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CN109843323B - 用于黄病毒疫苗接种的组合物和方法 - Google Patents

用于黄病毒疫苗接种的组合物和方法 Download PDF

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CN109843323B CN201780054642.1A CN201780054642A CN109843323B CN 109843323 B CN109843323 B CN 109843323B CN 201780054642 A CN201780054642 A CN 201780054642A CN 109843323 B CN109843323 B CN 109843323B
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Abstract

本文公开了包含一种或多种黄病毒抗原基因的基于重组腺病毒的载体疫苗的组合物。也描述了用于构建和生产这种疫苗的方法以及使用这些疫苗产生针对黄病毒的免疫应答的方法。本文描述的组合物允许在具有对腺病毒具有预先存在的免疫力的受试者中进行疫苗接种。

Description

用于黄病毒疫苗接种的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2016年7月15日提交的美国临时专利申请号62/363,131的权益，其公开内容在此通过引用以其全部被并入。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式被电子提交并且在此通过引用以其全部被并入。在2017年7月5日创建的所述ASCII拷贝被命名为39891-724_601_SL.txt和大小为430,874字节。
背景技术
疫苗通过训练免疫系统识别和破坏有害物质与病变细胞来帮助身体对抗疾病。很大程度上，疫苗可分为两种类型，预防性疫苗和治疗性疫苗。向健康人群给予预防性疫苗，以预防发展特定疾病，而向已诊断患有疾病的人给予治疗性疫苗(也被称作免疫疗法)，以帮助终止疾病生长和扩散，或作为规避措施。
目前正在开发病毒疫苗，以帮助对抗传染性疾病和癌症。这些病毒疫苗通过诱导宿主细胞内与疾病相关联的小部分基因的表达来起作用，其又增强宿主的免疫系统识别和破坏病变细胞的能力。因此，病毒疫苗的临床应答可取决于疫苗获得高水平免疫原性和具有持久长期表达的能力。
因此，仍需要开发用于对复杂疾病并且尤其是新出现疾病威胁的增强的治疗性应答的新颖组合物和方法。
发明内容
在各个方面，本公开内容提供了组合物，其包含：复制缺陷型病毒载体，其包含E2b基因区中的缺失；和编码黄病毒靶抗原的序列。在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列包含编码多种黄病毒靶抗原的序列。在其他方面，编码多种黄病毒靶抗原的序列包含多种基因插入物，每种基因插入物对应于靶抗原，其中每种基因插入物被编码自切割2A肽的核酸序列分开。在一些方面，自切割2A肽衍生自猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1病毒或Thosea asigna病毒。在一些方面，多种黄病毒靶抗原包含三种黄病毒靶抗原或四种黄病毒靶抗原。
在一些方面，复制缺陷型病毒载体是腺病毒载体。在进一步方面，复制缺陷型病毒载体是腺病毒5(Ad5)载体。在仍进一步方面，复制缺陷型病毒载体包含E1基因区、E3基因区、E4基因区或其任何组合中的缺失。在一些方面，E2b基因区中的缺失包含E2b基因区中的多种缺失。
在一些方面，E2b基因区中的缺失、E1基因区中的缺失、E3基因区中的缺失、E4基因区中的缺失或其任何组合各自包含至少一个碱基对。
在其他方面，E2b基因区中的缺失、E1基因区中的缺失、E3基因区中的缺失、E4基因区中的缺失或其任何组合由两个或更多碱基对的易位引起。在一些方面，E2b基因区中的缺失、E1基因区中的缺失、E3基因区中的缺失、E4基因区中的缺失或其任何组合每个包含至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140或至少150个碱基对。在其他方面，E2b基因区中的缺失、E1基因区中的缺失、E3基因区中的缺失、E4基因区中的缺失或其任何组合各自包含超过150、超过160、超过170、超过180、超过190、超过200、超过250、或超过300个碱基对。
在一些方面，黄病毒靶抗原包含选自黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKAV)或其任何组合的病毒的抗原。在其他方面，黄病毒靶抗原包含选自YFV、ZIKAV或两者的病毒的抗原。
在仍进一步方面，黄病毒靶抗原包含ZIKAV的抗原。在一些方面，黄病毒靶抗原包含选自下组的抗原：C(衣壳蛋白)、E(包膜蛋白)、prM(前膜蛋白)、M(膜蛋白)、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，或其任何组合。在一些方面，黄病毒靶抗原包含选自下组的抗原：E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5，或其任何组合。在一些方面，黄病毒靶抗原包含选自下组的抗原：E、prM、M和NS3，或其任何组合。
在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列包含N末端GCCGCCACC序列。在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列包含编码突变的序列，并且其中突变包含异亮氨酸(I)至天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)至天冬氨酸(D)、天冬氨酸(D)至异亮氨酸(I)、天冬氨酸(D)至亮氨酸(L)，或其任何组合。
在进一步方面，突变发生在I21D、L175D、L240D、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L或其任何组合。在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37或其任何组合的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列包含与选自SEQ ID NO:15–SEQ ID NO:19的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列是氨基酸序列，并且其中该氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:34和SEQ ID NO:36或其任何组合的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，编码黄病毒靶抗原的序列是核苷酸序列，并且其中该核苷酸序列包含与选自SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35和SEQID NO:37或其任何组合的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性。
在一些方面，复制缺陷型病毒载体还包含增加黄病毒靶抗原表达的元件。在进一步方面，所述元件包含至少一种元件、至少2种元件、至少3种元件、至少4种元件或至少5种元件。在一些方面，该元件包含内部核糖体结合位点。
在其他方面，该元件包含组成型启动子。在一些方面，该元件包含诱导型启动子。在一些方面，该元件包含转录增强子。在一些方面，转录增强子是劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子。在一些方面，该元件不包含回文序列。
在一些方面，复制缺陷型病毒载体还包含编码增加黄病毒靶抗原免疫原性的蛋白质的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型病毒载体不是空壳(gutted)载体。在一些方面，组合物或复制缺陷型病毒载体还包含编码共刺激分子的核酸序列或免疫融合配偶体。
在各个方面，本公开提供了药物组合物，其包含任何一种上述组合物和药学上可接受的运载体。
在各个方面，本公开提供了包含任何一种上述组合物的细胞。在一些方面，细胞是宿主细胞。在进一步方面，细胞是树突细胞(DC)。
在各个方面，本公开提供了制备疫苗的方法，包括制备上述药物组合物。
在各个方面，本公开提供了在受试者中产生针对黄病毒靶抗原的免疫应答的方法，其包括：向受试者施用任何一种上述组合物或上述药物组合物。在一些方面，受试者未感染黄病毒。在一些方面，靶黄病毒抗原来自黄病毒，其中黄病毒包括黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKAV)或其任何组合。
在各个方面，本公开提供了预防受试者中寨卡病毒感染的方法，该方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含：复制缺陷型病毒载体，其包含E2b基因区中的缺失；和编码至少一种寨卡病毒靶抗原的序列。
在一些方面，受试者具有对腺病毒或腺病毒载体的预先存在的免疫力。在一些方面，受试者是人或非人动物。在一些方面，施用是静脉内、皮下、淋巴管内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、口服、通过膀胱滴注或通过划痕。在一些方面，将组合物施用至受试者至少一次，重复至少两次，或重复至少三次。
在一些方面，向受试者施用组合物包含每剂量1×109至5×1012个病毒颗粒。在其他方面，向受试者施用组合物包含每剂量至少109个病毒颗粒、至少1010个病毒颗粒或至少1011个病毒颗粒。在一些方面，复制缺陷型病毒载体是腺病毒载体。在其他方面，复制缺陷型病毒载体是腺病毒5(Ad5)载体。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。
附图说明
图1示例已经生成的衍生自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗。
图2图解本公开的黄病毒疫苗的多靶点三基因插入物的示意图。
图2A图解三基因构建体的示意性表示，该三基因构建体包含编码待用于插入Ad5[E1-、E2b-]的黄病毒的衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)的基因。
图2B图解化学计量丰度的图2A中的翻译产物。
图3图解本公开的黄病毒疫苗的多靶点四基因插入物的示意图。
图3A图解四基因构建体的示意性表示，该四基因构建体包含编码待用于插入Ad5[E1-、E2b-]的黄病毒的衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和NS蛋白的基因。
图3B图解化学计量丰度的图3A中的翻译产物。
图4图解暴露于寨卡肽库后来自免疫小鼠的脾细胞中的细胞介导的免疫(CMI)应答和抗体应答。在小鼠中进行Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗的免疫原性研究。
图4A图解在注射Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)或Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠中如通过ELISpot斑点形成细胞(SFC)测定的对IFN-γ分泌细胞的CMI应答。注意在免疫小鼠(白色条)中诱导CMI应答，但对照小鼠(阴影黑条)没有。通过缺乏针对无关抗原Nef肽库的反应性证实了特异性。注意，对于Nef肽库和寨卡肽库，左侧条表示来自注射空载体对照的小鼠的SFC，右侧条表示来自注射Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠的SFC。
图4B图解在注射Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)或Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠中如通过ELISpot斑点形成细胞(SFC)测定的对IL-2分泌细胞的CMI应答。在免疫小鼠(白色条)中诱导CMI应答，但对照小鼠(黑阴影条)没有。通过缺乏针对无关抗原Nef肽库的反应性证实了特异性。注意，对于Nef肽库和寨卡肽库，左侧条表示来自注射空载体对照的小鼠的SFC，右侧条表示来自注射Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠的SFC。
图4C图解在注射Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)或Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠中如通过定量ELISA测定的抗-寨卡-E IgG抗体应答。在免疫小鼠(白色条，G4M1-5)中诱导抗体应答，但对照小鼠(黑色条，G1M1-5)没有。注意，左侧G1M1、G1M2、G1M3、G1M4和G1M5表示来自注射空载体对照的小鼠的抗体应答，和右侧G1M1、G1M2、G1M3、G1M4和G1M5表示来自注射Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E的小鼠的抗体应答。
图5图解基于信息谱方法(ISM)的非冗余包膜蛋白(E)的系统树，该包膜蛋白(E)来自2014-2015年在巴西分离的寨卡病毒。
图6图解来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的细胞介导的免疫(CMI)应答和溶细胞性T淋巴细胞(CTL)应答。小鼠(C57BL/6株)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQ ID NO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35中的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ IDNO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27中的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。测试的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut2014，其包含由SEQ ID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。在每种Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗的最终免疫后一周，将从免疫小鼠中分离的脾细胞暴露于寨卡wt病毒肽库，然后使用ELISPOT测定来测量CMI应答(IFN-γ和IL-2分泌斑点形成细胞(SFC))和CTL应答(颗粒酶-B分泌SFC)。通过脾细胞对SIV-nef肽库缺乏反应性(阴性对照)显示应答的特异性。脾细胞对伴刀豆球蛋白A(Con A)的反应性用作阳性对照。误差条显示SEM，每组中有5只小鼠。
图6A图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IFN-γCMI应答。
图6B图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IL-2CMI应答。
图6C图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的颗粒酶B CTL应答。
图7图解使用流式细胞术，通过来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠的脾细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。小鼠(C57Bl/6株)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQ IDNO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ ID NO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。测试的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2014，其包含由SEQID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。最终免疫后一周，将从免疫小鼠中分离的脾细胞暴露于寨卡wt病毒肽库，并使用流式细胞术测量CD8+细胞和CD4+细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内细胞因子产生。通过脾细胞对SIV-nef肽库(阴性对照)缺乏反应性来显示应答的特异性。脾细胞对PMA/离子霉素的反应性用作阳性对照。数据报告为表达IFN-γ或IFN-γ和TNF-α的CD8+或CD4+脾细胞的百分比，误差条显示SEM。每组有五只小鼠。
图7A图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库或对照后，使用流式细胞术通过CD8+脾细胞中IFN-γ的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。
图7B图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库或对照后，使用流式细胞术通过CD4+脾细胞中IFN-γ的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。
图7C图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库或对照后，使用流式细胞术通过CD8+脾细胞中IFN-γ和TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。
图7D图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库或对照后，使用流式细胞术通过CD4+脾细胞中IFN-γ和TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。
图8图解用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠血清中的抗寨卡IgG抗体应答。从颊囊抽取血液，并使用定量ELISA或IgG抗体，使用Gabitzsch等人(Cancer GeneTher.2011May；18(5):326–335)中阐述的方法进行分析。小鼠(C57Bl/6株，每组5只小鼠)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQ IDNO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35中的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ ID NO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。测试的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2014，其包含由SEQ ID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ IDNO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。最终免疫后一周，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试小鼠血清诱导抗体应答。y轴显示血清中的抗寨卡IgG的纳克(ng)。x轴显示每组和测试的小鼠(例如，“G1M1”表示组1小鼠1)。注意来自组1的小鼠用Ad5[E1-、E2b-]-无效免疫，来自组2的小鼠用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡Mut 2015免疫，来自组3的小鼠用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡Mut 2014免疫，来自组4的小鼠用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡Wt 2014免疫。误差条显示SEM。
图9图解在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗接种或注射Ad5[E1-、E2b-]-无效空载体作为对照后寨卡病毒感染的小鼠模型中的体重减轻(Rossi等人Am J Trop MedHyg.2016Jun1；94(6):1362-9)。用1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E 2015wt或1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-无效(对照)免疫A129小鼠组(n＝10/组)一次。免疫后30天，用寨卡病毒的致病毒株(腹膜内(IP)注射5×105个噬菌体形成单位(PFU)的寨卡病毒株FSS13025)攻击小鼠。监测小鼠的体重变化。
图10图解在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗或Ad5[E1-、E2b-]-无效空载体作为对照进行疫苗接种后寨卡病毒感染的小鼠模型中的温度变化(Rossi等人Am J Trop MedHyg.2016Jun 1；94(6):1362-9)。用1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E 2015wt或1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-无效(对照)免疫A129小鼠组(n＝10/组)一次。免疫后30天，用寨卡病毒的致病毒株(腹膜内(IP)注射5×105PFU的寨卡病毒株FSS13025)攻击小鼠。监测小鼠的温度变化。
图11图解来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的细胞介导的免疫(CMI)应答和溶细胞性T淋巴细胞(CTL)应答。C57BL/6小鼠(n＝5/组)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了两种类型的寨卡疫苗，包括Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015，其包含由SEQ ID NO:32的核苷酸序列和SEQ ID NO:33的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:32是核苷酸序列，SEQ ID NO:33是对应于SEQ ID NO:32的氨基酸序列)。SEQID NO:33的寨卡wt 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。第二种测试的寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)，其包含由SEQ ID NO:36的核苷酸序列和SEQ ID NO:37的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:36是核苷酸序列，SEQ ID NO:37是对应于SEQ ID NO:36的氨基酸序列)。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)中的寨卡抗原包含对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白，该多蛋白包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。包含跨膜结构域可以用作信号序列，确保负载mRNA的核糖体迁移到内质网，糖基化，并最终迁移和束缚蛋白质到质膜，这都可以最终提高抗原性，从而产生免疫应答。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫7后天分离脾细胞并暴露于寨卡2014肽库、SIV-Nef肽库(阴性对照)、SIV-Gag肽库(阴性对照)和伴刀豆球蛋白A(阳性对照)，并且通过ELISPOT评估CMI应答(IFN-γ和IL-2)和CTL应答(颗粒酶B)。数据报告为每106个脾细胞的斑点形成细胞(SFC)的数量，误差条显示SEM。
