CN109797437A - 一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用，该构建方法包括：步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris‑HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库；本发明构建方法通过上下游引物上不同标签组合识别样品，能够大大降低引物合成量，此外，还能够减少扩增次数，有效降低样品间的数据不均衡。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学、法医学、刑侦及物证鉴定技术领域，具体涉及一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用。
背景技术
高通量测序技术自2010年以来发展迅猛，由于该技术可获得的数据量较大，针对不同的项目需求，可满足几十甚至几百份样品的位点分型要求。为了区分样品，在构建文库时，每个样品的序列前添加了样品标签(barcode)，在进行数据分析时利用识别序列将测序数据分到每个样品中。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。目前，基于高通量测序技术检测人基因组单核苷酸多态性中，测序数据的归类均是通过单个样品标签进行识别；对于同时检测几十份样品的上百个靶标的核酸序列，使用单个样品标签进行识别分类，容易造成样品间数据量相差悬殊且引物合成成本较高；此外，引物处理繁琐，易出错，且对引物间的扩增不均衡不宜进行调整。
发明内容
为此，本发明提供一种检测多个样品时测序文库的构建方法，用于解决现有技术中由于测序数据的归类通过单个标签进行识别容易导致的各样品间数据量相差悬殊，引物合成成本较高且引物处理繁琐，易出错，对引物间的扩增不均衡不宜进行调整的问题。
为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：
在本发明的实施方式的第一方面中，提供了一种检测多个样品时测序文库的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；
步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；
步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；
步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库。
本发明上述构建方法，在上游引物和下游引物的5’端分别依次增加标签序列和接头序列，并合成融合引物，其中上下游引物采用不同标签序列，即能够通过含不同序列的第一标签与不同序列的第二标签任意组合以识别样品，进而能够大大降低引物合成量；此外，采用双样品标签融合引物法相较于连接法，减少了扩增次数，有效降低样品间的数据不均衡。
进一步地，所述第一标签和第二标签的序列不同，且分别为1-20核苷酸或类核苷酸的随机序列。
进一步地，所述步骤四中，纯化采用的方法为：吸取20μL PCR产物到一个1.5mL EP管中，再加入30μL磁珠，吸打混匀，室温下平衡5分钟；将混合物放在磁力架上，移除上清液后，用70％乙醇清洗磁珠两次，加入20μL水洗脱，洗脱液即为构建完成的文库。
在本发明的一个实施例中，所述A接头或P接头选自Ion PGM、Ion Proton或IonS5/S5XL测序平台的接头。
优选地，所述A接头序列具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，并通过人工合成得到；所述P接头序列具有SEQ ID NO.2所示的碱基序列，并通过人工合成得到；其中，SEQ IDNO.1序列为：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG；
SEQ ID NO.2序列为：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。
优选地，所述步骤二中，所述添加方法为在上游引物序列的5’端依次添加第一标签序列、A接头序列组成一段长度为46-80碱基的核苷酸序列，在下游引物序列的5’端依次添加第二标签序列、P接头序列组成一段长度为40-80碱基的核苷酸序列，随后，分别合成上游融合引物和下游融合引物。本发明中对上游融合引物和下游融合引物的合成方法不做严格限制，例如可以通过第三方引物合成公司进行合成即可。
本发明中对多重PCR反应体系中各原料不做严格限制，优选地，所述混合融合引物中每对引物浓度为0.1-3.0μM。
优选地，所述基因组DNA浓度为0.1-100ng/μL。
优选地，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为5-30mM；Mg2+浓度为1-20mM；dNTPs浓度为0.1-2mM；Taq酶浓度为0.1-5U。
优选地，所述步多重PCR反应体系中各原料的体积份数为：含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液2.8-3.2份、混合融合引物0.1-0.3份、基因组DNA0.8-1.2份和无核酸酶水5.5-6.1份。
优选地，所述PCR反应程序为：93-96℃1min；93-96℃30s，50-63℃30s，68-72℃1min，共10-25个循环；并在10℃下保存。
在本发明的实施方式的第二方面中，提供了一种所述构建方法在人基因组单核苷酸多态性检测中的应用。
根据本发明的实施方式，本发明具有如下优点：
(1)本发明上述构建方法直接对样品进行扩增，一次纯化即可完成文库构建，操作简单，易于推广。
(2)本发明构建方法采用双样品标签的融合引物法，通过不同样品标签的组合，可有效降低引物合成数量，显著降低引物合成成本以及引物处理的工作量，并有效降低样品间的数据不均衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明采用双样品标签组合识别多个样品的示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中采用的接头如下：
A接头序列如SEQ ID NO.1所示；
P接头序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1
本实施例为一种检测64份人基因组DNA中10个单核苷酸多态性位点的高通量测序文库构建方法，该构建方法包括如下步骤：
步骤一、根据基因组DNA10个特定单核苷酸多态性位点所在的序列分别设计上游引物F1和下游引物R1，其中，多态性位点、上游引物和下游引物如表1所示；
步骤二、选定16组样品标签(见表2)，其中8组(001-008)作为第一标签添加在每条上游引物F1和A接头中间(如图1所示)，得到上游融合引物；另外8组(101-108)作为第二标签添加在每条下游引物R1和P接头中间，得到下游融合引物；由此可得到每组样品标签的10条融合引物，共计160条；将每组10条融合引物混合得到融合引物混合液，共得到8组上游融合引物混合液和8组下游融合引物混合液；将上、下游融合引物混合液两两组合，可得到64组含不同样品标签组合的混合融合引物；混合融合引物中每对引物浓度为1.8μM；
