CN109912687A - 一种治疗老年痴呆症的多肽药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗老年痴呆症的多肽药物，属于蛋白质工程技术领域。该多肽药物选自以下氨基酸序列中的至少任意一种：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。该多肽药物可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，具有广泛的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种治疗老年痴呆症的多肽药物。
背景技术
老年痴呆症或称老年性阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是世界性老年人的常见病，占人类死亡原因的第4位，是由巴伐利亚的神经病理学家阿尔茨海默于1907年首先发现，并以其名字命名。AD是一种弥漫性中枢神经退行性疾病，以进行性认知障碍、智力衰退和人格改变为特征，伴有大脑淀粉样蛋白Aβ1-42沉积、神经纤维缠结、神经元丢失和缓慢的炎性病理特征。AD的病因及发病机制尚不十分清楚，在临床上可表现为进行性记忆功能受损、认知功能紊乱及行为状况改变。尤其AD生前缺乏客观有效指标。目前市面上的治疗老年痴呆病的药物还没达到十分令人满意的结果。AD非常顽固难治，迄今尚未找到治愈该病的有效方法，发病机理非常复杂，病因至今尚不十分清楚，但有很多种假说，如神经递质缺陷、炎症、自由基损伤、淀粉样蛋白、神经毒作用、激素缺乏、细胞凋亡等假说。目前已上市的药物也只是对症治疗，还不能对其病程产生影响。据美国Decision Resources公司专业的医疗产业市场调查报告称，2019年阿尔茨海默病防治药物用量在法国、德国、意大利、日本、英国和美国将增长3倍。现在中国，AD病人约有600～800万人，平均每AD病人消耗125万元，共约消耗90亿元。而中国人口逐渐步入老龄化，这个数字只可能是最保守的估计。AD给个人、家庭及社会带来极其不良的影响，加重了家庭和社会的经济负担。
目前，治疗老年痴呆的药物种类较多，按照上述的作用机理可以分为以下几种:(1)胆碱酯酶(AChE)抑制剂:如多奈哌齐、石杉碱甲、加兰他敏等。(2) 钙离子拮抗剂:如尼莫地平、盐酸氟桂嗪等。(3)大脑代谢调节剂:如尼麦角林、阿米三嗪及萝巴辛、吡拉西坦等。(4)神经保护剂:如脑活素。(5)谷氨酸受体 (NMDA)调控剂：如盐酸美金刚胺(memantinehydrochloride，易倍申)。(6) 抗炎药物：如布洛芬、耐普生及新一代的NSAIDs2Ⅱ型环氧脂酶(COX2Ⅱ)抑制剂 Celecoxib及Rofecoxib等。(7)神经营养性因子(Neurotrophicfactors)：神经生长因子(NGF)、神经节苷脂(Ganglioside，简称GM)。(8)中枢胆碱能受体激动剂：ENS163、LY246078、Dup996能选择性作用于M1受体正处在临床试用中。(9)其他：金属螯合剂、雌激素、非甾体抗炎药(NSAIDs)、抗氧化剂等。但这些药物具有很多不足:(1)目前尚无对因治疗或逆转病程的理想药AD一线治疗药物，比如乙酰胆碱酶(AChE)抑制剂，只能缓解早期病人的认知障碍，提供适度的症状改善作用，无法阻止病情的进展。(2)某些药物副作用大。如采用雌激素替代治疗可以减少停经后妇女患AD的危险，可以提高AD患者的认知功能，但雌激素有促进女性化的作用，只能用于停经后的妇女，并且增加乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等疾病的发病率。(3)进口药价格昂贵。(4)新药研发，化学合成新的药物难度大。其它Semagacestat(LY450139)、ACC-001等。疗效均见一般。目前开发的人单克隆抗体主要是为了清除脑内的β-淀粉样蛋白，虽然预防甚至是逆转阿尔茨海默病的进程。但经试验后发现不安全，存在很大的副作用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗老年痴呆症的多肽药物，可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，具有广泛的临床应用价值。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种多肽，所述多肽包括以下氨基酸序列中的任意一种：
1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
4)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
5)如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
6)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
7)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
