CN109797115A - 一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌GZU05及其应用方法 - Google Patents

Abstract

一株产纳豆激酶和β‑葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌GZU05，该枯草芽孢杆菌的微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌GZU05，拉丁文学名：Bacillus subtilis.GZU05，已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018763。它采集于贵州传统发酵豆制品豆豉。应用方法是将选择的菌株GZU05用固态发酵纳豆培养基培养，发酵纳豆产β‑葡萄糖苷酶和纳豆激酶，得到富含纳豆激酶的豆豉产品。本发明的GZU05可用来高值化转化银杏黄酮苷而且可生产高值的纳豆激酶所生产的纳豆纳豆激酶酶活力高，且感官性能良好，适宜推广应用于生产纳豆激酶。

Description

一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌GZU05及其应 用方法

技术领域

本发明涉及微生物，还涉及酶，进一步来说涉及解淀粉芽孢杆菌，涉及枯草芽孢杆菌的应用方法。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，是一类来源广泛的水解酶类。其特性是可水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶可由酵母，曲霉、木霉、细菌等产生。根据国内外的报道，该酶可广泛用于黄酮类物质的生物转化。

微生物发酵产酶是生物酶来源的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵产酶能够水解银杏黄酮苷成银杏黄酮苷元，使苷元活性明显高于银杏黄酮苷。银杏黄酮是目前已发现的最好的防治心脑血管疾病的药物，当前银杏黄酮主要是从银杏叶中提取的，不过从银杏叶中提前的银杏黄酮主要是以银杏黄酮苷的形式存在，而而银杏黄酮苷的生物活性要显著小于银杏黄酮苷元，由于酶法环境友好选择性高，因此有必要利用β-葡萄糖苷酶把银杏黄酮苷转化为苷元。

目前对于β-葡萄糖苷酶研究成果虽多，但是大多微生物来源于自然界，来源于传统发酵食品中的鲜有报道。此外，传统酶类对底物选择性差，不能使苷元含量最大化，高选择性水解银杏黄酮苷为苷元的报道还很少。伍毅等采用固定商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷，取得了较好结果。但是，利用非商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷还极少报道，由于商业β-葡萄糖苷酶价格昂贵，因此，筛选产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的菌株，为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本就十分重要。

血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶 (Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)和组织型纤溶酶原激活剂(type plasminogenactivator，t-PA)，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶 (Nattokinase，NK)已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。

中国专利数据库中，涉及β-葡萄糖苷酶的专利和申请件很多，例如ZL2014106023384号《一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用》、ZL2015101756557号《高耐受性β-葡萄糖苷酶及其应用》、 2017102790450号《一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法》等；但未见涉及枯草芽孢杆菌GZU05的申请件。

发明内容

本发明旨在提供一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌 GZU05，该菌株对发酵豆豉所产的选择性水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶和高产纳豆激酶对防治心脑血管疾病都具有重要作用。

本发明另一目的是提供将该枯草芽孢杆菌的应用于生产黄酮苷元和生产富含纳豆激酶豆豉的方法。

发明人提供的一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌 GZU05，其微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌GZU05，拉丁文学名： Bacillus subtilis.GZU05，已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018763，保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。

发明人提供的一株枯草芽孢杆菌GZU05是在贵州传统发酵豆制品豆豉里采集的，它具有产选择性水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶和高产纳豆激酶的性能。

发明人提供的将该枯草芽孢杆菌的应用于生产黄酮苷元和生产富含纳豆激酶豆豉的方法，包括以下步骤：

(1)发酵豆制品样品适当稀释，涂布于栀子苷显色平板上用事先配制的栀子苷显色筛选培养基培养，筛选出蓝色菌圈大，且颜色深的菌株，进行划线、分离、纯化，经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用；

(2)利用菌株发酵液转化银杏黄酮，测定β-葡萄糖苷酶酶活力；同时测定纳豆激酶的酶活力，进行纳豆产品的感官评价，挑选出β-葡萄糖苷酶酶、纳豆激酶酶活力高，且综合感官评价最优的纳豆发酵菌株 GZU05；

(3)对菌株GZU05进行形态学分析、生理生化测定、16S rRNA序列分析，确定该菌株属于枯草芽孢杆菌；

(4)枯草芽孢杆菌GZU05用固态发酵纳豆培养基培养，发酵纳豆产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶，发酵48～72h；得到富含纳豆激酶的豆豉产品。

