CN109906979A - 一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种斑马鱼高胆固醇模型的构建方法，其包括如下步骤：S1、斑马雌雄成鱼以1:2～2:3的比例置于交配盒，交配后收卵，将健康的卵在28℃恒温培养，5天后显微镜下挑选健康斑马鱼幼鱼；S2、在蛋黄粉中添加胆固醇制作高胆固醇饲料，将不添加胆固醇的蛋黄粉作为普通饲料，用于饲养所述健康斑马鱼幼鱼；S3、将斑马鱼幼鱼用高胆固醇饲料连续培养后，同时用普通饲料喂养的斑马鱼幼鱼作为对照组，斑马鱼血管胆固醇积累量显著性高于对照组时，斑马鱼高胆固醇模型建成。本发明构建的斑马鱼高胆固醇模型的方法具有经济、简便、稳定、可靠等优点，斑马鱼高胆固醇模型可用于高血脂及其并发症的药物筛选、毒性评估和机制研究等方向。

Description

一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法

技术领域

本发明涉及一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

高血脂症是一种慢性脂代谢紊乱疾病，是心血管类疾病发生的主要危险因素。也是糖耐量异常、高血压、糖尿病的一种重要危险因素，还可导致脂肪肝、高尿酸血症、肝硬化、胰腺炎、胆石症、眼底出血、周围血管疾病、失明、跛行等症。胆固醇模型的建立为胆固醇症与其相关疾病的防治及发病机制的研究提供了重要的工具。

目前国内外关于高血脂模型的建立方法有多种，最常用的模式动物是鼠和兔。鼠应用广泛，易获取、易饲养、生理结构与人类极为相似。朱磊等通过向SD大鼠喂食不同配方的高脂饲料以确认肥胖模型建立的最佳方法，最终认为45％脂供能高脂饲料喂食6周是最经济的建模方案。陈剑峰等在高脂饲料中添加膨润土提高高脂饲料的硬度和可食性，证明了喂养8周后膨润土高脂饲料诱导SD大鼠高血脂症更优于普通高脂饲料组。兔为草食性动物，对高脂饮食非常敏感，也是研究者们建立高血脂模型偏爱的对象。由于饲料的配方和饲养的方法不同，建模时间长短也因人而异。游晓庆等认为新西兰兔经高脂膳食诱导6周可成功建立高血脂模型，而吴韫宏等利用健康雄性新西兰白兔经自配高脂饲料喂养5周建立了高血脂模型。鼠兔在高血脂模型建立方面各有独特的优势，但其避免不了周期长、成本高、不易活体观察和大规模实验的劣势。高脂饲料是高血脂模型建立常用食物，对于哺乳动物和鸟类动物而言只要对其长时间进行高脂饲料喂食高血脂模型便会在一定时期内建立成功，并且实验期间并不会严重影响其生命活动。而斑马鱼幼鱼体型小生命脆弱，且生活在食物的水环境中，食物的投喂量和喂食时间均有可能影响幼鱼的健康生长。目前虽然也有少数学者利用斑马鱼建立高血脂模型，但方法存在有弊端，主要存在检测之后，说明模型建立成功，但是斑马鱼已经是死体，不能用于后续药物筛选。本发明主要探究一种稳定可靠的斑马鱼高胆固醇模型建立方法，模型建立检测后为活体，为高血脂及其并发症的药物筛选、毒性评估和机制研究提供重要工具。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法，其包括如下步骤：

S1、斑马鱼雌雄成鱼以1:2～2:3的比例置于交配盒，交配后收卵，将健康的卵在28℃恒温培养，之后显微镜下挑选健康斑马鱼幼鱼；

S2、在蛋黄粉中添加胆固醇制作高胆固醇饲料，将不添加胆固醇的蛋黄粉作为普通饲料，用于饲养所述健康斑马鱼幼鱼；

S3、将斑马鱼幼鱼用高胆固醇饲料连续培养后，同时用普通饲料喂养的斑马鱼幼鱼作为对照组，斑马鱼血管胆固醇积累量显著性高于对照组时，斑马鱼高胆固醇模型建成。

其中，斑马鱼血管胆固醇积累量显著性高于对照组时，是指t检测统计分析的P<0.05。

在一优选地实施方案中，在步骤S1中，所述交配的时间为1.5h后收卵，所述培养的时间为5天。

在一优选地实施方案中，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料中胆固醇在蛋黄粉中的添加量为质量百分比2.5％～12.5％。

在一优选地实施方案中，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料的每天的喂养量为1.4mg/尾～3.2mg/尾。

最优选地，所述高胆固醇饲料中胆固醇在蛋黄粉中的添加量为质量百分比5％，所述高胆固醇饲料的每天的喂养量为2mg/尾。

在一优选地实施方案中，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料中还添加胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物添加比为10μg/g。