作为本发明优选的实施方式，所述多肽为由如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7 中任一种所示的氨基酸序列的取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的多肽。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述的多肽药物通过鼻腔给药、静脉注射或脑室注射单独使用或共同使用于患有老年痴呆症病的小鼠，均显示出良好的效果，可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，为联合使用多种药物提供可能性，具有广泛的临床应用价值。
附图说明
图1为老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-42的一级结构和二级结构；
图2为蛋白质双层叠结构连结模型；
图3为本发明的多肽药物抑制Aβ聚集蛋白质双层叠型结构模型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
阿尔茨海默病的病因及发病机制尚不十分清楚，有大量证据表明脑组织中淀粉样蛋白Aβ1-42积聚是引起阿尔茨海默病的元凶，但淀粉样蛋白Aβ1-42的形成机理和致病机理还不十分清楚，随着人类老龄化社会的到来，阿尔茨海默病已成世界性的难题。本发明的目的就是要探讨淀粉样蛋白Aβ1-42的形成机理，为研发治疗阿尔茨海默病提供理论基础。
实际上，研究发现淀粉样蛋白Aβ是由淀粉样前体蛋白(Amyloid PrecursorProtein,APP)酶切产生的多肽片段，APP基因定位于21号染色体，APP主要的产物有APP695、APP751、APP770等。APP蛋白是一N端在外，C端在内的跨膜大糖蛋白。
正常情况下，APP蛋白由三种被称为α、β、γ分泌酶的蛋白水解。Aβ蛋白分子由β、γ分泌酶的酶序列性分解而产生。APP蛋白被α分泌酶酶切位点位于淀粉样蛋白Aβ第16位和第17位氨基酸之间，产生一个大的N端片段分泌到细胞介质中,称为可溶性APP(sAPPα)，小的C端片段被γ分泌酶分解形成P3 片段和更小的C端片段，α分泌酶酶切位点结果分解了淀粉样蛋白Aβ分子，因而不产生淀粉样蛋白Aβ分子。但β和γ分泌酶合作就可产生淀粉样蛋白Aβ分子。γ分泌酶可以作用于小的C端片段的不同位点，从而产生了各种不同大小的淀粉样蛋白Aβ。核心部分是由39-43个氨基酸组成，其中Aβ40是主要形式(在正常人脑脊液Aβ中Aβ40占大约90-95％，Aβ42占不到10％)，但Aβ42是有害的、致病的，是形成老年斑核心的主要成份。Aβ42也可形成有害的多聚体 (oligomer)；Aβ40与Aβ42都会形成典型的纤维或形成老年斑。在正常的生理情况下，α分泌酶酶切起主要作用；但如出现APP基因突变或过度表达的病理情况时，将影响APP的切割，大部分情况下，β、γ分泌酶分解占主导地位，因而容易生成异常的淀粉样蛋白Aβ。
(1)淀粉样蛋白Aβ分子的一级结构
APP分子先在内质网被合成，然后由高尔基体运到细胞表面，再通过细胞的内吞作用进入溶酶体。APP分子的酶解主要发生在内吞小体-溶酶体系统内进行。在溶酶体内被γ分泌酶酶切生成Aβ蛋白分子。淀粉样蛋白Aβ的长度有多种，1985年研究人员从阿尔茨海默病患者脑淀粉样蛋白中分离到1种39和43 氨基酸多肽，如图1所示，Aβ43肽的序列如下:DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT。
Aβ蛋白是如何形成有害的多聚体、形成典型的纤维，或形成老年斑呢？根据文献报道C-末端弯曲回转形成U型结构。发明人在美国纽约大学医学中心工作期间,发明人的导师和同事是国际著名的老年痴呆病研究专家(Professor Frangione B；ProfessorWisniewski T；Dr.Soto C；Dr.Sigurdsson EM等)。在2000 年前后，他们报道了一短少五个氨基酸(aa)多肽片段iAβ5(LPFFD)可以抑制老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-40和Aβ1-42的积聚(Soto et al.,1998； Adessi et al.,2003；Chacon et al.,2004)，很多新闻媒体相继采访报道，引起世界性的轰动。但为什么iAβ5(LPFFD)可以抑制老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-40和Aβ1-42的积聚？其机理还不清楚，发明人在与他们合作和相处期间，不断思考探索这一难解之问题，经过多年不断思考探讨，查阅文献反复推演(Sotoet al.,1995；Petkova et al.,2002；Sachse et al.,2008；Fandrich et al.,2009；Meinhardt et al.,2009；Schmidt et al.,2009；Sachse et al.,2010；Fandrich et al.,2011)，发明人逐渐形成了蛋白质双层叠型结构复制连结模型的理论(Ye,2011)，如图2所示。
(2)构象的转换和双体的形成可能机理
