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CN109791152A - 用于鉴定和分离循环肿瘤细胞的磷脂醚类似物 - Google Patents

用于鉴定和分离循环肿瘤细胞的磷脂醚类似物 Download PDF

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CN109791152A CN201780048543.2A CN201780048543A CN109791152A CN 109791152 A CN109791152 A CN 109791152A CN 201780048543 A CN201780048543 A CN 201780048543A CN 109791152 A CN109791152 A CN 109791152A
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Abstract

本发明涉及鉴定循环肿瘤细胞、分离循环肿瘤细胞和实现循环肿瘤细胞下游分析的方法，其包括：使受试者的血液样品或血清样品与包含磷脂醚类似物的组合物接触，所述磷脂醚类似物与发光分子或磁珠键合；以及对受试者的血液样品或血清样品进行荧光显微术、流式细胞术或磁性分离。

Description

用于鉴定和分离循环肿瘤细胞的磷脂醚类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月14日提交的美国临时专利申请第62/349,713号的优先权，其整体内容通过引用全部并入本文。
背景技术
循环肿瘤细胞(“CTC”)是血液基标记物，其被假设为在癌症检测和进展中具有预测价值和预后价值。具体而言，CTC理论上是来自原发性肿瘤和转移部位的肿瘤细胞的微创源。(Alix-Panabieres C等,Challenges in circulating tumour cell research,NatRev Cancer,2014年9月,14(9),623-31和Yap T等,Circulating tumor cells:amultifunctional biomarker,Clin Cancer Res,2014年5月15日,20(10),2553-68)。许多癌症类型已知或预测会产生CTC，包括多发性骨髓瘤。Paiva B等，Detailedcharacterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows uniquephenotypic,cytogenetic,functional,and circadian distribution profile,Blood,2013年11月21日,122(22),3591-3598。此外，癌症干细胞(“CSC”)被预测为具有预后价值的另一种可能的癌细胞类型，理论上为CTC的亚群。Scatena R等，Circulating tumour cellsand cancer stem cells:a role for proteomics in defining theinterrelationships between function,phenotype and differentiation withpotential clinical applications,Biochim Biophys Acta,2013年4月；1835(2)，129-143；Faltas B.Cornering metastases:therapeutic targeting of circulating tumorcells and stem cells,Front Oncol,2012年7月3日,(2)68。根据定义，CTC是有核的、CD45阴性、上皮细胞粘附分子(“EpCAM”)阳性和泛细胞角蛋白阳性细胞。然而，从全血中鉴定和分离CTC在技术上具有挑战性，因为CTC非常罕见并且可以低至7.5毫升(“mL”)血液中1个细胞(即数十亿个细胞中的1个)。
目前，对于CTC唯一接受和批准的指征是作为癌症进展的预后标志物的计数。系统(CellSearch是强生公司(Johnson&Johnson Corp)的注册商标)是目前唯一被FDA批准用于对CTC进行计数的化验。(Ignatiadas M等,Circulating tumor cellsand circulating tumor DNA for precision medicine:dream or reality？,Ann Oncol,2014年12月,25(12),2304-13和Toss A等,CTC enumeration and characterization:moving toward personalized medicine,Ann Transl Med,2014年12月,2(11):108,1-16.)。不幸的是，仅被批准用于转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。