CN109820816B - 温度敏感性生物凝胶制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：间充质干细胞外泌体20‑30份、泊洛沙姆407 20‑28份、泊洛沙姆188 5‑10份、用于调节胶凝温度和药物释放特性的高分子稳定剂0.9‑2.4份和水32‑54份。利用生物相容性可降解高分子聚合物为间充质干细胞外泌体的载药基质，加入高分子稳定剂调节胶凝温度和药物释放特性，从而使载入的MSCs外泌体持续释放，减少给药频率，防止药液的泄露，提高生物利用度，为治疗IUA提供安全、有效、临床应用方便的制剂。

Description

温度敏感性生物凝胶制剂及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其涉及一种温度敏感性生物凝胶制剂及其应用。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是一类来源于中胚层，具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞，能够分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞。MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肺、肝、脾、胎盘、羊水、脐血、脐带等多种组织中分离获得。由于MSCs具有易于分离、多向分化、独特的免疫表型和免疫调节的能力，被广泛应用于组织工程和免疫治疗方面。

子宫内膜损伤后修复障碍是导致月经过少、宫腔粘连、闭经和继发不孕等临床常见疾病的重要原因，其中最常见的是人工流产后发生的宫腔粘连(IUA)。

IUA为子宫内膜基底层损伤后修复障碍导致的宫腔部分或全部粘连闭塞，从而引起月经异常，周期性腹痛，不孕及反复流产等一系列并发症，目前多以宫腔粘连分解术治疗，术后于宫腔内放置宫内节育器、球囊导尿管或宫腔形状气囊等支架，能部分阻隔宫腔创面，预防再粘连。然而存在分离效果有限，易引起逆行感染等缺点。因此IUA严重威胁女性的生殖健康，已成为临床上亟待解决的难题。

近年研究发现，IUA的发生可能与子宫内膜干细胞减少、缺失或功能障碍有关。体内移植实验证明，间充质干细胞能迁移到病变部位，促进其修复。路平等发现，MSCs可定植于子宫内膜损伤小鼠的子宫内膜组织(路平,et al.小鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜损伤小鼠子宫内膜中的定位.郑州大学学报(医学版)1(2015):101-104.)。Nagori等发现移植骨髓间充质干细胞可有效修复子宫内膜缺陷，包括不孕及子宫内膜厚度过薄(Nagori,C.B.et al.Endometrial regeneration using autologous adult stem cells followedby conception byin vitrofertilization in a patient of severe asherman'ssyndrome.Journal of Hμman Reproductive Sciences,4(1),43-48.)。研究表明，MSCs可能主要通过旁分泌作用参与细胞间的交流。其中外泌体被认为是发挥主要作用的因子。

外泌体是活细胞分泌的膜性囊泡，直径约30～100nm，内含蛋白质、mRNA、microRNA等，可在细胞间进行物质传递。MSCs来源的外泌体疗效类似于母细胞功能，对缺血性心脏病、肾损伤、肺损伤均有修复作用。如MSCs来源的外泌体在肾脏损伤动物模型中可促进肾脏修复；在大肠杆菌诱导的肺损伤小鼠模型中，MSCs来源的外泌体通过调控角质细胞生长因子mRNA水平，促进肺上皮修复。在肝纤维化的疾病模型中，MSCs来源的外泌体主要抑制EMT减轻肝纤维化程度。外泌体可获得与MSCs移植类似的疗效，避免了干细胞治疗带来的风险，为临床患者提供了治疗新策略。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种温度敏感性生物凝胶制剂及其应用，利于具有生物相容性的可降解高分子聚合物为凝胶基质，同时作为间充质干细胞外泌体的载药基质，加入高分子稳定剂调节胶凝温度和药物释放特性，使载入的MSCs外泌体持续释放，减少给药频率，防止药液的泄露，提高生物利用度，为治疗IUA提供安全、有效、临床应用方便的制剂。

一方面，本发明提供了一种温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：间充质干细胞(MSCs)外泌体20-30份、泊洛沙姆407(P407)20-28份、泊洛沙姆188(P188)5-10份、用于调节胶凝温度和药物释放特性的高分子稳定剂0.9-2.4份和水32-54份。