图11A图解在暴露于寨卡2014肽库或对照之后，来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞的IFN-γCMI应答。
图11B图解在暴露于寨卡2014肽库或对照之后，来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞的IL-2CMI应答。
图11C图解来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞对寨卡2014肽库或对照的颗粒酶BCTL应答。
图12图解使用流式细胞术，来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。C57BL/6小鼠以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了两种类型的寨卡疫苗，包括Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015，其包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列和SEQ ID NO:33的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:32是核苷酸序列，SEQ ID NO:33是对应于SEQ ID NO:32的氨基酸序列)。SEQID NO:33的寨卡wt 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。第二种测试的寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)，其包含由SEQ ID NO:36的核苷酸序列和SEQ ID NO:37的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:36是核苷酸序列，SEQ ID NO:37是对应于SEQ ID NO:36的氨基酸序列)。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)中的寨卡抗原包含对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白，其包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。包含跨膜结构域可以用作信号序列，确保负载mRNA的核糖体迁移到内质网，糖基化，并最终迁移和束缚蛋白质到质膜，这可以最终提高抗原性，从而产生免疫应答。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫后7天，从免疫小鼠分离脾细胞并暴露于寨卡病毒肽库，并使用流式细胞术测量CD8+细胞和CD4+细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内细胞因子产生。通过脾细胞对SIV-nef肽库(阴性对照)和介质(阴性对照)缺乏反应性和脾细胞对PMA/离子霉素(数据未示出)(阳性对照)的反应性示出应答的特异性。数据报告为表达IFN-γ或IFN-γ和TNF-α的CD8+或CD4+脾细胞的百分比，误差条显示SEM。
图12A图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ在CD8+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。
图12B图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ在CD4+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。
图12C图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ和TNF-α在CD8+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。
图12D图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ和TNF-α在CD4+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。
图13图解用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠血清中的抗寨卡IgG应答。C57BL/6小鼠(n＝5/组)以2周的间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015全长(FL)疫苗免疫两次。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫后7天从小鼠收集血清，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评估针对寨卡病毒包膜蛋白-1的抗原特异性抗体。y轴显示血清中的抗寨卡IgG的纳克(ng)。在Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015组中，五组中的三组(3/5)为抗体阳性。在Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015FL组中，五组中的五组(5/5)为抗体阳性。
具体实施方式
以下段落更详细地描述了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，否则每个方面可以与任何其他方面组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与被指示为优选或有利的任何其他特征组合。
如本文所用，除非另外指示，否则冠词“一(a)”意味着一个或更多个，除非另外明确地指出。
如本文所用，除非另外指示，否则如“含有(contain/containing)”、“包含(include/including)”以及其类似的术语意味着“包括(comprising)”。
如本文所用，除非另外指示，否则术语“或”可为连词或转折词。
如本文所用，除非另外指示，否则任何实施方式可与任何其它实施方式组合。
如本文所用，除非另外指示，否则本文中的一些发明性实施方式涵盖数值范围。本发明的各种方面可以范围形式出现。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应该被解释为是对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开所有可能子范围以及在所述范围内的各个数值，如同明确地写出一般。例如，对如从1到6的范围的描述应被认为已经具体地公开子范围，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。当存在多个范围时，范围包含范围端点。
术语“腺病毒”或“Ad”可以指一组来自腺病毒科家族的未包膜DNA病毒。除人类宿主以外，这些病毒还可在(但不限于)鸟、牛、猪和犬物种中找到。来自腺病毒科家族的四个属(例如禽腺病毒、哺乳动物腺病毒、腺胸腺病毒和涎腺病毒)中的任一种的任何腺病毒的用途可以预期为E2b缺失病毒载体或含有如本文所描述的其它缺失的载体的基础。另外，在每一物种中可以找到几种血清型。Ad还涉及这些病毒血清型中的任一种的基因衍生物，包含(但不限于)同源或异源DNA序列的基因突变、缺失或移位。
“辅助腺病毒”或“辅助病毒”可以指可提供特定宿主细胞不能(宿主可提供Ad基因产物，如E1蛋白)提供的病毒功能的Ad。这种病毒可以用于反式提供第二病毒或辅助依赖型病毒(例如空壳或无内容(gutless)病毒，或缺失如本文所描述的特定区(如E2b或其它区)的病毒)中缺乏的功能(例如蛋白质)；第一无复制能力的病毒可以称为“辅助”第二辅助依赖型病毒，从而允许在细胞中产生第二病毒基因组。
如本文所用，术语“腺病毒5无效(Ad5null)”可以指可以不含有任何用于表达的异源核酸序列的非复制性Ad。
如本文所用，术语“第一代腺病毒”可以指缺失早期区1(E1)的Ad。在其它情况下，也可缺失非必需的早期区3(E3)。
如本文所用，术语“空壳”或“无内容”可以指已缺失所有病毒编码区的腺病毒载体。
如本文所用，术语“转染”可以指将外源核酸引入到真核细胞中。转染可通过所属领域中已知的各种手段来实现，包含磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、反转录病毒侵染和基因枪法。
术语“稳定转染(Stable transfection/stably transfected)”可以指将外源核酸、DNA或RNA引入且整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”可以指已将外源DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
术语“报告基因”可以指示编码报告分子(包含酶)的核苷酸序列。“报告分子”在各种检测系统中的任一种中可以为可检测的，所述检测系统包含(但不限于)基于酶的检测分析(例如ELISA，以及基于酶的组织化学分析)、荧光、放射性和发光系统。
在一个实施方式中，可以采用大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶基因(获自Pharmacia Biotech,Pistacataway,N.J.)、绿色荧光蛋白(GFP)(可购自Clontech,PaloAlto,Calif.)、人类胎盘碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或本领域已知的其他报告基因。
如本文所用，术语“编码…的核酸分子”、“编码…的DNA序列”和“编码…的DNA”可以指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的次序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的次序可以决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的次序。因此，核酸序列可以编码氨基酸序列。
如本文所用，术语“异源核酸序列”可以指接合到或被操纵以接合到核酸序列的核苷酸序列，在自然界中，所述核苷酸序列不与所述核酸序列接合，或在自然界中于不同位置处接合。异源核酸可包含：在将异源核酸引入到其中的细胞中天然存在的核苷酸序列，或异源核酸相对于天然存在的序列可含有一些修饰。
术语“转基因”可以指引入到细胞或测试受试者基因组中的任何基因编码区、天然或异源核酸序列、或融合的同源或异源核酸序列。在本发明中，转基因可以携载在用于将转基因引入到受试者细胞中的任何病毒载体上。
如本文所用，术语“第二代腺病毒”可以指从病毒缺失(去除)E1、E2、E3和(在某些实施方式中)E4DNA基因序列的全部或部分的Ad。
如本文所用，术语“受试者”可以指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。受试者可包括但不限于人、非人灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
在某些方面，可提供用于产生疫苗的方法，所述疫苗使用腺病毒载体产生针对各种黄病毒的免疫应答，所述腺病毒载体允许多次疫苗接种以产生针对黄病毒的广泛反应性免疫应答。
一方面提供了在受试者中产生针对几种黄病毒靶抗原的免疫应答的方法，包括向受试者施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码多种黄病毒靶抗原的核酸；并将腺病毒载体再施用至受试者至少一次；从而产生针对黄病毒靶抗原的免疫应答。
另一方面提供了在受试者中产生针对几种黄病毒靶抗原的免疫应答的方法，其中所述受试者具有对腺病毒的预先存在的免疫力，包括：向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区具有缺失，和b)编码多种黄病毒靶抗原的核酸；并将腺病毒载体再施用至个体至少一次；从而产生针对黄病毒靶抗原的免疫应答。
I.黄病毒靶抗原
在某些实施方式中，可以例如在如本文所描述的疫苗组合物或包括腺病毒载体的组合物中使用黄病毒抗原比如C、prM、E、M和非结构蛋白，比如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。
例如，可以使用E和M抗原。保护免受天然黄病毒感染的主要相关因素可以是血清和粘膜中对E具有特异性的Ab的水平。对E蛋白的体液应答可以作为中和效价进行测量，其已被用作保护的替代物。M蛋白可能不是体液应答的主要靶标；然而，M的表达可以指示E的适当折叠，并且因此适当的抗原展示。
NS3也可以用于某些方面。研究表明NS3含有保守区，当用于实验疫苗(包括使用Ad5载体的那些)时，该保守区可以提供更广泛的黄病毒保护(Papageorgiou,L等人Molecular BioSystems.2016DOI:10.1039/c5mb00706b；Duangchinda T等人PNAS.2010107(39):16922-16927)。
在进一步方面，靶抗原可以由衍生自各种黄病毒蛋白的抗原组成。在某些方面，黄病毒蛋白可以衍生自任何黄病毒，包括但不限于黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKAV)。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以是选自下列的黄病毒蛋白：C、prM、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS1的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS2A的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS2B的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS3的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS4A的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS4B的蛋白质。在某些实施方式中，至少一种黄病毒病毒蛋白可以包括选自M、E和NS5的蛋白质。在一些实施方式中，至少一种靶抗原与C、prM、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、或NS5的抗原序列中任一种或本文描述的其他抗原序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、或至少100％序列同一性。在一些实施方式中，至少一种靶抗原是黄病毒的结构和/或非结构抗原。例如，在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:1(YFV JN628281.1)中陈述的序列或其片段编码的黄热病病毒(YFV)抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:2(JEVAY508812.1)中陈述的序列或其片段编码的日本脑炎病毒(YEV)抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:3(TBEV-fe KJ755186)中陈述的序列或其片段编码的蜱传脑炎病毒(TBEV)-fe抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:4(TBEV-si KP331441)中陈述的序列或其片段编码的蜱传脑炎病毒(TBEV)-si抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:5(TBEV-eu TEU27495)中陈述的序列或其片段编码的蜱传脑炎病毒(TBEV)-eu抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:6(DENV-1KF887994.1)中陈述的序列或其片段编码的登革热病毒-1(DENV-1)抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:7(DENV-2HQ026763)中陈述的序列或其片段编码的登革热病毒-2(DENV-2)抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:8(DENV-3KP406805)中陈述的序列或其片段编码的登革热病毒-3(DENV-3)抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:9(DENV-4KJ596658)中陈述的序列或其片段编码的DENV-4抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQID NO:10(WNV GQ903680)中陈述的序列或其片段编码的西尼罗河病毒(WNV)抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:11(ZIKAV KF383118)中陈述的序列或其片段编码的寨卡病毒(ZIKAV)抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:12(ZIKAV KF383121)中陈述的序列或其片段编码的ZIKAV抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:13(AMA12087-修饰的:GP1，来自寨卡病毒隔离株AMA12087(Brazil-2015)，具有突变:D37I D43L D266I D129L D218L)中陈述的序列编码的ZIKAV抗原。在进一步实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是ZIKAV抗原，其包括突变D37I、D43L、D266I、D129L、D218L，如在SEQ ID NO:13中的。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:14(AHL43503-修饰的:E，来自寨卡病毒隔离株AHL43503(Brazil-2014)，具有突变I21D L175D L240D)中陈述的序列编码的ZIKAV抗原。在进一步实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是ZIKAV抗原，其包括突变I21D、L175D、L240D，如在SEQ ID NO:14中的。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:15(AHL43505(Brazil-2014))中陈述的序列编码的ZIKAV抗原。在进一步实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是ZIKAV抗原，其是部分寨卡病毒，如在SEQ IDNO:15中的。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:16–SEQ IDNO:21(SEQ ID NO:16是AHL43503(Brazil-2014)，SEQ ID NO:17是AHL43502(Brazil-2014)，SEQ ID NO:18是AHL43501(Brazil-2014)，SEQ ID NO:19是AMA12087(Brazil-2015)，SEQ ID NO:20是寨卡病毒隔离株MEX/InDRE/14/2015多蛋白基因，部分cds基因库：KU686218.1，SEQ ID NO:21是寨卡病毒株Haiti/1225/2014，完全基因组；基因库：KU509998.3)的任一种中陈述的序列编码的ZIKAV抗原。在其他实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:22(YFV 17D疫苗株；基因库ID：X03700.1)中陈述的序列编码的黄热病病毒(YFV)抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ IDNO:23(完整寨卡多蛋白序列-Acession AHL43505)中陈述的序列编码的完整ZIKAV多蛋白抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:24–SEQ ID NO:25的任一种中陈述的序列编码的ZIKAV抗原。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:26中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是寨卡wt 2014抗原(AHL43503)，该抗原包括对应于SEQ ID NO:23的氨基酸409-690的寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分并且还包括在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:27中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQID NO:26中陈述的寨卡wt 2014抗原(AHL43503)的氨基酸版本。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:28中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是寨卡mut2014抗原(AHL43503)，该抗原包括对应于SEQ ID NO:23的氨基酸409-690的寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分、在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列和导致SEQID NO:29中的下列氨基酸突变的点突变(不计N末端甲硫氨酸)：I21D、L175D、L240D。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:29中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQ ID NO:28中陈述的寨卡mut 2014抗原(AHL43503)的氨基酸版本。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:30中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是包括对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白的寨卡完整2014抗原(AHL43503)，该多蛋白包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，和ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:31中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQ ID NO:30中陈述的寨卡完整2014抗原(AHL43503)的氨基酸版本。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:32中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是寨卡wt 2015抗原(AHL12087)，该抗原包括对应于SEQ ID NO:23的氨基酸409-690的寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分并且还包括在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:33中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQ IDNO:32中陈述的寨卡wt 2015抗原(AHL12087)的氨基酸版本。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:34中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是寨卡mut2015抗原(AHL12087)，该抗原包括对应于SEQ ID NO:23的氨基酸409-690的寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分、在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列和导致SEQID NO:35中的下列氨基酸突变的点突变(不计N末端甲硫氨酸)：D37I、D43L、D266I、D129L、D218L。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:35中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQ ID NO:34中陈述的寨卡mut 2015抗原(AHL12087)的氨基酸版本。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:36中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是包括对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白的寨卡完整2015抗原(AHL12087)，该多蛋白包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，和ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。在一些实施方式中，本文使用的至少一种靶抗原是由在SEQ ID NO:37中陈述的序列编码的ZIKAV抗原，其是在SEQ ID NO:36中陈述的寨卡完整2015抗原(AHL12087)的氨基酸版本。