(HayesDF等,Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy ofmetastatic breast cancer patients predict progression-free and overallsurvival,Clin Cancer Res,2006年7月15日,12(1),4218-24；Cristofanilli M等,Circulating tumor cells,disease progression,and survival in metastatic breastcancer,N Engl J Med,2004年8月19日,351(8),781-91；De Bono JS等,Circulatingtumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer,Clin Cancer Res,2008年10月1日,14(19),6302-9；和CohenSJ等,Relationship of circulating tumor cells to tumor response,progression-free survival,and overall survival in patients with metastatic colorectalcancer,J Clin Oncol,2008年7月1日,26(19),3213-21)。
在当前定义下鉴定CTC仍然存在挑战。第一，由于EpCAM阳性循环上皮细胞，可能存在假阳性结果。第二，由于肿瘤细胞经历上皮-至-间充质转变导致上皮标志物的表达降低，可能发生假阴性结果。(Yu M等,Circulating breast tumor cells exhibit dynamicchanges in epithelial and mesenchymal composition,Science,2013Feb 1,339(6119),580-4)。第三，文献中越来越多的证据表明并非所有CTC表达EpCAM，并且某些癌症类型(例如肾癌)具有EpCAM的低表达或异质表达。(Eichelberg C等,Epithelial celladhesion molecule is an independent prognostic marker in clear cell renalcarcinoma,Int J Cancer,2013年6月15日,132(12),2948-55和Spizzo G等,EpCAMexpression in primary tumour tissues and metastases:an immunohistochemicalanalysis,J Clin Pathol,2011年5月,64(5):415-20)。因此，临床上需要使用广泛的肿瘤标志物的经济且稳健的化验，所述广泛的肿瘤标志物可以识别所有潜在的CTC而没有偏差。靶向癌症的烷基磷酸胆碱(“APC”)类似物提供了用于从大范围的不同癌症类型中鉴定和分离CTC的新方法。
发明内容
本发明涉及鉴定一种或多种循环肿瘤细胞的方法，其包括：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含磷脂醚(“PLE”)类似物的组合物接触，所述磷脂醚类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；
和
(ii)使所述来自受试者的血液样品或血清样品经受荧光显微术或流式细胞术，
其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合。
本发明还涉及分离一种或多种循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
(i)向受试者施用包含PLE类似物的组合物，所述PLE类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；和
(ii)使来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术或磁场，
其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合，并且所述来自受试者的血液样品或血清样品经受磁场；并且其中如果所述制品是发光分子，则所述来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术。
在一个实施方案中，一种或多种循环肿瘤细胞包含癌症干细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明的与制品键合的PLE类似物是选自由式(I)化合物
式(II)化合物
式(III)化合物
和式(IV)化合物
组成的组的化合物，其中：
n是16至30的整数，优选18；
Y选自由-H、-OH、-OR1、-C(O)OH和-OC(O)R1组成的组，其中R1是烷基；以及
X是发光分子或磁珠。
在一个优选的实施方案中，发光分子是荧光团，更优选荧光团选自由 组成的组，其中每个R独立地选自H、CH3、C2H5和C3H7，最优选