蛋白质双层叠型结构复制连结模型可解释短少五个氨基酸多肽片段 iAβ5(LPFFD)可以抑制老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-40和Aβ1-42 的积聚的原因，根据蛋白质双层叠型结构复制连结模型理论，老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-40和Aβ1-42的一级结构是C-末端弯曲回转形成U型结构。在这U型结构有一短小反向平衡的β折叠，其中第16-20aa和第38-34aa 形成带氢键的β折叠像拉键结构一样连结。第16aa与第36aa上下连结形成了N 端拉链结合止点(Zipper closing point at N-site,nZCP)，而第20aa与第34aa上下连结形成了C端拉链结合止点(Zipper closing point at C-site,cZCP)，第20aa至第 34aa形成一个多肽环，被称为H1环(H1-loop)。由于Aβ蛋白二级结构的多样性和不确定性，U型结构的型态不同，β折叠的长短，数量和位置不同，造成N 端拉链结合止点(Zipper closing point at N-site,nZCP)，和C端拉链结合止点 (Zipper closingpoint at C-site,cZCP)的位点不同，因此，Aβ蛋白单体结构是多样的和不确定的。
当Aβ蛋白分子通过迁移运动到达不同细胞空间，在不同的细胞器时，如细胞膜表面,内包体(Bristle coated vesicle),早期内质体(early endosomes),后期内质体/溶酶体(late endosomes/lysosomes)，多泡体(Multivestcular body),和排出体(exosome)等胞体内外循环时，由于酸碱度、离子浓度的变化，如pH值下降，氢离子增加，由氢链(H-bone)连结的反向平衡的β折叠会被重新打开，原来折叠的β层叠(β-strand)相互分开，由U型β折叠结构(folder monomer)形成直线状的 Aβ蛋白分子单体(unfolded monomer)。可以认为N-端第16-20aa转变成游离的正β层叠(β1)，与之相应的原互补的C-端β层叠第38-34aa转变成游离的负β层叠 (β2)。分开后的正、负β层叠形成被激活的β层叠区(activeβ-zone)。
这样当众多的直线状的Aβ蛋白分子在同一细胞器或相遇，随着细胞内外循环移动到特定的微环境时，当分开的正负β层叠重新配对结合时，就有二种可能性出现:(1)直线状的Aβ蛋白分子自身正负β层叠重新配对结合，重新形成U 型β折叠结构Aβ蛋白分子单体(folded monomer)；(2)直线状的Aβ蛋白分子正负β层叠与另一直线状的Aβ蛋白分子负正β层叠重新配对结合，形成由分子间β折叠的氢键相连的Aβ蛋白分子双体(inter-molecularβ-sheet bonded dimer, IMβD)；这种由分子间β折叠的氢键相连的Aβ蛋白分子双体与一般的两个Aβ蛋白分子连结形成的双体不同，由分子间β折叠的氢键相连的Aβ蛋白分子双体是紧密连结较难分开成单体的，或可称纠缠的Aβ蛋白分子双体(misfolded dimer, MD)。纠缠的Aβ蛋白分子双体(misfolded dimer,MD)上下对齐层叠就形成了Aβ蛋白纤维，Aβ蛋白分子双体层叠结集就可形成Aβ蛋白聚集沉淀。蛋白质双层叠型结构复制连结模型提供了解释Aβ蛋白纤维和Aβ蛋白聚集沉淀的理论基础。
(3)淀粉样纤维和淀粉斑的形成的可能机理
有研究报道Aβ10-42aa是形成β折叠的中心区,而Aβ1-9aa暴露在纤维表面并参与纤维间的相互作用。通过对Aβ分子N未端进行切割，发现Aβ1-9aa对纤维的形成是不必要的(Hilbich et al.,1991)。用FTIR进行测试发现Aβ10-23和 Aβ29-42都能形成β折叠，后来又发现能形成纤维的最小区域是Aβ14-23，这一区域的切除和置换都会导致纤维形成能力的丧失，表明这一序列对β折叠十分重要，是形成Aβ纤维的中心。
一般认为，成核阶段是纤维和淀粉斑形成的重要过程。Aβ淀粉样纤维形成过程一般需要经过:(1)核化阶段；(2)原纤维；(3)纤维化等三个过程。而Aβ淀粉样沉聚也经过三个不同的过程:(1)核化阶段；(2)聚集阶段；(3)淀粉斑形成。如图2所示，在核化阶段中，Aβ分子单体内的β折叠分开，氢键断开，在Aβ分子单体内形成正负两个β层叠(β1与β2)，直线状的Aβ蛋白分子正负β层叠与另一直线状的Aβ蛋白分子负正β层叠重新配对结合，形成Aβ蛋白分子双体；在外观上是直径最小的球型的种子(seed)(Seilheimer et al.,1997；Kowalewskiet al.,1999)。Aβ蛋白分子双体上下对齐层叠就形成了直径最小的Aβ蛋白原纤维(protofilament)。在大多数情况下，Aβ蛋白分子双体与另一Aβ蛋白分子双体头碰头，就形成了Aβ蛋白四聚体，外观上是直径较大的球型的种子(seed)，或淀粉样球粒(amylospherroid,ASPD)(Hoshi et al.,2003)。当更多的Aβ蛋白分子双体连结在一起就会形成更大直径的球型的种子(seed)，寡聚体或淀粉样球粒 (amylospherroid,ASPD)。核化阶段需要一定的时间，称为延迟时间(lag time)，一旦通过这段时间，纤维的形成将大大加速(Carulla et al.,2009)。最小直径的淀粉样纤维被称为原纤维(protofilament)，由Aβ蛋白分子双体上下对齐层叠形成。较大直径的单一的淀粉样纤维也可被称为原纤维(protofilament)，推断是由Aβ蛋白四聚体(tetramer)上下对齐层叠形成。