在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:1或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:2或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:3或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ IDNO:4或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:5或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:6或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:7或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:8或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ IDNO:9或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:10或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:11或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:12或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:13或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:14或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:15或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:16或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:17或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:18或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:19或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:20或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:21或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:22或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:23或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:24或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:25或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:26或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:27或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:28或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:29或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:30或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:31或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:32或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:33或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:34或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:35或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的核苷酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:36或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，抗原的氨基酸序列具有如此区，其与SEQ ID NO:37或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。
在某些实施方式中，靶抗原是寨卡病毒蛋白，比如来自寨卡病毒的包膜糖蛋白(E)。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:13或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:14或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:15或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:16或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:17或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:18或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:19或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:11或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:12或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:20或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:21或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:23或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:24或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。在具体实施方式中，靶抗原具有如此区，其与SEQ ID NO:25或其片段具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(或由其衍生的任何范围或值)同一性。
在某些方面，靶抗原包含来自黄病毒家族的任何抗原。黄病毒科家族的黄病毒属包含许多公共健康和/或兽医关注的病毒。黄病毒是媒介传播的病毒，一些群体通过蚊虫传播并且一些群体通过蜱虫传播。关于公共健康特别感兴趣的黄病毒是：黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、登革热病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)和寨卡病毒(ZIKAV)。
估计YFV每年导致200,000例病例和30,000例死亡。YFV是撒哈拉以南非洲和南美洲的特有种。YFV感染大多无症状。然而，大约15％的病例可能发展成更严重的疾病形式，如出血热。有几种有效的可利用的活减毒疫苗。然而，严重的不良事件可能与这些疫苗有关，如脑膜脑炎、格-巴利二氏综合症和急性播散性脑脊髓炎。
JEV是东南亚和南亚的特有种，并最近已经在澳大利亚发现。JEV的病死率在5-40％之间，其中儿童和老年人更容易患严重疾病。心理神经后遗症可发生在20-50％的幸存者中。据估计，JEV每年导致70,000例病例和20,000例死亡。存在五种不同的JEV基因型，但是所有疫苗株都属于基因型III。疫苗对其他四种基因型的有效性尚未确定。
有三种已知引起人类疾病的TBEV的亚型。亚型是远东(TBEV-fe)、西伯利亚(TBEV-si)和欧洲(TBEV-eu)。TBEV都是通过蜱虫传输的。据信，10-30％的病例可以是无症状的，但TBEV可引起脊髓炎、脑膜炎和脑炎。不同亚型的死亡率不同，TBEV-fe的死亡率最高，超过20％。
DENV有四种亚型，DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。总的来说，这些亚型每年导致大约5000万到1亿例感染，并且不存在许可的疫苗。限制DENV疫苗生产的问题之一是必须在一种疫苗中提供对所有四种血清型的免疫。尽管DENV的初始感染可以是自限性的，但随后的异型病毒感染可导致登革热休克综合征(DSS)和登革热出血热(DHF)。登革热每年约有20,000人死亡，其中大多数死亡与DSS和DHF有关。由于疫苗株之间的竞争，尝试使用活减毒病毒制备针对所有四种血清型的疫苗已经失败。
WNV广泛分布于非洲、欧洲、亚洲、澳大利亚和美洲。大多数感染可以是无症状的，但WNV也可以在人类、马和伴侣动物中引起神经系统疾病。
ZIKAV最近出现在南美洲。ZIKAV于1947年首次在非洲分离，并随后被发现是赤道非洲黄疸爆发的致病因子。最近在南美洲的爆发突出表明，与许多黄病毒一样，ZIKAV可引起神经元疾病。虽然大多数ZIKAV感染可能是轻微的或无症状的，但感染可导致严重的神经系统症状，如胎儿脑损伤、小头畸形和格-巴二氏综合征。据信，在怀孕的前三个月发生的感染可导致胎儿的脑损伤和小头畸形。美洲特别是巴西目前黄病毒爆发的严重程度突显了对长期黄病毒疫苗的医疗需求，该疫苗保护高危人群，特别是没有常规获得医疗保健的育龄妇女。
可使用本文所述的腺病毒载体靶向的黄病毒的其他实例包括阿布塞塔罗夫病毒、阿波病毒、Hansalova病毒、Hypr病毒、Iheus病毒、以色列火鸡脑膜脑炎病毒(Israelturkey meningoencephalits)、科科贝拉病毒、科坦戈病毒、库宁病毒、库阿撒鲁尔森林病毒、兰加特病毒、跳跃病病毒、摩多克病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、纳基许病毒、欧姆斯克出血热病毒、波瓦生病毒、里约布拉沃病毒、罗西欧病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和韦赛尔斯布朗病毒。
在一些实施方式中，本公开的基于Ad5[E1-、E2b-]的载体中的抗原(例如，任何寨卡抗原)包含可降低疫苗在受试者中产生抗人C1q应答的能力的突变。例如，在一些实施方式中，点突变可以包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N-末端甲硫氨酸)，如在寨卡mut 2015抗原(编码寨卡mut 2015抗原的核苷酸序列是SEQ ID NO:34，编码寨卡mut2015抗原的氨基酸序列是SEQ ID NO:35)中的。在其他实施方式中，点突变可以包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N-末端甲硫氨酸)，如在寨卡mut 2014抗原(编码寨卡mut 2014抗原的核苷酸序列是SEQ ID NO:28，编码寨卡mut 2014抗原的氨基酸序列是SEQ ID NO:29)中的。
在一些实施方式中，本公开的基于Ad5[E1-、E2b-]的载体中的抗原(例如，任何寨卡抗原)包含对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID：NO:23)的氨基酸409-690的序列，其是寨卡包膜蛋白细胞外结构域的截短部分。例如，此类抗原的序列在SEQ ID NO:26-SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:35中陈述。
在一些实施方式中，本公开的基于Ad5[E1-、E2-]的载体中的抗原(例如，任何寨卡抗原)包含两个跨膜结构域和细胞外环以及大部分包膜蛋白并且对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805。例如，此类抗原的序列在SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:36-SEQ ID NO:37中陈述。包含跨膜结构域可以用作序列信号以确保装载mRNA的核糖体迁移到内质网，糖基化，以及最终迁移和蛋白质束缚到质膜，这些都可以最终提高抗原性并从而产生免疫应答。
II.腺病毒载体
在某些方面，腺病毒载体可在递送黄病毒抗原(特别是寨卡病毒抗原)的组合物和方法中使用。
重组Ad5[E1-、E2b-]载体疫苗平台是新的，在早期基因2b(E2b)区中具有可以去除病毒DNA聚合酶(pol)和/或前末端蛋白(pTP)基因的额外缺失，并且可以在E.C7人细胞系中繁殖(Amalfitano A,Begy CR,Chamberlain JS Proc Natl Acad Sci U S A.1996 93:3352-6；Amalfitano A,Chamberlain JS Gene Ther.1997 4:258-63；Amalfitano A等人JVirol.1998 72:926-33；Seregin SS和Amalfitano AExpert Opin Biol Ther.2009 9:1521-31)。与目前Ad5[E1-]载体的7kb容量相比，该载体可以具有高达12kb的扩展的基因携带/克隆容量，其足以允许包含多个基因(Amalfitano A等人J Virol.1998 72:926-33；Seregin SS和Amalfitano A Expert Opin Biol Ther.2009 9:1521-31)。E2b区的额外缺失可赋予有利的免疫特性，例如引发对特定抗原的有效免疫应答，同时使对Ad5病毒蛋白的免疫应答最小化。
重要的是，癌症和传染病的临床前和临床研究表明，基于Ad5[E1-、E2b-]的载体可诱导针对载体抗原的有效CMI和Ab应答，即使存在Ad5免疫力(Osada T等人Cancer GeneTher.2009 16:673-82；Gabitzsch ES等人Vaccine.2009 27:6394-8；Gabitzsch ES等人Immunol Lett.2009 122:44-51；Gabitzsch ES等人Cancer Immunol Immunother.201059:1131-5；Gabitzsch ES等人Cancer Gene Ther.2011 18:326-35；Gabitzsch ES等人Vaccine 2011 29:8101-7；Jones FR等人Vaccine 2011 29:7020-6；Gabitzsch ES,JonesFR J Clin Cell Immunol.2011S4:001.doi:10.4172/2155-9899.S4-001；Gabitzsch ES等人Vaccine 2012 30:7265-70；Wieking BG等人Cancer Gene Ther.2012 19:667-74；MorseMA等人Cancer Immunol Immunother.2013 62:1293-1301；Balint等人Cancer ImmunolImmunother.2015 64:977-87；Rice AE等人Cancer Gene Ther.2015 22:454-62；Gabitzsch ES等人Oncotarget 2015Sept 7)。
先进的重组腺病毒血清型5(Ad5)载体平台可以为黄病毒开发新型的广泛交叉反应疫苗提供机会。该载体可以通过皮下注射直接递送，以将限定的黄病毒抗原暴露于诱导有效免疫应答的抗原呈递细胞(APC)。重要的是，Ad5重组载体可以游离型地(episomally)复制并且可以不将基因组插入宿主细胞基因组中，从而确保没有基因整合和重要细胞基因功能的破坏(Imler JL Vaccine.1995 13:1143-51；Ertl HC,Xiang Z J Immunol.1996156:3579-82；Amalfitano,ACurr Opin Mol Ther.2003 5:362-6)。
遗憾的是，目前基于Ad5的载体面临的主要挑战是对Ad5存在预先存在的免疫力。大多数人表现出针对人疫苗最广泛使用的亚型Ad5的中和Ab，其中研究的人中三分之二的人具有针对Ad5的淋巴增殖应答(Chirmule N等人Gene Ther.1999 6:1574-83)。这种免疫力可以阻止使用目前早期基因1(E1)区缺失的Ad5载体(Ad5[E1-])作为黄病毒疫苗的平台。Ad5免疫力抑制免疫，特别是用重组Ad5载体再次免疫，并且也可以排除针对第二种疾病抗原的疫苗接种者的免疫。克服预先存在的Ad5载体免疫力的问题一直是深入研究的主题。然而，使用其他Ad血清型或甚至非人类形式的Ad可直接导致重要趋化因子和细胞因子的产生改变，基因失调，并且具有显著不同的生物分布和组织毒性(Appledorn DM等人GeneTher.2008 15:885-901；Hartman ZC等人Virus Res.2008 132:1-14)。即使这些方法在初始免疫中成功，但随后的疫苗接种也可能由于对Ad亚型的诱导免疫应答而成为问题。为了帮助避免Ad免疫屏障并避免当前Ad5[E1-]载体的不利条件，构建了如上所述的改进的Ad5载体平台。
此外，与目前的Ad5[E1-]载体相比，Ad5[E1-、E2b-]载体在注射后的第一个24至72小时期间可显示减少的炎症(Nazir SA,Metcalf JP J Investig Med.2005 53:292-304；Schaack J Proc Natl Acad Sci U S A.2004 101:3124-9；Schaack J ViralImmunol.2005 18:79-88)。缺乏Ad5[E1-、E2b-]晚期基因表达使受感染的细胞不易受抗Ad5活性的影响，并允许它们产生和表达转基因持续延长时间段(Gabitzsch ES,Jones FR JClin Cell Immunol.2011S4:001.doi:10.4172/2155-9899.S4-001；Hodges BL J GeneMed.2000 2:250-9)。针对Ad5[E1-、E2b-]病毒蛋白的减少的炎症应答和导致的预先存在的Ad5免疫力的逃避可以增加Ad5[E1-、E2b-]感染APC细胞的能力，导致接种者的更强免疫。此外，增加的其他细胞类型的感染可以提供有效的CD4+和CD8+T细胞应答所需的高水平的抗原呈递，导致记忆T细胞发育。因此，似乎E2b区的缺失可赋予有利的免疫特性，例如引发对特定抗原的有效免疫应答，同时即使在存在预先存在的Ad5免疫力的情况下也使对Ad5蛋白的免疫应答最小化。
结果证明了基于重组Ad5[E1-、E2b-]平台的疫苗克服预先存在的和/或Ad5载体诱导的免疫力并诱导显著的保护性免疫应答的能力。这些研究证实，新的基于Ad5[E1-、E2b-]载体的疫苗1)与目前的Ad5[E1-]载体相比可诱导显著更高的CMI应答，2)可用于被设计为诱导有效的CMI应答的多种免疫方案，3)可以在具有预先存在的Ad5免疫力的动物中诱导显著的抗原特异性CMI应答，和4)可以在具有高水平的预先存在的Ad5免疫力的动物中诱导显著的抗肿瘤应答或预防感染性疾病。
某些方面涉及用于产生针对黄病毒靶抗原的免疫应答的方法和腺病毒载体。特别地，某些方面可以提供改进的基于Ad的疫苗，使得可以实现针对一种以上抗原靶标实体的多次疫苗接种。重要的是，疫苗接种可在存在对Ad的预先存在的免疫力的情况下进行和/或施用于先前用本文所述的腺病毒载体或其他腺病毒载体多次免疫的受试者。腺病毒载体可以多次施用于受试者以诱导针对多种黄病毒抗原的免疫应答，包括但不限于产生广谱类抗体和针对引起多关节痛(polyarthralgias)或脑炎的黄病毒的细胞介导的免疫应答。
某些方面提供了E2b缺失的腺病毒载体的使用，例如美国专利号6,063,622；6,451,596；6,057,158和6,083,750中所述的那些(均通过引用整体并入本文)。如'622专利中所述，为了进一步削弱病毒蛋白质表达，并且还降低产生有复制能力Ad(RCA)的频率，可以在某些方面提供在E2b区中含有缺失的腺病毒载体。这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖需要表达缺失的E2b基因产物的细胞系。
在进一步方面，可以提供包装细胞系；例如E.C7(正式地称为C-7)，其衍生自HEK-203细胞系(Amalfitano A等人Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:3352-56；Amalfitano A等人Gene Ther 1997 4:258-63)。
此外，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白可以在E.C7或类似细胞中与E1基因产物一起组成型地表达。将基因区段从Ad基因组转移到生产细胞系可以具有立即的益处：(1)增加重组DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的腺病毒载体的携带能力，因为DNA聚合酶和前末端蛋白的可以理论上缺失的组合编码序列大约是4.6kb；(2)RCA产生的潜力降低，因为需要两个或更多个独立的重组事件来产生RCA。