在另一个优选的实施方案中，磁珠选自由纳米磁珠、微米磁珠、顺磁珠和超顺磁珠组成的组，其中磁珠经由选自由生物素-链霉亲和素接头、氮杂环丁酮接头以及胺基接头、叠氮基接头、炔基接头、羧基接头和羟基接头以及它们的组合组成的组的接头与PLE类似物键合。
在另一个优选的实施方案中，本发明的一种或多种循环肿瘤细胞选自由乳腺癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、宫颈癌细胞、鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和癌症干细胞组成的组，优选乳腺癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、宫颈癌细胞、鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、结肠直肠癌细胞细胞，并且更优选前列腺癌细胞或胰腺癌细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于进一步的下游数据采集技术，包括但不限于蛋白质分离、RNA分离、DNA分离、基因易位和/或扩增分析和荧光原位杂交。
附图说明
图1.从患者108(结肠直肠癌)分离的CD45-、CD34-细胞的散点图分析。组A示出用除CD14外的所有标记物染色的细胞。组B示出用所有标记物染色的细胞。左上象限表示CD14-/CLR1501+细胞，右上表示CD14+/CLR1501+，右下表示CD14+/CLR1501-，左下表示CD14-/CLR1501。
具体实施方式
PLE类似物具有鉴定、分离所有类型的CTC以及实现所有类型的CTC的下游分析的能力。癌细胞的脂筏比健康细胞多5到10倍。脂筏是膜磷脂双层的特殊区域，含有高浓度的胆固醇和鞘脂类，并且用于组织细胞表面和细胞内信号传递分子(例如，生长因子和细胞因子受体，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt存活途径)。数据表明，脂筏是PLE进入的门户。这些化合物对癌细胞与非癌细胞的显著选择性归因于PLE对胆固醇的高亲和力和癌细胞中丰富的含胆固醇的脂筏。由于脂筏结构的破坏抑制了PLE向癌细胞中的摄取，因此脂筏发挥的关键作用得到了强调。已经表明，当阻止脂筏形成时，PLE的摄取减少了60％。
在超过55种异种移植物和自发性肿瘤模型中获得的初步结果已普遍显示CLR1404在肿瘤中经历选择性摄取和延长的保留。Weichert,JP等,Alkylphosphocholine analogsfor broad-spectrum cancer imaging and therapy,Sci Transl Med,2014年6月11日,6(240ra75)。之前未知的是PLE类似物是否能够被CTC吸收到能够鉴定和分离CTC的程度。
本发明涉及鉴定一种或多种循环肿瘤细胞的方法，其包括：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含磷脂醚(“PLE”)类似物的组合物接触，所述磷脂醚类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；
和
(ii)使所述来自受试者的血液样品或血清样品经受荧光显微术或流式细胞术，
其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合。
本发明还涉及分离一种或多种循环肿瘤细胞的方法，其包括以下步骤：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含PLE类似物的组合物接触，所述PLE类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；和
(ii)使来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术(优选荧光激活细胞分选术)或磁场，
其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合，并且所述来自受试者的血液样品或血清样品经受磁场；并且其中如果所述PLE类似物与发光分子键合，则所述来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术。
在一个优选的实施方案中，与制品键合的PLE类似物是选自由式(I)化合物
式(II)化合物
式(III)化合物
和式(IV)化合物
组成的组的化合物，其中：
n是16至30的整数，优选18；
Y选自由-H、-OH、-OR1、-C(O)OH和-OC(O)R1组成的组，其中R1是烷基；以及X是发光分子或磁珠。
在一个优选的实施方案中，发光分子是荧光团，更优选荧光团选自由 组成的组，其中每个R独立地选自H、CH3、C2H5和C3H7，最优选
在另一个优选的实施方案中，磁珠选自由纳米磁珠、微米磁珠、顺磁珠和超顺磁珠组成的组，其中磁珠经由选自由生物素-链霉亲和素接头、氮杂环丁酮接头以及胺基接头、叠氮基接头、炔基接头、羧基接头和羟基接头以及它们的组合组成的组的接头与PLE类似物键合。