Aβ淀粉样纤维的形态和长短大小是多种多样的(Fandrich et al.,2009)，这里有三个层次造成Aβ淀粉样纤维的形态和长短大小的多种多样性。第一层次是Aβ蛋白的一级结构不同，至少有长短不同的Aβ蛋白，核心部分是由39-43个氨基酸组成，主要是Aβ10-40和Aβ10-42；第二层次是如上面所述的Aβ蛋白的二级结构不同，β折叠的长短，数量和位置不同；第一层次和第二层次的多样性造成了Aβ蛋白单体和双体的多样性，也就是说形成Aβ淀粉样纤维的基本单位砖块 (单体或双体)的大小、形状是有不同规格。第三层次也是最主要的，Aβ蛋白分子双体与寡聚体，包括四聚体(tetramer)、多聚体有不同形状大小，相同形状大小的Aβ蛋白多体具有很强的自我识别和亲和的能力，能够自发地上下层叠聚合成不同形态大小的纤维(Hilbich et al.,1991；Snyder et al.,1994)。或许是Aβ蛋白多体上下二面带有不同的电荷，形成上下两面正负极性。电荷吸引力(静电作用) 促进Aβ蛋白多体自发地上下层叠聚合成不同形态大小的纤维。
在体内很多情况下，球型的种子(seed)，淀粉样球粒(amylospherroid,ASPD) 或Aβ蛋白分子双体，四聚体、六聚体、多聚体等不规则积聚就形成了淀粉斑。
原子力显微镜为本发明提供了关于淀粉样纤维的形成的信息(Lyubchenko etal.,2010)。在纤维形成的早期，可以看到很多大小不一的有序聚集体或原纤维(Seilheimer et al.,1997)。随着时间的推移，大约5或6根原纤维环绕成一个中空的园柱体，每根原纤维的直径大约为(Inouye et al.,1993；Fraser et al., 1991)。在聚集的过程中先出现小的寡聚体，包括球型的种子(seed)，淀粉样球粒 (amylospherroid,ASPD)或Aβ蛋白分子双体，四聚体、多聚体，然后形成原纤维再形成纤维，当然Aβ蛋白分子双体，四聚体、多聚体也有可能自发地上下层叠聚直接合成不同形态大小的纤维。
蛋白质双层叠型结构复制连结模型既可解释短少五个氨基酸多肽片段 iAβ5(LPFFD)可以抑制老年痴呆病关键致病源类淀粉样蛋白Aβ1-40和Aβ1-42 的积聚的原因，又可解释光靠利用iAβ5(LPFFD)也无法开发成治疗老年痴呆病药物的原因。根据本发明人的蛋白质双层叠型结构复制连结模型理论，五个氨基酸多肽片段iAβ5(LPFFD)实际上类似于Aβ分子N-端的β1片段，可以与直线状的原互补的C-端β2片段结合，因此竞争性地抑制了另一直线状的Aβ分子与之结合，从而在某种程度上抑制了Aβ双层叠型双体的形成，也就抑制了Aβ蛋白纤维和Aβ蛋白聚集的形成，如图3所示。值得注意的是iAβ5只能与N-端的β2结合,无法与另一激活的β层叠区(β1)结合，故无法100％地抑制被激活的β层叠区(β1和β2)，这可解释光靠利用iAβ5(LPFFD)也无法开发成治疗老年痴呆病药物的原因。本发明不但在理论上有所创新，在应用上也有所创新，本发明的多肽药物中要研发既抑制β2层叠区，又要抑制β1层叠区，并且尝试使用类淀粉状蛋白沉积抑制剂混合剂共同作用，这是本发明的原理和创新点。
因此，发明人经过多次的实验，得到一种能够有助于治疗老年痴呆症的多肽，该多肽包括以下氨基酸序列中的任意一种：
1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
4)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
5)如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
6)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
7)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
多肽也可以是由如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.7中任一种所示的氨基酸序列的取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明还提供了一种药物组合物，药物组合物包含如上所述的多肽。
实施例一：固相多肽合成法合成多肽
固相合成，树脂的选择及活化处理，从吉尔生化(上海)有限公司购买；取二氯树脂1.5g,加入到用DCM浸泡过的反应柱中,用DCM15ml浸泡30min使树脂充分膨胀,以活化待用；称取Fmoc-Cys(Acm).OH 0.31g于DCM中溶解, 再加入DIEA0.5ml混合加入反应容器中,吹N2反应2hr,将反应液过滤加入 MeOH 5ml封闭反应1hr后,用DCM异丙醇DMF各洗涤3次；脱除氨基保护基,加入约15ml20％呱啶的DMF溶液反应5min,过滤,再加入15ml反应20min 后用异丙醇洗涤树脂2次,DMF洗涤树脂3次；肽健的形成,称取 0.55gFmoc-Trp(600)-OH,0.35gTBTU以DMF溶解,与0.6mlHoBt(2mol/L)0.2ml DIEA混合加入盛有树脂；N端是乙酰化,C端是氨基化,用MBHA树脂,注意在使用DCM时,在此之前不可以在反应釜中添加DIPF(去保护试剂)；反应不能超过85℃，合成反应完后，切割，冰乙醚沉淀,置冰箱2hr,离心收集,经HPLC分离纯化,冷冻干燥,成品存-80℃冰箱保存,HPLC纯化,柱层析,肽纯度,50％ w/w 95％,准备多肽标记及修饰技术,特别是荧光标记(FAM,FITC)和生物素标记技术。