因此，E1、Ad DNA聚合酶和表达前末端蛋白的细胞系能够使携带能力大约13kb的腺病毒载体繁殖，而不需要污染的辅助病毒(Mitani等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 199592:3854；Hodges等人J Gene Med 2000 2:250-259；Amalfitano和Parks Curr Gene Ther2002 2:111-133)。
此外，当缺失对病毒生命周期关键的基因(例如E2b基因)时，可能发生Ad复制或表达其他病毒基因蛋白的进一步削弱。这可以降低病毒感染细胞的免疫识别，并且可以允许延长的外源转基因表达的持续时间。
但是，E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失载体的重要特性可以包括它们不能表达来自E1和E2b区的各自蛋白质，以及大多数病毒结构蛋白质表达的预测的缺乏。例如，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责晚期结构蛋白L1至L5的转录(Doerfler,In Adenovirus DNA,TheViral Genome and Its Expression(Martinus Nijhoff Publishing Boston,1986)。尽管MLP可以在Ad基因组复制之前具有最低活性，但是只有在病毒基因组复制发生后，才能由MLP主要转录和翻译高毒性的Ad晚期基因(Thomas和Mathews Cell 1980 22:523)。这种晚期基因转录的顺式依赖性活化一般可以是DNA病毒的特征，例如在多瘤和SV-40的生长中。DNA聚合酶和前末端蛋白可以是Ad复制绝对必需的(与E4或蛋白质IX蛋白不同)，并且因此它们的缺失可以对腺病毒载体晚期基因表达，以及该表达在APC等细胞中的毒性作用极为不利。
在某些实施方式中，预期使用的腺病毒载体包括E2b缺失的腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区和E1区具有缺失，但没有缺失Ad基因组的任何其他区。在另一个实施方式中，预期使用的腺病毒载体可包括E2b缺失的腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区中具有缺失并且在E1和E3区中具有缺失，但没有其他区缺失。在进一步实施方式中，预期使用的腺病毒载体可包括腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区中具有缺失并且在E1、E3中具有缺失并且部分或完全去除E4区，但没有其他缺失。
在另一个实施方式中，预期使用的腺病毒载体包括腺病毒载体，其在Ad基因组的E2b区中具有缺失并且在E1和E4区域中具有缺失，但没有其他缺失。在另外的实施方式中，预期使用的腺病毒载体可包括腺病毒载体，其在Ad基因组的E2a、E2b和E4区中具有缺失，但没有其他缺失。
在一个实施方式中，用于本文的腺病毒载体包含缺失E2b区的E1和DNA聚合酶功能但没有其他缺失的载体。在进一步实施方式中，用于本文的腺病毒载体具有E1和E2b区的前末端蛋白功能缺失而没有其他缺失。
在另一个实施方式中，用于本文的腺病毒载体缺失E1、DNA聚合酶和前末端蛋白功能，并且没有其他缺失。在一个特定的实施方式中，预期用于本文的腺病毒载体缺失E2b区和E1区的至少一部分，但不是“空壳”腺病毒载体。在这方面，可以缺失载体的DNA聚合酶和E2b区的前末端蛋白功能二者。
如本文所使用，术语“E2b缺失”可以指突变的特定DNA序列，以此方式以便阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能。因此，在某些实施方式中，“E2b缺失”可以指从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列。E2b缺失或“在E2b区内含有缺失”可以指在Ad基因组的E2b区内缺失至少一个碱基对。因此，在某些实施方式中，缺失多于一个碱基对，且在进一步实施方式中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一实施方式中，缺失具有在Ad基因组的E2b区内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。E2b缺失可以是阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的缺失，且因此涵盖在E2b特定蛋白质的编码部分的外显子内的缺失以及在启动子和前导序列内的缺失。在某些实施方式中，E2b缺失为阻止E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白中的一个或两个的表达和/或功能的缺失。在进一步实施方式中，“E2b缺失”可以指Ad基因组的此区的DNA序列中使得一个或更多个所编码蛋白质呈非功能性的一个或更多个点突变。这类突变可以包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。
如本领域技术人员在阅读本公开内容时将理解的，可以缺失Ad基因组的其他区。因此，如本文所用，在Ad基因组的特定区中“缺失”可以指突变的特定DNA序列，以此方式以便阻止由该区编码的至少一种基因产物的表达和/或功能。在某些实施方式中，在特定区中“缺失”可以指从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列，以此方式以便阻止由该区编码的表达和/或功能(例如，DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)。特定区内的“缺失”或“含有缺失”可以指Ad基因组的该区内的至少一个碱基对的缺失。因此，在某些实施方式中，缺失多于一个碱基对，并且在进一步的实施方式中，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对从特定区缺失。在另一个实施方式中，缺失是在Ad基因组的特定区内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。在一些实施方式中，上述缺失中的任何一种也可以是两个或更多个碱基对易位的结果。
这些缺失可以使得可以阻止由该区编码的基因产物的表达和/或功能。因此，缺失可以包括蛋白质编码部分的外显子内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在进一步实施方式中，Ad基因组的特定区中“缺失”可以指Ad基因组的该区的DNA序列中的一个或多个点突变，使得一种或多种编码的蛋白质是无功能的。此类突变可包括残基被不同残基置换，导致氨基酸序列的变化，这可导致无功能蛋白质。
可以使用本领域已知的重组技术产生包含一个或多个缺失的腺病毒载体(参见例如，Amalfitano等人J.Virol.1998 72:926-33；Hodges等人,J Gene Med 2000 2:250-59)。如本领域技术人员所认识到的，使用合适的包装细胞系可以使使用的腺病毒载体成功地生长至高滴度，所述包装细胞系组成型地表达E2b基因产物和可以缺失的任何必需基因的产物。在某些实施方式中，可以使用HEK-293衍生的细胞，其不仅组成型地表达E1和DNA聚合酶蛋白，还组成型地表达Ad-前末端蛋白。在一个实施方式中，E.C7细胞用于成功地生长腺病毒载体的高滴度原种(参见例如，Amalfitano等人J.Virol.1998 72:926-33；Hodges等人JGene Med 2000 2:250-59)。
为了从自我繁殖的腺病毒载体中缺失关键基因，由靶基因编码的蛋白质可以首先在HEK-293细胞或类似细胞中与E1蛋白一起共表达。因此，只能使用组成型地共表达时无毒的那些蛋白质(或可诱导地表达的有毒蛋白质)。已证实E1和E4基因的HEK-293细胞中的共表达(利用诱导型，非组成型启动子)(Yeh等人J.Virol.1996 70:559；Wang等人GeneTherapy 1995 2:775；和Gorziglia等人J.Virol.1996 70:4173)。E1和蛋白质IX基因(病毒体结构蛋白)已共表达(Caravokyri和Leppard J.Virol.1995 69:6627)，并且还描述了E1、E4和蛋白质IX基因的共表达(Krougliak和Graham Hum.Gene Ther.1995 6:1575)。已经在如具有E1和蛋白酶基因的反式互补(transcomplementing)细胞系中成功表达了E1和100k基因(Oualikene等人Hum Gene Ther 2000 11:1341-53；Hodges等人J.Virol 2001 75:5913-20)。
用于生长高滴度的E2b缺失的Ad颗粒的共表达E1和E2b基因产物的细胞系描述于美国专利号6,063,622中。E2b区编码病毒复制蛋白，其对于Ad基因组复制可以是绝对必需的(Doerfler，上文和Pronk等人Chromosoma 1992 102:S39-S45)。有用的细胞系组成型地表达大约140kDa的Ad-DNA聚合酶和/或大约90kDa的前末端蛋白。特别地，具有E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的高水平、组成型共表达而没有毒性的细胞系(例如，E.C7)可以期望用于繁殖Ad以用于多次疫苗接种。这些细胞系可以允许E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的腺病毒载体的繁殖。
重组Ad可以使用本领域已知的技术繁殖。例如，在某些实施方式中，含有E.C7细胞的组织培养板以适当的MOI(例如5)用腺病毒载体病毒原种感染，并在37.0℃下培育40-96小时。收获感染的细胞，重悬浮于10mM Tris-Cl(pH8.0)中，超声处理，并通过两轮氯化铯密度离心纯化病毒。在某些技术中，含有病毒的带在Sephadex CL-6B柱(Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)上脱盐，加入蔗糖或甘油，并将等分试样储存在-80℃。在一些实施方式中，将病毒置于被设计成增强其稳定性的溶液中，例如A195(Evans等人J Pharm Sci 200493:2458-75)。可以测量原液的滴度(例如，通过测量SDS裂解后病毒等分试样在260nm处的光密度)。在另一个实施方式中，包含整个重组E2b缺失的腺病毒载体的线性或环状质粒DNA可以转染到E.C7或类似细胞中，并在37.0℃下培育直至存在病毒产生的证据(例如，细胞病变效应)。然后，来自这些细胞的条件培养基可用于感染更多的E.C7或类似细胞，以在纯化前扩增产生的病毒量。
纯化可以通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤完成。在某些实施方式中，可以使用市售产品(例如，来自Puresyn,Inc.,Malvem,PA的Adenopure)或定制的色谱柱，通过柱色谱法纯化病毒。
在某些实施方式中，重组Ad可以包含足够的病毒以确保待感染的细胞面临一定数量的病毒。因此，可以提供重组Ad的原液，特别是不含RCA的重组Ad的原液。Ad原液的制备和分析在本领域中是众所周知的。病毒原种的滴度可以有很大差异，主要取决于病毒基因型和用于制备它们的方案和细胞系。病毒原种可以具有至少约106、107或108个病毒颗粒(VP)/ml的滴度，并且许多这样的原种可以具有更高的滴度，例如至少约109、1010、1011或1012VP/ml。
III.异源核酸
腺病毒载体还可以包含异源核酸序列，其编码几种感兴趣靶抗原、其片段或融合物，针对其产生免疫应答是期望的。在一些实施方式中，腺病毒载体包含编码几种蛋白质、其融合物或其片段的异源核酸序列，其可调节免疫应答。因此，某些方面提供了包含异源核酸序列的第二代E2b缺失的腺病毒载体。
因此，某些方面提供核酸序列，其在本文中也可称为编码几种感兴趣黄病毒靶抗原的多核苷酸。因此，某些方面提供了编码来自如本文进一步描述的任何来源的靶抗原的多核苷酸，包含此类多核苷酸的载体和用此类表达载体转化或转染的宿主细胞。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文基本上可互换使用。如所属领域的技术人员还将认识到，多核苷酸可为单链(编码或反义链)或双链，且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包含hnRNA分子，其含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子，和mRNA分子，其不含有内含子。额外编码或非编码序列可(但不一定)存在于多核苷酸内，且多核苷酸可(但不一定)与其它分子和/或载体材料连接。如本文所用，分离的多核苷酸可以指多核苷酸大体上与其它编码序列分开。举例来说，如本文所用，分离的DNA分子不含有大部分的无关编码DNA，如大的染色体片段或其它功能性基因或多肽编码区。当然，这可以指原始分离的DNA分子，且不排除在实验室中通过重组稍后添加到区段中的基因或编码区。
如所属领域的技术人员将理解，多核苷酸可包含基因组序列、基因组外和质粒编码的序列、和较小的工程化基因区段，所述基因区段表达或可适于表达如本文所描述的靶抗原、抗原片段、肽等。这类区段可为天然分离的，或通过人力以合成方式修饰的。
多核苷酸可包括天然序列(即，编码靶抗原多肽/蛋白质/表位或其部分的内源性序列)，或可包括编码这种序列的变体或衍生物的序列。在某些实施方式中，本文中陈述的多核苷酸序列编码如本文描述的靶抗原蛋白。在一些实施方式中，多核苷酸表示已对于在特定细胞类型(即，人类细胞系)中的表达进行优化的新颖基因序列，其可大体上不同于天然核苷酸序列或变体但编码类似蛋白质抗原。
在其他相关的实施方式中，可以提供与编码如本文所述的蛋白质(例如，感兴趣靶抗原)的天然序列具有实质同一性的多核苷酸变体，例如与使用本文所述方法编码多肽的天然多核苷酸序列相比(例如，使用标准参数进行BLAST分析，如下所述)，包含至少70％序列同一性，特别是至少75％上至99％或更高序列同一性的那些。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
在某些方面，多核苷酸变体将含有一个或更多个置换、添加、缺失和/或插入，具体地使得由变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性或异源靶蛋白的免疫原性相对于由天然多核苷酸序列编码的多肽不大体上减弱。如本文其它地方所描述，多核苷酸变体可以编码靶抗原的变体或其片段(例如，表位)，其中变体多肽或其片段(例如，表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向相对于天然多肽大体上不减弱。术语“变体”也可以涵盖异种来源的同源基因。
某些方面可提供多核苷酸，其包括或由以下组成：编码多肽(包含如本文所描述靶蛋白抗原)的至少约5上至1000或更多个连续核苷酸，以及其间的所有中间长度。将容易地理解，在此环境中，“中间长度”可以指在给出值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200-500、500-1,000等的所有整数。如本文所描述的多核苷酸序列可在一端或两端延长额外核苷酸，所述额外核苷酸不存在于编码如本文所描述的多肽(如表位或异源靶蛋白)的天然序列中。这种额外序列可由在所公开序列的任一端或所公开序列的两端的1上至20或更多个核苷酸组成。
在某些实施方式中，多核苷酸或其片段，不管编码序列自身的长度，可与如以下的其它DNA序列组合：启动子、表达控制序列、聚腺苷酸化信号、额外限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等，使得其总长度可变化相当大。因此预期，可采用几乎任何长度的核酸片段，并且总长度可以受制备简易性和预期重组DNA方案中的用途限制。举例来说，预期具有以下总长度的说明性多核苷酸区段可用于许多实施：长度约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对，等(包含所有中间长度)。
当比较多核苷酸序列时，如下文所描述，如果两个序列中的核苷酸的序列当经比对以获得最大对应性时相同，那么两个序列可以被认为“同一的”。两个序列之间的比较可以通过在比较窗口比较序列，以鉴定和比较局部区的序列类似性来进行。如本文所用，“比较窗口”可以指至少约20个、通常30到约75个、40到约50个邻接位置的区段，其中在两个序列经最优比对之后，序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。
用于比较的序列的最优比对可以使用默认参数，使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)来执行。这个程序体现在以下参考文献中描述的几种比对方案：Dayhoff MO(1978)A model of evolutionary changein proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff MO(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J Unified Approach toAlignment and Phylogenes,pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins DG和Sharp PM CABIOS 1989 5:151-53；Myers EW和Muller W CABIOS 1988 4:11-17；Robinson ED Comb.Theor 1971 11A 05；Saitou N,Nei M MoI.Biol.Evol.1987 4:406-25；Sneath PHA和Sokal RR NumericalTaxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,SanFrancisco,CA(1973)；Wilbur WJ和Lipman DJ Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 1983 80:726-30。
可选地，用于比较的序列的最优比对可通过以下来进行：Smith和Waterman,Add.APL.Math 1981 2:482的局部同一性算法；Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.1970 48:443的同一性比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988 85:2444的相似性搜索方法；这些算法(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup(GCG),575 Science Dr.,Madison,Wl中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式；或检验(inspection)。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul et al.,Nucl.Acids Res.1977 25:3389-3402和Altschul等人J.MoI.Biol.1990 215:403-10中。BLAST和BLAST 2.0可以例如与本文所述的参数一起使用，以测定多核苷酸的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，累积得分可以使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)计算。当累积比对得分从其达到的最大值降低量X时；累积得分因一次或多次负得分残基比对的累积而变成零或低于零；或到达任一序列的末端时，中断字命中点在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)是11，并且期望值(E)是10，和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989 89:10915)比对，(B)是50，预期值(E)是10，M＝5，N＝-4，和两条链的比较。
在某些方面，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗口中比较两个最优比对序列来测定，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括相较于参考序列(其不包括添加或缺失)的20％或更少，通常5到15％或10到12％的添加或缺失(即，间隙)，以用于对两个序列的最优比对。百分比可以通过以下方式计算：测定两个序列中存在的同一核酸碱基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列(即，窗口大小)中的总位置数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
所属领域的一般技术人员将了解，如本文所描述，由于遗传密码的简并性，可以存在多种编码感兴趣的特定抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些可以与任何天然基因的核苷酸序列携有最小同源性。但是，在某些方面具体地预期由于密码子使用差异而变化的多核苷酸。此外，还考虑包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(例如缺失、添加和/或置换)而可以改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可(但不一定)具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
因此，在另一实施方式中，采用诱变方法(如位点特异性诱变)，以用于制备靶抗原序列或其片段的变体和/或衍生物，如本文所描述的。通过此方法，多肽序列中的特异性修饰可通过编码其的潜在多核苷酸的诱变来制备。这些技术可以提供制备和测试序列变体的直接了当的方法，例如结合前述考虑中的一个或更多个，通过将一种或更多种核苷酸序列变化引入到多核苷酸中。
通过使用编码期望突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻核苷酸，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列以在横穿的缺失接合两侧形成稳定的双螺旋，位点特异性诱变可以允许产生突变体。可在所选择多核苷酸序列中采用突变，以改进、变更、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸自身的特性，和/或变更所编码多肽的以下特性：活性、组成、稳定性或一级序列。
编码多肽的多核苷酸区段或片段可容易地通过以下来制备：例如通过化学方法直接合成片段，如通常使用自动化寡核苷酸合成器实践。另外，片段可通过以下来获得：应用核酸复制技术(如美国专利4,683,202的PCRTM技术)，通过将所选择序列引入到重组载体中以用于重组生产，和通过分子生物学领域的技术人员一般已知的其它重组DNA技术(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NY,NY)。
为了表达如本文所描述的期望靶抗原多肽或其片段、或包括以上中的任一种的融合蛋白，使用所属领域中已知的重组技术，可以将编码多肽或功能等效物的核苷酸序列插入到如本文别处描述的适当Ad中。适当腺病毒载体可以含有用于转录与翻译所插入编码序列的必需元件以及任何期望连接体。所属领域的技术人员熟知的方法可用于构建这些腺病毒载体，所述载体含有编码感兴趣多肽的序列和适当的转录和翻译控制元件。这些方法可以包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。这类技术例如描述于以下中：Amalfitano等人J.Virol.1998 72:926-33；Hodges等人J Gene Med 2000 2:250-259；Sambrook J等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Plainview,N.Y.和Ausubel FM等人(1989)Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y。