进一步地，间充质干细胞外泌体来源于脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、月经血间充质干细胞或牙髓间充质干细胞中的一种。MSCs来源的外泌体具有减轻细胞损伤、诱导组织细胞增殖、促进组织修复的特性。

优选地，间充质干细胞外泌体来源于人脐带间充质干细胞。采用无饲养层培养法，在无血清培养体系培养人脐带MSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为MSCs外泌体。

进一步地，间充质干细胞外泌体是采用旋转超滤结合低温超速离方法收纯化集获得。

进一步地，制剂中还包括其他具有生物相容性的可降解高分子聚合物，包括聚磷酸酯、聚丙烯、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PLC)和聚乙二醇(PEG)中的一种或者几种。本发明的具有生物相容性的可降解高分子聚合物作为间充质干细胞外泌体的载药基质。

进一步地，高分子稳定剂包括海藻酸钠(SA)、透明质酸钠、壳聚糖和羟丙基甲基纤维素(HPMC)中一种或者几种。高分子稳定剂用于调节制剂的胶凝温度和药物释放特性，使载入的MSCs外泌体持续释放，减少给药频率，防止药液的泄露，提高生物利用度。

进一步地，温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：间充质干细胞(MSCs)外泌体20-30份、、泊洛沙姆407(P407)20-28份、泊洛沙姆188(P188)5-10份、用于调节胶凝温度和药物释放特性的高分子稳定剂0.9-2.4份、水32-54份和保湿剂0.5-1份。

进一步地，保湿剂包括丙二醇、甘油山梨醇、透明质酸和生育酚中的一种或者几种。

进一步地，温度敏感性生物凝胶制剂还包括磷酸盐缓冲液。

进一步地，以质量计，上述温度敏感性生物凝胶制剂包括以下比例的各组分：间充质干细胞外泌体20-30份、泊洛沙姆407 20-28份、泊洛沙姆188 5-10份、海藻酸钠或羟丙基甲基纤维素0.3-1份、聚乙二醇0.1-0.4份、壳聚糖0.5-1份和纯水32-54份。

采用泊洛沙姆407和泊洛沙姆188作为载药基质，通过针对MSCs外泌体设置特定比例的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的配伍，使本发明的MSCs外泌体温度敏感型原位凝胶制剂常温下为液态便于储存和临床使用。

当本发明中MSCs外泌体温度敏感型原位凝胶剂中添加了聚乙二醇和羟丙基甲基纤维素时，二者可以调节凝胶溶蚀特性和药物释放特性，其中聚乙二醇除了本身有一定的生物粘附性外，二者还可与泊洛沙姆作用后生成聚乙二醇-羟丙基甲基纤维素-泊洛沙姆，可聚集形成强有力的三维空间网络结构，提高凝胶在体内的粘度和生物粘附性，有效延长药物在体内的滞留时间。

进一步地，温度敏感性生物凝胶制剂的相变温度为30-35℃。本发明的温度敏感性生物凝胶制剂的相变温度接近人体温度，应用后在用药部位发生胶凝转相(由溶胶状态转变为凝胶状)，能够充分阻隔创面，预防感染。

进一步地，上述温度敏感性生物凝胶制剂利用高分子材料聚合物在生理条件下发生分散状态或构象的可逆变化，完成由溶胶状态向半固体凝胶状态的相转变。即能以溶液状态给药，在用药部位立即发生相转变，由液态转化形成非化学交联半固体凝胶。

另一方面，本发明还要求保护上述温度敏感性生物凝胶制剂在制备治疗宫腔粘连制剂中的应用。

进一步地，温度敏感性生物凝胶制剂通过原位凝胶灌注给药。

进一步地，上述温度敏感性生物凝胶制剂是通过宫口以无创注射方式填充于子宫腔，属于原位凝胶灌注给药系统，以达到药物持续释放，减小给药频率，防止药液的泄露的目的。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明将MSCs外泌体制备成温度敏感性生物凝胶剂。本发明的温度敏感性生物凝胶制剂具有良好的生物相容性，还具有生物可降解、无细胞毒性、维持生物因子活性等特点，其相变温度接近人体温度，应用后在用药部位发生胶凝转相(由溶胶状态转变为凝胶状)，能够充分阻隔创面，预防感染。应用在治疗宫腔粘连制剂方面时，可以分隔宫腔创面，具有预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复的作用。同时载有MSCs外泌体的水凝胶在宫腔内转变为凝胶相后可紧密粘附在内膜上，持续释放，可以达到长效修复内膜损伤，以治疗IUA，并且可以预防感染。通过宫颈口以无创注射方式填充于子宫腔内，使用方便、安全，具有良好的临床应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的溶液的相转变过程图；