进一步地，所述胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物为CHOLESTERYL BODIPY 524/563C11，在波长为524、563nm进行检测，产生红色荧光，在饲料添加比为10μg/g，乙醚为有机助溶剂，避光下在通风柜通风处理20h使乙醚完全挥发。

在一优选地实施方案中，在步骤S3中，所述连续培养为在28℃恒温培养8～10天。

在一优选地实施方案中，在步骤S3中采用只喂养添加有10μg/g的胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物的蛋黄粉为对照组，培养后共聚焦或体视荧光显微镜实时观察幼鱼尾部血管胆固醇积累量，若其尾部血管胆固醇积累量显著低于高胆固醇饮食组(P<0.05)，说明高胆固醇饮食诱导幼鱼血脂升高成功。

在一优选地实施方案中，在步骤S2中，所述蛋黄粉为将新鲜鸡蛋煮熟，取出蛋黄，压碎后冷冻干燥器处理得到蛋黄干粉。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

本发明提供的斑马鱼高胆固醇模型建立的方法，采用AB系野生型和转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼作为实验动物，向纯蛋黄干粉中添加不同百分比的胆固醇配制成高胆固醇饲料，以共聚焦或体视荧光显微镜实时观察和幼鱼体内的生理生化指标作为高脂血症模型的评估手段。研究证实增加饲料中胆固醇百分比可引起幼鱼血脂升高，并且适量增加投喂量可以加快幼鱼血管脂质沉积；5％高胆固醇饮食模型组在70ml培养皿中，喂养30尾斑马鱼，每次喂养30mg，喂养8～10天可成功建立成高胆固醇斑马鱼模型。

与现有技术相比，本发明的建立的高胆固醇斑马鱼模型可在活体情况下，用于降脂药物的实验实时观察；本发明可以根据控制饲料胆固醇百分含量和饲料投喂量来控制高脂血症建模时间，进而用于急性或亚急性降脂药物的探究，或环境污染物急性或亚急性暴露时对生物体内脂代谢毒性效应的评估。

附图说明

图1为转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼尾部血管脂质沉积情况；其中，A.普通饲料对照组(Control)和5％高胆固醇饮食模型组(5％HCD)的共聚焦显微镜图像；B.斑马鱼幼鱼在添加不同百分比的胆固醇(2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％)饲料下饲养10天后，感兴趣区内红色荧光光密度平均值对普通饲料对照组的相对值(n＝3)；C为体视荧光显微镜下，对照组(Control)和5％胆固醇模型组(5％HCD)幼鱼尾部血管脂质沉积，红色距框为感兴趣区；D.来自图C中5％胆固醇模型组感兴趣区内红色荧光光密度平均值对普通饲料对照组的相对值(n＝25)；

图2A为5dpf转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼经不同投喂量5％的高胆固醇饲料(7、21、35、49、63和77mg)喂养1天后，感兴趣区内红色荧光光密度平均值的相对值；

图2B为5dpf野生型AB系斑马鱼幼鱼经不同投喂量5％的高胆固醇饲料(7、21、35、49、63和77mg)喂养10天后的生存率；

图3为5％高胆固醇饮食对幼鱼体长体宽的影响示意图；其中，A为普通饲料组和5％胆固醇模型组幼鱼的平均体长，B为普通饲料组和5％胆固醇模型组幼鱼的平均体宽，C为测量方法(n＝15)；

图4为5％高胆固醇饮食对幼鱼体内生化指标的影响示意图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法，具体采用如下方法：

1.斑马鱼挑选

将健康AB系雌雄斑马成鱼以2:1的比例置于交配盒，用隔板隔开。次日早上八点拿开隔板，交配1.5h后收卵。显微镜下挑出健康的卵置于1×E3培养液中28℃恒温培养，每天换一次水，5天后显微镜下挑选健康斑马鱼幼鱼用于实验。

实验所用转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼获取：与野生型斑马鱼配鱼方法相同，受精48小时后(48hpf，hours post fertilization)的斑马鱼用体视荧光显微镜挑选出血管具有绿色荧光蛋白表达的健康斑马鱼幼鱼置于28℃恒温培养箱中继续培养。将受精5天后的健康转基因斑马鱼幼鱼分选出用于实验。

2.高胆固醇饲料制备

将新鲜鸡蛋煮熟，取出蛋黄，压碎分装进50mL离心管中，冷冻干燥器处理3天得到蛋黄干粉，在蛋黄干粉中添加一定质量百分比(2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％)的胆固醇制作高胆固醇饲料(HCD，high cholesterol diet)，纯蛋黄干粉为普通饲料，乙醚为助溶剂，高胆固醇饲料和普通饲料都经过乙醚挥发处理。转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼所用的高胆固醇饲料和普通饲料均加一种胆固醇示踪剂红色荧光胆固醇酯类似物CHOLESTERYLBODIPY 524/563C11(Invitrogen)，添加比例按10μg/g进行添加，乙醚为有机助溶剂。在通风橱内磁力搅拌45min，通风处理使乙醚完全挥发。

