CN109825578A - P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 - Google Patents
P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109825578A CN109825578A CN201811464165.9A CN201811464165A CN109825578A CN 109825578 A CN109825578 A CN 109825578A CN 201811464165 A CN201811464165 A CN 201811464165A CN 109825578 A CN109825578 A CN 109825578A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- bladder cancer
- expression
- added
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 59
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 59
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 59
- 101000639962 Homo sapiens Endoplasmic reticulum protein SC65 Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 102100033933 Endoplasmic reticulum protein SC65 Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 18
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 claims description 9
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 claims description 6
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 6
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 6
- 102100040193 ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3 Human genes 0.000 claims description 5
- 101001037079 Homo sapiens ADP-ribosylation factor-binding protein GGA3 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 claims description 3
- 101000580092 Homo sapiens RNA-binding protein 10 Proteins 0.000 claims description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 102100027514 RNA-binding protein 10 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 230000037351 starvation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims 1
- 238000012549 training Methods 0.000 claims 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 abstract 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 2
- 102100023345 Tyrosine-protein kinase ITK/TSK Human genes 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- SOQBVABWOPYFQZ-UHFFFAOYSA-N oxygen(2-);titanium(4+) Chemical class [O-2].[O-2].[Ti+4] SOQBVABWOPYFQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N titanium dioxide Inorganic materials O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010215 titanium dioxide Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，通过细胞培养，转染，RNA抽提和荧光定量PCR检测，免疫印迹试验，CCK8增殖检测，transwell迁移和侵袭实验，凋亡流式检测，实现对膀胱癌细胞中P3H4基因的检测，进而由P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，对膀胱癌实现更准确的影响分析。TCGA数据库结果分析显示，在膀胱癌中，P3H4高表达。且低表达P3H4后膀胱癌患者愈后效果更佳。
Description
技术领域
本发明涉及一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法。
背景技术
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。膀胱癌的病因复杂，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素。较为明确的两大致病危险因素是吸烟和职业接触芳香胺类化学物质。目前比较公认的观点是病毒或某些化学致癌物作用于人体，使原癌基因激活，抑癌基因失活而致癌。
膀胱癌细胞凋亡与基因的研究，能够有助于研究基因对膀胱癌细胞凋亡的影响，进而对膀胱癌实现更准确的影响分析。目前尚缺乏该方面的准确研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法解决现有技术中存在的如何实现膀胱癌细胞凋亡的预测分析的问题。
本发明的技术解决方案是：
一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，包括以下步骤，
步骤1、细胞培养：膀胱癌细胞EJ、T24购自上海中科院细胞库，使用RPMI-1640培养液于37℃，5％CO2环境下常规培养，血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验；待孔板中的细胞密度达到80％时，对细胞进行加转染，转染P3H4；
