CN109810909A - 一株高产番茄红素的红发夫酵母菌株及番茄红素生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083；一种番茄红素生产方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种到发酵培养基，摇床培养，得发酵液；2）将发酵液离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清，加入3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡，沸水浴，降温，离心，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；3）加入丙酮，在避光条件下震荡浸提，离心，收集上清液；4）减压蒸干，加入甲醇，得甲醇番茄红素溶液，转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到番茄红素；制备的番茄红素含量为30.32mg/g干菌体。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株高产番茄红素的红发夫酵母菌株及番茄红素生产方法。
背景技术
番茄红素又称ψ-胡萝卜素，分子式C40H56，相对分子质量为536.8，由11个共轭双键和2个非共轭双键组成。在较低浓度溶液中呈橙黄色，通常为深红色粉末或油状液体，纯的番茄红素则为针状深红色，不溶于水，难溶于极性有机溶剂，可溶于极性低的有机溶剂，因此提取番茄红素通常用极性较小的有机溶剂。番茄红素是一种抗氧化活性很强的萜类物质，具有猝灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质过氧化等多种生理功能活性，其猝灭单线态氧的能力是β-胡萝卜素的2倍，维生素E的100倍，被世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）评定为A类营养素。番茄红素早在1873年从莓果中分离出来，为结晶性深红色色素；1875年Millardet从番茄中萃取出含有番茄红素的粗提物，并将番茄红素命名为Solanorubin ；后于1903年，Schunck将其更名为lycopene且沿用至今。
番茄红素共轭双烯结构不仅决定了其在有机溶剂中的吸收峰和特殊的红色，还赋予了它广泛的生理功能，如抗氧化、抗衰老、预防心脏病、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症等。番茄红素可以有效地抑制癌细胞的生长。番茄红素可以有效保护皮肤降低受紫外线的伤害，同时对机体的免疫能力有提高作用，番茄红素促进免疫细胞增殖是通过保护吞噬细胞发挥作用的。有植物黄金之称，被誉为“21世纪保健品的新宠”。目前番茄红素的生产方法主要包括天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法获得的番茄红素产量不高，成本高且受制于原料来源；化学合成法存在安全隐患；而微生物发酵法具有工艺简单、生产效率高，不受气候和季节影响等优点，越来越受到关注。目前可以产番茄红素的微生物有三孢布拉霉、杜氏盐藻、细菌、酵母以及基因工程菌。其中，产番茄红素的大肠杆菌（Escherichia coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌已经被成功构建。但是工程菌稳定系数低，可能还隐藏着安全隐患，距离工业化生产还有很多待解决的问题。目前工业生产番茄红素的主要菌株是三孢布拉霉，但产物多为混合型类胡萝卜素，操作过程复杂等。红酵母的产色素特性可能与三孢布拉霉相似，目前所获菌株色素产量相对较低，但红酵母具有营养要求简单粗放、生长周期短和菌体无毒、营养丰富等优点，其开发利用具有广阔的前景。番茄红素显现的优良性能受到国内外广泛的关注，而番茄红素的潜在价值还没有被完全开发，但人体自身无法合成这种物质，只能从其他物质中提取，所以一种新的资源对于番茄红素的开发利用尤为重要。
邱连芳等通过紫外诱变选育得到优良高产番茄红素的红酵母突变株Zk1-1，经培养条件优化，番茄红素产量达20.25mg/L；李洁等利用基因组重排技术对产番茄红素红酵母育种中的关键步骤进行条件优化，番茄红素产量可达103.47μg/mL；罗冰选用红酵母作为发酵菌株来生产番茄红素，优化得到最佳浸提条件，番茄红素产量为1.031μg/mL；王海兵等对黏红酵母番茄红素提取工艺进行了优化，得到番茄红素含量4.55mg/g；王海兵等人采用代谢调控物对黏红酵母进行调控，番茄红素累积量达到176.97mg/L；汤锋等通过添加麦角固醇合成抑制剂使番茄红素生物合成量最高达24.23mg/L。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产番茄红素的红发夫酵母菌株及番茄红素生产方法。
一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083。
一种番茄红素生产方法，它包括：
1）取红发夫酵母菌，活化，按1~15%的接菌量接种到发酵培养基，在18~28℃、120~300r/min下摇床培养，发酵48~96h，得发酵液；
2）将发酵液在4000~6000r/min、0~4℃下离心8~15min，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入所述发酵液的20~30%体积的3mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；
3）细胞碎片加入丙酮，在避光条件下震荡浸提1~3min，在4000~8000r/min下离心8~15min，收集上清液；重复上述加入丙酮的步骤，直至上清液无色；