实施例二：固相多肽合成法合成多肽
多肽合成仪采用美国AB1431A型,多肽固相合成，树脂的选择及活化处理，从吉尔生化(上海)有限公司购买。N端是乙酰化，C端是氨基化，用MBHA树脂，注意在使用DCM时在此之前不可以在反应釜中添加DIPF(去保护试剂)。反应不能超过85℃，合成反应完后，切割、冰乙醚沉淀、置冰箱2hr，离心收集。
多肽合成其实就是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端(C端) 向氨基端(N端)合成。过去的多肽合成都是在溶液中进行的，现在固相合成法已经成为合成多肽和蛋白质的一个常用方法，它的许多方面是传统液相合成方法无法做到的。固相合成多肽的基本原理是：以不溶性高分子树脂作为固相载体，首先在固相载体上以共价键连接一个含有被封闭基团保护的氨基的氨基酸，然后以三氟乙酸作为脱保护剂，脱掉氨基的保护基，这样在固相载体上就连接上了第一个氨基酸。将上了保护基的第二个氨基酸的羧基通过用过量的活化羧基组分活化，羧基被活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体上的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复(缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合)操作，使肽链从C 端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后用三氟乙酸将合成好的多肽从树脂上切割下来。
2-Cl-Trt树脂(美国Aldrich公司)；HMP resin,FMOC-AA, FMOC-L-LYS(Boc)-OH[9-芴甲氧羰基(叔丁氧羰基)左旋赖氨酸，美国Aldrich 公司]；FMOC-L-ALA-OH(9-芴甲氧羰基左旋丙氨酸，美国Aldrich公司)； FMOC-L-PRO-OH(9-芴甲氧羰基左旋脯氨酸，美国Aldrich公司)；MeOH(甲醇，上海巴斯夫)；NMP,DMF(N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫)；20％哌啶 -DMF(20％哌啶-N，N-二甲基甲酰胺，上海巴斯夫)；DCM(二氯甲烷，中国医药集团上海化学试剂公司)；HCTU(6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯，上海A.R.吉尔生化有限公司)；HOBt(1-羟基苯并三氮唑，上海A.R. 吉尔生化有限公司)；1％TFA/DCM(1％三氟乙酸/二氯甲烷，上海A.R.吉尔生化有限公司)；DIEA(N，N-二异丙基乙胺，上海A.R.吉尔生化有限公司)。 Piperidine,HOBT,DCC,TFA,EDT,500mL单口烧瓶(北京兴运玻璃仪器制品厂)；磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)；磁子(北京市化玻供应公司)；温度计(北京兴运玻璃仪器制品厂)；气球；布氏漏斗(北京兴运玻璃仪器制品厂)；滤纸；抽滤瓶(北京兴运玻璃仪器制品厂)；洗瓶；岛津瓶(日本岛津公司)； LC-MS液质联用仪(LC-20AD，LCMS-2010EV，日本岛津公司)；缓冲球(上海贝凯生物化工设备有限公司)；旋转蒸发仪(BC-R203上海贝凯生物化工设备有限公司)。铝箔；冰；微波盒。
固相载体是将固相合成与其他合成技术分开来的最显著的区别，能用于多肽合成的固相载体必须满足以下的要求：⑴载体必须空间位阻小，便于溶剂的渗透，使其可以在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；⑵载体上必须有足够的反应位点，能使氨基酸共价连接在这些位点上，并在合成反应结束后，裂解这种共价键，以使得每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用；⑶另外载体必须在合成中表现为反应惰性，对合成过程中的物理和化学条件稳定。固相法合成多肽的高分子载体(树脂)主要有三类：聚丙烯酰胺类树脂、交联聚苯乙烯类树脂、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物。只有将这些树脂导入反应基团，才能直接连上第一个上了保护基的氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又将这些树脂及树脂衍生物分为羧基树脂、氯甲基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。
FMOC固相合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂作为固相载体，用的是 2-Cl-Trt树脂。其步骤是：将2-Cl-Trt树脂(1.00g，1.00mmol)和DIEA(516mg， 4.00mmol)加入到无水的DCM(20mL)中混合，然后将 FMOC-L-LYS(Boc)-OH(1.40g，3.00mmol)溶于无水的DCM(30mL)中，在0℃条件下，将后者加入到前者中，在室温下搅拌5小时。最后，将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物中加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)，在室温下搅拌过夜，以脱掉FMOC 保护基。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(30mL)，DCM(30mL)洗涤三次，干燥后得到产物A1。现象：滤液呈黄色，滤液加水有白色沉淀产生。