上述方法的第(1)步中，所述栀子苷显色筛选培养基的配方为：银杏叶提取物5、硫酸镁0.5、磷酸二氢钾10、栀子苷0.1、谷氨酸钠 10、硫酸铵2、琼脂20；所述培养温度为37℃，培养时间为36～72h。

上述方法的第(2)步中，所述酶活力的单位是在测定条件下，每 1min水解银杏黄酮苷以葡萄糖计产生1μmol还原糖所需酶量,定义为一个酶活力单位。

上述方法的第(2)步中，所述β-葡萄糖苷酶的测定方法为：取15 ml具塞刻度试管，加入底物1.8mL，50℃下预热3min，加入葡萄糖苷酶酶液0.2mL，于50℃下水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值，测定生成的还原糖含量；所述纳豆激酶酶活力测定方法为：取纳豆激酶固态发酵粗酶液10μL点样于纤维蛋白平板上(四孔为一组平行)，放置10min，移入37℃培养箱，保温16h后取出，用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活；所述富含纳豆激酶的豆豉制品感官评价方法为：发酵完成后采用加权法进行打分，分别从拉丝(粘度)、色泽、气味和体态4个方面进行感官评价。

上一步方法中，所述底物是1％银杏黄酮苷或苦杏仁苷、栀子苷、芦丁、龙胆二糖、麦芽三糖、熊果苷、昆布多糖、海藻糖中的一种。

上述方法的第(4)步中，所述培养基是如下方法制得的：将黄豆清洗干净，剔除霉烂、虫蛀、畸形的黄豆，去除杂质，用去离子水冲洗干净，然后准确称量，加入4倍体积的溶解了1％的食盐和1％的葡萄糖糖的去离子水完全浸没，常温浸泡18～24h，即得。

上述方法的第(4)步中，所述β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷具有高选择性，其水解银杏黄酮苷酶活为4.2U/g，在室温下该酶可存放2～4d， 4℃下可存放7～10d，该酶转化能力保持在45％以上，发酵纳豆所产纳豆激酶酶活超过6000U/g。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：①本发明制备的生物复合酶对底物银杏黄酮转化的加标回收率可达88％，β-葡萄糖苷酶对底物银杏黄酮的转化率可达45％；且发酵方法工艺与原材料简单，降低β-葡萄糖苷酶的生产成本；且酶对环境耐受力较此前文献中报道的β-葡萄糖苷酶显著提高：耐受pH2.8～5.5，耐受温度40℃～70℃；且转化反应可连续进行，适合大规模连续化生产；②本发明的枯草芽孢杆菌GZU05 的β-葡萄糖苷酶酶活为4.022U/g，纳豆激酶酶活力为5786.1±510.9，具有将银杏黄酮苷转化为苷元的的作用。且所生产的纳豆纳豆激酶酶活力高，且感官性能良好，易于被大众接受；③本发明的枯草芽孢杆菌 GZU05，可用来高值化转化银杏黄酮苷而且可生产高值的纳豆激酶，同时提供了一种新的生产β-葡萄糖苷酶、纳豆激酶的培养方法，且安全性高；由于黄豆来源广泛，价格适中，降低β-葡萄糖苷酶、纳豆激酶的生产成本。因此该枯草芽孢杆菌具有很好的应用前景。

附图说明

图1是葡萄糖浓度标准曲线；

图2是尿激酶标准曲线；

图3是菌株GZU05显微镜(100x)观察照；

图4是菌株GZU05的系统发育树图。

具体实施方式

以下实施例用来进一步说明本发明：

实施例1种子液培养基、纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶粗酶液制备

1)配制种子液培养基(g/L):葡萄糖10，酵母提取物5，牛肉膏10，NaCl 5,从斜面上挑取2-3环菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃，180r/min的条件下培养18h。

2)纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶粗酶液制备方法：按质量份比，每升去离子水添加NaCl 10g，葡萄糖10g，加热完全溶解，冷却后干豆：去离子水＝1：4完全浸没浸泡市售非转基因大豆，浸泡时间为18小时。后沥水装入50/250三角瓶灭菌。按2％-4％的接种量接种种子液到冷却好的固态发酵培养基上，37℃培养72h，每12h摇晃一次，形成发酵物。取发酵物，用生理盐水浸提于4℃下浸提24小时，用研钵研磨，然后在4℃，离心力为8000-12000×g的条件下离心12-18min，取上清液，细胞破碎后得β-葡萄糖苷酶、纳豆激酶粗酶液；