4）将步骤3）的上清液，在40~50℃下减压蒸干，加入甲醇，并转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，40~50℃减压蒸干，得到番茄红素；
步骤1）所述的红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083；
步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分包括：酵母浸粉1~3kg，麦芽浸粉1~4kg，玉米浆2~12kg，蛋白胨2~8kg，葡萄糖5~15kg，水1000kg；
所述的发酵培养基，还包括：H2O22~6g；
所述的H2O2为4g；
步骤1）所述的在22℃、180 r/min下摇床培养72 h；
步骤4）所述的色谱柱为C18固相萃取柱。
本发明提供了一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083；一种番茄红素生产方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种到发酵培养基，摇床培养，得发酵液；2）将发酵液离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清，加入3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡，沸水浴，降温，离心，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；3）加入丙酮，在避光条件下震荡浸提，离心，收集上清液；4）减压蒸干，加入甲醇，得甲醇番茄红素溶液，转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到番茄红素；制备的番茄红素含量为30.32mg/g干菌体。
附图说明
图1 红发夫酵母（CCTCC M 2019083）26s D1/D2区的系统发育树；
图2不同红发夫酵母产番茄红素的含量比较结果。
具体实施方式
实施例1 红发夫酵母菌种的制备
采集吉林农业大学果园土壤，将该果园土壤接种于YPD培养基平板，20-28℃恒温培养48-96 h，选择红色菌落接种于YEPD培养基中，进行20-28℃恒温摇床150-270r/min培养48-96h，进行番茄红素产量测定，获得番茄红素产量较高的菌株即为PR106，然后进行菌体形态、生理生化及26s rRNA鉴定，26s rRNA RNA长度为522bp，通过系统发育树比较该菌株为红发夫酵母（Phaffia rhodozyma），命名为红发夫酵母PR106，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2019年1月24日，地址湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M2019083。
实施例2菌种培养
菌种活化：取红发夫酵母PR106，摇瓶培养后，进行划线培养，在生化培养箱中20-28℃条件下培养，7天后选取大而颜色深的单菌落接入液体培养基中，液体培养基121℃条件下灭菌15min，菌种在18-28℃、150-270r/min培养48-96h，按此步骤传三代；
种子培养：传代培养后的活化菌种，使用YEPD液体培养基，接菌量1-10%，在摇床中18-28℃、120-300r/min的条件下培养48-96h。
实施例3 番茄红素的提取纯化
红发夫酵母PR106按10%的接菌量，接种到装有30mL发酵培养基的100mL三角烧瓶中，20℃、180r/min摇床培养72h；溶氧40-90%，流加碱液控制，pH6.0-7.5；所述的发酵培养基也可以替换为YEPD培养基，但综合考虑生产成本及发酵周期，以发酵培养基最为合适；
然后进行细胞破碎，取20 ml发酵液装入50 ml离心管中，5000r/ min，4℃离心10min收集沉淀得到菌体，用蒸馏水水洗离心弃上清三次后得到酵母泥，加入5 mL预配的3mol/L的盐酸溶液，震荡均匀后浸泡30min以酸化酵母细胞壁，沸水浴4-5分钟，然后立即放到冰水中降温。将破壁细胞浆以5000 r/min 离心10min去除盐酸，收集沉淀重复离心水洗3次弃上清，得细胞碎片。沉淀在4℃下储存，用于后期的测定；
采用丙酮萃取方法提取番茄红素。取20 mL发酵液进行细胞破碎后加入5 mL丙酮，在避光条件下震荡浸提1 min，5000 r/min离心10 min，收集上清液，得到色素丙酮浸提液，若是未完全提取，加入丙酮进行再次提取，直到细胞呈无色。
每1.5mL离心管中加入1mL的提取液，45℃减压蒸干后加入100µL甲醇溶解粗提品，取5mL甲醇活化CNW C18固相萃取柱，然后转移2mL甲醇番茄红素溶液至C18柱中。用10 mL甲醇洗脱，分4次添加到柱中，收集全部洗脱液，45 ℃减压蒸干，每1.5 mL离心管加46 µL甲醇复溶，过0.22 nm的有机滤膜，备用。
实施例4高效液相色谱法分析番茄红素
采用紫外检测器高效液相色谱法测定红发夫酵母PR106中番茄红素的含量；色谱条件为：
1）色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），或具同等性能的色谱柱；
2）流动相：流动相：乙腈：二氯甲烷= 10∶90，经0.45μm膜过滤后备用；
3）流速：1.0mL/min；
4）检测波长：472nm；
5）柱温：室温；
6）进样体积：20μL，等度洗脱，浓度不变；
高效液相色谱法分析红发夫酵母PR106中的番茄红素含量；设置对照组，对照组是来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心的CICC33064红法夫酵母；结果如图2所示，红发夫酵母PR106中的番茄红素含量为27.00mg/g干菌体（117.46mg/L发酵液），对照组番茄红素含量只有9.05mg/g；证明红发夫酵母PR106可以高产番茄红素。