在另一个优选的实施方案中，本发明的一种或多种循环肿瘤细胞选自由乳腺癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、宫颈癌细胞、鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞和癌症干细胞和恶性浆细胞组成的组，优选前列腺癌细胞或胰腺癌细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可用于进一步的下游数据采集技术，包括但不限于蛋白质分离、RNA分离、DNA分离、基因易位和/或扩增分析和荧光原位杂交。
定义
通常，提及“一个循环肿瘤细胞”意指单个细胞，而提及“多个循环肿瘤细胞”或“循环肿瘤细胞簇”意指一个以上癌细胞。然而，本领域技术人员将理解，提及“多种循环肿瘤细胞”旨在包括一群循环肿瘤细胞，包括一种或多种循环肿瘤细胞，而提及“一个循环肿瘤细胞”可包括一种以上循环肿瘤细胞。
如本文所用，术语“循环肿瘤细胞”或“多种循环肿瘤细胞”是指在受试者的血液样品或血清样品中发现的任何癌细胞或癌细胞簇。CTC还可以包含在受试者的血液样品或血清样品中发现的癌症干细胞或癌症干细胞簇或由在受试者的血液样品或血清样品中发现的癌症干细胞或癌症干细胞簇组成。
如本文所用，术语“癌症干细胞”是指能够自我更新和分化成在恶性肿瘤中发现的不同类型的癌细胞的癌细胞。
如本文所用，术语“癌症”是指但不限于多种癌症类型，包括：乳腺癌，包括男性乳腺癌；消化道/胃肠癌，包括肛门癌、阑尾癌、肝外胆管癌、胃肠道类癌、结肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道间质瘤(“gist”)、胰岛细胞瘤、成人原发性肝癌、儿童期肝癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和胃癌；内分泌和神经内分泌癌，包括胰腺癌、肾上腺皮质癌、胰腺神经内分泌肿瘤、Merkel细胞癌、非小细胞肺神经内分泌肿瘤、小细胞肺神经内分泌肿瘤、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤和甲状腺癌；眼癌，包括眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；泌尿生殖系统癌，包括膀胱癌、肾(肾细胞)癌、阴茎癌、前列腺癌、移行细胞肾盂和输尿管癌、睾丸癌、尿道癌和肾母细胞瘤；生殖细胞癌，包括儿童中枢神经系统癌、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤和睾丸癌；妇科癌症，包括宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养细胞肿瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、子宫肉瘤、阴道癌和外阴癌；头颈癌，包括下咽癌、喉癌、唇癌和口腔癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、咽喉癌、唾液腺癌和喉癌；白血病，包括成人急性淋巴细胞白血病、儿童急性淋巴细胞白血病、成人急性骨髓性白血病、儿童急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓细胞白血病和毛细胞白血病；多发性骨髓瘤，包括恶性浆细胞；淋巴瘤，包括艾滋病相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、成人霍奇金淋巴瘤、儿童霍奇金淋巴瘤、妊娠期霍奇金淋巴瘤、蕈样真菌病、成人非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、妊娠期非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、Sézary综合征和巨球蛋白血症；肌肉骨骼癌，包括尤文肉瘤、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、儿童横纹肌肉瘤和软组织肉瘤；神经系统癌，包括成人脑肿瘤、儿童脑肿瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、神经母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；呼吸道/胸腺癌，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤和胸腺癌；和皮肤癌，包括Kaposi肉瘤、黑色素瘤和鳞状细胞癌。
如本文所用，术语“样品”是指适用于本发明提供的方法的任何样品。样品可以是包括适于检测的循环肿瘤细胞的任何样品。样品来源包括全血、骨髓、胸膜液、腹膜液、中央脊髓液、尿液、唾液和支气管冲洗液。在一个方面，样品是血液样品，例如包括全血或其任何部分或组分。适用于本发明的血液样品可以从已知包括血细胞或其组分的任何来源提取，例如静脉、动脉、外周、组织、脐带等。例如，可以使用众所周知的常规临床方法(例如，用于抽血和处理全血的程序)获得和处理样品。在一个实施方案中，示例性样品可以是从患有癌症的受试者抽取的外周血。