图2是MSCs外泌体生物凝胶累计溶蚀率测试结果；

图3为采用HE染色对比手术前后子宫内膜厚度的结果，其中A为手术前；C为手术后；B、D分别为A、B图黑框内放大图像；

图4为术后28d各处理组子宫标本大体形态观察结果，其中A为假手术组；B为自然修复组；C为空白凝胶治疗组；D为外泌体凝胶治疗组；

图5为术后28d各处理组子宫标本横截面HE染色观察结果，其中A为假手术组；B为自然修复组；C为空白凝胶治疗组；D为外泌体凝胶治疗组。E、F、G、H分别为A、B、C、D黑框内放大图像；

图6为术后28d各处理组子宫内膜上皮组织角蛋白免疫组化染色观察结果，其中A为假手术组；B为自然修复组；C为空白凝胶治疗组；D为外泌体凝胶治疗组。E、F、G、H分别为A、B、C、D黑框内放大图像；

图7为各组再生内膜上皮层周长与基底层周长比值测试结果，其中1为假手术组；2为自然修复组；3为空白凝胶治疗组；4为外泌体凝胶治疗组。a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.05，与自然修复组比较；c:P<0.05，与空白凝胶治疗组比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1MSCs外泌体的制备

1)人胎盘间充质干细胞细胞以1×10⁶/cm²的密度接种于多个培养瓶中。将细胞培养瓶置于37℃，5％CO₂饱和湿度孵育箱中培养，每隔三、四天换液。培养液为常用的哺乳细胞培养液。倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，待细胞长至培养瓶底60％面积时，换新鲜培养液，48h后，收集每个培养瓶的上清液，合并。取30mL上清液，1000×g离心15min，除去细胞碎片，再经0.45μm无菌滤膜过滤到20mL规格的超滤离心管中，4℃条件下1000×g离心70min，得到含外泌体的浓缩液，将浓缩液移至加有200μL质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中，4℃条件下，100 000×g离心70min，收集底部沉淀，用PBS稀释后，再次100 000×g离心70min，洗涤1次，最后将收集的外泌体浓缩液采用BCA法进行蛋白浓度测定，0.22μL滤膜过滤除菌，分装，于-80℃冷藏备用。

2)将上述外泌体浓缩液用磷酸盐缓冲液调节浓度到1000μg/L，1℃～8℃保存备用。

实施例2冷溶法原位凝胶的制备

取实施例1制备的MSCs外泌体，以重量计，各取以下原料混合：MSCs外泌体20份、泊洛沙姆407(P407)26份、泊洛沙姆188(P188)5份、海藻酸钠0.3份、聚乙二醇0.1份、壳聚糖0.5份、磷酸盐缓冲液和纯水48份。在搅拌条件下，将以上物质按比例缓慢加入无菌注射用纯水中，置于4℃冰箱中冷藏24h，使其充分溶胀，得澄清均匀溶液，即为温度敏感性生物凝胶制剂，将其置于4℃冰箱备用。

采用倒置法测定温度敏感性生物凝胶制剂的胶凝温度。取化5mL上述制备的溶液加入1mL试管中，置于15℃水浴中，以1℃/min速率缓慢升温，溶液完全不流动时为完全胶凝状态，此时的温度即为胶凝温度。图1是上述溶液的相转变过程图。A离心管作为对照，B离心管中装有本发明的上述温度敏感性生物凝胶制剂，图1中，本发明的温度敏感性生物凝胶制剂在30-35℃范围内，由溶胶相转变为凝胶相。