实施例2：β-葡萄糖苷酶酶活力的测定：

1)葡萄糖标准曲线绘制：吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2mL， 0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL于具塞刻度试管中，补水至2mL，加DNS 试剂3mL，混合后于沸水中煮10min,冷却后加水定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度；以吸光度为纵坐标、葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y＝0.5841x+0.0044，R²＝0.9991(附图1)；

(2)β-葡萄糖苷酶酶活力的测定：通过DNS法检测菌株β-葡萄糖苷酶酶活力，挑选酶活力较高菌株；取15ml具塞刻度试管加入底物 (1％银杏黄酮苷或苦杏仁苷、栀子苷、芦丁、龙胆二糖、麦芽三糖、熊果苷、昆布多糖、海藻糖中的一种)1.8mL，50℃预热3min，加入酶液 0.2mL，50℃水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值。根据葡萄糖浓度标准曲线回归方程计算样品中β-葡萄糖苷酶酶活。

β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义：在测定条件下，每1min水解银杏黄酮苷产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。

GZU05发酵豆豉所产β-葡萄糖苷酶酶水解银杏黄酮苷的酶活为 3.696U/g，高于水解其它底物的酶活，表现出对银杏黄酮苷的高选择性。

实施例3：纳豆激酶酶活力测定

纳豆激酶酶活力定义：用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活。

尿激酶标准曲线的制作：将尿激酶标准品分别配制为248IU/m L、 496IU/m L、744IU/m L、992IU/m L和1240IU/m L，各取10μL点样于新配制的纤维蛋白原平板孔中(4孔为1组平行)，放置10min，37℃下培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积；以溶解圈的面积(x，mm²)为横坐标，以尿激酶酶活(y，IU/mL)为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。线性回归方程为y＝4.2016x+10.874，R²＝0.9994(附图2)。然后测GZU05发酵纳豆的纳豆激酶活力为6861U/g。

实施例4：紫外分光光度法精密测定纳豆激酶：

紫外分光光度计法是由日本纳豆激酶协会建立的种能准确反应纳豆激酶纤溶活性的测定方法，也是世界公认的纳豆激酶活性测定方法之一。该方法的优点在于能客观得出纳豆激酶纤溶活性含量，且能同时检测多种样品。由于琼脂糖—纤维蛋白原平板法测定值易随培养时间、平板厚度的变化而变化，精确度较差不适合精确度要求高的样品测定。具体方法为：向试管中加入1.4mL Tris-HCl(50mM，pH 7.8)缓冲液和 0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL 凝血酶(20U/mL)，再37℃下温育10min形成人工血栓，加入0.1mL 的待测样品，37℃下温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm 波长处测定吸光度。酶活定义：每1min于275nm处吸光度增加0.01 所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力。按紫外分光光度法精密测定GZU05固态发酵纳豆36h后的纳豆激酶的的纳豆激酶活力达到116FU/g。

实施例5：GZU05菌种固态发酵纳豆感官评价及打分情况

(1)GZU05菌种固态发酵感官评价：发酵后熟后的纳豆采用加权法进行打分，分别从拉丝(粘度)、色泽、气味和性状行态四个方面进行感官评价，每个指标分为五个等级，分别有10位专业人士品评，取平均值，评分标准及得分权重见表1。

表1发酵产品的感官评分标准

(2)固态发酵的纳豆感官评价结果

良好的生产菌株是保证食品发酵的基础，选择感官优良的菌株是后续发酵的先决条件。将GZU05菌株接种以黄豆为主要原料的固体发酵培养基，置于相同的发酵条件下进行培养，发酵结束后，分别记录各菌株发酵产品的拉丝长度、色泽、气味和口感分值，并计算综合评分为4.2。发酵的纳豆颜色为黄色至淡黄色，拨动豆豉有长长拉丝的现象，带有淡淡的香味物质，香味协调、体态均匀，豆豉中纳豆激酶激酶的活力高于 6000U/g(湿黄豆)。

实施例6：菌落形态鉴定、生理生化鉴定及16SrRNA分子生物学鉴定

菌株于筛选培养基平板上培养48h，观察并记录菌落形态、颜色。

革兰氏染色：挑取平板上的菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、媒染、脱色、水洗、番红复染、干燥、镜检。