可使用各种载体/宿主系统来容纳和产生多核苷酸序列。这些系统可以包含(但不限于)：微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌；用酵母菌载体转化的酵母菌；昆虫细胞系统，其用病毒载体(例如杆状病毒)感染；植物细胞系统，其用病毒载体(例如花椰菜嵌纹病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或细菌载体(例如Ti或pBR322质粒)转化；或动物细胞系统。
存在于腺病毒载体中的“控制元件”或“调控序列”可以为载体的那些非翻译区——增强子、启动子、5'和3'未翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录与翻译。这些元件可在其强度和特异性方面变化。取决于所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录与翻译元件，包含组成型启动子和诱导型启动子。举例来说，可将编码感兴趣多肽的序列接合到Ad转录/翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。病毒基因组的非必需E1或E3区中的插入可用于获得能够在受感染宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan J和Shenk T(1984)Proc.Natl.Acad.Sci 1984 87:3655-59)。另外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)增强子，可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。转录增强子可以包括一种元件、至少两种元件、至少三种元件、至少四种元件、至少五种元件、或至少六种元件。
特异性起始信号还可用以实现编码感兴趣多肽的序列的更高效翻译。这类信号包含ATG起始密码子和相邻序列。在将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入到适当表达载体中的情况下，可以不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅插入编码序列或其部分的情况下，可以提供包含ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。此外，起始密码子可以在正确阅读框中以确保整个插入物的翻译。外源性翻译元件和起始密码子可具有多个天然和合成的起源。可通过包含适合于所用的特定细胞系统的增强子来增强表达效率，所述增强子如描述于文献(Scharf D.等人Results Probl.Cell Differ.1994 20:125-62)中的那些增强子。也可并入特异性终止序列(转录或翻译终止序列)，以实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
用于使用对产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体来检测和测量多核苷酸编码的产物(例如，感兴趣的靶抗原)的表达的各种方案为所属领域中已知的。实例可以包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。对于一些应用，可以使用利用单克隆抗体与给定多肽上的两个非干扰表位反应的基于两位点单克隆的免疫分析，但也可采用竞争性结合分析。这些和其它分析描述于Hampton R等人(1990；Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul.Minn.)和Maddox DE等人J.Exp.Med.1983 758:1211-16)等中。腺病毒载体可以包括编码几种感兴趣的黄病毒抗原的核酸序列。
在某些实施方式中，可以将增加期望靶抗原的表达的元件并入到本文所描述的腺病毒载体的核酸序列中。这类元件包含内部核糖体结合位点(IRES；Wang和SiddiquiCurr.Top.Microbiol.Immunol 1995 203:99；Ehrenfeld和SemlerCurr.Top.Microbiol.Immunol.1995 203:65；Rees et al.,Biotechniques 1996 20:102；Sugimoto等人Biotechnology 1994 2:694)。IRES可以增加翻译效率。同样，其它序列可增强表达。对于一些基因，尤其在5'端处的序列可以抑制转录和/或翻译。这些序列可以是可形成发夹结构的回文结构。可以缺失或不缺失待递送核酸中的任何这类序列。
可以分析转录物或翻译产物的表达水平，以确认或确定哪些序列影响表达。可通过任何已知方法，包含RNA印迹杂交、RNA酶探针保护等，来分析转录物水平。可通过任何已知方法，包含ELISA，来分析蛋白质水平。如本领域技术人员将认识到的，可以使用本领域已知的重组技术产生包含异源核酸序列的腺病毒载体，例如在Maione等人Proc Natl AcadSci USA 2001 98:5986-91；Maione等人Hum Gene Ther 2000 1:859-68；Sandig等人ProcNatl Acad Sci USA,2000 97:1002-07；Harui等人Gene Therapy 2004 11:1617-26；Parks等人Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:13565-570；DelloRusso等人Proc Natl Acad SciUSA 2002 99:12979-984；Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,NY,NY)中描述的那些。
如上面所指出，腺病毒载体可包含编码几种感兴趣的黄病毒靶蛋白或抗原的核酸序列。在这方面，载体可含有编码1至4种或更多种不同感兴趣的靶抗原的核酸。靶抗原可以是全长蛋白质或可以是其片段(例如表位)。腺病毒载体可以含有编码来自一种感兴趣的靶蛋白的多个片段或表位的核酸序列，或者可以含有来自许多不同感兴趣的靶黄病毒抗原蛋白的一种或多种片段或表位。
在一些方面，核酸序列编码多种黄病毒靶抗原。编码多种黄病毒靶抗原的核酸序列可包含多个基因插入物，每个基因插入物对应于靶抗原，并且其中每个基因插入物由编码自切割2A肽的核酸序列分开。在一些方面，自切割2A肽(即可切割连接体)衍生自猪捷申病毒-1或Thosea asigna病毒等。
可切割连接体的实例可包括2A连接体(例如，T2A)、2A样连接体或其功能等效物及其组合。在一些实施方式中，连接体包括小核糖核酸病毒2A样连接体，猪捷申病毒(P2A)、Thosea asigna病毒(T2A)的CHYSEL序列，或其组合、变体和功能等效物。
在某些实施方式中，免疫原性片段结合至MHC I类或II类分子。如本文所用，如果使用本领域已知的任何分析法可检测到这种结合，则可以说免疫原性片段“结合至”MHC I类或II类分子。例如，可以通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物的能力来间接评估多肽结合至MHC I类的能力(参见Parker et al.,J.Immunol.752:163,1994)。可选地，可以使用本领域已知的功能性肽竞争分析。多肽的免疫原性片段通常可使用众所周知的技术鉴定，例如Paul,Fundamental Immunology,3rded.,243-247(Raven Press,1993)和其中引用的参考文献中总结的那些技术。用于鉴定免疫原性片段的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。特定靶多肽的免疫原性片段可以是与这种抗血清和/或T细胞反应的片段，在基本上不低于全长靶多肽的反应性的水平下(例如，在ELISA和/或T反应性分析中)。换句话说，免疫原性片段可以在这些分析中以与全长多肽的反应性相似或更高的水平反应。这种筛选通常可以使用本领域普通技术人员熟知的方法进行，例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988中所述的那些。
靶抗原可包括但不限于衍生自任何黄病毒的抗原。靶抗原可包括由本文所述的任何感染性黄病毒产生的蛋白质，例如C、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。如本文所用，“感染因子”可以是能够感染宿主的任何物种。感染因子可包括例如黄病毒属内的任何病毒。
腺病毒载体还可以包括编码增加靶抗原免疫原性的蛋白质的核酸序列。在这方面，用含有这种蛋白质的腺病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，其包含与增加感兴趣的靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的感兴趣的靶抗原。
IV.组合疗法
某些实施方式提供用于治疗和预防感染性疾病的组合免疫疗法和疫苗组合物。一些实施方式提供组合多靶向疫苗、免疫疗法和方法，用于增强对复杂疾病例如感染性疾病的治疗应答。组合疗法的每种组分可以独立地包含在用于预防寨卡感染或任何黄病毒感染的疫苗组合物中。
“治疗”可以指向受试者施用治疗有效剂量的本公开的疫苗。治疗可以在药物组合物中施用至受试者。受试者在治疗时也可以是健康的和无疾病的，在这种情况下，治疗可以称为预防性疫苗接种。受试者在治疗时可能患有疾病，在这种情况下，该治疗可称为预防性疫苗接种。
“受试者”可以指任何动物，包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和家禽。“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。
在一些方面，载体包括至少一种抗原。在一些方面，载体包括至少两种抗原。在一些方面，疫苗制剂包括1:1比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:2比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:3比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:4比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:5比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:6比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:7比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:8比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:9比的载体与抗原。在一些方面，疫苗包括1:10比的载体与抗原。
在一些方面，疫苗是组合疫苗，其中该疫苗包括至少两种载体，每种包含至少单一抗原。
当在受试者中同时施用或表达来自相同或不同载体的不同抗原的混合物时，它们可以彼此竞争。结果，可以评估组合免疫疗法或疫苗中包含不同浓度和比的表达抗原的制剂，并使其适合于受试者或受试者组，以确保在施用后发生有效和持续的免疫应答。
包括多种抗原的组合物可以以不同比存在。例如，具有多于一种载体的制剂可以具有不同比。例如，免疫疗法或疫苗可以具有以1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:30、2:1、2:3、2:4、2:5、2:6、2:7、2:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、3:1、3:3、3:4、3:5、3:6、3:7、3:8、4:1、4:3、4:5、4:6、4:7、4:8、5:1、5:3、5:4、5:6、5:7、5:8、6:1、6:3、6:4、6:5、6:7、6:8、7:1、7:3、7:4、7:5、7:6、7:8、8:1、8:3、8:4、8:5、8:6、或8:7的化学计量的两种不同载体。
在一些实施方式中，至少一种重组核酸载体是复制缺陷型腺病毒载体，其包含含有第一同一性值的复制缺陷型腺病毒5载体。在一些实施方式中，复制缺陷型腺病毒载体包含E2b区中的缺失。在一些实施方式中，复制缺陷型腺病毒载体还包含E1区中的缺失。在一些实施方式中，复制缺陷型腺病毒载体包含E1区、E2b区、E3区、E4区或其任何组合中的缺失。
下面进一步详细地描述了可以与本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]疫苗组合使用的具体疗法。
A.共刺激分子
除了使用含有寨卡病毒抗原的基于重组腺病毒的载体疫苗外，还可以将共刺激分子掺入到所述疫苗中，这将增加免疫原性。
免疫应答的起始需要用于通过APC活化天然T细胞的至少两种信号(Damle等人JImmunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Hellstrom等人Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44(1996)；Hodge等人Cancer Res 39:5800-07(1999))。抗原特异性第一信号经由肽/主要组织相容性复合物(MHC)通过T细胞受体(TCR)递送并使T细胞进入细胞周期。可以递送第二种或共刺激信号用于细胞因子产生和增殖。
正常地发现于专职抗原呈递细胞(APC)的表面上的至少三种不同的分子已经被报道为能够提供对T细胞活化关键的第二信号：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人CD58)(Damle等人J Immunol 148:1985–92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261–82(1994)；Wingren等人Crit Rev Immunol 15:235–53(1995)；Parra等人Scand.J Immunol 38:508–14(1993)；Hellstrom等人Ann NY Acad Sci 690:225–30(1993)；Parra等人J Immunol158:637–42(1997)；Sperling等人J Immunol 157:3909–17(1996)；Dubey等人J Immunol155:45–57(1995)；Cavallo等人Eur J Immunol 25:1154–62(1995))。
例如，这些共刺激分子可以是不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1/β-2整联蛋白)复合物相互作用，以及LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在某些实施方式中，将期望具有分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当与包含编码靶抗原(例如寨卡病毒抗原)的一种或多种核酸的基于重组腺病毒的载体疫苗组合时，将进一步增加/增强针对特定靶抗原的抗寨卡免疫应答。
V.免疫融合配偶体
本文所描述的病毒载体或组合物可进一步包括编码蛋白质的核酸序列，或“免疫融合配偶体”，所述“免疫融合配偶体”可增加靶抗原如寨卡病毒抗原，或本公开的任何靶黄病毒抗原的免疫原性。在这点上，在用含有这种蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括与增加感兴趣的靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的感兴趣的靶抗原。此外，用编码寨卡病毒抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起免疫应答增强，使得相较于编码单独寨卡病毒抗原的Ad5[E1-、E2b-]载体或单独免疫融合配偶体，两个治疗性部分的组合更加协同地增强免疫应答。举例来说，用编码寨卡病毒抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞应答的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在向有需要的受试者施用之后的存活率结果。在某些实施方式中，用编码寨卡病毒抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起产生免疫应答，包括相较于对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，施用编码寨卡病毒抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的受试者中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由ELISpot分析测量细胞因子分泌所测量的，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于适当对照，施用如本文所描述的编码寨卡病毒抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
作为额外实例，用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞应答的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在向有需要的受试者施用之后的存活率结果。在某些实施方式中，用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起产生免疫应答，包括相较于对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，施用编码靶表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的受试者中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由ELISpot分析测量细胞因子分泌所测量的，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于适当对照，施用如本文所描述的腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
在一个实施方式中，这类免疫融合配偶体衍生自分枝杆菌属某种，如结核分枝杆菌衍生的Ra12片段。衍生自分枝杆菌属某种的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:38-SEQID NO:46和SEQ ID NO:109-SEQ ID NO:114中所陈述的序列中的任一种。寡核苷酸、Met-His标签和肠激酶识别位点，其可以用于构建这些分枝杆菌属某种衍生的Ra12序列，在SEQID NO:115-SEQ ID NO:122中的任一种中陈述，也如表2中所示出的。增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的Ra12组合物和其使用方法描述于美国专利号7,009,042中，所述专利以其全部并入本文中。简单来说，Ra12是指为结核分枝杆菌MTB32A核酸的子序列的多核苷酸区。MTB32A为由毒性和无毒结核分枝杆菌菌株中的基因编码的32kDa丝氨酸蛋白酶。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已有描述(参见例如美国专利号7,009,042；Skeiky等人,Infection和Immun.67:3998-4007(1999)，其以其全部并入本文中)。MTB32A编码序列的C末端片段可以高水平表达，且在整个纯化过程中保持为可溶性多肽。此外，Ra12可增强与其融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽可包括对应于MTB32A的氨基酸残基192到323的14kDa C末端片段。其它Ra12多核苷酸一般可包括编码Ra12多肽的一部分的至少约15、30、60、100、200、300或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可包括天然序列(即，编码Ra12多肽或其部分的内源性序列)或可包括这种序列的变体。Ra12多核苷酸变体可含有一个或更多个置换、添加、缺失和/或插入，使得所编码融合多肽的生物活性相对于包括天然Ra12多肽的融合多肽不大体上减弱。变体与编码天然Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列可具有至少约70％、80％或90％同一性或更多。
在某些方面，免疫融合配偶体可衍生自蛋白质D，一种革兰氏阴性细菌B型流感嗜血杆菌的表面蛋白。衍生自蛋白质D的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:47中所陈述的序列。在一些情况下，蛋白质D衍生物包括大约前三分之一的蛋白质(例如前N末端100-110个氨基酸)。蛋白质D衍生物可被脂化。在某些实施方式内，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含于N末端上，以提供具有额外外源性T细胞表位的多肽，其可增加在大肠杆菌中的表达水平，且可用作表达增强子。脂质尾可确保将抗原最优呈递到抗原呈递细胞。其它融合配偶体可包含来自流感病毒的非-结构蛋白质NS1(血凝素)。通常，使用N末端81个氨基酸，但是可使用包含T-辅助表位的不同片段。
在某些方面，免疫融合配偶体可为称为LYTA的蛋白质或其部分(特定来说，C末端部分)。衍生自LYTA的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:48中所陈述的序列。LYTA衍生自肺炎链球菌，所述肺炎链球菌合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码)。LYTA为特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C末端结构域是对于胆碱或对于一些胆碱类似物(如DEAE)具有亲和力的原因。可以采用这种特性来研发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。可采用在氨基末端处含有C-LYTA片段的杂交蛋白质的纯化。在另一实施方式内，可以将LYTA的重复部分并入到融合多肽中。重复部分可例如发现于在残基178开始的C末端区中。一个特定重复部分包含残基188-305。