步骤三、按照体积份数比为混合融合引物0.1份、8ng/μL基因组DNA1.2份、含有Mg2 +，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液2.8份和无核酸酶水6.1份配制多重PCR反应体系；其中，Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为18mM；Mg2+浓度为15mM；dNTPs浓度为0.9mM；Taq酶浓度为1U；
步骤四、将得到的多重PCR反应体系按照95℃1min；95℃30s，55℃30s，68℃1min，共18个循环反应程序进行PCR反应，并将扩增后溶液在10℃下保存，随后，吸取20μL PCR产物到一个1.5mLEP管中，再加入30μL磁珠，吸打混匀,室温下平衡5分钟；将混合物放在磁力架上，移除上清液后，用70％乙醇清洗磁珠两次，加入20μL水洗脱，洗脱液即为构建完成的文库。
表1
表2
| 样品标签编号 | 序列 |
| 001 | CTATCAGGTAAC(SEQ ID NO.3) |
| 002 | CGACAAGCTATC(SEQ ID NO.4) |
| 003 | CGAGACGAGCGC(SEQ ID NO.5) |
| 004 | CGTCGACTTCTC(SEQ ID NO.6) |
| 005 | CTCAATACGCTC(SEQ ID NO.7) |
| 006 | CTGTGCACATAC(SEQ ID NO.8) |
| 007 | TCTAGGCAGGTC(SEQ ID NO.9) |
| 008 | TTAGATTCGGAC(SEQ ID NO.10) |
| 101 | TTCGACAGACGC(SEQ ID NO.11) |
| 102 | ATATGTCGCGAG(SEQ ID NO.12) |
| 103 | CGTATAGACTAG(SEQ ID NO.13) |
| 104 | ACGCCGGAGTAT(SEQ ID NO.14) |
| 105 | GCACGCGTAGTG(SEQ ID NO.15) |
| 106 | CGACTGCTCGAG(SEQ ID NO.16) |
| 107 | TACGATCACGATC(SEQ ID NO.17) |
| 108 | TCAGTGTACGCGA(SEQ ID NO.18) |
实验例1
一种检测64份人基因组DNA中10个单核苷酸多态性位点的高通量测序方法；
(1)样品选取：
选取两份未知分型结果的人基因组DNA样品各64份；
(2)文库构建
采用实施例1和按照现有Thermo Fisher公司提供的连接法文库构建方法分别对选取的两份样品进行测序文库的构建；
(3)高通量DNA测序
采用Ion Torrent PGM(购自Life Technologies)以及配套测序试剂盒进行高通量测序；
(4)数据处理
采用分析软件SeqVision完成，包括数据质控、测序数据归类和分型结果转换三个步骤；
质控参数设置：片段长度≥60碱基；
数据归类参数设置：Barcode Sorting(按样本标签归类)全部样品标签碱基必须吻合，Primer Sorting(按位点引物归类)可允许3个以内碱基错配；
分型结果转换参数：如同样本、同位点的测序结果与某参考序列吻合，则转换为该参考序列对应的SNP分型；
(5)结果分析
由上述结果可知：
上述两种方法构建的文库，位点分型结果完全一致；双样品标签文库构建仅需一步PCR扩增后进行一次纯化即可完成文库的构建，而连接法文库构建则需要两次PCR扩增、一次末端修饰、一次连接接头序列和四次磁珠纯化才能完成文库构建，费时费力、易出错；在进行多样品、多靶标序列的文库构建过程中，双样品标签文库构建的优势更加明显。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京爱普益生物科技有限公司
<120> 一种检测多个样品时测序文库的构建方法及其应用
<130> 2018
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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aagacattag gtggattcat agctg 25
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial(人工序列)
<400> 38
gagtgtcacc gaattcaacg 20
Claims (10)
1.一种检测多个样品时测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、根据基因组DNA序列分别设计上游引物和下游引物；
步骤二、在每条上游引物上添加A接头和第一标签，得到上游融合引物，在每条下游引物上添加P接头和第二标签，得到下游融合引物，并将上游融合引物与下游融合引物混合得到混合融合引物；
步骤三、将混合融合引物、基因组DNA、含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液和无核酸酶水配制成多重PCR反应体系；
步骤四、将得到的多重PCR反应体系进行PCR反应、纯化得到多样品测序文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一标签和第二标签的序列不同，且分别为1-20核苷酸或类核苷酸的随机序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述A接头或P接头选自Ion PGM、IonProton或Ion S5/S5XL测序平台的接头。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，所述添加方法为在上游引物序列的5’端依次添加第一标签序列、A接头序列组成一段长度为46-80碱基的核苷酸序列，在下游引物序列的5’端依次添加第二标签序列、P接头序列组成一段长度为40-80碱基的核苷酸序列，随后，分别合成上游融合引物和下游融合引物。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述混合融合引物中每对引物浓度为0.1-3.0μM。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因组DNA浓度为0.1-100ng/μL。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为5-30mM；Mg2+浓度为1-20mM；dNTPs浓度为0.1-2mM；Taq酶浓度为0.1-5U。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，多重PCR反应体系中各原料的体积份数为：含有Mg2+，dNTPs，Taq酶的Tris-HCl缓冲液2.8-3.2份、混合融合引物0.1-0.3份、基因组DNA0.8-1.2份和无核酸酶水5.5-6.1份。
9.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：93-96℃1min；93-96℃30s，50-63℃30s，68-72℃1min，共10-25个循环；随后，在10℃下保存。
10.权利要求1-9任一所述的构建方法在人基因组单核苷酸多态性检测中的应用。
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