CN109837343B - 早期肺腺癌特异性外泌体miRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了早期肺腺癌特异性外泌体miRNA及其应用。本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，收集早期肺腺癌病人手术前和手术后外周血样本以及健康人外周血样本，通过对术前与健康样本中差异外泌体miRNA，和术前与术后样本中差异外泌体miRNA取交集，并且在肿瘤组织与癌旁正常样本中进行表达验证，筛选获得了早期肺腺癌特异性外泌体miRNA，其RNA序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示，其可作为早期肺腺癌诊断标志物。通过检测该miRNA标志物，可对早期肺腺癌进行辅助诊断或术后监测，敏感性达71.9％，特异性达75.0％，具有较好的临床应用价值和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及早期肺腺癌特异性外泌体miRNA分子标志物及其应用。
背景技术
癌症的发病率和致死率在不断的增长，已经成为当今威胁生命健康的主要疾病之一。肺癌是所有癌症中发病率和致死率最高的癌症。尽管诊断和治疗的技术在不断发展，肺癌预测的五年生存率仍然只有15.9％。肺癌分为小细胞癌和非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞癌各占非小细胞肺癌的30％-50％。肺鳞癌又称肺鳞状上皮癌，是肺癌中最常见的类型，与吸烟关系密切，多见于老年男性。生长缓慢，转移晚，五年生存率高；肺腺癌起源于支气管上皮或粘液腺，易发生于女性，发病年龄小，多数病人早期没有明显的临床症状，有时早期即发生血行转移。根据肿瘤TNM分期，肺癌早期即I期，指肿瘤直径≤2cm,无淋巴结或远处转移，外科手术切除效果好，预后好；中期包括II期和III期，包括肿瘤侵犯邻近组织或伴随淋巴结转移，手术治疗配合化疗或靶向药物治疗；当肿瘤发生远处转移时，即被定为晚期，即IV期。手术治疗已不适用于晚期病人，只能通过化疗或靶向药物治疗来延长病人生存期。目前用于临床诊断肺癌的技术主要包括穿刺，X射线，螺旋CT等。但是，大多数肺癌患者(约70％)是在晚期才被确诊，耽误了治疗。现有的应用于临床的血清蛋白诊断标志物，例如癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)，对早期肺癌的诊断缺乏足够的敏感性和特异性。因此，筛选出早期肺癌诊断标志物是相当紧迫且具有重大意义的。
miRNA是一类内源性、高度保守、非编码的小分子RNA，长度通常为18-25nt。miRNA发挥调节功能的主要方式是介导mRNA降解或者抑制其翻译。肿瘤细胞异常表达一些miRNA分子，这为miRNA作为肿瘤诊断以及预后的标志物奠定了基础。miRNA不仅存在于细胞内，在细胞外也存在一些游离的miRNA分子。以往有研究报道，血液中游离的miRNA可以作为包括癌症在内的多种疾病的诊断标志物。在关于肺癌标志物的研究报道中，血浆中游离的miRNA，包括miR-19b-3p,miR-221-3p,miR-409-3p,miR-425-5p和miR-584-5p，可以区分肺腺癌病人和健康人。而miR-181a-5p,miR-106a-5p和miR-93-5p可区分肺鳞癌病人和健康人。
近期发现，miRNA还可以存在于细胞外的亚结构——外泌体中。外泌体是一类直径30-150nm的细胞外囊泡，其内包含脂质，蛋白和核酸。miRNA在外泌体中丰度较高，并且可以被外泌体运送到受体细胞中发挥调节功能。外泌体包含的miRNA作为诊断标志物的优势包括三方面：第一，外泌体存在于各种体液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁和羊水等。大多数体液可以通过微创甚至无创的方式获得。第二，肿瘤早期即可分泌大量的外泌体。外泌体包含的miRNA依赖于母体细胞，也就是说不同肿瘤细胞分泌的外泌体，其内包含的miRNA不尽相同。第三，外泌体的双层膜结构保护了其内容物的稳定性，特别是一些比较容易降解的单链RNA分子。由此可见，血浆外泌体内包含的miRNA比直接游离在血浆中的miRNA有更高的稳定性。外泌体miRNA是一类稳定、易测的，且可反映早期肿瘤特征的小分子。
在关于肺癌标志物的研究报道中，发现血清来源的外泌体miRNA，包括miR-106a-5p,miR-20a-5p和miR-93-5p，在男性肺鳞癌病人中高表达；而miR-126在早期非小细胞肺癌病人中高表达，上述结果都是通过比较肺癌病人和健康对照外周血样本的外泌体miRNA获得的。由于血液中的外泌体可来源于各种组织器官的细胞，不同个体样本的直接比较会对筛选造成噪音干扰。而目前尚缺乏可以分离组织器官特异性外泌体的技术。
另有一项研究发现，以EpCAM阳性的外泌体miRNA可以作为区分肺癌病人与健康个体的分子。EpCAM是一种跨膜糖蛋白，往往存在于癌变的上皮细胞质膜及其分泌的外泌体膜表面，肺癌、前列腺癌、肝癌和卵巢癌等多种肿瘤都分泌EpCAM阳性的外泌体，而健康人EpCAM阳性的外泌体含量极低。该研究分离肺癌病人和健康人外周血中EpCAM阳性的外泌体，分析其内容物发现miR-181-5p,miR-30a-3p,miR-30e-3p和miR-361-5p可以区分肺腺癌与健康对照，而miR-10b-5p,miR-15b-5p和miR-320b可以区分肺鳞癌与健康对照。该方法需要专门分离EpCAM阳性的外泌体，且健康人极低的EpCAM阳性外泌体含量给分离和分析带来困难，加之EpCAM阳性的外泌体并非只存在于肺癌病人中，因此该方法有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供早期肺腺癌特异性外泌体miRNA分子标志物及其应用。