如本文所用，术语“鉴定(identify或identifying)”是指可视化CTC的存在。
如本文所用，术语“分离(isolate或isolating)”是指将CTC与受试者样品中发现的其它细胞类型物理分离。
如本文所用，术语“接触(contact或contacting)”是指使受试者、组织、器官或细胞与本发明的PLE类似物接触。如本文所用，接触可以离体或体外完成，即在试管中，在活生物体(例如人)的细胞或组织中。本文中等同使用的“患者”或“受试者”是指哺乳动物，优选人。
除非另有说明，本文所用的术语“烷基”是指由1至24个碳原子的饱和烃基(C1-C24)组成的支链或直链烷基。烷基基团可以是环状或非环状的。
如本文所用，术语“胺”是指含有氮原子和孤对电子的官能团。
如本文所用，术语“叠氮”是指含有三个连续氮原子的官能团。
如本文所用，术语“炔”是指含有两个彼此三键键合的碳原子的官能团。
如本文所用，术语“羧基”是指含有C(O)O结构的官能团。
如本文所用，术语“羟基”是指含有OH的官能团。
如本文所用，“n”是16至30的整数。
如本文所用，“Y”选自由-H、-OH、-OR、-C(O)OH和-OC(O)R组成的组。
如本文所用，“R”是指烷基。
如本文所用，术语“R”是指H、CH3，C2H5和C3H7。
如本文所用，“X”是与接头键合的发光分子或磁珠。
可用于本发明的流式细胞术包括但不限于荧光激活细胞分选术(“FACS”)和多色流式细胞术。
可用于本发明的磁珠包括但不限于：尺寸在纳米范围内的纳米磁珠，有时称为磁性纳米颗粒，例如50nM磁珠(MACS是Miltenyi Biotec GmbH的注册商标，并且可从Miltenyi Biotec GmbH获得)；尺寸在微米范围内的微米磁珠，例如1-3μM(Dynabeads是Invitrogen Dynal AS Corp的注册商标，并且可从Invitrogen Dynal ASCorp获得)；顺磁珠和超顺磁珠。
可用于本发明的发光分子包括荧光团。
荧光团包括但不限于：Alexa(Alex Fluor是Molecular Probes,Inc.的注册商标，并且可从Molecular Probes，Inc.获得)化合物，包括350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790；Brilliant VioletTM(BrilliantViolet可从获得)化合物，包括420、510、605、650、711和786；BrilliantUltra-VioletTM(Brilliant Ultra-Violet可从BD Biosciences,Inc.获得)化合物，包括频率395nm和737nm的那些；(Dylight是Pierce Biotechnology,Inc.的注册商标，并且可从Pierce Biotechnology,Inc.获得)化合物，包括350、405、488、550、594、633、650、680、755和800；(Violetfluor和Redfluor是TonboBiotechnologies Corporation的注册商标，并且可从Tonbo BiotechnologiesCorporation获得)；别藻蓝蛋白(“APC”)，APC AlexaAPC-Cy7；多甲藻素-叶绿素蛋白(“PerCP”)，PerCP-Cy5、PerCP-Cy5.5、PerCP-Cy7；碘化丙啶(“PI”)；藻红蛋白(“PE”)，PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas(Texas Red是Molecular Probes,Inc.的注册商标)；荧光素(“FITC”)；氨基甲酰基香豆素(“AMCA”)；(MarinaBlue和Cascade Blue是注册商标，并且可从Molecular Probes,Inc.获得)；CascadeYellow；Pacific Blue；(Qdot是Life Technologies Corp的注册商标)；四甲基罗丹明(“TRlTC”)；Cy3；Cy5；Cy5.5；Texas和以下结构的化合物 其中每个R独立地选自H、CH3、C2H5和C3H7。
可用于本发明的接头包括但不限于：键、生物素-链霉亲和素接头、氮杂环丁酮接头和胺基接头、叠氮基接头、炔基接头、羧基接头、羟基接头以及它们的组合。
提供以下优选实施方案仅用于说明目的，并不意味着以任何方式限制本发明。
优选实施例
在一个优选的实施方案中，本发明涉及鉴定循环前列腺癌细胞的方法，包括：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含式(V)化合物
CLR1501或式(VI)化合物
CLR1502的组合物接触；和
(ii)将来自受试者的血液样品或血清样品进行荧光显微术或流式细胞术。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及分离循环前列腺癌细胞的方法，包括：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含式(V)化合物
CLR1501或式(VI)化合物
CLR1502的组合物接触；和