3.斑马鱼幼鱼共聚焦荧光或体视荧光拍照

(1)实验方法

Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼随机分为普通饲料组(胆固醇0％)和高胆固醇饮食(含2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％的胆固醇)模型组，每组30尾鱼，70mL1×E3培养，每次喂食30mg，每天喂食两次，28℃恒温培养。在连续喂养10天后，用甲基纤维素凝胶将普通饲料喂养组或高胆固醇饮食模型组中的斑马鱼侧面平直固定在载玻片上，用共聚焦或体视荧光显微镜对幼鱼尾部进行活体图像采集，并用imageJ软件或蔡司ZEN分析软件对特定尾部动脉感兴趣区的红色荧光光密度进行数据处理。

(2)实验结果

(a)、高胆固醇饮食对斑马鱼幼鱼尾部动脉血管脂质积累影响

如图1A所示为普通饲料对照组(Control)和5％高胆固醇饮食模型组(5％HCD)的共聚显微镜图像，其中，EGFP表示加强型绿色荧光蛋白示踪血管，Dil表示红色荧光胆固醇示踪剂示踪血管内胆固醇，Merge表示两者荧光标记融合图像。图1B数据来自于共聚焦图像处理，表示为高胆固醇饮食模型组(含胆固醇的质量百分比为2.5％、5％、7.5％、10％和12.5％)和普通饲料组(0％)幼鱼尾部动脉血管感兴趣区红色荧光光密度平均值的比值，图中a、b、c表示显著性水平差异性，P<0.05。结果显示，与普通饲料组相比，高胆固醇饲料模型组光密度平均值的相对值均极显著性(p<0.01)增加，且随着高胆固醇饲料中添加的胆固醇比例的增加，光密度平均值也随之增加。

(b)、同时，将健康的5dpf转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼随机分为普通饲料对照组(Control)和5％胆固醇饮食模型组(5％HCD)，每组30尾，70mL1×E3培养，每次投喂量选择30mg，每天喂食两次。在连续喂养10天后利用荧光体显微镜对斑马鱼幼鱼的血管脂质沉积量进行了图像采集，结果如图1C所示，此图表示对照组(Control)和5％胆固醇模型组(5％HCD)幼鱼尾部血管脂质沉积，绿色荧光来自血管内皮细胞，红色荧光来自血管脂质，红色距框为感兴趣区。图中可以直观观察到斑马鱼尾部感兴趣区内5％HCD红色荧光光密度大于Control组。图1D数据来自于体视荧光显微镜图像处理，表示为5％模型组与普通饲料组幼鱼尾部动脉血管感兴趣区红色荧光光密度平均值的比值，其结果与共聚焦结果相似，模型组幼鱼尾部动脉血管感兴趣区红色荧光光密度平均值是普通饲料组的1.2倍，并表现出极显著性差异(p<0.01，n＝25)。以上结果表明5％高胆固醇饮食可以促进斑马鱼血管脂质积累。

实施例2高胆固醇饲料投喂量改变对斑马鱼幼鱼体内血管脂质水平影响

本实施例中，受精5天后(5dpf,days post fertilization)的转基因Fli1-EGFP斑马鱼幼鱼随机分为6组，每组30尾鱼，每组分别每次饲喂5％高胆固醇饲料7、21、35、49、63和77mg。每天喂食两次，70mL 1×E3培养。如图2A所示为喂养一天后不同投喂量幼鱼尾部动脉血管感兴趣区红色荧光光密度平均值与最低投喂量(7mg)组的比值。由图可知，随着投喂量的增加，幼鱼尾部动脉血管感兴趣区红色荧光光密度平均值的相对值先增加后趋于平缓，且高投喂量(35、49、63和77mg)组极显著性高于低投喂量组(7和21mg)(p<0.01)，但高投喂量组(49、63和77mg)之间并没有显著性差异(p>0.05，n＝17)；图2B为喂养10天后各投喂量组的平均生存率，由图可知投喂量越大生存率越小，且投喂量大于49mg后，增加投喂量会明显降低斑马鱼幼鱼的生存率(P<0.05，n＝3)。结果表明增加高胆固醇饲料投喂量会加快斑马鱼幼鱼血管脂质积累，但投喂量过高会影响其生存率。