观察菌株的菌落形态特征，该菌株菌落有明显蓝色菌圈，凸起有褶皱，革兰氏染色后，于光学显微镜油镜下观察细胞形态特征，结果如附图3所示。

对所述枯草芽孢杆菌GZU05进行生理生化特征鉴定，所述枯草芽孢杆菌GZU05生理生化特征—碳源利用如表2所示，所述枯草芽孢杆菌 GZU05生理生化特性—酶活、碳源同化如表3所示。

所述枯草芽孢杆菌GZU05的系统发育树图如4所示。

表2菌株GZU05生理生化特性–利用碳源产酸

注：+：阳性，-：阴性，

表3菌株GZU05生理生化特性–酶活、碳源同化

注：+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

附：枯草芽孢杆菌GZU05的16S rRNA序列：

ATGGCGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGG CGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG GCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCAC TTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATG CGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGT CTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAG AAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTG GCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCC TTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTC AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGT GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATC TGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGC GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAG AGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAAGGGGACCCC

Claims (9)

1.一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶枯草芽孢杆菌GZU05，其特征在于：该枯草芽孢杆菌的微生物学分类命名为枯草芽孢杆菌GZU05，拉丁文学名：Bacillus subtilis. GZU05，已于2018年11月9日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2018763；保藏单位地址是中国武汉，武汉大学，其邮编为430072，电话号码为027-68754952。

2.按照权利要求1所述枯草芽孢杆菌GZU05，其特征在于：它是在贵州传统发酵豆制品豆豉里采集的，它具有产选择性水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶和高产纳豆激酶的性能。

3.将权利要求1所述枯草芽孢杆菌的应用于生产黄酮苷元和生产富含纳豆激酶豆豉的方法，包括以下步骤：

（1)发酵豆制品样品适当稀释，涂布于栀子苷显色平板上用事先配制的栀子苷显色筛选培养基培养，筛选出蓝色菌圈大，且颜色深的菌株，进行划线、分离、纯化，经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用；

（2)利用菌株发酵液转化银杏黄酮，测定β-葡萄糖苷酶酶活力；同时测定纳豆激酶的酶活力，进行纳豆产品的感官评价，挑选出β-葡萄糖苷酶酶、纳豆激酶酶活力高，且综合感官评价最优的纳豆发酵菌株GZU05；

（3）对菌株GZU05进行形态学分析、生理生化测定、16S rRNA序列分析，确定该菌株属于枯草芽孢杆菌；

（4）枯草芽孢杆菌GZU05用固态发酵纳豆培养基培养，发酵纳豆产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶，发酵48～72h；得到富含纳豆激酶的豆豉产品。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法的第（1）步中，所述栀子苷显色筛选培养基的配方为：银杏叶提取物 5、硫酸镁 0.5、磷酸二氢钾 10、栀子苷0.1、谷氨酸钠10、硫酸铵 2、琼脂20；所述培养温度为37℃，培养时间为36～72h。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法的第（2）步中，所述酶活力的单位是在测定条件下，每1min水解银杏黄酮苷以葡萄糖计产生1μmol还原糖所需酶量, 定义为一个酶活力单位。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法的第（2）步中，所述β-葡萄糖苷酶的测定方法为：取15 ml具塞刻度试管，加入底物1.8mL，50℃下预热3min，加入葡萄糖苷酶酶液0.2mL，于50℃下水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值，测定生成的还原糖含量；所述纳豆激酶酶活力测定方法为：取纳豆激酶固态发酵粗酶液10μL点样于纤维蛋白平板上（四孔为一组平行），放置10min，移入37℃培养箱，保温16h后取出，用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活；所述富含纳豆激酶的豆豉制品感官评价方法为：发酵完成后采用加权法进行打分，分别从拉丝（粘度）、色泽、气味和体态4个方面进行感官评价。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述底物是1％银杏黄酮苷或苦杏仁苷、栀子苷、芦丁、龙胆二糖、麦芽三糖、熊果苷、昆布多糖、海藻糖中的一种。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法的第（4）步中，所述培养基是如下方法制得的：将黄豆清洗干净，剔除霉烂、虫蛀、畸形的黄豆，去除杂质，用去离子水冲洗干净，然后准确称量，加入4倍体积的溶解了1％的食盐和 1％的葡萄糖糖的去离子水完全浸没，常温浸泡 18～24 h，即得。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法的第（4）步中，所述β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷具有高选择性，其水解银杏黄酮苷酶活为4.2U/g，在室温下该酶可存放2～4d，4℃下可存放7～10d，该酶转化能力保持在45％以上，发酵纳豆所产纳豆激酶酶活超过6000 U/g。