在一些实施方式中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，所述免疫融合配偶体在本文中也可以被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合可产生与以下中的一种或更多种具有实质同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合可编码核酸，所述核酸编码与以下中的一种或更多种具有实质同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施方式中，靶抗原融合进一步包括一种或更多种免疫融合配偶体，所述免疫融合配偶体在本文中也可以被称作“免疫原性组分”，其包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。IFN-γ的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:49中所陈述的序列。TNFα的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:50中所陈述的序列。IL-2的序列可为(但不限于)SEQ IDNO:51中所陈述的序列。IL-8的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:52中所陈述的序列。IL-12的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:53中所陈述的序列。IL-18的序列可为(但不限于)SEQID NO:54中所陈述的序列。IL-7的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:55中所陈述的序列。IL-3的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:56中所陈述的序列。IL-4的序列可为(但不限于)SEQID NO:57中所阐述的序列。IL-5的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:58中所陈述的序列。IL-6的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:59中所陈述的序列。IL-9的序列可为(但不限于)SEQID NO:60中所陈述的序列。IL-10的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:61中所陈述的序列。IL-13的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:62中所陈述的序列。IL-15的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:63中所陈述的序列。IL-16的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:90中所陈述的序列。IL-17的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:91中所陈述的序列。IL-23的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:92中所陈述的序列。IL-32的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:93中所陈述的序列。
在一些实施方式中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施方式中，靶抗原与免疫融合配偶体一起在细胞中共表达，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。
在一些实施方式中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括CpG ODN(例如，A、B或C类CpG ODN；非限制性实例序列在SEQ ID NO:124-SEQ ID NO:135中示出，其中磷酸二酯碱基以大写字母示出，硫代磷酸酯碱基以小写字母示出，并且回文结构加下划线以及冒号表示反射点)、霍乱毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:65中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截断的A亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQID NO:66中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截断的B亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:67中)、Hp91(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:68中)、CCL20(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:123中)、CCL3(非限制性实例序列显示于SEQID NO:70中)、GM-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:71中)、G-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:72中)、LPS肽模拟物(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:73-SEQ IDNO:84中)、志贺毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:85中)、白喉毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:86中)或CRM197(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:89中)。
在一些实施方式中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括IL-15超激动剂。白介素15(IL-15)为在病毒感染之后分泌的天然存在的炎性细胞因子。分泌的IL-15可经由效应免疫细胞上的其同源受体通过信号传导来执行其功能，且因此可使得效应免疫细胞活性总体增强。
基于IL-15刺激和维持细胞免疫应答的广泛能力，认为其为有前景的免疫治疗药物。然而，IL-15临床研发的主要限制可包含：在标准哺乳动物细胞表达系统中的低生产产率和短血清半衰期。此外，包括由同一细胞共表达的蛋白质的IL-15:IL-15Rα复合物，而不是游离IL-15细胞因子，可负责刺激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
为了处理这些缺点，鉴定出具有增大的结合IL-15Rβγc的能力和增强的生物活性的一种新颖IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)。向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人类IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)可得到IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现用于支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其比游离IL-15细胞因子的低10倍以上。
在一些实施方式中，IL-15超激动剂可以是新颖IL-15超激动剂突变体(IL-15N72D)。在某些实施方式中，向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人类IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)可得到IL-15生物活性的进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现用于支持IL-15依赖性细胞生长的中值有效浓度(EC50)，其可比游离IL-15细胞因子的低10倍以上。
因此，在一些实施方式中，本公开提供IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，其中用于支持IL-15依赖性细胞生长的EC50比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
在一些实施方式中，IL-15超激动剂为两个IL-15N72D分子与可溶性IL-15Rα/Fc融合蛋白的二聚体的生物活性蛋白质复合物，也称为ALT-803。ALT-803的组成和制造与使用ALT-803的方法描述于美国专利申请公开2015/0374790中，所述专利以引用的方式并入本文中。众所周知，在N末端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶性IL-15Rα片段可携带负责高亲和力细胞因子结合的结构元件的大部分。可溶性融合蛋白可通过将人类IL-15RαSu结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白质的氨基酸1-65)与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人类IgG1CH2-CH3区连接来产生。这种IL-15RαSu/IgG1Fc融合蛋白可具有以下优势：通过IgG1结构域的二硫键的二聚体形成；和易于使用标准蛋白A亲和色谱法来纯化。
在一些实施方式中，ALT-803可具有可溶性复合物，所述可溶性复合物由与二聚体IL-15Rαsushi结构域/人类IgG1Fc融合蛋白具有高亲和力相关联的人类IL-15变体的2个蛋白质亚基组成。IL-15变体为114个氨基酸多肽，其包括在螺旋C的位置72处具有Asn置换为Asp(N72D)的成熟人类IL-15细胞因子序列。人类IL-15R sushi结构域/人类IgG1Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的sushi结构域(成熟人类IL-15Rα蛋白的氨基酸1-65)，所述sushi结构域与含有Fc结构域(232个氨基酸)的人类IgG1CH2-CH3区连接。除N72D置换以外，所有蛋白质序列为人类的。基于亚基的氨基酸序列，包括两条IL-15N72D多肽(实例IL-15N72D序列显示于SEQ ID NO:87中)和二硫键连接的同源二聚体IL-l5RαSu/IgG1Fc蛋白(实例IL-15RαSu/Fc结构域显示于SEQ ID NO:88中)的复合物的计算分子量为92.4kDa。在一些实施方式中，编码靶抗原和ALT-803的重组载体可具有本文所描述的任何序列来编码靶抗原，且可以任何次序具有SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:88，来编码ALT-803。
各IL-15N720多肽可以具有大致12.8kDa的计算分子量，且IL-15RαSu/IgG 1Fc融合蛋白可以具有大致33.4kDa的计算分子量。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1Fc蛋白质均可被糖基化，由尺寸排阻色谱法，得到ALT-803的表观分子量为大致114kDa。对于ALT-803所测定的等电点(pI)可以在大致5.6到6.5范围内。因此，融合蛋白在pH 7下可带负电。
用编码寨卡病毒抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起增强免疫应答，使得相较于任一单独疗法，两个治疗部分的组合协同作用以更加增强免疫应答。举例来说，用编码寨卡病毒抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞应答的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞应答的刺激、或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制。用编码寨卡病毒抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可协同增强以上应答中的任一者或以上应答的组合，以极大地提高在向有需要的受试者施用之后的存活率结果。
通过在同一重组载体中表达免疫原性增强剂和靶抗原，使用本文所描述的任何重组载体，本文所描述的免疫原性增强剂中的任一种可与靶抗原融合或连接。
编码这种免疫原性增强剂的核酸序列可以包括编码在表1中总结的SEQ ID NO:38–SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65–SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:109–SEQ ID NO:135中任一种的核酸序列。
表1–免疫融合配偶体的序列
Figure BDA0001986662650000381
Figure BDA0001986662650000391
Figure BDA0001986662650000401
Figure BDA0001986662650000411
Figure BDA0001986662650000421
Figure BDA0001986662650000431
Figure BDA0001986662650000441
Figure BDA0001986662650000451
Figure BDA0001986662650000461
Figure BDA0001986662650000471
Figure BDA0001986662650000481
Figure BDA0001986662650000491
Figure BDA0001986662650000501
表2–构建分支杆菌属某种衍生的Ra12序列的工具
Figure BDA0001986662650000502
在一些实施方式中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列未由任何核酸分隔开。在其它实施方式中，可将编码连接体的核酸序列插入在编码本文所描述的任何靶抗原的核酸序列与编码本文所描述的任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施方式中，在用含有靶抗原、连接体和免疫融合配偶体的病毒载体免疫之后产生的蛋白质可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括感兴趣的靶抗原，随后连接体和最后的免疫融合配偶体，因此将靶抗原与增加感兴趣的靶抗原的免疫原性的免疫融合配偶体通过连接体连接。在一些实施方式中，连接体核酸的序列的长度可从约1到约150个核酸、约5到约100个核酸或约10到约50个核酸。在一些实施方式中，核酸序列可编码一个或更多个氨基酸残基。在一些实施方式中，连接体的氨基酸序列的长度可为约1到约50或约5到约25个氨基酸残基。在一些实施方式中，连接体的序列包括小于10个氨基酸。在一些实施方式中，连接体可以是聚丙氨酸连接体、聚甘氨酸连接体或具有丙氨酸和甘氨酸二者的连接体。
编码这种连接体的核酸序列可以是SEQ ID NO:94–SEQ ID NO:108中的任一种并在表3中总结。
表3–连接体的序列
Figure BDA0001986662650000503
Figure BDA0001986662650000511
VI.使用方法
腺病毒载体可用于许多疫苗环境中，用于产生针对如本文所述的一种或多种靶抗原的免疫应答。腺病毒载体特别重要，因为意外发现它们可以用于在对Ad具有预先存在的免疫力的受试者中产生免疫应答，并且可以用于包括使用腺病毒载体的多轮免疫的疫苗接种方案中，而使用前代的腺病毒载体，方案是不可能的。
通常，产生免疫应答可包括诱导体液应答和/或细胞介导的应答。在某些实施方式中，期望增加针对感兴趣的靶抗原的免疫应答。因此，“产生免疫应答”或“诱导免疫应答”可包括任何统计学上显著的变化，例如，一种或多种免疫细胞(T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞等)的数量增加，或这些免疫细胞中的一种或多种的活性(CTL活性、HTL活性、细胞因子分泌、细胞因子分泌的分布的变化等)增加。
技术人员将容易理解，可利用许多用于确定是否发生免疫应答改变的方法。用于检测免疫应答(例如，细胞数量、细胞因子表达、细胞活性)改变的多种方法是本领域已知的，并且可用于本发明的上下文中。示例性方法在Current Protocols in Immunology,John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,WarrenStrober编著(2001 John Wiley&Sons,NY,NY)，Ausubel等人(2001Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publ.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,NY,NY)；Sambrook等人(1989Molecular Cloning,Second Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)；Maniatis等人(1982 Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY)中以及别处描述。可用于该背景的示例性方法包括细胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖测定、细胞毒性T细胞测定(包括铬释放或等效测定)、以及使用任何数量的聚合酶链反应(PCR)或基于RT-PCR的测定的基因表达分析。
在某些实施方式中，产生免疫应答包括与对照相比，施用腺病毒载体的受试者中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5至20倍或更多倍，至少、约或至多1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19倍或由其衍生的任何范围或数字。在另一个实施方式中，产生免疫应答包括与对照相比，在施用腺病毒载体的受试者中靶特异性CTL活性增加约1.5至20倍或更多倍。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由ELISpot分析测量细胞因子分泌所测量的，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。
在进一步实施方式中，产生免疫应答包括相较于适当对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施方式中，产生免疫应答包括相较于对照，施用腺病毒载体的受试者中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
因而，某些方面可以提供用于产生针对感兴趣的黄病毒靶抗原的免疫应答的方法，包括向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中所述腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；并将腺病毒载体再施用至个体至少一次；从而产生针对靶抗原的免疫应答。在某些实施方式中，可以提供这样的方法，其中施用的载体不是空壳载体。
在进一步实施方式中，可以提供用于通过向个体施用腺病毒载体在个体中产生针对黄病毒病毒靶抗原的免疫应答的方法，其中所述个体具有对Ad的预先存在的免疫力，所述腺病毒载体包含：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体在E2b区中具有缺失，和b)编码靶抗原的核酸；并将腺病毒载体再施用至个体至少一次；从而产生针对黄病毒病毒靶抗原的免疫应答。
关于对Ad的预先存在的免疫力，这可以使用本领域已知的方法(例如基于抗体的测定)进行测定以测试Ad抗体的存在。此外，在某些实施方式中，所述方法可包括首先测定个体对Ad具有预先存在的免疫力，然后施用如本文所述的E2b缺失的腺病毒载体。
在某些方面，可以提供产生针对黄病毒靶抗原的免疫应答的方法，如别处或本文描述的那些。
在具体方面，可以提供产生针对黄病毒的免疫应答的方法，如本文别处描述的那些。
如本文别处所指出的，腺病毒载体可以包含编码一种或多种感兴趣的靶抗原的核酸序列，所述靶抗原来自任何一种或多种针对其产生免疫应答的感染因子。例如，靶抗原可包括但不限于病毒抗原蛋白，例如C、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。
对于施用，腺病毒载体原液可以与合适的缓冲液、生理学上可接受的运载体、赋形剂等组合。在某些实施方式中，在合适的缓冲液(例如无菌PBS)中施用适当数量的腺病毒载体颗粒。
在某些情况下，肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文公开的腺病毒载体组合物可以是期望的。在某些实施方式中，作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备。在其他实施方式中，E2b缺失的腺病毒载体可以以丸剂形式递送，通过吞咽或通过栓剂递送。
适于注射使用的示例性药物形式可包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的，其程度是存在容易的注射能力。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌、霉菌和真菌的污染作用。运载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散的情况下维持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等促进微生物作用的预防。在许多情况下，它可以包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
在一个实施方式中，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000ml的皮下注射液中或者在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington’sPharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038和1570-158页)。取决于所治疗的受试者的状况，剂量的一些变化可能必然发生。此外，对于人类施用，制品可能需要满足FDA生物学标准办公室要求的无菌、热原性、以及一般安全性和纯度标准。
运载体可进一步包含任何和所有溶剂、分散介质、载剂、涂层、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入组合物中。短语“药学上可接受的”可以指分子实体和组合物，当施用至人时其不能产生过敏或类似的不良反应。
本文所述治疗组合物的施用途径和频率以及剂量可以因个体而异，并且可以根据疾病而不同，并且可以使用标准技术容易地确定。通常，药物组合物和疫苗可以通过注射(例如，皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内或皮下)、鼻内(例如通过吸入)、以丸剂形式(例如，吞咽、用于阴道或直肠递送的栓剂)施用。在某些实施方式中，可以在6周的时期内施用1至3个剂量，并且此后可以定期给予进一步的加强疫苗接种。
在不同实施方式中，以适合于实现这种免疫应答的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×109个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以约1×108个病毒颗粒到约5×108个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约5×108个病毒颗粒到约1×109个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×109个病毒颗粒到约5×109个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约5×109个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约5×1010个病毒颗粒到约1×1011个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1011个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约5×1011个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1012个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约5×1012个病毒颗粒到约1×1013个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1013个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×108个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1010个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以大于或等于以下个病毒颗粒(VP)/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多。在一些情况下，以小于或等于以下个病毒颗粒/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多。在不同实施方式中，以合适体积的配方缓冲液，例如约0.1-10mL、0.2-8mL、0.3-7mL、0.4-6mL、0.5-5mL、0.6-4mL、0.7-3mL、0.8-2mL、0.9-1.5mL、0.95-1.2mL或1.0-1.1mL的体积，施用本文所描述的所需剂量。所属领域的技术人员应了解，体积可在以这些值中任一者为界的任何范围(例如约0.5mL到约1.1mL)内。