步骤2、转染：按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染，具体为，待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液；脂质体Lipofectamine2000 10ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ul质粒溶于250ul无血清无抗生素培养基中；30min内混合脂质体和质粒混合液，轻轻混匀后室温静置30min；弃去6孔板中的旧培养基，PBS清洗细胞2次；将500ul脂质体和质粒混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养；将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液；24h后观察转入质粒表达情况或进行后续实验；
步骤3、RNA抽提和荧光定量PCR检测：使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果；
步骤4、免疫印迹试验Western blot：细胞转染质粒48小时后，将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min；垂直电泳槽内每孔内加入20μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ECL显影；QUANTITY ONE软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量；
步骤5、CCK8增殖检测：将转染质粒24小时后的细胞消化计数，制备细胞悬液，取100ul细胞悬液，以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，二氧化碳培养箱中常规培养，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ul CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线；
步骤6、transwell迁移和侵袭实验：将提前过夜融解的Matrigel基质胶100ul(无血清培养液按1：6稀释)加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃二氧化碳培养箱中静置4-6小时成胶，后吸干培养液，下室中加500ul无血清培养液，静置半小时水化基底膜。将转染质粒24h后的细胞使用无血清培养制备细胞悬液，100ul细胞悬液(1×105个)加入到上室中，下室中加入500ul完全培养液；过夜后，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS清洗后，4％多聚甲醛固定30min；0.1％结晶紫染色20min，PBS清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数；
步骤7、凋亡流式检测：细胞转染质粒24h后，移去培养基，更换成无血清培养基，常规条件下培养饥饿24h。收集细胞：使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，收集细胞到离心管中，1000rpm离心5min，再次加入4℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清；加入1X结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1-5×106/ml；取100ul细胞悬液至于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min；加入10ul PI染液，并加400ulPBS后进行检测。
进一步地，步骤3中，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果，具体为，实验用引物：P3H4:F-5’-CGGGCTGTGAAGCTCTACAA-3’R：5’-GCGTCAGATAGGGCATCCTC-3’，内参：β-actin:F:5’-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3’R：5’-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’，荧光定量PCR程序：95℃5min，95℃30s，循环40次，60℃45s，72℃30min；每组设3个复孔，2-△Ct法计算RBM10的表达量；独立重复三次。
本发明的有益效果是：该种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，能够实现对膀胱癌细胞中P3H4基因的检测，进而由P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，对膀胱癌实现更准确的影响分析。TCGA数据库结果分析显示，在膀胱癌中，P3H4高表达。且低表达P3H4后膀胱癌患者愈后效果更佳。
附图说明
图1是本发明实施例中TCGA数据库结果分析中膀胱癌患者的P3H4的表达情况示意图。
图2是实施例中膀胱癌患者愈后P3H4的表达情况示意图。
图3是实施例的膀胱癌及癌旁组织中P3H4的表达情况示意图。
图4是实施例中P3H4在膀胱癌细胞中的表达效果的鉴定示意图。
图5是实施例中CCK8增殖实验结果示意图。
图6是实施例中Transwell实验结果的示意图。
图7是实施例中流式周期结果示意图。
图8是实施例中流式凋亡结果示意图。
图9是实施例中慢病毒包装后的P3H4干扰质粒，转染膀胱癌细胞的示意图。
图10是实施例中Q-PCR结果显示示意图。
图11是实施例中Western Blot结果示意图。
图12是实施例中裸鼠成瘤实验显示图。
图13是实施例中对成瘤实验中肿瘤切片做免疫组化的示意图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。
实施例
一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，包括以下步骤，
步骤1、细胞培养：膀胱癌细胞EJ、T24购自上海中科院细胞库，使用RP MI-1640培养液于37℃，5％CO2环境下常规培养，血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验；待孔板中的细胞密度达到80％左右时，对细胞进行加转染，实验组转染P3H4，对照组转染P3H4空载体。