(ii)使受试者的血液样品或血清样品经受荧光激活细胞分选术。
提供以下实施例仅用于说明目的，并不意味着以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1-PLE-磁珠结合物的合成
首先，式I-式IV的PLE和如本文所述的磁珠各自连接至其自身的官能团。然后通过点击化学将这些官能团连接。例如，本发明的式I的PLE可以与叠氮官能团连接，磁珠可以与炔官能团连接。然后叠氮官能团和炔官能团可以通过点击化学键合，例如铜催化叠氮-炔环加成(“CuAAC”)。通常，连接到官能团的磁珠被称为“官能化磁珠”，并且可以从多种来源获得，如Nanocs,Inc.。
CLR1401叠氮化物的合成
在反应容器中，将18-(对碘苯基)十八烷基磷酸胆碱(4.01g，6.3mmol)、叠氮化钠(818mg，12.6mmol)和抗坏血酸钠(140mg，0.71mmol)溶解在脱气乙醇(28ml)与水(12ml)的混合物中。将碘化亚铜(I)(120mg，0.63mmol)和N,N’-二甲基-乙二胺(0.1ml，0.94mmol)加入到反应混合物中。紧密关闭反应容器，将混合物在80℃下搅拌45分钟。将反应混合物冷却至室温，加入水(60ml)，并将混合物在空气中搅拌30分钟。将混合物转移到分液漏斗中，加入氯仿(80ml)和甲醇(52ml)，并通过摇动进行萃取。除去氯仿层，重复萃取(2×80ml氯仿)。用0.01N HCl洗涤合并的氯仿萃取物，用Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。将残余物溶于氯仿(4ml)中并在搅拌下缓慢加入丙酮(170ml)。将混合物搅拌30分钟并过滤。用丙酮在过滤器上冲洗产物，并在高真空下干燥，得到3.31g(95％)18-(对叠氮基苯基)十八烷基磷酸胆碱。
PLE-叠氮化物与炔官能化磁珠的键合
CLR1401叠氮化物通过点击化学与炔官能化磁珠键合。以上是CuAAC的一个实施例。在Himo F等，Copper(I)-catalyzed synthesis of azoles中描述了CuAAC。DFT研究预测了前所未有的反应和中间体，J Am Chem Soc,2005年1月12日,127(1),210-216，其通过引用整体并入。简而言之，在氧化铜(“Cu(I)”)催化剂存在下，将炔官能化磁珠和CLR1401叠氮化物在1：1比例的水和叔丁醇中混合6至12小时。任选地，将抗坏血酸钠加入混合物中。然后可以使用简单的过滤或萃取从溶液中分离最终的PLE-磁珠。
PLE-乙炔与叠氮官能化磁珠的键合
CLR1401乙炔通过点击化学与叠氮官能化磁珠键合。如上所述，可以使用用于键合CLR1401叠氮化物与炔官能化磁珠的相同CuAAC反应。
羧基-PLE与胺官能化磁性纳米颗粒的键合
羧基CLR1401通过酰胺键合与胺官能化磁性纳米颗粒键合。酰胺键合可以用任何适于形成酰胺键的偶联剂实现，例如用于肽合成的试剂，包括但不限于：(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)(“HBTU”)、(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化六氟磷酸盐)(“HATU”)、(COMU可从Sigma AldrichCo,LLC获得并且是Luxembourg Biotechnologies Ltd.的注册商标)和丙烷膦酸酐(“PPAA”或T3P可通过Euticals SPA获得并且是Euticals SPA的注册商标)。
PLE羧基-AZD与胺官能化磁性纳米颗粒的键合
作为上述酰胺键合的替代，胺官能化磁性纳米颗粒可以通过氮杂环丁酮(“AZD”)接头与羧基-PLE键合。例如，CLR1401羧基-AZD可以经由AZD接头与胺官能化磁性纳米颗粒键合。AZD连接在Roberts LR等,Kappa agonist CovX-Bodies,Bioorg Med Chem Lett,2012年6月15日,22(12),4173-4178和Sato S等,Chemically Programmed Antibodies ASHIV-1Attachment Inhibitors,ACS Med Chem Lett,2013年5月9日,4(5),460-465中有描述。
实施例2-使用荧光PLE类似物鉴定和计数肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、鳞状细 胞癌和结肠直肠癌患者的循环肿瘤细胞
方法
当可获得时，将来自7名患有肺癌(患者101和103)、甲状腺癌(患者102)、乳腺癌(患者106)、宫颈癌(患者104)、鳞状细胞癌(107)和结肠直肠癌(患者108)的癌症患者治疗之前(抽取1)和治疗之后(抽取2)的全血收集在Cell收集管或者乙二胺四乙酸(“EDTA”)收集管中。使用Ficoll-Paque密度梯度从全血中分离单核细胞。然后将来自每位患者的细胞与Fc阻断剂一起培养。然后用CD45、CD14、CD34、EpCAM和泛细胞角蛋白(CK)的荧光标记抗体和荧光PLE类似物(“CLR1501”)染色细胞30分钟。然后通过流式细胞术分析细胞以指示来自每个全血样品(其对于特定标记物是阳性和/或阴性的)细胞数量。根据目前的定义，CTC被鉴定为CD45-、CD14-、CD34-、CK+和EpCAM+的活细胞(“根据定义”)。由于先前CD14+单核细胞/巨噬细胞的经验(图1)，由于CLR1501的高摄取，CD14+细胞从分析中除去。还从分析中除去CD34+正常上皮细胞。相比之下，相同患者中剩余的CD45+和CD34+细胞在很大程度上不会占用CLR1501。该分析的结果在下面解释并总结在表1和2中。