实施例3冷溶法原位凝胶的制备

取实施例1制备的MSCs外泌体，以重量计，各取以下原料混合：MSCs外泌体20份、泊洛沙姆407(P407)25份、泊洛沙姆188(P188)7份、羟丙基甲基纤维素0.3份、聚乙二醇0.1份、壳聚糖0.5份、磷酸盐缓冲液和纯水48份。在搅拌条件下，将以上物质按比例缓慢加入无菌注射用纯水中，置于4℃冰箱中冷藏24h，使其充分溶胀，得澄清均匀溶液，即为温度敏感性生物凝胶制剂，将其置于4℃冰箱备用。

按照实施例2的方法测定其胶凝温度，结果表明，其胶凝温度为30-35℃。

实施例4

一种温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：脂肪间充质干细胞(MSCs)外泌体20份、聚磷酸酯5份、泊洛沙姆407(P407)20份、泊洛沙姆188(P188)10份、透明质酸钠2份、壳聚糖1份、磷酸盐缓冲液和水32份。

实施例5

一种温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：外周血间充质干细胞(MSCs)外泌体25份、聚磷酸酯2份、、泊洛沙姆407(P407)28份、泊洛沙姆188(P188)5份、透明质酸钠2份、甘油山梨醇10份、壳聚糖1份、磷酸盐缓冲液和水32份。

实施例6

一种温度敏感性生物凝胶制剂，以质量计，包括以下比例的各组分：骨髓间充质干细胞(MSCs)外泌体30份、聚乙二醇20份、泊洛沙姆407(P407)25份、泊洛沙姆188(P188)5份、羟丙基甲基纤维素1份、透明质酸10份、壳聚糖0.5份、磷酸盐缓冲液和水50份。

实施例7体外溶蚀试验

采用无膜溶出模型研究实施例3制备的MSCs外泌体生物凝胶溶蚀动力学药物释放情况：

1)精密吸取实施例3制备的原位凝胶制剂，置于预先已称重的10mL具塞刻度试管中，再行称重，使加入的原位凝胶质量大概为5g左右；

2)将试管置于(37℃±0.5)的恒温水浴振荡器中平衡10min，使原凝胶制剂完全胶凝。

3)加入37℃1mL的PBS溶剂作为释放介质，在30r/min恒温水浴震荡，分别在0.5h、1.5h、2.5h、3h、3.5h倾出全部释放介质，将试管外表面用滤纸吸干，迅速称量并记录；

4)将试管重新放入恒温水浴中平衡10min，在补充释放介质1mL；如此反复操作，直至剩余凝胶量不足加入量的10％，考察时设置3个平行管(重复)，结果取其平均值。

5)直至试验结束，相邻时间点的样品重量差异即为在此期间凝胶溶蚀量。计算不同时间点凝胶的累计溶蚀率(M％),(M％)的计算公式为：M％＝Et/E*100％,其中Et为t时刻的累计凝胶溶蚀量；E为凝胶初始重量；

6)以不同时间点原位凝胶制剂的累积百分溶蚀率(M％)对时间(t)作图，得到凝胶经时溶蚀曲线(图2)。

实施例8动物实验

按实施案例3方法制备的外泌体生物凝胶预防宫腔粘连及促进子宫内膜再生修复的效果测定，方法如下：

1)动物模型及分组：

24只成年雌性新西兰白兔(48条子宫)分为4组，实验动物购自上海斯莱克动物公司，体质量3000-3500g。手术前以30mg/mL戊巴比妥钠按兔体重1mL/kg经耳缘静脉注射麻醉，观察呼吸频率降至15-20/min、角膜反射消失、肌张力下降为麻醉满意，取下腹部正中切口暴露子宫，沿子宫长轴剪开，用眼科剪剪去子宫内膜凸起部分，生理盐水纱布确切止血，将剪开的子宫切口对合整齐并以6-0尼龙线间断缝合。

