CN109853045B - 一种高通量检测的基因芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量检测的基因芯片，包固相载体层和设在固相载体层上的基因芯片区，基因芯片区上设有探针阵列，探针阵列为同心圆阵列，组成同心圆阵列的相邻两个圆环上的探针点交错排列。本发明高通量检测的基因芯片的探针阵列为同心圆阵列，相邻两个圆环的探针阵列点交错排列，这样可以避免在探针合成过程中，相邻两点间的相互干扰，影响最终的信号识别，进而提高了检测的准确性；结构简洁，使用方便，降低了实验难度，提高了检测结果的准确度。

Description

一种高通量检测的基因芯片

技术领域

本发明涉及一种高通量检测的基因芯片，属于基因检测领域。

背景技术

随着人类基因组(测序)计划的实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。基因芯片检测因其高通量、检测快速高效的特征已广泛应用于疾病的诊断与治疗、药物筛选、司法鉴定、环境检测等领域。基因芯片采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地固定于与光电测量装置相结合的硅片、玻璃片、塑料片或尼龙基底等固体支持物上，形成二维阵列，与待测的标记样品的基因按碱基对配对原理进行杂交，从而检测特定基因。

利用基因芯片进行检测的实验步骤主要为：首先将遗传物质在核酸扩增反应容器中进行PCR扩增，达到一定的富集量后，将扩增产物吸出，加入到基因芯片上进行芯片探针杂交分析，杂交后对芯片进行洗脱去掉未结合的反应物，然后将芯片放入检测仪进行信号检测，最后对检测信号进行数据分析。现有的基因芯片二维陈列多是矩阵阵列，该种排列方式因为前后左右的反应小孔均相邻，在将探针固定在支持物上时，相邻探针之间的干扰较大，特别是使用原位合成法合成寡核苷酸探针，该技术主要步骤为：先使支持物羟基化，再用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护后参与反应。由于矩阵阵列相邻两个探针间的距离太近，蔽光膜透光孔间距离很小，会有光衍射问题，造成最终的杂交信号比较模糊，信噪比降低。同时矩阵阵列会使得杂交后洗脱困难，容易干扰检测信号。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种高通量检测的基因芯片。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种高通量检测的基因芯片，包固相载体层和设在固相载体层上的基因芯片区，基因芯片区上设有探针阵列，探针阵列为同心圆阵列，组成同心圆阵列的相邻两个圆环上的探针点交错排列。

上述本基因芯片上的探针阵列为同心圆阵列，相邻两个圆环的探针阵列点交错排列，这样可以避免在探针合成过程中，相邻两点间的相互干扰，影响最终的信号识别。

本申请的基因芯片使基因检测的准确性得到显著的提高。

作为常识，同心圆阵列是由多个同心圆组成的。

为了提高杂交效率和方便洗脱，基因芯片区包括上下相接的基膜层和承载层，其中，基膜层与固相载体层相接，探针阵列设在承载层上，承载层上组成同心圆阵列的相邻两个圆环存在高度差。杂交过程中，反应液依从高处留向低处，提高了杂交效率；洗脱时，方便洗脱液从高处留向低处，进而方便了洗脱。

为了进一步提高杂交效率和方便洗脱，承载层上组成同心圆阵列的相邻两个圆环，内圆环的高度高于外圆环的高度。这样的设计一方面可以使在杂交的过程中，反应液依次向外圈环流动，提高杂交效率，另一方向可以使洗脱时洗脱液向外圈流动，洗脱方便快捷。

本申请，将同心圆阵列的圆心指向同心圆阵列周边的方向视为从内到外的方向，也即相邻两个圆环，内圆环的半径是小于外圆环的半径的。

为了方便控制和使用，承载层上组成同心圆阵列的任意两个相邻圆环的高度差相等。

为了提高检测的准确性，承载层上组成同心圆阵列的最内层圆环与最外层圆环的高度差为同心圆阵列半径的1/5-1/2。

为了方便使用，同一固相载体层上设有2-10个基因芯片区；承载层为玻片层或塑料层。

进一步优选，承载层为硝酸纤维素层或尼龙层或聚苯乙烯层中的至少一种。

为了能实现对多个目标的测定，探针阵列由两组以上的测试单元组成，每组测试单元均包括检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点。

作为本申请的一种优选方案，同一组测试单元的检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点设置在同一圆环上。

作为本申请的另一种优选方案，同一组测试单元的检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点设置在同一扇形区上或设在同一径向上。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明的有益效果是：