A2产物的合成步骤是：将FMOC-L-ALA-OH(933mg，3.00mmol)加入到无水DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol) 和DIEA(516mg，4.00mmol)的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌30min。将产物A1(1.00mmol)溶于DMF(30mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。称10～20mg吸附在树脂上的样品于微量离心管中，用1％TFA/DCM清洗树脂，抽滤。将滤液进行浓缩，若残渣不溶于甲醇中则采取ELSD来检测反应是否完成。将上述所得产物中加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)，DCM(50mL)洗涤三次，干燥后得到产物 A2。
A3产物的合成步骤是：：将FMOC-L-PRO-OH(3.00mmol)加入到无水 DMF(20mL)中，混合后将HCTU(1.24g，3.00mmol)，HOBt(405mg，3.00mmol) 和DIEA(516mg，4.00mmol)的混合液在0℃条件下加入其中，并在室温下搅拌 30min。将产物A2(1.00mmol)溶于DMF(30mL)后加入到上述反应液中，室温下搅拌1.5h。当ELSD检测后显示该反应完成，则将反应液进行抽滤，滤饼分别用DCM(30mL)，DMF(30mL)，MeOH(30mL)洗涤三次。将上述所得产物加入含有20％的哌啶-DMF(30mL)中，在室温下搅拌过夜。将反应液进行抽滤，滤饼分别用DMF(50mL)洗涤三次，DCM(50mL)洗涤两次，干燥后得到产物A3。
制备产物A4，A5的反应过程与制得A3的操作方法相同。
将TFA(1％，10mL)加入到无水DCM(20mL)中，混合后产物A5加入到其中，在室温下搅拌1h。将反应液进行抽滤，然后滤液用与无水DCM(20mL) 混合的20％DIEA来中和，测酸碱值，溶液浓缩后既得终产物。用LC-MS液质联用仪来检测。色谱条件：流动相(90％甲醇+10％水)；流速(0.2mL/min)；扫描时间(4min)；离子源模式：电喷雾电离(ESI)，正离子模式；质量分析器：三重四级杆。方法：各阶段均取适量产物于微量离心管中，用甲醇稀释后混匀。取适量于岛津瓶中，送检，进样量为1μL。经HPLC分离纯化、冷冻干燥。成品存-80℃冰箱保存。准备多肽标记及修饰技术，特别是荧光标记(FAM，FITC) 和生物素标记技术。
实施例三：采用基因重组表达合成多肽
利用基因工程技术利用益生菌和酵母分泌生产本发明的多肽药物，并利用酸奶、固体饮料、啤酒等方法将利用益生菌和酵母在肠道内生长繁殖连续不断地分泌生产各种疾病预防和治疗性多肽药。应用基因工程技术构建益生菌和酵母多肽药和疫苗载体，将抗原基因和细胞因子基因克隆到益生菌和酵母质粒上。经益生菌和酵母转化后筛选出含有表达目的基因的多肽药产品作为种子多肽药冻存保种，种子多肽药放大培养。
效果验证实验
阳性药物：脑复康片(吡拉西坦片，生产厂家：湖北华中药业有限公司，批号：20060812，0.4g/片，人用量为4.8g/kg/d)
实验动物：SAMP8早衰老小鼠，SAMR1正常小鼠，雌雄各半，18-22g，7 月龄。
实验仪器：电子天平(型号：AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；天然药物分离纯化器(BUCHI Syncore)；小鼠跳台仪(XZC-5Q型，山东省医学科学院设备维修供应站)；Y型水迷宫。
数据统计：各组的数据用SD X±表示，采用单因素方差检验进行分析。两组间用t检验进行分析。
对比实验一:鼻腔给药对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响
各取本发明实施例1制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在上述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组 (0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药，记录各组的生长存活期，结果见表1。
表1 鼻腔给药对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的生长存活期实验结果
| 组别 | 生长存活期(天) |
| 正常对照组(SAMR1) | 88** |
| 药物阳性对照 | 52* |
| 实验组1 | 57** |
| 实验组2 | 56** |
| 实验组3 | 53* |
| 实验组4 | 53** |
