CN109884216A - 一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，属于药物分析领域。采用安捷伦‑1260高效液相色谱仪，采用紫外检测器，检测波长为216nm；色谱条件：色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反向色谱柱；流动相优选为体积比为80：20的乙腈与水的混合物；流速为0.8～1.2mL/min，进样量为5～15μL，柱温为20～40℃。本发明方法具有操作简便，专属性强，准确度高，精密度良好等特点，日内和日间标准偏差均不超过1.2％，因此本发明方法能够准确有效达对法尼醛进行含量测定的要求，能够准确地用于法尼醛负载的载药胶束的包封率、载药量、体外释放等实验中法尼醛含量的测试。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，更具体地说，本发明涉及一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法。
背景技术
法尼醛(Farnesal，Far)，又称为金合欢醛，属于倍半萜烯醛，主要来自柠檬草和马鞭草中，其化学名为：3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯醛，分子式为C15H24O，分子量为220.35。法尼醛的水溶性很差，几乎不溶于水，本品可由法尼醇(Farnesal)氧化或脱氢制得。研究表明法尼醛在体内无毒性，且能抑制多种细菌微生物的生长，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及白色念珠菌等。另外法尼醛还能影响变异链球菌生物膜的通透性，降低变异链球菌的糖酵解；可抑制细菌产生多糖、酸性代谢物，破坏变异链球菌的耐酸性，有研究表明法尼醛在低浓度时就对变异链球菌有良好的抑制效果。
法尼醛结构如下式一所示：
经检索，现有技术中还没有一种简单、高效且专属性强、准确度高、重复性好的体外测定法尼醛含量的方法。
基于上述理由，提出本申请。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，该方法具有操作简便，专属性强，准确度高，精密度、重复性良好等特点，能够有效达到对法尼醛进行含量测定的要求。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案如下：
一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，采用安捷伦-1260高效液相色谱仪，采用紫外检测器，检测波长为216nm，包括如下步骤：
(1)色谱条件：色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反向色谱柱；流动相为乙腈与水的混合物、或甲醇与水的混合物或乙腈与0.01％的磷酸溶液的混合物中的任一种；其中：乙腈与水的体积比为60～90：10～40，甲醇与水的体积比为60～90：10～40，乙腈与0.01％的磷酸溶液的体积比为60～90：10～40；流速为0.8～1.2mL/min，进样量为5～15μL，柱温为20～40℃；
(2)标准曲线绘制：精密称量法尼醛(对照品)适量，置于容量瓶中，用流动相溶解，并稀释至刻度，作为法尼醛标准溶液储备液，然后将所述标准溶液储备液逐级稀释成法尼醛含量为10、25、50、100、150、200、250、300、350、400μg/mL的溶液，分别按步骤(1)所述色谱条件测定，分别计算同一保留时间下的峰面积，以含量x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，做出标准曲线方程y＝f(x)，含量为10～400μg/mL；
(3)待测样品配制：精密称取待测样品适量，加流动相溶解稀释成适当浓度的溶液后，过滤；
(4)检测待测法尼醛样品中法尼醛的含量：将待测法尼醛样品溶液分别按步骤(1)所述色谱条件测试，计算同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算得出待测法尼醛样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出样品中法尼醛的含量。
进一步地，上述技术方案，所述的色谱柱选用Agilent C18柱4.6*150mm，5μm、Waters C18柱4.6*150mm，5μm或Shimadzu C18柱4.6*150mm，5μm中的一种，优选采用Agilent C18柱4.6*150mm，5μm。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述流动相优选为乙腈与水的混合物，所述乙腈与水的体积比为80：20。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述流速优选为1.0mL/min。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述柱温优选为25℃。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述进样量为10μL。
进一步地，上述技术方案，步骤(1)所述过滤优选采用0.22μm微孔滤膜。
与现有技术相比，本发明涉及的一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法的优点在于：
(1)本发明方法具有操作简便，专属性强，准确度高，精密度良好等特点，日内和日间标准偏差均不超过1.2％，因此本发明方法能够准确有效达对法尼醛进行含量测定的要求，能够准确地用于法尼醛负载的载药胶束的包封率、载药量、体外释放等实验中法尼醛含量的测试。
(2)本发明方法涉及的样品配制方便，操作简单，且本发明方法重复性好，样品平行测试的RSD不超过于1.5％。
(3)本发明回收率高，平均回收率在98.0％～102％之间，因此本发明测试方法准确度高。
附图说明
图1为本发明实施例1中法尼醛的标准曲线图。
图2为专属性考察实验中法尼醛(A)、空白胶束(B)、载药胶束(C)的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，本发明下述实施例中采用的载药胶束为PPi-Far-PMs，是利用下述方法制得：
(1)化合物1(Boc-PEG)的合成
取OH-PEG2000-NHNH2(500mg，0.25mmol)溶解在适量甲醇中，再加入1当量的三乙胺(25.3mg，0.25mmol)，使溶液冷却至0℃，缓慢加入二碳酸二叔丁酯(65.5mg,0.30mmol)，0℃下搅拌1h，再缓慢升至室温，反应24h。反应完毕，减压旋蒸去掉甲醇，剩余少量溶剂，再用大量无水乙醚沉淀。取沉淀用少量蒸馏水溶解，透析12h，真空冻干，-20℃保存。所得化合物1产率为72.4％。
化合物1的表征1H NMR，13C NMR表征结果如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm)7.01(s,1H),6.67(s,1H),4.27(s,2H),3.64(s,180H),1.45(s,9H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ(ppm)70.71,28.40.