本发明利用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，收集大量早期肺腺癌病人(IA或者IB期)手术前和手术后外周血样本以及健康人外周血样本，通过对术前与健康样本中差异外泌体miRNA，和术前与术后样本中差异外泌体miRNA取交集，并且在肿瘤组织与配对癌旁正常样本中进行表达验证，筛选获得了肺腺癌特异性外泌体miRNA，其为hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p，其中，hsa-miR-342-5p的RNA序列如SEQ IDNO.1所示；hsa-miR-574-5p的RNA序列如SEQ ID NO.2所示。
含有上述分子标志物的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料为表达盒、转座子、载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌。
本发明提供了hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p在制备检测肺腺癌诊断试剂盒中的应用。
进一步本发明提供了检测hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的方法在制备检测肺腺癌诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了含有hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的生物材料在制备检测肺腺癌诊断试剂盒中的应用，所述的生物材料为表达盒、转座子、载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌。
本发明提供了hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p在制备肺腺癌治疗用药效果评价体系中的应用。
进一步本发明提供了检测hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的方法在制备肺腺癌治疗用药效果评价体系中的应用。
本发明提供了hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的检测试剂在制备检测肺腺癌诊断试剂盒或制备肺腺癌治疗用药效果评价体系中的应用。
所述检测试剂为针对hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的特异性引物对。
优选地，用于检测hsa-miR-342-5p的特异性引物含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；用于检测hsa-miR-574-5p的特异性引物含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，用于检测hsa-miR-342-5p的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测hsa-miR-574-5p的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了含有hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p的生物材料在制备肺腺癌治疗用药效果评价体系中，所述的生物材料为表达盒、转座子、载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌。
本发明所述的上述应用，均优选适用于肺腺癌，特别优选适用于早期肺腺癌。
本发明还提供一种肺腺癌的诊断试剂盒，含有检测hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p表达量的检测试剂。进一步地，所述肺腺癌的诊断试剂盒为早期肺腺癌的诊断试剂盒。
优选地，所述的诊断试剂盒含有检测hsa-miR-342-5p和/或hsa-miR-574-5p表达量的特异性引物。
更优选地，所述的诊断试剂盒含有核苷酸序列含有如SEQ ID NO.6和/或SEQ IDNO.7所示的特异性引物。
进一步地，在本发明实施例中用于检测hsa-miR-342-5p和hsa-miR-574-5p表达量的特异性引物的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的有益效果在于，本发明针对早期肺腺癌，筛选特征性外泌体分子，收集的样本包括早期肺腺癌病人手术前和手术后外周血样本以及健康人外周血样本，通过对术前与健康样本中差异外泌体miRNA，和术前与术后样本中差异外泌体miRNA取交集，并且在肿瘤组织与癌旁的正常样本中进行表达验证。降低了不同个体的外泌体中其他组织来源的噪音干扰，同时也降低手术本身对外泌体miRNA组成的影响，最终获得的特征性外泌体miRNAs具有组织来源的特异性以及对早期肿瘤的敏感性。本发明的两个miRNA可以单独使用对肺腺癌，特别是早期肺腺癌进行辅助诊断或术后监测，其敏感性分别为70％(hsa-miR-342-5p)和62.5％(hsa-miR-574-5p)，其特异性分别为70.18％(hsa-miR-342-5p)和87.72％(hsa-miR-574-5p)；也可以同时使用对早期肺腺癌进行辅助诊断或术后监测，其敏感性达71.9％，特异性达75.0％，本发明适用于辅助筛查早期肿瘤，为肺腺癌病人赢得治疗时机。本发明具有较好的临床应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为外泌体和外泌体RNA特征验证图。a图为Flow Nano Analyzer检测外泌体颗粒粒径分布，峰值时99.2nm。b图为western blot验证外泌体标志蛋白CD63和TSG101。c图为安捷伦2100分析外泌体总RNA长度分布。