自然修复组(n＝12)：缝合子宫切口，关闭宫腔，逐层缝合腹壁，让受损的子宫内膜自然修复；空白凝胶治疗组(n＝12)：关闭子宫腔后，向腔内注射空白凝胶至饱和，2min后回抽水凝胶无法吸出，即其已凝胶化，随后逐层缝合腹壁；外泌体凝胶治疗组(n＝12)：宫腔内注射的为外泌体复合水凝胶至饱和，2min后回抽水凝胶无法吸出，即其已凝胶化，随后逐层缝合腹壁；假手术组(n＝12)：仅进行下腹壁的切开及缝合，不处理子宫。在术后7d和28d各组分别取6条子宫标本进行组织学检测。

2)HE染色及免疫组织化学染色：

子宫标本切分为上、中、下3段，4％多聚甲醛固定标本，石蜡包埋，石蜡切片机连续切片(3μm)，用常规方法进行HE染色，免疫组织化学染色，切片用枸橼酸钠煮沸修20min，H₂O₂反应内源性过氧化氢酶，山羊血清37℃封闭30min，加小鼠抗兔广谱角蛋白单克隆抗体(1:50稀释，Abcam，英国)4℃孵育过夜，PBS洗涤后加生物素标记羊抗小鼠IgG 37℃孵育30min，辣根过氧化物酶室温孵育15min，DAB显色1min，封片后显微镜观察角蛋白阳性细胞的表达并拍照。

3)外泌体生物凝胶对术后子宫内膜再生修复的效果

手术剪去大部分子宫内膜，术后内膜菲薄(图3)术后28d，从子宫标本大体形态上看，自然修复组由于宫腔粘连闭塞，致子宫输卵管连结部位积水膨大，而空白凝胶治疗组及外泌体凝胶治疗组未发生积水(图4)；组织切片HE染色显示自然修复组宫腔内无上皮样细胞出现，宫腔完全闭塞，内壁相互粘连，治疗组有连续的上皮样细胞覆盖宫腔，但外泌体凝胶治疗组再生内膜层较空白凝胶治疗组更接近假手术组上皮层，褶皱更多，周长更长(图5)；覆盖宫腔的上皮样细胞角蛋白免疫组化染色均为阳性(图6)，以角蛋白染色结果统计各组内膜上皮层周长与基底层周长之比，如图7所示：假手术组大于其他各组(P<0.05)，空白凝胶治疗组大于自然修复组(P<0.05)，外泌体凝胶治疗组大于空白凝胶治疗组(P<0.05)。

综上，本发明制备的间充质干细胞外泌体(宫腔原位灌注)治疗宫腔粘连温度敏感性生物凝胶剂有以下特点：

温度敏感性水凝胶复合具有预防子宫宫腔粘连、促进子宫内膜再生修复的作用。水凝胶在宫腔内转变为凝胶相，在受损的子宫内膜间起到了物理阻隔作用，载入MSCs外泌体在宫腔内缓慢释放，吸引MSCs定植于受损子宫内膜层，减轻内膜组织纤维化，促进再生修复，温度敏感性水凝胶具有生物可降解、无细胞毒性、维持生物因子活性等特点，并可通过宫颈口以无创注射方式填充于子宫腔内，具有良好的临床应用前景，相较于目前临床用于宫腔粘连分粘术后预防再粘连的宫内节育器、球囊导尿管和宫腔形状气囊支架等，具有对宫腔形状的适应性强，可自然降解，感染风险低等优点。在动物实验中，水凝胶能有效地填充新西兰白兔子宫宫腔，迅速发生相转变，形成有效的物理阻隔，有明显预防宫腔粘连，促进子宫内膜再生修复的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种治疗宫腔粘连的温度敏感性生物凝胶制剂，其特征在于，以质量计，由以下比例的各组分组成：间充质干细胞外泌体20份、泊洛沙姆407 25份、泊洛沙姆188 7份、海藻酸钠或羟丙基甲基纤维素0.3份、聚乙二醇0.1份、壳聚糖0.5份和磷酸盐缓冲液，纯水48份。

2.根据权利要求1中所述的温度敏感性生物凝胶制剂，其特征在于：所述温度敏感性生物凝胶制剂的相变温度为30-35℃。

3.权利要求1中所述的温度敏感性生物凝胶制剂在制备治疗宫腔粘连制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述温度敏感性生物凝胶制剂通过原位凝胶灌注给药。

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