实施例3斑马鱼幼鱼体长体宽测量

健康的5dpf野生型AB系斑马鱼幼鱼随机分为普通饲料组和5％高胆固醇饮食模型组，每组30尾鱼，70mL1×E3培养，每次投喂量选择30mg，每天喂食两次。在连续喂养10天后，用ImageJ软件/蔡司ZEN分析软件测量体长体宽。体长是从斑马鱼幼鱼吻端到尾鳍基部的长度，体宽是垂直于后部主要静脉且泄殖腔之前第四至第五体节位置从背部顶端到主要静脉下皮细胞的宽度。

利用体视荧光显微镜对普通饲料组和模型组随机所选的幼鱼整体进行图像采集，如图3C所示。如图3A所示为普通饲料组和模型组幼鱼的平均体长。与普通饲料组幼鱼相比，模型组体长有所增加，但没有显著性差异(p>0.05，n＝15)。图3B为普通饲料组和模型组幼鱼的平均体宽，模型组体宽极显著性地高于普通饲料组(p<0.01，n＝15)，C为测量方法，注：图中Control/0:普通饲料对照组；5％HCD/5:5％高胆固醇饮食组；`X±SE，与Control组相比，**P<0.01。以上结果表明高胆固醇饮食可以促进斑马鱼幼鱼侧面生长，但对体长没影响。

实施例4斑马鱼幼鱼血脂生化指标检测

5dpf野生型AB系斑马鱼幼鱼随机分为普通饲料组和5％高胆固醇饮食模型组，每组30尾，70mL1×E3培养液28℃恒温培养，每次投喂量选择30mg，每天喂食两次。在连续喂养10天，空腹36h后收样，将其保存在-80℃超低温冰箱直至使用时取出。组织样本处理方法：每条幼鱼重量以1mg计算，按重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例加入生理盐水，冰水匀浆液于2500rpm下离心10min，取上清液，用于总胆固醇(TC,total cholesterol)、总甘油三酯(TG,total glyceride)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,low-density lipoproteincholesterol)的测定。取上清液稀释成1％匀浆组织用来检测各样品的总蛋白量，用于生化指标的标准化。

实验结果

检测幼鱼整体组织中的TC、TG和LDL-C水平，如图4所示。结果显示，模型组幼鱼组织中TC和TG水平极显著性高于普通饲料组(p<0.01)，LDL-C水平也显著性高于普通饲料组(p<0.05)。以上结果表明高胆固醇饮食可以促进幼鱼体内脂质水平显著升高。

上述实验数据说明本发明中采用5％高胆固醇饮食模型组喂养斑马鱼幼鱼，建立斑马鱼高胆固醇模型，高胆固醇饲料中添加胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物，说明斑马鱼高胆固醇模型可用于后续降脂药物实验的研究，可在其活体条件下采用体视荧光显微镜实时观察其降脂的研究。

现有技术中李春启等人的研究是通过给斑马鱼喂食不同剂量浓度的纯蛋黄干粉建立斑马鱼高脂血症模型，但喂养量过高，不利于斑马鱼幼鱼的健康生存，而本发明是在蛋黄干粉基础之上增加饲料中胆固醇的含量作为高脂饲料，可以在相对低的饲料喂养量情况下达到同等的效果，并且该方法稳定、可靠、简便。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、斑马雌雄成鱼以1:2～2:3的比例置于交配盒，交配后收卵，健康的卵在28℃恒温培养，之后显微镜下挑选健康斑马鱼幼鱼；

S2、在蛋黄粉中添加胆固醇制作高胆固醇饲料，将不添加胆固醇的蛋黄粉作为普通饲料，用于饲养所述健康斑马鱼幼鱼；

S3、将斑马鱼幼鱼用高胆固醇饲料连续培养后，同时用普通饲料喂养的斑马鱼幼鱼作为对照组，斑马鱼血管胆固醇积累量显著性高于对照组时，斑马鱼高胆固醇模型建成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述交配的时间为1.5h后收卵，所述培养的时间为5天。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料中胆固醇在蛋黄粉中的添加量为质量百分比5％～12.5％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料的每天的喂养量为1.4mg/尾～3.2mg/尾。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料中胆固醇在蛋黄粉中的添加量为质量百分比为5％，所述高胆固醇饲料的每天的喂养量为2mg/尾。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述高胆固醇饲料中还添加胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物，添加量为10μg/g。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物为CHOLESTERYL BODIPY 524/563 C11，采用乙醚作为有机助溶剂。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述连续培养为在28℃恒温培养8～10天。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中采用只喂养添加有10μg/g的胆固醇示踪剂荧光胆固醇酯类似物的蛋黄粉为对照组，培养后共聚焦或体视荧光显微镜实时观察。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述蛋黄粉为将新鲜鸡蛋煮熟，取出蛋黄，压碎后冷冻干燥器处理得到蛋黄干粉。