.如权利要求4所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤S1所述种子培养基配方为：8-12g/L蛋白胨，4-6g/L酵母浸出粉，8-12g/L氯化钠，pH 7.0-7.2。

9.如权利要求4所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：步骤S1所述种子培养条件为：培养温度25-40℃，摇床转速180-240r/min，培养时间为6-14h。

10.如权利要求4所述的高效生产短支链脂肪酸的发酵工艺，其特征在于：还包括步骤S3：将发酵液离心除去菌体、收集上清液。