| 对照组 | 45 |
*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01
实验结论：结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的生长存活期实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的生存能力提高了。实验组1(原液1)的生长存活期实验结果稍比药物阳性对照组,实验组2,3,4(原液2,3,4)好。
对比实验二:注射对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的影响
各取本发明实施例1制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水0.5ml/100g腹腔注射)、药物阳性对照组 (0.72g/kg腹腔注射)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水0.5ml/100g腹腔注射)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上腹腔注射，小鼠以腹腔注射的方式连续给药20天，0.5ml/100g的剂量腹腔注射，以后观察小鼠停药后生长至死亡，记录每只小鼠的生长存活期，将同组内10只小鼠的生长存活期的平均值作为该组的最终结果，结果见表2。
表2 注射对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠存活期的生长存活期实验结果
| 组别 | 生长存活期(天) |
| 正常对照组(SAMR1) | 88** |
| 药物阳性对照 | 52* |
| 实验组1 | 56** |
| 实验组2 | 53** |
| 实验组3 | 54* |
| 实验组4 | 52** |
| 对照组 | 46 |
*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01
实验结论：结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的生长存活期实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的生长存活能力提高了。实验组1(原液1)的生长存活期实验结果稍比药物阳性对照组,实验组2,3,4(原液2,3,4)好。
对比实验三:对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠跳台实验的影响
各取本发明实施例1制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组 (0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药。每天一次，第20天训练。于训练前1小时给与药物。每批实验各组有1只小鼠给药，平行操作，以此类推。训练时将第一批的5只小鼠分别放入跳台仪的5个格子内，先适应环境3分钟，然后通电，小鼠受电击后，多数跳上跳台，逃避电击。动物多数再次跳下平台时以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应，训练5分钟，并记录5分钟内触电次数，24小时后重新测试，以潜伏期及触电次数为观察指标记录测试成绩，结果见表3。
表3 跳台实验结果
| 组别 | 训练成绩(错误次数) | 潜伏期(秒) | 测验成绩(错误次数) |
| 正常对照组(SAMR1) | 3.0±1.7** | 236.3±94.6** | 1.2±0.9** |
| 药物阳性对照 | 9.0±2.3 | 148.6±105.9* | 3.4±1.2** |
| 实验组1 | 8.2±3.6 | 158.3±120.8* | 4.6±2.5* |
| 实验组2 | 10.0±2.5 | 145.6±110.6* | 6.6±2.1* |
| 实验组3 | 8.0±2.6 | 151.6±110.6* | 5.2±3.1* |
| 实验组4 | 9.3±3.1 | 179.3±112.4* | 6.3±2.6* |
| 对照组 | 13.9±2.6 | 112.6±115.3 | 8.9±3.6 |
*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01
实验结论：结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的跳台实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的学习记忆能力提高了。实验组2(原液1)的跳台实验结果稍比药物阳性对照组好但比实验组1,3,4(原液1,3,4)好。
对比实验四：对正常小鼠及SAMP8衰老小鼠Y型水迷宫实验的影响