步骤2、转染：按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染，具体为，待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液；脂质体Lipofectamine2000 10ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ul质粒溶于250ul无血清无抗生素培养基中；30min内混合脂质体和质粒混合液，轻轻混匀后室温静置30min；弃去6孔板中的旧培养基，PBS清洗细胞2次；将500ul脂质体和质粒混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养；将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液；24h后观察转入质粒表达情况或进行后续实验。
步骤3、RNA抽提和荧光定量PCR检测：使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果；其中实验用引物：P3H4:F-5’-CGGGCTGTGAAGCTCTACAA-3’R：5’-GCGTCAGATAGGGCATCCTC-3’，内参：β-actin:F:5’-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3’R：5’-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’，荧光定量PCR程序：95℃5min，95℃30s，循环40次，60℃45s，72℃30min；每组设3个复孔，2-△Ct法计算RBM10的表达量；独立重复三次。
步骤4、免疫印迹试验Western blot：细胞转染质粒48小时后，将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min；垂直电泳槽内每孔内加入约20μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ECL显影；QUANTITY ONE软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量。
步骤5、CCK8增殖检测：将转染质粒24小时后的细胞消化计数，制备细胞悬液，取100ul细胞悬液，以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，二氧化碳培养箱中常规培养，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ul CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线。
步骤6、transwell迁移和侵袭实验：将提前过夜融解的Matrigel基质胶100ul(无血清培养液按1：6稀释)加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃二氧化碳培养箱中静置4-6小时成胶，后吸干培养液，下室中加500ul无血清培养液，静置半小时水化基底膜。将转染质粒24h后的细胞使用无血清培养制备细胞悬液，100ul细胞悬液(1×105个)加入到上室中，下室中加入500ul完全培养液。过夜后，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS清洗后，4％多聚甲醛固定30min。0.1％结晶紫染色20min，PBS清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数。
迁移实验步骤类似于侵袭实验，transwell小室无须进行铺胶处理，细胞数目将为5000个。
步骤7、凋亡流式检测：细胞转染质粒24h后，移去培养基，更换成无血清培养基，常规条件下培养饥饿24h。收集细胞：使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，收集细胞到离心管中，1000rpm离心5min，再次加入4℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清。加入1X结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1-5×106/ml。取100ul细胞悬液至于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min.加入10ul PI染液，并加400ulPBS，后进行上机检测。Flowjo软件对流式结果进行分析处理。
统计分析
采用SPSS18.0统计分析软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
实施例的实验结果如下：
TCGA数据库结果分析显示，如图1与图2，在膀胱癌中，P3H4高表达。且低表达P3H4后膀胱癌患者预后效果更佳。
图3是实施例的膀胱癌及癌旁组织中P3H4的表达情况，由图3、表1与表2可以看出，在癌组织中高表达。
表1.BLCA中SC65的表达与癌旁组织的比较
表2.BLCA中SC65表达与临床病理参数的关系
图4是P3H4在膀胱癌细胞中的表达效果的鉴定：QPCR结果表明，转染P3H4小干扰1～4 48小时后，si-P3H4-3呈低表达。
图5是实施例中CCK8增殖实验结果示意图，如图5，CCK8增殖实验结果表明，下调P3H4的表达后，能够抑制膀胱癌细胞的增殖。
图6是实施例中Transwell实验结果的示意图，Transwell实验结果表明，下调P3H4的表达后，能够抑制膀胱癌细胞的侵袭结果差异显著(P<0.05)，迁移能力也相应受到抑制结果差异显著(P<0.05)。
图7是实施例中流式周期结果示意图，流式周期结果分析表明：下调P3H4的表达可以将细胞周期阻断在G1期，进而抑制癌细胞增殖。
图8是实施例中流式凋亡结果示意图，流式凋亡结果分析表明：下调P3H4的表达可以促进膀胱癌细胞的凋亡。
图9是实施例中慢病毒包装后的P3H4干扰质粒，转染膀胱癌细胞的示意图，在荧光显微镜下观察到其转染效率明显提高到80％以上。
图10是实施例中Q-PCR结果显示示意图，用慢病毒包装后的P3H4干扰质粒转染膀胱癌细胞，转染效率明显提高。
图11是实施例中Western Blot结果示意图，图11表明，用慢病毒包装后的P3H4干扰质粒转染膀胱癌细胞，膀胱癌细胞中细胞周期蛋白的表达明显受到抑制,同时细胞凋亡蛋白及EMT通路相关蛋白也收到影响。即：P3H4表达被抑制后可以不仅可以通过影响EMT信号通路抑制膀胱癌细胞增殖，而且可以促进膀胱癌细胞的凋亡。
图12是实施例中裸鼠成瘤实验显示图，由图12可以看出，P3H4被干扰后裸鼠的成瘤能力明显降低。
图13是实施例中对成瘤实验中肿瘤切片做免疫组化的示意图，结果表明：P3H4干扰后肿瘤阳性率降低。
Claims (2)
1.一种P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤1、细胞培养：膀胱癌细胞EJ、T24购自上海中科院细胞库，使用RP MI-1640培养液于37℃，5％CO2环境下常规培养，血清浓度为10％，青霉素浓度为100U/ml，链霉素为0.1mg/ml；待细胞进入对数生长期时，使用PBS清洗3次，然后用胰酶消化，待细胞变圆之后，重新加入培养液终止消化，反复吹打为单细胞悬液，种植到六孔板中进行后续实验；待孔板中的细胞密度达到80％时，对细胞进行加转染，转染P3H4；