图2为外泌体小RNA测序分析。a图展示了外泌体小RNA各组分及其占比。b图为miR-342-5p测序表达量。c图为miR-574-5p测序表达量，其中术前、术后样本之间的统计分析方法是双尾配对t检验。术前健康样本之间的统计分析方法是Mann–Whitney test。数据展示平均值±SEM。
图3为RT-qPCR分析3个候选miRNAs在扩大样本中表达，术前样本57例，其中有52例配对的术后样本，40例健康样本。a图为RT-qPCR验证miR-342-5p在术前，术后和健康人血液外泌体中的相对表达水平。b图为受试者工作特征曲线分析miR-342-5p在术前和健康样本诊断能力。c图为RT-qPCR验证miR-574-5p在术前，术后和健康人血液外泌体中的相对表达水平。d图为受试者工作特征曲线分析miR-574-5p在术前和健康样本诊断能力。
图4为RT-qPCR分析8例III期肺腺癌病人外泌体中2个miRNA表达差异，统计分析是Wilcoxon matched pairs检验。miR-342-5p的p＝0.0234，miR-574-5p的p＝0.38，数据展示相对差异倍数。
图5为RT-qPCR分析8例肺腺癌组织及配对癌旁组织中2个miRNA表达差异倍数。统计分析是Wilcoxon matched pairs检验。miR-342-5p的p＝0.0234，miR-574-5p的p＝0.0156，数据展示相对差异倍数。
图6为联合miR-342-5p和miR-574-5p的受试者工作特征曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1利用生物信息技术筛选出与早期肺腺癌相关的特异性外泌体的miRNA
1、外周血分离纯化所得的外泌体及外泌体RNA的特征。
收集的样本包括早期肺腺癌病人手术前和手术后外周血样本以及健康人外周血样本，通过对术前与健康样本中差异外泌体miRNA，和术前与术后样本中差异外泌体miRNA取交集。通过传统的超速离心方法，从外周血样本中将外泌体富集的颗粒纯化出来，外周血样本来源情况见表1。
具体方法是将冻存于-80℃的血液样本在冰上融化后，用0.22μm的滤膜过滤，过滤后的血样120000g，4℃离心10h，去上清，将外泌体颗粒溶于250μl的磷酸缓冲液中(PBS，pH7.4)。用Flow Nano Analyzer仪器检测外泌体颗粒粒径，粒径分布表明收集到的外泌体富集的颗粒直径在99.2nm左右(图1的a)。用免疫印迹方法检测外泌体富集颗粒，表明本实施例收集到的外泌体富集的颗粒具有外泌体标志物CD63和TSG101(图1的b)。外泌体总RNA用TRIzol LS试剂纯化出来后，再用安捷伦2100芯片检测外泌体总RNA的长度分布，结果表明外泌体总RNA长度大多小于200nt(图1的c)，说明本实施例得到的外泌体RNA纯度符合要求，没有细胞RNA的污染。
表1样本来源病人及健康人信息表
2、外泌体小RNA测序。
为了在外泌体miRNA中筛选肺腺癌早期诊断标志物，本实施例进行了外泌体小RNA测序。小RNA测序采用的是illumina HiSeq 2500系统和单端50bp测序。测序样本包括7对术前和配对的术后样本以及7个健康人样本，合计21个样本。每个样本得到的测序序列不少于一千万条。将这些测序得到的序列与miRNA的数据库(mirbase21)进行比对，匹配到的百分比介于53.19％到69.97％(表2)。这些小RNA序列也包含核糖体RNA，mRNA，小核/小核仁RNA，miscRNA和长链非编码RNA片段(图2的a)。每百万条序列中miRNA表达量(RPM)的方法用来标准化miRNA的表达量。
通过分别比较早期肺腺癌疾病组(术前)和健康组，早期肺腺癌术前组和配对术后样本组的差异性miRNAs，然后取交集，获得2个在疾病术前组含量高，而在配对术后样本显著降低，同样在健康组中的含量显著降低的外泌体miRNAs(miR-342-5p和miR-574-5p)。它们具有辅助诊断早期肺腺癌和预后监测的潜能(图2的b、c)。
表2小RNA测序量及miRNA比对占比
表3 miRNA序列信息
| miRNA名称 | 序列 |
| hsa-miR-342-5p | aggggugcuaucugugauuga(SEQ ID NO.1) |
| hsa-miR-574-5p | ugagugugugugugugagugugu(SEQ ID NO.2) |
实施例2RT-qPCR验证miR-342-5p和miR-574-5p可作为早期肺癌诊断标志物
采用RT-qPCR在更多的样本中验证miR-342-5p和miR-574-5p是具有肺癌早诊标志物潜能的miRNAs。样本总量包括术前57例，其中52例有术后对应样本，健康对照样本40例。反转录(RT)用的试剂盒是QIAGEN的反转录试剂盒(miScript II RT kit)，操作步骤按照说明书完成。qPCR用的是QIAGEN荧光定量试剂盒(miScript SYBR Green PCR Kit)，操作步骤按照说明书完成。荧光定量PCR在Bio-rad CFX96 Real time PCR system上完成。小核RNARNU6用作内参，倍数变化计算方法是2-ΔΔCT。定量检测的正向引物序列见表4，表4中SEQID NO.3所示序列中的AGGGGTGCTATCTG(SEQ ID NO.6)和SEQ ID NO.4所示序列中的TGAGTGTGTGTGTGTGAG(SEQ ID NO.7)分别为miR-342-5p和miR-574-5p的正向引物序列的核心序列。