本发明一种高通量检测的基因芯片的探针阵列为同心圆阵列，相邻两个圆环的探针阵列点交错排列，这样可以避免在探针合成过程中，相邻两点间的相互干扰，影响最终的信号识别，进而提高了检测的准确性；结构简洁，使用方便，降低了实验难度，提高了检测结果的准确度；进一步，组成同心圆阵列的圆环由内向外逐渐降低，一方面可以使在杂交的过程中，反应液依次向外圆环流动，提高杂交效率，另一方向可以使洗脱时洗脱液次向外圆环流动，洗脱方便快捷。

附图说明

图1为本发明高通量检测的基因芯片的结构示意图；

图2为本发明高通量检测的基因芯片区上探针阵列的结构示意图(图中，相邻两探针点之间的连线为辅助线)；

图3为本发明基因芯片区的剖面图；

图4为应用实施例中探针的排布图，左图为对照组(方形)，右图为本发明(圆形)；

图5为应用实施例中5种腺病毒核酸基因芯片扫描图，左图为对照组，右图为本发明；

图中，1：固相载体，2：基因芯片，21探针点。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一种高通量检测的基因芯片，包固相载体层和设在固相载体层上的6个基因芯片区，基因芯片区上设有探针阵列，探针阵列为同心圆阵列，组成同心圆阵列的相邻两个圆环上的探针点交错排列。

上述基因芯片上的探针阵列为同心圆阵列，相邻两个圆环的探针点交错排列，这样可以避免在探针合成过程中，相邻两点间的相互干扰，影响最终的信号识别，进而使基因检测的准确性得到显著的提高。

实施例2

与实施例1基本相同，所不同的是：基因芯片区包括上下相接的基膜层和承载层，其中，承载层为硝酸纤维素层，基膜层与固相载体层相接，探针阵列设在承载层上，承载层上组成同心圆阵列的相邻两个圆环，内圆环的高度高于外圆环的高度，承载层上组成同心圆阵列的任意两个相邻圆环的高度差相等，承载层上组成同心圆阵列的最内层圆环与最外层圆环的高度差为同心圆阵列半径的1/3。这样的设计一方面可以使在杂交的过程中，反应液依次向外圈环流动，提高杂交效率，另一方向可以使洗脱时洗脱液向外圈流动，洗脱方便快捷。

实施例3

与实施例2基本相同，所不同的是：承载层上组成同心圆阵列的最内层圆环与最外层圆环的高度差为同心圆阵列半径的1/5，承载层为玻片层。

实施例4

与实施例2基本相同，所不同的是：承载层上组成同心圆阵列的最内层圆环与最外层圆环的高度差为同心圆阵列半径的1/2，承载层为尼龙层。

实施例5

与实施例2基本相同，所不同的是：为了能实现对多个目标的测定，探针阵列由两组以上的测试单元组成，每组测试单元均包括检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点。

实施例6

与实施例5基本相同，所不同的是：同一组测试单元的检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点设置在同一圆环上。

实施例7

与实施例5基本相同，所不同的是：同一组测试单元的检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点设置在同一扇形区上或设在同一径向上。

上述各例的基因芯片的探针阵列为同心圆阵列，相邻两个圆环的探针阵列点交错排列，这样可以避免在探针合成过程中，相邻两点间的相互干扰，影响最终的信号识别，进而提高了检测的准确性；结构简洁，使用方便，降低了实验难度，提高了检测结果的准确度；进一步，组成同心圆阵列的圆环由内向外逐渐降低，一方面可以使在杂交的过程中，反应液依次向外圆环流动，提高杂交效率，另一方向可以使洗脱时洗脱液次向外圆环流动，洗脱方便快捷。

应用实施例

所用到的芯片为自主合成的基因芯片，使用美国Genomic Solution公司的全自动点样仪，实验组的芯片为实施例7的芯片，芯片的基片被醛基化。对照组的基因芯片采用博奥生物有限公司的醛基化基片。

本实施例在GeneBank数据库中选取了腺病毒B亚属的3、7、14、11、55五种型别，针对五种病毒的保守区域设计了基因芯片，通过对病毒的检测比较两种芯片的检测结果，检测方法采用化学发光生物芯片成像仪进行芯片的扫描分析。

步骤一：病毒核酸的提取：

选择DNA/RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书对3、7、14、11、55五个型别的腺病毒进行核酸提取，将提取好的样本核酸放于-70℃冰箱保存。

步骤二：引物的设计：

选取GenBank数据库中常见型别腺病毒的核酸序列，使用Aligenment软件比对所下载的序列，选择型别内保守、型别间特异的序列区，结合分子生物学软件设计特异性引物，11和55型病毒共用一对引物，引物如下：