合适的剂量可以是如此腺病毒载体的量，当如上所述施用时，其能够促进如本文其他地方所述的靶抗原免疫应答。在某些实施方式中，免疫应答比基础(即未治疗)水平高至少10-50％。可以通过测量患者中的靶抗原抗体或通过疫苗依赖性产生能够在体外杀伤黄病毒感染细胞的溶细胞效应细胞或本领域已知的用于监测免疫应答的其他方法来监测这种应答。
通常，合适的剂量和治疗方案可以以足以提供预防益处的量提供腺病毒载体。通常可以使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估保护性免疫应答，所述标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定可以使用在免疫之前和之后(疫苗接种)由患者获得的样品进行。
虽然一个优点可以是用相同的腺病毒载体进行多次疫苗接种的能力，特别是在对Ad具有预先存在的免疫力的个体中，但是腺病毒疫苗也可以作为致敏和加强方案的一部分施用。混合模式致敏和加强接种方案可以导致增强的免疫应答。
因此，一个方面是用质粒疫苗致敏受试者的方法，例如包含感兴趣靶抗原的质粒载体，通过施用质粒疫苗至少一次，允许通过预定的时间长度，然后通过施用腺病毒载体进行加强。可以使用多次致敏，例如1-3次，但可以使用更多次。致敏和加强之间的时间长度可以从大约六个月到一年不等，但是可以使用其他时间范围。
试剂盒
本文所描述的组合物、免疫疗法或疫苗可以试剂盒形式提供。本公开的试剂盒可进一步包括关于剂量和或施用的说明书，所述说明书包含治疗方案信息。
在一些实施方式中，试剂盒包括用于提供所描述的免疫疗法或疫苗的组合物和方法。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括可用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备所述组分的说明书。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括用于在治疗前后用适当实验室测试监测患者、或与医务人员交流结果和患者数据的软件。
试剂盒的组分可呈干燥或液体形式。如果其呈干燥形式，那么试剂盒可包含溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可包含呈液体或干燥形式的转移因子。在一些实施方式中，如果转移因子呈干燥形式，那么试剂盒包含溶解转移因子的溶液。试剂盒还可包含用于混合和制备组分的容器。试剂盒还可包含用于辅助施用的仪器，例如针、导管、施用器、吸入器、注射器、移液管、镊子、标准匙(measured spoon)、滴眼器或任何这类医学上批准的递送媒介物。如本文所描述的试剂盒或药物传递系统还可以包含用于容纳本公开的组合物的装置，其呈密封以用于商业销售和配送。
上文所描述的不同的实施方式可以组合以提供另外的实施方式。本说明书参考和/或应用数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利公开通过引用以其全部并入本文中，其程度如同每一单独公开、专利或专利申请具体和独立地被指示通过引用并入。
必要时可以修改实施方式的各方面，以使用不同专利、申请以及公开的观点来提供其它实施方式。
可以根据以上详细说明对这些实施方式作出这些和其它改变。总体而言，在所附权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施方式，但应理解为包含所有可能的实施方式以及该权利要求书要求保护的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。
实施例
包括下列实施例以进一步描述本公开内容的一些方面，并且下列实施例不应当被用于限制本公开内容的范围。
实施例1
单靶向的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗的生产
该实施例说明包含ZIKAV-E(也被称为“包膜”或“E”)抗原的单靶向的Ad5[E1-、E2b-]载体的构建。
根据该实施例使用的Ad5-ZIKAV-E疫苗是腺病毒血清型5(Ad5)载体，其通过去除E1、E2b、E3基因区或其任何组合(例如Ad5[E1-、E2b-])，和插入本文公开的任何ZIKAV-E抗原(例如，SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:37中的任一种)而被修饰。
将编码具有在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQID NO:19中陈述的氨基酸序列的ZIKAV-E抗原的核苷酸序列克隆入多个基于Ad5[E1-、E2b-]的平台以产生单独的单靶向的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗，每个疫苗含有SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中的一种。用具有SEQID NO:20的核苷酸969-1274的核苷酸序列(即，编码从墨西哥获得的寨卡病毒分离株的包膜蛋白的核苷酸序列)制备单独的ZIKAV-E疫苗。用具有SEQ ID NO:21的核苷酸977-2491的核苷酸序列(即，编码从海地获得的寨卡病毒株的包膜蛋白的核苷酸序列)制备不同的ZIKAV-E疫苗。将SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:37中的任一种克隆到多个基于Ad5[E1-、E2b-]的平台中以产生单独的单靶向的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗，每个含有SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:37中的一种。
对于在小鼠中的临床前免疫原性研究，使用如SEQ ID NO:26(寨卡2014wt E基因插入物核酸序列(以起始密码子开始，并以终止密码子结束))中所示的寨卡病毒野生型E基因插入物构建Ad5[E1-、E2b—ZIKAV-E疫苗。随后，Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗在E.C7细胞中产生，如图1中示意性所示。复制缺陷型病毒在E.C7包装细胞系中繁殖，CsCl2或离子交换柱纯化，并滴定。病毒感染滴度测定为在E.C7细胞单层上的噬斑形成单位(PFU)。病毒颗粒(VP)浓度通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏(disruption)和在260nm和280nm下的分光光度法测定。
实施例2
包含多种黄病毒抗原的多靶向的Ad5[E1-、E2b-]构建体的制备
该实施例说明包含多种黄病毒抗原的多靶向的Ad5[E1-、E2b-]载体的制备，例如，本文公开的寨卡病毒抗原的任何组合(例如，SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23–SEQ ID NO:37的任何组合)。
根据该实施例使用的Ad5-ZIKAV-E疫苗是腺病毒血清型5(Ad5)载体，其通过去除E1、E2b、E3基因区或其任何组合(例如Ad5[E1-、E2b-])，和插入编码黄病毒抗原的核苷酸序列而被修饰。
产生含有核苷酸序列的Ad5[E1-、E2b-]载体，其编码多种黄病毒抗原。单个黄病毒抗原基因序列(包括具有编码衣壳蛋白、膜蛋白和包膜蛋白(E)的黄病毒基因序列的三基因插入物，以及具有编码衣壳蛋白、膜蛋白、以及包膜蛋白(E)和非结构蛋白(NS)的黄病毒基因序列的四基因插入物)分别通过衍生自猪捷申病毒-1和Thosea asigna病毒的“自切割”2A肽分离(图2A和图3A)(de Felipe P和Ryan M Traffic 2004 5(8),616–26；Holst J等人Nature Immunol.2008 9:658–66；Kim JH等人PloS One,2011 6(4),e18556.doi:10.1371/journal.pone.0018556)。当2A肽在核糖体上翻译时，2A肽的最后两个残基之间的肽键不形成，从而在一个核糖体传递中导致明显表达的蛋白质(图2B和图3B)。使用分开三个基因的两个2A肽序列导致三种蛋白质的近化学计量表达(图2B和图3B)。
实施例3
Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E的多次注射产生针对寨卡E抗原的免疫应答
该实施例说明注射Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗诱导针对寨卡E抗原的免疫应答。五(5)只小鼠的组每只以二(2)周的间隔皮下免疫两(2)次，剂量为1010VP Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E(试验组小鼠G4M1-5，白色条)。对照小鼠注射1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体无序列对照)(对照组小鼠G1M1-5，黑色阴影条)。在第二次免疫后一(1)周，处死小鼠并收获其脾脏和血清以测定针对寨卡-E抗原的诱导免疫应答。如图4A-4C所示，通过用Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E免疫(疫苗接种)产生细胞介导的免疫(CMI)应答和抗体(Ab)应答。
实施例4
小鼠中Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-E疫苗的临床前研究
该实施例说明小鼠中Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的临床前研究，包括评估细胞介导的免疫(CMI)应答、溶细胞T淋巴细胞(CTL)应答、细胞内细胞因子表达、抗体分泌、和重量/温度变化。临床前研究包括施用包含几种不同寨卡抗原变体的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗，与对照组比较，以及评估小鼠的免疫应答。
Ad5[E1-、E2b-]-寨卡突变体(mut)2015、Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2014、Ad5[E1-、E2b-]-寨卡突变体(mut)2014疫苗的临床前评估
所有Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗包括含有如在实施例1中描述的寨卡插入物的疫苗制品。
CMI和CTL应答。通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定评估小鼠中的CMI和CTL应答。图6图解来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的细胞介导的免疫(CMI)应答和溶细胞性T淋巴细胞(CTL)应答。小鼠(C57BL/6株)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ IDNO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQ ID NO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ ID NO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。测试的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2014，其包含由SEQ ID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。在最终免疫后一周，将从每只小鼠中分离的脾细胞暴露于寨卡wt病毒肽库，并使用ELISPOT测定来测量CMI应答(IFN-γ和IL-2分泌斑点形成细胞(SFC))和CTL应答(颗粒酶-B分泌SFC)。通过脾细胞对SIV-nef肽库缺乏反应性(阴性对照)和通过脾细胞对伴刀豆球蛋白A(Con A)的反应性(阳性对照)显示应答的特异性。误差条显示SEM，每组中有5只小鼠。图6A图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IFN-γCMI应答。与对照小鼠相比，在免疫小鼠中诱导更高数目的SFC。图6B图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IL-2CMI应答。与对照小鼠相比，在免疫小鼠中诱导更高数目的SFC。图6C图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的颗粒酶B CTL应答。与对照小鼠相比，在免疫小鼠中诱导更高数目的SFC。
细胞内细胞因子表达。流式细胞术分析揭示淋巴细胞活化的水平，如通过评估细胞内细胞因子表达测量的。图7图解通过流式细胞术分析来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠的脾细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。小鼠(C57Bl/6株)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQ ID NO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ ID NO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。本文测试和示出的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut2014，其包含由SEQ ID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。最终免疫后一周，将从免疫小鼠中分离的脾细胞暴露于寨卡wt病毒肽库，并使用流式细胞术测量CD8+细胞和CD4+细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内细胞因子产生。通过脾细胞对SIV-nef肽库(阴性对照)缺乏反应性和脾细胞对PMA/离子霉素的反应性(阳性对照)来显示应答的特异性。数据报告为表达IFN-γ或IFN-γ和TNF-α的CD8+或CD4+脾细胞的百分比，误差条显示SEM。每组有五只小鼠。图7A图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照后，通过流式细胞术分析CD8+脾细胞中IFN-γ的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。与对照小鼠相比，更高百分比的来自免疫小鼠的细胞响应寨卡病毒肽和分泌的细胞因子。图7B图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照后，通过流式细胞术分析CD4+脾细胞中IFN-γ的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。与对照小鼠相比，更高百分比的来自免疫小鼠的细胞响应寨卡病毒肽和分泌的细胞因子。图7C图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照后，通过流式细胞术分析CD8+脾细胞中IFN-γ和TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。与对照小鼠相比，更高百分比的来自免疫小鼠的细胞响应寨卡病毒肽和分泌的细胞因子。图7D图解将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照后，通过流式细胞术分析CD4+脾细胞中IFN-γ和TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。与对照小鼠相比，更高百分比的来自免疫小鼠的细胞响应寨卡病毒肽和分泌的细胞因子。
抗原特异性抗体产生。在免疫小鼠的血清中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量寨卡特异性IgG抗体。图8图解用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗免疫的小鼠血清中的抗寨卡IgG抗体应答。从颊囊抽取血液，并使用定量ELISA或IgG抗体，使用Gabitzsch等人(CancerGene Ther.2011May；18(5):326–335)中阐述的方法进行分析。小鼠(C57Bl/6株，每组5只小鼠)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了三种类型的寨卡疫苗。测试的第一种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2015，其包含由SEQ ID NO:34的核苷酸序列和SEQ ID NO:35的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:34是核苷酸序列，SEQ ID NO:35是对应于SEQID NO:34的氨基酸序列)。SEQ ID NO:35的寨卡mut 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2015抗原相比，寨卡mut 2015抗原包含点突变。这些点突变包括D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，并且与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。测试的第二种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2014，其包含由SEQ ID NO:26的核苷酸序列和SEQ ID NO:27的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:26是核苷酸序列，SEQ ID NO:27是对应于SEQ ID NO:26的氨基酸序列)。SEQ ID NO:27的寨卡wt 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。测试的第三种寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡mut 2014，其包含由SEQ ID NO:28的核苷酸序列和SEQ ID NO:29的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ IDNO:28是核苷酸序列，SEQ ID NO:29是对应于SEQ ID NO:28的氨基酸序列)。SEQ ID NO:29中示出的寨卡mut 2014抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。与寨卡wt 2014抗原相比，寨卡mut 2014抗原包含点突变。这些点突变包括I21D、L175D、L240D(位置编号不计N末端甲硫氨酸)，与野生型相比，这些突变可导致抗人C1q应答降低。最终免疫后一周，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测试小鼠血清诱导抗体应答。y轴显示血清中的抗寨卡IgG的纳克(ng)。x轴显示每组和测试的小鼠(例如，“G1M1”表示组1小鼠1)。在免疫小鼠中诱导抗体应答，但是在对照小鼠中没有。误差条显示SEM。
症状评估。在小鼠中评估寨卡感染的症状，包括体重和温度的变化。图9图解在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗或用Ad5[E1-、E2b-]-无效空载体作为对照疫苗接种后寨卡病毒感染的小鼠模型中的体重减轻(Rossi等人Am J Trop Med Hyg.2016Jun 1；94(6):1362-9)。用1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E或1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-无效空载体对照免疫A129小鼠组(n＝10/组)一次。免疫后30天，用寨卡病毒的致病毒株(腹膜内(IP)注射5×105个噬菌体形成单位(PFU)的寨卡病毒株FSS13025)攻击小鼠。监测小鼠的体重变化。图10图解在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E疫苗或Ad5[E1-、E2b-]-无效空载体作为对照进行疫苗接种后寨卡病毒感染的小鼠模型中的温度变化(Rossi等人Am J Trop Med Hyg.2016 Jun1；94(6):1362-9)。用1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡-E 2015wt或1×1010VP的Ad5[E1-、E2b-]-无效(对照)免疫A129小鼠组(n＝10/组)一次。免疫后30天，用寨卡病毒的致病毒株(腹膜内(IP)注射5×105PFU的寨卡病毒株FSS13025)攻击小鼠。监测小鼠的温度变化。
Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015和Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)疫苗的临床前评估
所有Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗包括含有如实施例1中描述的寨卡插入物的疫苗制品。
CMI和CTL应答。通过酶联免疫斑点(ELISPOT)测定评估小鼠中的CMI和CTL应答。图11图解来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的细胞介导的免疫(CMI)应答和溶细胞性T淋巴细胞(CTL)应答。C57BL/6小鼠(n＝5/组)以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了两种类型的寨卡疫苗，包括Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015，其包含由SEQ IDNO:32的核苷酸序列和SEQ ID NO:33的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:32是核苷酸序列，SEQ ID NO:33是对应于SEQ ID NO:32的氨基酸序列)。SEQ ID NO:33的寨卡wt2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。第二种测试的寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)，其包含由SEQ ID NO:36的核苷酸序列和SEQ ID NO:37的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:36是核苷酸序列，SEQ ID NO:37是对应于SEQ ID NO:36的氨基酸序列)。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)中的寨卡抗原包含对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白，该多蛋白包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。包含跨膜结构域可以用作信号序列，确保负载mRNA的核糖体迁移到内质网，糖基化，并最终迁移和束缚蛋白质到质膜，这都可以最终提高抗原性，从而产生免疫应答。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫后7天分离脾细胞并暴露于寨卡2014肽库、SIV-Nef肽库(阴性对照)、SIV-Gag肽库(阴性对照)和伴刀豆球蛋白A(阳性对照)，并且通过ELISPOT评估CMI应答(IFN-γ和IL-2)和CTL应答(颗粒酶B)。数据报告为每106个脾细胞的斑点形成细胞(SFC)的数量，误差条显示SEM。图11A图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IFN-γCMI应答。图11B图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的IL-2CMI应答。图11C图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后的颗粒酶B CTL应答。