实施例5 添加代谢调控物对番茄红素产量的影响
按番茄红素2%的接菌量，接种到装有30mL发酵培养基中，加入不同H2O2的量，分别为0%，0.2%，0.4%，0.6%；将三角瓶放入摇床中培养，培养条件为转速180 r/min，温度为20℃，72h后测定番茄红素含量；结果表明，当H2O2的量为0.4%时红发夫酵母PR106产生的番茄红素的含量为30.32mg/g干菌体（144.9mg/L发酵液），证明在发酵培养基中添加适量的H2O2更有利于提高番茄红素含量。
实施例6 培养基的制备
实施例1-5所述的YPD、YEPD以及发酵培养基，其组分分别为：
1）YPD培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂20.0g，自来水1.0 L；
2）YEPD培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，自来水1.0 L；
3）发酵培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，玉米浆8.0kg，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0kg，自来水1000.0L。
三种培养基的制备方法按常规方法制备。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一株高产番茄红素的红发夫酵母菌株及番茄红素生产方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 522
<212> DNA
<213> rRNA RNA
<400> 1
tagtacggcg agtgaagcgg gatgagctca aatttgaaat ctggcagcct ccggttgtcc 60
gagttgtaaa ctagagaagc gttttccgtg ccggcctgtg tacaagtccc ttggaatagg 120
gcgtcataga gggtgagaat cccgtccttg acacagacca ccggtgctat gtgatacgct 180
ctcgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctcaaattgg gtggtaaatt ccatctaagg 240
ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtaccgtg agggaaagat gaaaagcact 300
ttggaaagag agttaaacag tacgtgaaat tgttgaaagg gaaacgattg aagtcagtca 360
tgcgtgctcg gactcagctg ggttcgtccc agtctatttc cgggtgccgc aggtcagcat 420
cagtttcggg cggtggaaaa cgggcggggg aaggtggcat ctccggatgt gttatagccc 480
ccgtttggat gcatcgcgtg ggactgagga acgcagcgcg cc 522
Claims (8)
1. 一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083。
2.一种番茄红素生产方法，它包括：
1）取红发夫酵母菌，活化，按1~15%的接菌量接种到发酵培养基，在18~28℃、120~300r/min下摇床培养，发酵48~96h，得发酵液；
2）将发酵液在4000~6000r/min、0~4℃下离心8~15min，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入所述发酵液的20~30%体积的3mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；
3）细胞碎片加入丙酮，在避光条件下震荡浸提1~3min，在4000~8000r/min下离心8~15min，收集上清液；重复上述加入丙酮的步骤，直至上清液无色；
4）将步骤3）的上清液，在40~50℃下减压蒸干，加入甲醇，并转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，40~50℃减压蒸干，得到番茄红素。
3. 根据权利要求2所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：步骤1）所述的红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083。
4.根据权利要求2或3所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分包括：酵母浸粉1~3kg，麦芽浸粉1~4kg，玉米浆2~12kg，蛋白胨2~8kg，葡萄糖5~15kg，水1000kg。
5. 根据权利要求4所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：所述的发酵培养基，还包括：H2O2 2~6g。
6.根据权利要求5所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：所述的H2O2为4g。
7. 根据权利要求6所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：步骤1）所述的在22℃、180 r/min下摇床培养72 h。
8.根据权利要求7所述的一种番茄红素生产方法，其特征在于：步骤4）所述的色谱柱为C18固相萃取柱。
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