表1和表2的第一行描绘了来自每个患者的抽取血液满足CTC的定义：CD45-、CD14-、CD34-、CK+和EpCAM+并且包含细胞核的细胞的数量。第二行描绘了来自每位患者的抽取血液为CD45-、CD14-、CD34-、CK+并且包含细胞核的细胞的数量。第三行描绘了来自每位患者的抽取血液为CLR 1501+、CD45-、CD14-、CD34-、CK+并且包含细胞核的细胞的数量。第四行描绘了来自每位患者的抽取血液为CD45-、CD14-、CD34-和EpCAM+并且包含细胞核的细胞的数量。第五行描绘了来自每位患者的抽取血液为CLR1501+、CD45-、CD14-、CD34-和EpCAM+并且包含细胞核的细胞的数量。第六行描绘了来自每位患者的抽取血液为CLR 1501+、CD45-、CD14-、CD34-、CK-和EpCAM-并且包含细胞核的细胞的数量。
表1.在收集管中收集的具有不同癌症类型的患者的血液样品中的循环肿瘤细胞的鉴定和计数
M表示百万
表2.在EDTA收集管中收集的具有不同癌症类型的患者的血液样品中的循环肿瘤细胞的鉴定和计数
M表示百万
结果
所有七个样品含有可检测的CTC(根据定义)，其示出CLR1501的正摄取(比较表1和表2中的第1行与第3、5和6行)。图1中示出了代表性的流式细胞术图像，其描绘了来自患者8的血液样品的CD14+细胞中CLR1501的高摄取。在图1中，左上象限表示CD14-/CLR1501+细胞，右上表示CD14+/CLR1501+，右下表示CD14+/CLR1501-，左下表示CD14-/CLR1501-。在组A中，从患者108抽取的血液中分离的对CD45和CD34阴性的细胞(即可能的循环肿瘤细胞)用除Brilliant Violet 785TM CD14之外的所有标记物染色示出。对CD14标记阳性的细胞示出在x轴上，对CLR1501阳性的细胞示出在y轴上。组A用作对照以设定Brilliant Violet785TM CD14阳性细胞的门限。在组B中，从患者108抽取的血液中分离的对CD45和CD34阴性的细胞用所有标记染色示出，包括Brilliant Violet 785TM CD14。如图所示，99.7％的对CD14+阳性的细胞对CLR1501也呈阳性。比较图1的组A与组B。
此外，在所有癌症类型中，不论使用哪种血液收集管，CLR 1501能够鉴定～99-100％的CK+细胞(比较表1或表2的第2行与第3行)和～35-100％的EpCAM+细胞(比较表1或表2的第4行或第5行)。令人惊讶的是，存在大量CLR1501+细胞，而无CK-、EpCAM-、CD45-、CD14-、CD34-细胞，并含有细胞核(第6行，表1-2)。表1和表2的第6行中指示的细胞不是血细胞类型，但可以是可能具有降低的EpCAM和CK表达或无EpCAM和CK表达的其它肿瘤细胞。据报道，许多癌症表达其它肿瘤标志物，具有EpCAM和/或CK的异质表达，或者可能正在经历上皮-间质转化(EMT)，并因此丧失上皮标志物的表达。Yu 2013，Eichelberg 2013和Spizzo2011。因此，CLR1501能够鉴定在目前的单标记化验和多标记化验中检测不到的循环肿瘤细胞。
患者101、102、104和108在治疗之前和治疗之后进行抽血(分别为抽取1和抽取2)。患者101对治疗有非常好的部分反应；然而，从抽取1至抽取2中可以看出，该患者的根据定义的CTC计数从0到10增加，表明癌症的进展(表1)。如果仅将CK用作肿瘤细胞的标记物，则患者101的肿瘤细胞计数从470万减少至10(表1，比较抽取1与抽取2)。如果仅将EpCAM用作肿瘤细胞的标记物，则患者101的肿瘤细胞计数从20增加至41(表1，比较抽取1与抽取2)。然而，患者101的总肿瘤细胞计数(CK+和EpCAM+两者的数量)从抽取1至抽取2有所下降，表明单独的标记可以是临床反应更准确的测量，并且患者101的癌细胞描绘了CK和EpCAM的异质表达。此外，患者101的所有CLR 1501+细胞的计数从抽取1到抽取2急剧下降。患者101的EDTA血液采集管中也出现了这种趋势(表2)。因此，单独的CLR 1501可能是比目前的化验更准确的临床反应的测量，否定了鉴定EpCAM和CK两者的需要。
总之，荧光PLE类似物CLR1501成功用于鉴定来自肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、鳞状细胞癌和结肠直肠癌患者的CTC。

Claims (21)

1.鉴定一种或多种循环肿瘤细胞的方法，其包括：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含磷脂醚(PLE)类似物的组合物接触，所述磷脂醚类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；和