(2)化合物2(Boc-PEG-PPi)的合成
取化合物1(500mg，0.24mmol)和溴乙酸(43.4mg,0.31mmol)共同加入到无水二氯甲烷(DCM)中，使溶液冷却至0℃，缓慢加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，2.9mg,0.024mmol)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC，54.4mg,0.26mmol)，室温磁力搅拌反应24h，过滤，减压旋转蒸发有机溶剂，剩余少量溶剂，再用水乙醚沉淀。过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，透析24h，真空冻干，-20℃保存。取三(四丁基铵)氢焦磷酸(TBAP，415.1mg,0.46mmol)溶解于适量无水乙腈中，上述反应产物(500mg,0.23mmol)缓慢滴加至溶液中。室温磁力搅拌12h，旋转蒸干有机溶剂，所得残渣溶解在适25mM的NaCl溶液中，并在NaCl溶液中透析12h。取透析后的粗产物于蒸馏水溶液中透析12h，以去除小分子NaCl，真空冻干纯化后的产物，-20℃保存。所得化合物2产率为80.7％。
化合物2的表征1H NMR，13C NMR和31P NMR表征结果如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm)4.30-4.19(m,4H),3.87(s,1H),3.62(s,180H),2.45(s,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ(ppm)155.82,70.67,69.36,68.88,65.47,64.93,28.37；31P NMR(D2O,160MHz)δ(ppm)-9.49(m,2P).
(3)化合物3(PPi-PEG)的合成
取化合物2(500mg,0.18mmol)溶解在三氟乙酸(TFA,41mg,0.36mmol)的二氯甲烷溶液中，并在0℃搅拌反应1h，旋蒸去掉有机溶剂，剩余少量溶剂，再用水乙醚沉淀。过滤，沉淀用少量蒸馏水溶解，透析12h，真空冻干，-20℃保存。所得化合物3产率为80.2％。
化合物3的表征1H NMR，13C NMR表征结果如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm)6.27(s,1H),4.27-4.21(m,4H),3.65(s,180H),1.87(s,3H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ(ppm)70.72,69.60,64.71.
(4)化合物4(PPi-PEG-hyd-Far)的合成
取化合物3(500mg,0.19mmol)和法尼醛(61mg,0.28mmol)溶解于适量甲醇中，再向反应液中加入少量催化剂乙酸。室温反应48h，向反应液中加入大量冷的无水乙醚使产物沉淀析出，减压抽滤至干，所得沉淀用二氯甲烷溶解后再用乙醚反复沉淀3次，所得沉淀真空干燥，既得产品。所得化合物4产率为79.8％。
化合物4的表征1H NMR，13C NMR表征结果如下：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm)8.63(s,1H),7.80(m,1H),6.08(s,1H),5.07(m,2H),4.33(s,3H),3.63(s,182H),2.21(s,2H),2.12(s,3H),2.03(s,2H),1.96(s,2H),1.85-1.82(m,2H),1.66(s,3H),1.57(s,6H)；13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ(ppm)136.05,131.67,124.40,124.29,123.32,123.13,72.80,70.70,70.40,69.48,40.20,39.84,26.84,26.21,25.90,17.89,17.47,16.20.
(5)化合物5(PPi-Far-PMs)的合成
精密称取4mg法尼醛，20mg Far-PEG2000-PPi，20mg mPEG2000-PLA2000将两者溶解于4mL乙腈中，55℃减压除去溶剂，得到药物与载体材料的混合薄膜；量取2mL UP水加入圆底烧瓶中，将瓶壁含药薄膜水化；超声3min，再转移至室温，并在室温下磁力搅拌12h；以0.22μm一次性注射过滤器过滤，所得透明并带有淡蓝色乳光的滤液即为载药胶束溶液(PPi-Far-PMs)，并于4℃储存，以备后续实验使用。
另外，本发明下述实施例中利用的空白胶束溶液(Blank PMs)的制备方法与上述所述载药胶束(PPi-Far-PMs)的制备方法基本相同，区别仅在于：空白胶束溶液的制备方法中未加入法尼醛，且将PEG2000-PPi替换实施例1中的Far-PEG2000-PPi，其他条件不变。
实施例1
本实施例的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，采用安捷伦-1260高效液相色谱仪，包括如下步骤：
(1)检测波长的选择
精密称取5mg法尼醛(Farnesal,Far)，置于25mL的容量瓶中，加乙腈使其完全溶解，定容，得到法尼醛储备液(100μg/mL)。量取法尼醛储备液少量，用乙腈稀释至适宜浓度，并以乙腈作为空白对照，采用紫外分光光度计在200-600nm的波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长。
通过紫外分光光度计全波长扫描，选择216nm作为UV检测波长。
(2)色谱条件
本实验采用高效液相色谱法测定法尼醛的含量。色谱柱：Agilent ZORBAXSB-C18(4.6×150mm,5μm)。流动相，乙腈：水＝80:20(v/v)；检测波长，216nm；流速，1.0mL/min；柱温，25℃；进样量，10μL。
(3)标准曲线的绘制
精密称取12.5mg法尼醛，置于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度线，得到浓度为500μg/mL的法尼醛储备液，备用。再分别精密量取0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4的法尼醛储备液置于5mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成10、25、50、100、150、200、250、300、350、400μg/mL的不同浓度法尼醛溶液。分别按步骤(2)色谱条件测定系列浓度的法尼醛溶液的峰面积，并以峰面积(A)为纵坐标对浓度(C)进行线性回归，得到标准曲线方程为A＝15146C-29860，R2＝0.9992(n＝3)。图1表明，法尼醛在浓度10～400μg/mL范围内浓度与峰面积的线性关系良好。
(4)待测样品配制：精密称取法尼醛适量，加甲醇溶解并配制至到一定浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤；
(5)检测待测法尼醛样品中法尼醛的含量：将待测法尼醛样品溶液按步骤(2)所述色谱条件测试，计算同一保留时间下的峰面积，带入步骤(3)所得的标准曲线方程，计算得出待测法尼醛样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出样品中法尼醛的含量。
样品中法尼醛含量(％)＝待测法尼醛样品溶液的浓度/(待测法尼醛取样重量*稀释因子)*100％，其中：稀释因子是样品稀释倍数的倒数。
1.1专属性考察
精密称取法尼醛适量，加甲醇溶解并配制至到一定浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤，按实施例1步骤(2)含量测定方法测定滤液中的法尼醛的含量，记录色谱图；制备载药胶束和空白胶束，分别精密量取500μL两种胶束溶液至5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，超声破乳5min后，用0.22μm微孔滤膜过滤，按步骤(2)含量测定方法测定滤液中的法尼醛的含量，记录色谱图。
专属性实验结果如图2，在步骤(2)色谱条件时，法尼醛的保留时间约10.574min，空白胶束对法尼醛的测定没有无干扰，表明该色谱条件符合含量测定条件。
1.2重复性考察
制备法尼醛的载药胶束，从中取出6份等体积样品，分别用乙腈稀释至适宜浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤，按步骤(2)下色谱条件测得法尼醛峰面积数据如表1所示。通过计算，峰面积的RSD为1.42％，即表明该色谱方法重复性良好，可用于后续实验。
表1重复性实验结果(n＝6)
1.3精密度考察
⑴日内精密度测定：精密量取一定体积的法尼醛储备液于5mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成低、中、高浓度分别为10、150、400μg/mL的不同浓度法尼醛溶液各三份。4℃储存，于不同时间点按照步骤(2)色谱条件进样检测，一天之内进样测定五次，记录色谱峰峰面积。
⑵日间精密度测定：精密量取一定体积的法尼醛储备液于5mL容量瓶中，以乙腈定容，配制成低、中、高浓度分别为10、150、400μg/mL的不同浓度法尼醛溶液各三份。4℃储存，按照步骤(2)色谱条件进样测得样品峰面积进行日间精密度来考察，在连续的五天内每一天的相同时间点进样测定，记录色谱峰峰面积。
日内精密度实验中，在步骤(2)色谱条件下按方案中的时间点将相应浓度的法尼醛溶液进样检测，测得样品峰面积如表2所示。根据峰面积计算出法尼醛溶液低浓度的日内标准偏差为0.20％，中浓度的日内标准偏差为0.43％，高浓度的日内标准偏差为1.12％，表明该方法日内精密度良好，符合分析要求。
同理，日间精密度实验中，在步骤(2)色谱条件下按方案中的时间点将相应浓度的法尼醛溶液进样测得峰面积，结果如表3所示，根据峰面积计算法尼醛溶液低浓度的日间标准偏差为0.98％，中浓度的日间标准偏差为0.82％，高浓度的日间标准偏差为1.06％，表明该方法日间精密度良好，符合分析要求。
表2日内精密度考察结果表(n＝5)
表3日间精密度考察结果表(n＝5)
1.4空白回收率
精密量取一定体积法尼醛储备液于5mL容量瓶中，加入0.5mL按处方制备的空白胶束溶液，用甲醇定容至刻度线，超声破乳5min后，用0.22μm微孔滤膜过滤，配制成低(10μg/mL)、中(150μg/mL)、高(400μg/mL)三个浓度的法尼醛溶液，每个浓度各3份，按步骤(2)含量测定方法测定滤液中的法尼醛的含量，记录色谱峰峰面积，根据所得标准曲线(A＝15146C-29860，R2＝0.9992)计算其含量及回收率。实验结果如表4所示，高中低三个浓度的法尼醛平均回收率均在98.0％～102％，RSD均小于2％。结果表明空白胶束对法尼醛不存在吸附作用，不影响法尼醛的含量测定，该方法满足测定要求。
表4回收率考察结果(n＝3)
综上所述，本发明成功建立了法尼醛体外含量测定的高效液相色谱方法，并对该方法进行验证。该方法具有操作简便，专属性强，准确度高，精密度、重复性良好等特点，能够有效达到后续对法尼醛进行含量测定的要求，以便能够准确地进行法尼醛负载的聚合物胶束的包封率、载药量、体外释放等实验。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
Claims (7)
1.一种高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：采用安捷伦-1260高效液相色谱仪，采用紫外检测器，检测波长为216nm，包括如下步骤：
(1)色谱条件：色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充物的反向色谱柱；流动相为乙腈与水的混合物、或甲醇与水的混合物或乙腈与0.01％的磷酸溶液的混合物中的任一种；其中：乙腈与水的体积比为60～90：10～40，甲醇与水的体积比为60～90：10～40，乙腈与0.01％的磷酸溶液的体积比为60～90：10～40；流速为0.8～1.2mL/min，进样量为5～15μL，柱温为20～40℃；
(2)标准曲线绘制：精密称量法尼醛(对照品)适量，置于容量瓶中，用流动相溶解，并稀释至刻度，作为法尼醛标准溶液储备液，然后将所述标准溶液储备液逐级稀释成法尼醛含量为10、25、50、100、150、200、250、300、350、400μg/mL的溶液，分别按步骤(1)所述色谱条件测定，分别计算同一保留时间下的峰面积，以含量x为横坐标，以峰面积y为纵坐标，做出标准曲线方程y＝f(x)，含量为10～400μg/mL；
(3)待测样品配制：精密称取待测样品适量，加流动相溶解稀释成适当浓度的溶液后，过滤；
(4)检测待测法尼醛样品中法尼醛的含量：将待测法尼醛样品溶液分别按步骤(1)所述色谱条件测试，计算同一保留时间下的峰面积，带入步骤(2)所得的标准曲线方程，计算得出待测法尼醛样品溶液的浓度，再通过样品的取样量计算出样品中法尼醛的含量。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述的色谱柱选用Agilent C18柱4.6*150mm，5μm、Waters C18柱4.6*150mm，5μm或Shimadzu C18柱4.6*150mm，5μm中的一种。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述流动相优选为乙腈与水的混合物，所述乙腈与水的体积比为80：20。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述流速优选为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述柱温优选为25℃。
6.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述进样量为10μL。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱测定载药胶束中法尼醛含量的方法，其特征在于：步骤(1)所述过滤优选采用0.22μm微孔滤膜。
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