各取本发明实施例一制备的得到用于老年期痴呆的多肽药剂0.5mg，在所述药物中分别加入5倍,10倍,15倍,20倍的蒸馏水配成原液1、原液2、原液3、原液4。实验共60只小鼠，随机分为6组，每组10只动物，分别为正常对照组(10只SAMR1小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、药物阳性对照组 (0.72mg/kg鼻腔给药)，对照组(SAMP8小鼠正常生理盐水20μl/20g鼻腔给药)、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别为用原液1、原液2、原液3、原液4早上鼻腔给药，小鼠以鼻腔给药的方式连续给药20天，20μl/20g的剂量鼻腔给药。于20天给药后1h开始进行Y型水迷宫训练。小鼠放在水温27±2℃、水深10cm的Y型水迷宫中，一侧有平台，以小鼠在15秒内抵达平台为正确反应，抵达平台后休息10秒再重复训练，每只小鼠共训练10次，计算其正确反应率，24小时后测试其记忆保持情况，48小时后测试其记忆巩固情况。将同组内10只小鼠的正确反应率的平均值作为该组的最终结果，结果见表4。
表4 Y型水迷宫实验结果
| 组别 | 第一天正确反应率 | 第二天正确反应率 | 第三天正确反应率 |
| 正常对照组(SAMR1) | 91％** | 92％** | 93％** |
| 药物阳性对照 | 89％* | 91％** | 92％** |
| 实验组1 | 84％* | 80％* | 88％* |
| 实验组2 | 72％* | 75％* | 86％* |
| 实验组3 | 73％* | 76％* | 85％* |
| 实验组4 | 75％* | 82％* | 82％* |
| 对照组 | 50％ | 57％ | 54％ |
*与对照组相比P<0.05，**与对照组相比P<0.01
实验结论：结果表明药物阳性对照组、实验组1(原液1)至实验组4(原液4)的Y型水迷宫实验结果比对照组有显著差异(P<0.05),说明用药后小鼠的学习记忆能力提高了。实验组4(原液4)的Y型水迷宫实验结果稍比药物阳性对照组差但比实验组1,2,3(原液1,2,3)好。
综上所述，本发明所述的多肽药物通过鼻腔给药、静脉注射或脑室注射单独使用或共同使用于患有老年痴呆症病的小鼠，均显示出良好的效果，可以延长老年痴呆症的小鼠的存活期，因此本发明的多肽药物可作为治疗老年痴呆症的候选药物，为联合使用多种药物提供可能性，具有广泛的临床应用价值。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 横琴欣健生物科技研究院有限公司
<120> 一种治疗老年痴呆症的多肽药物
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Leu Pro Phe Phe Asp
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
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Lys Leu Val Phe Phe
1 5
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Lys Leu Pro Phe Phe Asp
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Val Gly Gly Val Met
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Gly Leu Met Pro Gly
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Gly Pro Met Val Gly
1 5
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
1 5 10 15
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly
20
Claims (3)
1.一种多肽，其特征在于：所述多肽包括以下氨基酸序列中的任意一种：
1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
3)如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
4)如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
5)如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
6)如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
7)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽为由如SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.7中任一种所示的氨基酸序列的取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
3.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1所述的多肽。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190621 |
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