(ii)使所述来自受试者的血液样品或血清样品经受荧光显微术或流式细胞术，其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述与制品键合的PLE类似物选自由式(I)化合物式(II)化合物式(III)化合物和式(IV)化合物组成的组，其中：
n是16至30的整数；
Y选自由-H、-OH、-OR、-C(O)OH和-OC(O)R组成的组，其中R是烷基；以及
X是发光分子或磁珠。
3.根据权利要求2所述的方法，其中X是发光分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述发光分子是荧光团。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述荧光团选自由
组成的组，
其中每个R独立地选自H、CH3、C2H5和C3H7。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述与制品键合的PLE类似物是式(II)化合物，并且所述荧光团选自由组成的组。
7.根据权利要求2所述的方法，其中X是磁珠。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述磁珠选自由纳米磁珠、微米磁珠、顺磁珠和超顺磁珠组成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述接头选自由生物素-链霉亲和素接头、氮杂环丁酮接头以及胺基接头、叠氮基接头、炔基接头、羧基接头和羟基接头以及它们的组合组成的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种循环肿瘤细胞选自由乳腺癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、宫颈癌细胞、鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和癌症干细胞组成的组。
11.分离一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)的方法，其包括以下步骤：
(i)使来自受试者的血液样品或血清样品与包含磷脂醚(PLE)类似物的组合物接触，所述磷脂醚类似物与选自由发光分子和磁珠组成的组的制品键合；和
(ii)使所述来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术或磁场，
其中如果所述制品是磁珠，所述制品经由接头与所述PLE键合，并且所述来自受试者的血液样品或血清样品经受磁场；并且其中如果所述制品是发光分子，则所述来自受试者的血液样品或血清样品经受流式细胞术。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述与制品键合的PLE类似物选自由式(I)化合物式(II)化合物式(III)化合物和式(IV)化合物组成的组，其中：
n是16至30的整数；
Y选自由-H、-OH、-OR1、-C(O)OH和-OC(O)R1组成的组，其中R1是烷基；以及
X是发光分子或磁珠。
13.根据权利要求12所述的方法，其中X是发光分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述发光分子是荧光团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述荧光团选自由
组成的组，
其中每个R独立地选自H、CH3、C2H5和C3H7。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述与制品键合的PLE类似物是式(II)化合物，并且所述荧光团选自由组成的组。
17.根据权利要求12所述的方法，其中X是磁珠。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述磁珠选自由纳米磁珠、微米磁珠、顺磁珠和超顺磁珠组成的组。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述接头选自由生物素-链霉亲和素接头、氮杂环丁酮接头以及胺基接头、叠氮基接头、炔基接头、羧基接头和羟基接头以及它们的组合组成的组。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种CTC选自由乳腺癌细胞、肺癌细胞、甲状腺癌细胞、宫颈癌细胞、鳞状细胞癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和结肠直肠癌细胞、多发性骨髓瘤细胞和癌症干细胞组成的组。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种分离的CTC用于选自由蛋白质分离、RNA分离、DNA分离、基因易位分析、基因扩增分析和荧光原位杂交组成的组的方法中。
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