结果表明，上述2个miRNAs在术前和健康样本中都有统计学差异。Mann-Whitney检验得出的p值分别是0.0003(miR-342-5p)和<0.0001(miR-574-5p)(图3的a，c)。受试者工作特征曲线检验的结果分别是miR-342-5p曲线下面积0.7171(95％CI:0.6146to 0.8196),miR-574-5p曲线下面积0.7671(95％CI:0.6648to 0.8694)(图3b，d)。术前和术后样本相比，双尾配对t检验结果表明，miR-342-5p的p<0.0001，miR-574-5p的p＝0.0140，表明在手术后miR-342-5p和miR-574-5p的水平明显降低。除此之外,在8例配对的III期肺腺癌病人中miR-342-5p在手术后也明显降低(图4)。
表4 miRNA定量检测的正向引物序列(反向引物为通用引物序列，由QIAGEN公司提供)
实施例3评估miR-342-5p和miR-574-5p在癌组织和癌旁组织表达为了进一步证明早期肺腺癌病人外周血外泌体包含的miR-342-5p和miR-574-5p与健康样本的差异是来源于肿瘤组织的，本实施例在8对癌组织与配对癌旁正常组织中分析这三个miRNAs表达。RT-qPCR方法同上。结果发现miR-342-5p和miR-574-5p在肿瘤组织中显著高表达，Wilcoxonmatched pairs test检验得出miR-342-5p的p＝0.0234，miR-574-5p的p＝0.0156(图5)。
由于miR-342-5p和miR-574-5p在外周血外泌体中，健康、术前、术后相比较都有差异，并且在癌组织和癌旁组织也有显著差异，所以认为这两个miRNAs或其中的任一种在外周血外泌体中都可作为无创的肺癌早诊标志物。其敏感性分别为70％(hsa-miR-342-5p)和62.5％(hsa-miR-574-5p)，其特异性分别为70.18％(hsa-miR-342-5p)和87.72％(hsa-miR-574-5p)。
联合这两个miRNAs分析，受试者工作曲线的曲线下面积是0.7728(95％CI:0.6781to 0.8675)，敏感性是71.9％、特异性是75.0％(图6)说明这两种miRNAs(miR-342-5p和miR-574-5p)联合应用的区分度更高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院北京基因组研究所
<120> 早期肺腺癌特异性外泌体miRNA及其应用
<130> KHP191110381.5
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggggugcua ucugugauug a 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugagugugug ugugugagug ugu 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acactccagc tgggaggggt gctatctg 28
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acactccagc tgggtgagtg tgtgtgtgtg ag 32
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggggtgcta tctg 14
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagtgtgtg tgtgtgag 18
Claims (3)
1.检测外泌体miRNA分子标志物组合的试剂在制备检测早期肺腺癌诊断试剂盒中的应用，所述分子标记物组合由外泌体中hsa-miR-342-5p和hsa-miR-574-5p组成，其中，hsa-miR-342-5p的RNA序列如SEQ ID NO.1所示，hsa-miR-574-5p的RNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述试剂含有针对hsa-miR-342-5p和hsa-miR-574-5p的特异性引物对。
2.检测外泌体miRNA分子标志物组合的试剂在制备早期肺腺癌治疗用药效果评价体系中的应用，所述分子标记物组合由外泌体中hsa-miR-342-5p和hsa-miR-574-5p组成，其中，hsa-miR-342-5p的RNA序列如SEQ ID NO.1所示，hsa-miR-574-5p的RNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述试剂含有针对hsa-miR-342-5p和hsa-miR-574-5p的特异性引物对。
3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，用于检测hsa-miR-342-5p的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测hsa-miR-574-5p的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
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| CN109837343A (zh) | 2019-06-04 |
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