细胞内细胞因子表达。流式细胞术分析揭示淋巴细胞活化的水平，如通过评估细胞内细胞因子表达测量的。图12图解通过流式细胞术分析来自用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠的脾细胞中的IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内表达测量的淋巴细胞活化。C57BL/6小鼠以2周间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或1x1010VP Ad5[E1-、E2b-]-无效(空载体对照)免疫两次。测试了两种类型的寨卡疫苗，包括Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015，其包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列和SEQ ID NO:33的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:32是核苷酸序列，SEQ ID NO:33是对应于SEQ IDNO:32的氨基酸序列)。SEQ ID NO:33的寨卡wt 2015抗原对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQID NO:23)的氨基酸409-690，其是寨卡包膜蛋白的细胞外结构域的截短部分。第二种测试的寨卡疫苗是Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)，其包含由SEQ ID NO:36的核苷酸序列和SEQ ID NO:37的氨基酸序列编码的寨卡抗原蛋白(SEQ ID NO:36是核苷酸序列，SEQ ID NO:37是对应于SEQ ID NO:36的氨基酸序列)。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015全长(FL)中的寨卡抗原包含对应于3423-aa寨卡多蛋白(SEQ ID NO:23)的氨基酸271-805的完整包膜蛋白，其包括两个C-末端跨膜锚定结构域和细胞外环，ZIKAV基因组中紧邻包膜蛋白上游的两个跨膜结构域(该基因组编码M蛋白的一部分以确保靶向质膜)，和在N末端(GCCGCCACC)处确保翻译起始的KOZAK序列，就在细胞外环之前的两个跨膜结构域，和细胞外环。包含跨膜结构域可以用作信号序列，确保负载mRNA的核糖体迁移到内质网，糖基化，并最终迁移和束缚蛋白质到质膜，这都可以最终提高抗原性，从而产生免疫应答。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫后7天，将从免疫小鼠分离的脾细胞暴露于寨卡病毒肽库，并使用流式细胞术测量CD8+细胞和CD4+细胞中IFN-γ和IFN-γ/TNF-α的细胞内细胞因子产生。通过脾细胞对SIV-nef肽库(阴性对照)和介质(阴性对照)缺乏反应性和脾细胞对PMA/离子霉素(数据未示出)(阳性对照)的反应性示出应答的特异性。数据报告为表达IFN-γ或IFN-γ和TNF-α的CD8+或CD4+脾细胞的百分比，误差条显示SEM。图12A图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ在CD8+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。图12B图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ在CD4+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。图12C图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ和TNF-α在CD8+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。图12D图解在将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞暴露于寨卡2014肽库和对照之后，通过IFN-γ和TNF-α在CD4+脾细胞中的细胞内表达的流式细胞术分析测量的淋巴细胞活化。
抗原特异性抗体产生。在免疫小鼠的血清中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量寨卡特异性IgG抗体。图13图解用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫的小鼠血清中的抗寨卡IgG应答。C57BL/6小鼠(n＝5/组)以2周的间隔用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡野生型(wt)2015疫苗的1x1010病毒颗粒(VP)或Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015全长(FL)疫苗免疫两次。两种Ad5[E1-、E2b-]-无效用作比较对照载体，包括Ad5[E1-、E2b-]-无效(Viraquest)和Ad5[E1-、E2b-]-无效(E)(内部制造的无效对照载体)。在最终免疫后7天从小鼠收集血清，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评估针对寨卡病毒包膜蛋白-1的抗原特异性抗体。y轴显示血清中的抗寨卡IgG的纳克(ng)。在Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015组中，五组中的三组(3/5)为抗体阳性。在Ad5[E1-、E2b-]-寨卡wt 2015FL组中，五组中的五组(5/5)为抗体阳性。
实施例5
用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗对寨卡感染的预防
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗预防来预防寨卡感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的寨卡抗原(例如，SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:21或SEQID NO:23–SEQ ID NO:37)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如实施例1对于单靶向的寨卡疫苗描述的或如实施例2对于多靶向的寨卡疫苗描述的构建Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗免疫受试者后，诱导针对寨卡病毒的细胞和体液免疫应答以及针对寨卡病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例6
利用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗和共刺激分子的组合预防来预防寨卡感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗与本文描述的任何共刺激分子组合的预防来预防寨卡感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的寨卡抗原(例如，SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23–SEQ ID NO:37)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如实施例1对于单靶向的寨卡疫苗描述的或如实施例2对于多靶向的寨卡疫苗描述的构建Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗被皮下、皮内或肌肉内施用至受试者一次或每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。共施用Ad疫苗与共刺激分子，比如与疫苗制剂混合的toll样受体(TLR)激动剂。在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗与共刺激分子组合免疫受试者后，诱导针对寨卡病毒的细胞和体液免疫应答以及针对寨卡病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗与共刺激分子组合的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例7
利用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗和免疫融合配偶体的预防来预防寨卡感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗以及本文描述的、也由腺病毒载体编码的任何免疫融合配偶体的预防来预防寨卡感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的寨卡抗原(例如，SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23–SEQ ID NO:37)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如实施例1对于单靶向的寨卡疫苗描述的或如实施例2对于多靶向的寨卡疫苗描述的构建Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗，并且Ad载体另外地编码本文公开的任何免疫融合配偶体。Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用含有免疫融合配偶体的疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗-免疫融合配偶体免疫受试者后，诱导针对寨卡病毒的增强的细胞和体液免疫应答以及针对寨卡病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-寨卡疫苗-免疫融合配偶体的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例8
利用Ad5[E1-、E2b-]-黄热病病毒(YFV)疫苗预防黄热病病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-YFV疫苗的预防来预防黄热病病毒(YFV)感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的YFV抗原(例如，SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:22)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如根据实施例1对于单靶向的YFV疫苗修改的或如根据实施例2对于多靶向的YFV疫苗修改的构建Ad5[E1-、E2b-]-YFV疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-YFV疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-YFV疫苗免疫受试者后，诱导针对黄热病病毒的细胞和体液免疫应答以及针对黄热病病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-YFV疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例9
利用Ad5[E1-、E2b-]-日本脑炎病毒(JEV)疫苗预防日本脑炎病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-JEV疫苗的预防来预防日本脑炎病毒(JEV)感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的YFV抗原(例如，SEQ ID NO:2)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如根据实施例1对于单靶向的JEV疫苗修改的或如根据实施例2对于多靶向的JEV疫苗修改的构建Ad5[E1-、E2b-]-JEV疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-JEV疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-JEV疫苗免疫受试者后，诱导针对日本脑炎病毒的细胞和体液免疫应答以及针对日本脑炎病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-JEV疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例10
利用Ad5[E1-、E2b-]-蜱传脑炎病毒(TBEV)疫苗预防蜱传脑炎病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-TBEV疫苗的预防来预防蜱传脑炎病毒(TBEV)感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的TBEV抗原(例如，SEQ ID NO:3–SEQ ID NO:5)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如根据实施例1对于单靶向的TBEV疫苗修改的或如根据实施例2对于多靶向的TBEV疫苗修改的构建Ad5[E1-、E2b-]-TBEV疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-TBEV疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-TBEV疫苗免疫受试者后，诱导针对蜱传脑炎病毒的细胞和体液免疫应答以及针对蜱传脑炎病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-TBEV疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例11
利用Ad5[E1-、E2b-]-登革热病毒(DENV)疫苗预防登革热病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-DENV疫苗的预防来预防登革热病毒(DENV)感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的DENV抗原(例如，SEQ ID NO:6–SEQID NO:9)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如根据实施例1对于单靶向的DENV疫苗修改的或如根据实施例2对于多靶向的DENV疫苗修改的构建Ad5[E1-、E2b-]-DENV疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-DENV疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-DENV疫苗免疫受试者后，诱导针对登革热病毒的细胞和体液免疫应答以及针对登革热病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-DENV疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例12
利用Ad5[E1-、E2b-]-西尼罗河病毒(WNV)疫苗预防西尼罗河病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-WNV疫苗的预防来预防西尼罗河病毒(WNV)感染，该疫苗包括具有插入腺病毒载体的DENV抗原(例如，SEQ ID NO:10)的任一种或其任何组合的Ad5[E1-、E2b-]。如根据实施例1对于单靶向的WNV疫苗修改的或如根据实施例2对于多靶向的WNV疫苗修改的构建Ad5[E1-、E2b-]-WNV疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-WNV疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-WNV疫苗免疫受试者后，诱导针对西尼罗河病毒的细胞和体液免疫应答以及针对西尼罗河病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-WNV疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
实施例13
利用Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗预防黄病毒感染
该实施例说明通过用本公开的任何Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗的预防来预防黄病毒感染。Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗由下列的任何组合组成：如在实施例5中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-寨卡载体、如在实施例8中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-YFV载体、如在实施例9中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-JEV载体、如在实施例10中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-TBEV载体、如在实施例11中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-DENV载体、如在实施例12中描述的单靶向的或多靶向的Ad5[E1-、E2b-]-WNV载体。可选地，Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗由具有来自插入腺病毒载体的不同黄病毒的至少两种抗原的任何组合的Ad5[E1-、E2b-]组成。例如，至少两种抗原由寨卡抗原(例如，SEQ ID NO:11–SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:23–SEQ ID NO:37的任一种)、YFV抗原(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:22)、JEV抗原(例如，SEQ ID NO:2)、TBEV抗原(例如，SEQ ID NO:3–SEQ ID NO:5)、DENV抗原(例如，SEQ ID NO:6–SEQ ID NO:9)、和/或WNV抗原(例如，SEQ ID NO:10)的任何组合组成。
Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗每两周施用至受试者，持续总共两次免疫。皮下施用疫苗。在用Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗免疫受试者后，诱导针对黄病毒的细胞和体液免疫应答以及针对黄病毒感染的保护。换句话说，Ad5[E1-、E2b-]-黄病毒疫苗的预防免疫力被赋予受试者。受试者是任何动物，包括人、非人灵长类动物或任何其他非人动物。
虽然本文已经显示和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，本文所述的本发明实施方式的各种替代方案可用于实施本发明。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
序列
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Claims (13)

1.一种组合物，其包含：
复制缺陷型腺病毒载体，其包含E1基因区和E2b基因区中的缺失；和
具有编码寨卡病毒靶包膜抗原的序列的核酸，其中所述载体包含所述核酸。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述编码寨卡病毒靶包膜抗原的序列包含编码多种寨卡病毒靶包膜抗原的序列。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述编码多种寨卡病毒靶包膜抗原的序列包含多种基因插入物序列，每种基因插入物序列对应于靶包膜抗原，其中每种基因插入物序列被编码自切割2A肽的核酸序列分开。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述自切割2A肽衍生自猪捷申病毒-1病毒或Thoseaasigna病毒。
5.权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体是腺病毒5(Ad5)载体。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体包含E3基因区、E4基因区或其任何组合中的缺失。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型腺病毒载体还包含具有编码增加寨卡病毒靶包膜抗原免疫原性的蛋白质的序列的核酸，和/或其中所述组合物或所述复制缺陷型腺病毒载体还包含具有编码共刺激分子的序列的核酸或免疫融合配偶体。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的组合物和药学上可接受的运载体。
9.一种细胞，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的组合物或权利要求8所述的药物组合物，任选地其中所述细胞是树突细胞(DC)。
10.权利要求1-7中任一项所述的组合物或权利要求8所述的药物组合物，用于在受试者中产生针对寨卡病毒靶包膜抗原的免疫应答的方法中。
11.一种用于预防受试者中寨卡病毒感染的方法中的组合物，其包含：
复制缺陷型腺病毒载体，其包含E1基因区和E2b基因区中的缺失；和
具有编码至少一种寨卡病毒靶包膜抗原的序列的核酸，
其中所述载体包含所述核酸。
12.权利要求10或11所述使用的组合物，其中所述受试者具有对腺病毒或腺病毒载体的预先存在的免疫力。
13.权利要求10-12中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含每剂量1×109至5×1012个病毒颗粒。
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