步骤2、转染：按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明进行转染，具体为，待六孔板中的细胞长至对数期时，于转染前两小时更换新鲜的完全培养液；脂质体Lipofectamine200010ul溶于250ul无血清无抗生素培养基中，轻轻混匀后室温静置5min；将5ul质粒溶于250ul无血清无抗生素培养基中；30min内混合脂质体和质粒混合液，轻轻混匀后室温静置30min；弃去6孔板中的旧培养基，PBS清洗细胞2次；将500ul脂质体和质粒混合液加入每孔细胞中，轻轻混匀，放培养箱中培养；将细胞放入培养箱孵育6h后，更换完全培养液；24h后观察转入质粒表达情况或进行后续实验；
步骤3、RNA抽提和荧光定量PCR检测：使用RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，反转录形成cDNA后，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果；
步骤4、免疫印迹试验Western blot：细胞转染质粒48小时后，将六孔板置于冰上，加RIPA裂解液(加蛋白酶抑制剂)裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5min；垂直电泳槽内每孔内加入20μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后加ECL显影；QUANTITY ONE软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，目的蛋白/内参计算各蛋白的相对表达量；
步骤5、CCK8增殖检测：将转染质粒24小时后的细胞消化计数，制备细胞悬液，取100ul细胞悬液，以每孔1000个细胞的标准种到96孔板中，二氧化碳培养箱中常规培养，每隔24h检测一次细胞活力，检测前每孔加10ul CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5h，使用酶标仪用450nm激发光检测OD值，绘制增殖曲线；
步骤6、transwell迁移和侵袭实验：将提前过夜融解的Matrigel基质胶100ul(无血清培养液按1：6稀释)加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃二氧化碳培养箱中静置4-6小时成胶，后吸干培养液，下室中加500ul无血清培养液，静置半小时水化基底膜。将转染质粒24h后的细胞使用无血清培养制备细胞悬液，100ul细胞悬液(1×105个)加入到上室中，下室中加入500ul完全培养液；过夜后，取出小室，棉签擦掉上室中残余的细胞，PBS清洗后，4％多聚甲醛固定30min；0.1％结晶紫染色20min，PBS清洗后，显微镜下随机选取5个视野，拍照观察计数；
步骤7、凋亡流式检测：细胞转染质粒24h后，移去培养基，更换成无血清培养基，常规条件下培养饥饿24h。收集细胞：使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，收集细胞到离心管中，1000rpm离心5min，再次加入4℃预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸出上清；加入1X结合缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1-5×106/ml；取100ul细胞悬液至于5ml流式管中，加入5ulAnnexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min；加入10ul PI染液，并加400ulPBS后进行检测。
2.如权利要求1所述的P3H4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法，其特征在于：步骤3中，实时荧光定量PCR检测GGA3的表达效果，具体为，实验用引物：P3H4:F-5’-CGGGCTGTGAAGCTCTACAA-3’R：5’-GCGTCAGATAGGGCATCCTC-3’，内参：β-actin:F:5’-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3’R：5’-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3’，荧光定量PCR程序：95℃5min，95℃30s，循环40次，60℃45s，72℃30min；每组设3个复孔，2-△Ct法计算RBM10的表达量；独立重复三次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811464165.9A CN109825578A (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811464165.9A CN109825578A (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109825578A true CN109825578A (zh) | 2019-05-31 |
Family
ID=66859269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811464165.9A Pending CN109825578A (zh) | 2018-11-30 | 2018-11-30 | P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109825578A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048539A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-08 | 南通大学 | 一种靶向cirbp在抗前列腺癌药物中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6335170B1 (en) * | 1999-02-22 | 2002-01-01 | Torben F. Orntoft | Gene expression in bladder tumors |
| CN105331687A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-02-17 | 深圳市第二人民医院 | 膀胱癌筛选检测试剂盒 |
| CN108570453A (zh) * | 2018-05-12 | 2018-09-25 | 江西中医药大学第二附属医院 | 一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法 |