以病毒核酸为模板进行PCR扩增，构建载体并转化到DH5α感受态细胞。

步骤三：探针的设计：

在上下游引物之间的基因序列设计探针，在探针的3’端加上(T)12结构，并在(T)12的末端标记上-NH2，以改善探针的空间柔性。设计一条内标探针，探针经过设计筛选后得到如下可用探针：

步骤四：芯片的制备：

用RNase-Free Water溶解探针冻干粉，将探针点样液(6×SSC，0.1％SDS)与每个溶解好的探针等体积混合，探针终浓度为50μM/L。将(T)20重复序列作为标识列，用来提示探针在芯片的相对位置，同时还可以检测探针是否与芯片结合。(T)20重复序列5’端进行生物素标记，3’端进行NH2修饰。探针混合液和标识列各取10μl加入编好序号的384孔板中，通过在点样仪上设置点样程序，每个探针设计3个位点，每个芯片区设计1条阳性质控探针、1条阴性质控探针、1条空白对照及1条标识列即片基质控探针，完成基因芯片的制备。探针的排布如图4，图中的系号解释：①片基质控探针，②阳性质控探针，③3型腺病毒探针，④7型腺病毒探针，⑤14型腺病毒探针，⑥11型腺病毒探针，⑦55型腺病毒探针，⑧内标探针，⑨阴性质控探针，⑩空白对照。

步骤五：芯片的杂交：

以病毒核酸为模板进行PCR扩增，将扩增产物与芯片上的探针杂交，95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，共35个循环；终延伸72℃5min。

PCR反应体系如下：

将扩增产物变性使其处理解链状态，取5μl与预热后的杂交液5μl混匀，吸取8μl加入至芯片反应区，将芯片放于杂交盒中，45℃水浴杂交1h，杂交反应结束后，清洗晾干。然后加入10μl标记液，37℃水浴25min,依次使用1xPBST、去离子水清洗20s，在芯片离心机上离心甩干。取化学发光显色混合液加入芯片反应区，放入成像仪中扫描成像后进行结果分析。

5种腺病毒核酸基因芯片扫描图如图5所示。左侧图为对照组芯片的扫描结果，右侧图为本发明芯片的扫描结果，可以看出在检测样本相同，实验步骤及实验条件均一样的情况下，在3、7、14、11、55五种病毒的位置区域，本发明的芯片亮度明显高于传统芯片结果。在片基质控探针、阳性探针、内控探针的区域，本发明芯片的亮度更高，且发光点清楚，点周没有模糊的光晕。

针对两种基因芯片的检测重复性进行评价：

取各病毒的质粒进行基因芯片的检测，并设立无模板阴性对照，同芯片不同反应区，不同批次芯片之间重复5次，对照组芯片统计结果如下表1，本发明实验芯片统计结果如下表2。

表1

表2

由上表中数据可以看到，对于5种病毒的每条探针，片内重复性变异系数值均小于15％，片间重复性变异系数值也均小于15％，说明该检测方法重复性较好。另一方面，本发明芯片的重复性系数值明显优于对照组芯片的数据，说明本发明芯片比对照组芯片的检测效果更好。

Claims (6)

1.一种高通量检测的基因芯片，其特征在于：高通量检测的基因芯片：包含固相载体层和设在固相载体层上的基因芯片区，基因芯片区上设有探针阵列，探针阵列为同心圆阵列，组成同心圆阵列的相邻两个圆环上的探针点交错排列；

基因芯片区包括上下相接的基膜层和承载层，其中，基膜层与固相载体层相接，探针阵列设在承载层上，承载层上组成同心圆阵列的相邻两个圆环存在高度差；

探针阵列由两组以上的测试单元组成，每组测试单元均包括检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点；

同一组测试单元的检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和空白参照点设置在同一扇形区上或设在同一径向上；

上述高通量检测的基因芯片用于检测3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒；

检测时，11型腺病毒和55型腺病毒共用一对引物，引物设计如下：

探针设计如下：

2.如权利要求1所述的高通量检测的基因芯片，其特征在于：承载层上组成同心圆阵列的任意两个相邻圆环的高度差相等。

3.如权利要求1或2所述的高通量检测的基因芯片，其特征在于：承载层上组成同心圆阵列的相邻两个圆环，内圆环的高度高于外圆环的高度。

4.如权利要求3所述的高通量检测的基因芯片，其特征在于：承载层上组成同心圆阵列的最内层圆环与最外层圆环的高度差为同心圆阵列半径的1/5-1/2。

5.如权利要求1或2所述的高通量检测的基因芯片，其特征在于：同一固相载体层上设有2-10个基因芯片区；承载层为玻片层或塑料层中的至少一种。

6.如权利要求5所述的高通量检测的基因芯片，其特征在于：承载层为硝酸纤维素层、尼龙层或聚苯乙烯层中的至少一种。