-
2018
- 2018-11-30 CN CN201811464165.9A patent/CN109825578A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6335170B1 (en) * | 1999-02-22 | 2002-01-01 | Torben F. Orntoft | Gene expression in bladder tumors |
| CN105331687A (zh) * | 2015-10-22 | 2016-02-17 | 深圳市第二人民医院 | 膀胱癌筛选检测试剂盒 |
| CN108570453A (zh) * | 2018-05-12 | 2018-09-25 | 江西中医药大学第二附属医院 | 一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| WANGJIAN LI等: "P3H4 is correlated with clinicopathological features and prognosis in bladder cancer", 《WORLD J SURG ONCOL》 * |
| 李宁，冷雪，肖漓，毕丽丽主编: "《医学实验室管理与大型仪器使用》", 31 January 2018, 天津：天津科学技术出版社 * |
| 杜娟编: "《医学细胞与分子生物学理论与技术》", 31 July 2012, 长春：吉林大学出版社 * |
| 王筱冰，张坤，王攀，刘全宏编著: "《细胞生物学实验》", 31 August 2017, 西安：陕西师范大学出版社 * |
| 裴国献，魏宽海，金丹主编: "《组织工程学实验技术》", 31 May 2006, 北京：人民军医出版社 * |
| 陈逢振，尹利荣: "FABP-5基因沉默对宫颈癌SiHa细胞生物学特性的影响", 《中国组织工程研究》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048539A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-12-08 | 南通大学 | 一种靶向cirbp在抗前列腺癌药物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113755594B (zh) | 一种预测小细胞肺癌辅助化疗获益和识别化疗耐药治疗靶点的系统和应用 | |
| CN111189808A (zh) | 与肝脏损伤、肝细胞凋亡相关特异蛋白分子标志物筛选方法 | |
| Zhang et al. | Tumor-derived exosomal lincRNA ROR promotes angiogenesis in nasopharyngeal carcinoma | |
| CN111254146B (zh) | Linc01331基因抑制剂在制备治疗肺癌药物中的用途 | |
| CN109022584A (zh) | 一种食管癌的分子标志物及其用途 | |
| CN109825578A (zh) | P3h4基因在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌凋亡的影响分析方法 | |
| CN114317755A (zh) | m6A去甲基化酶FTO在抑制NPM1突变白血病细胞增殖方面的应用 | |
| CN113073139A (zh) | 一种胰腺癌肿瘤标志物及其应用 | |
| CN111257562B (zh) | 一种核酸适体鉴别靶标蛋白cd63的方法及其在克服黑素瘤威罗菲尼耐药中的应用 | |
| CN119287012A (zh) | 一种治疗靶点在抑制肾癌细胞转移和增殖产品上的应用 | |
| CN107779503A (zh) | 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用 | |
| AU2021100289A4 (en) | Method for Analyzing Expression of P3H4 Gene in Bladder Cancer Cells and Effect Thereof on Apoptosis of Bladder Cancer | |
| Chen et al. | Exosomatic miR‐1246 Promotes Hepatocellular Carcinoma Progression via FSTL5 and ERK/p38 MAPK Pathway | |
| CN114807364A (zh) | YRNA片段hY4F作为分子标志物在制备肺癌诊断试剂中的应用及抗肺癌药物 | |
| CN114908172B (zh) | Apobec3b在前列腺癌诊断、预后预测及治疗中的应用 | |
| CN116549649B (zh) | 一种中药壁虎microRNA在制备抗肿瘤转移治疗的药物中的应用 | |
| CN105385781B (zh) | Lce3e在诊治口腔癌中的应用 | |
| CN105132547A (zh) | Stac2基因及其编码蛋白在抑制盆腔脱垂中的应用 | |
| CN120789090B (zh) | U2surp在制备弥漫大b细胞淋巴瘤治疗药物中的应用 | |
| CN116036236B (zh) | 生物因子Sparcl1在促进内耳毛细胞再生的药物中的应用 | |
| CN117737246B (zh) | Plcb1基因作为生物标志物在侵袭性垂体腺瘤中的应用 | |
| CN112210604A (zh) | Cas作为三阴性乳腺癌标志物的应用及其调控在抑制或治疗三阴性乳腺癌方面的应用 | |
| CN110433171A (zh) | miRNA-1293在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 | |
| CN115105508B (zh) | 费德拉替尼在制备治疗krt18低表达的头颈鳞癌药物中的应用 | |
| CN120204406B (zh) | 抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Hao Lin Inventor after: Shi Zhenduo Inventor after: Han Conghui Inventor after: Han Xiaoxiao Inventor before: Hao Lin Inventor before: Shi Zhenduo Inventor before: Han Conghui Inventor before: Han Xiaoxiao Inventor before: Pang Hui |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190531 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |