CN109781985B

CN109781985B - 用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109781985B
Application number: CN201910149480.0A
Authority: CN
Inventors: 刘然义; 岳欣; 王雪涔; 黄文林
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: CN109781985A

Abstract

本发明涉及用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其在疗效预测上的应用，本发明对分子标志物的筛选完全是基于国际研究水平中较为实用和有效的筛选方式——全基因组RNAi文库筛选。鉴定是在体内外基于放疗耐受诱导过程中逐级进行，最终发现RFC4是一个与结直肠癌放疗耐受极为相关的基因。并且，对筛选鉴定出的RFC4基因进行临床回顾性研究分析和体内外功能分析，均发现较高的表达水平能够与肿瘤退缩不良存在正相关性，可以用以预测放疗耐受/敏感程度。基于上述发现，获得一种用于预测局部进展期新辅助放疗疗效的试剂盒，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后效果预测空白的难题，更好地实现精准治疗具有非常重要的现实意义。

Description

用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种能够预测局部进展期直肠癌放疗疗效的方法，具体涉及一种基于结直肠癌放疗耐受基因RFC4而开发得到的应用于治疗前预测放疗敏感性的组合物。

背景技术

近年来我国直肠癌发病率逐年上升，严重威胁人民健康。尤其是中低位局部进展期直肠癌，手术切除难度较大，局部复发风险高，预后较差。目前国内外指南均推荐新辅助放化疗联合手术切除为局部进展期直肠癌的标准治疗模式。

新辅助放化疗能提高肿瘤的局部控制率、手术切除率及保肛率，降低复发率，然而，新辅助治疗给患者带来治疗益处的同时也增加了其治疗的毒副作用，获益人群占比较少，仍有较多问题亟待解决。尤其在放疗领域：个体间临床疗效差异较大，即使接受同等方案及剂量的新辅助放疗仍有约半数肿瘤未获得明显退缩，甚至存在进展的情况；缺乏退缩效果及预后效果预测、毒理评价体系。回答好以上问题，就能更好地实现精准治疗，因此，开发新的肿瘤分子标志物用于局部进展期新辅助放疗疗效的预测具有重要意义。

目前已经发现的与直肠癌放化疗敏感性相关的标志物主要集中于p53、EGFR、TS、Ki-67、p21及Bcl-2/Bax等的研究，EGFR、TS表达高低及SNP多态性可能是目前最有价值的预测术前放化疗效果的标志物之一。令人遗憾的是，尽管大量研究发现一些可能具有潜在预测价值的分子标志，但迄今为止还没有发现真正用于临床辅助诊断、预测直肠癌新辅助放化疗疗效的分子，尤其是专门针对放疗疗效的标志物。

目前，在临床上欠缺关键的肿瘤分子标志物用于检测局部进展期直肠癌放疗的敏感性，暂时没有相应的试剂盒用于检测。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，发明人经过长期研究发现，RFC4是复制因子C(RFC)5个亚基的成员之一，在机制上发明人发现它能够正向促进非同源末端链接的DNA双链断裂损伤修复。因此，RFC4的异常表达能够指示放疗耐受情况，能够应用于诊断预测。

本发明的目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒能够特异性地检测RFC4基因的表达水平高低，作为判断放疗敏感/耐受的关键依据。

本发明的目的之一在于提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：

(1)引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示；

(3)引物对3：上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；

(4)引物对4：上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示；

(5)引物对5：上游引物序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物序列如SEQ ID NO：10所示；

(6)引物对6：上游引物序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物序列如SEQ ID NO：12所示；

(7)引物对7：上游引物序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物序列如SEQ ID NO：14所示；

(8)引物对8：上游引物序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物序列如SEQ ID NO：16所示；

(9)引物对9：上游引物序列如SEQ ID NO：17所示，下游引物序列如SEQ ID NO：18所示；

(10)引物对10：上游引物序列如SEQ ID NO：19所示，下游引物序列如SEQ ID NO：20所示；

(11)引物对11：上游引物序列如SEQ ID NO：21所示，下游引物序列如SEQ ID NO：22所示；

(12)引物对12：上游引物序列如SEQ ID NO：23所示，下游引物序列如SEQ ID NO：24所示；

(13)引物对13：上游引物序列如SEQ ID NO：25所示，下游引物序列如SEQ ID NO：26所示；

(14)引物对14：上游引物序列如SEQ ID NO：27所示，下游引物序列如SEQ ID NO：28所示。

在上下文中，所述引物对组是指用于在PCR中合成RFC4基因cDNA链的PCR引物，用于检测RFC4基因表达水平。

作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自RFC4单克隆抗体和/或RFC4多克隆抗体。

作为优选地，所述RFC4蛋白含量检测试剂选自Invitrogen公司的RFC4单克隆抗体(货号为PA5-21538)、Abcam公司的RFC4单克隆抗体(货号为ab156780)、Abcam公司的RFC4多克隆抗体(货号为ab96852)种的一种或多种。

进一步地，所述试剂盒还包括人正常的直肠组织或细胞的总RNA和总蛋白。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光底物中的一种或多种。

作为优选地，所述荧光底物选自Syber Green或荧光标记的探针。

本发明的目的之二在于提供一种组合物在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的试剂盒及其在疗效预测上的应用，所述组合物包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：

作为优选地，所述癌症为肠癌，最优选为直肠癌和/或结肠癌。

作为优选地，所述肠癌为局部进展期直肠癌。

本发明的目的之三在于提供一种检测RFC4表达水平的试剂在制备用于检测癌症放疗敏感性和/或疗效预测的组合物中的应用。

作为优选地，所述检测RFC4表达水平的试剂包括检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：

作为优选地，所述癌症为肠癌。

作为优选地，所述肠癌为局部进展期直肠癌。

本发明的核心标志物分子RFC4是在细胞水平基于全基因组RNAi文库筛选，在体内外逐级鉴定出来的，本发明发明人阐释清楚了其功能和作用机制。并且，对其作为分子标志物的各项要求逐一进行检验，检测其表达水平的手段和条件均已摸清，最终将其确定为分子诊断因子，在临床上应用于检测。

本发明选择结直肠癌细胞系使用全基因组shRNA文库筛选并逐级鉴定后，选定RFC4作为分子标记物。本发明选择145例局部进展期直肠癌治疗前活检组织，采用免疫组化检测其蛋白表达水平，进一步表明RFC4表达水平与新辅助放化疗肿瘤退缩评级(TumorRegression Grade，TRG)存在明显的相关性；RFC4高表达患者TRG明显偏高，并且与不良预后正相关。本发明排除了RFC4对结直肠癌化疗所产生的影响，直接阐明RFC4是局部进展期直肠癌新辅助放疗的耐受因素，能够指示患者对放疗的敏感程度。

在细胞放疗耐受诱导过程中RFC4的mRNA与蛋白分别均呈现出明显上调趋势，这些结果提示放疗可诱导RFC4基因表达上调，可能进而导致诱发性放疗耐受。

综上，RFC4在患者治疗前活检组织中的表达量(蛋白采用免疫组化表征，mRNA采用RT-qPCR表征)能够明确指示患者对放疗的敏感程度，并且对其肿瘤退缩情况进行有效预测。因此，本发明的试剂盒可以用于放疗疗效预测。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

本发明对分子标志物的筛选完全是基于国际研究水平中较为实用和有效的筛选方式——全基因组RNAi文库筛选。鉴定是在体内外基于放疗耐受诱导过程中逐级进行，最终发现RFC4是一个与结直肠癌放疗耐受极为相关的基因。并且，在结直肠癌分类中，局部进展期直肠癌的标准治疗方式是术前采用同步放化疗(新辅助治疗方式)实现肿瘤退缩，但是受限于现有的分子标志物的预测能力不足，对患者接受术前治疗的疗效无法提前评估，发明人针对于以上难点，对筛选鉴定出的RFC4基因进行临床回顾性研究分析和体内外功能分析，均发现其较高的表达水平与肿瘤退缩不良存在正相关性，可以用以预测放疗耐受/敏感程度。

基于上述发现，获得一种用于预测结直肠癌放疗疗效的试剂盒，其对于解决个体间临床疗效差异与退缩效果/预后效果预测空白的难题，更好地实现精准治疗具有非常重要的现实意义。

附图说明

图1为全基因组shRNA文库在结直肠癌细胞中的筛选流程图。

图2为结直肠癌放疗耐受细胞的构建流程图。

图3为结直肠癌放疗耐受细胞的备选基因在耐受株/敏感株mRNA表达水平。

图4为免疫组化检测145例局部进展期直肠癌患者治疗前活检样本蛋白表达水平。

图5为在细胞水平RFC4促进结直肠癌细胞放疗耐受实验结果。

图6为在裸鼠移植瘤模型中，RFC4促进结直肠癌细胞放疗耐受实验结果。

图7为治疗前活检组织中RFC4表达水平与肿瘤退缩分级相关性情况说明。

图8为Kaplan-Meier无进展生存分析(PFS)RFC4对局部进展期直肠癌预后的影响。

图9为Kaplan-Meier总生存分析(OS)RFC4对局部进展期直肠癌预后的影响。

图10为蛋白免疫印迹表征在细胞放疗过程中RFC4的蛋白水平变化情况。

图11为RFC4在结直肠癌中对化疗药物敏感性的影响。

具体实施方式

下面将结合说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下是本发明中所用到的部分实验材料来源：

结直肠癌细胞株HCT116/HT29/HCT15/SW480购自美国菌种保藏委员会(AmericanType Culture Collection，ATCC)。总RNA提取和保存试剂，实时荧光定量PCR试剂盒SYBRGreen PCR Kit，实验所用RFC4抗体(PA5-21538)均购自美国Invitrogen公司。免疫组织化学实验相关试剂，如辣根过氧化酶标记二抗购自美国Dako公司。本发明中所用到的其他试剂和材料均可商购获得。

对于本发明中所涉及的实验方法，在无特别说明的情况下，均为本领域的的常规方法。

实施例1全基因组shRNA文库在结直肠癌细胞中的筛选过程与放疗耐受细胞的构建

筛选的过程如图1所示，具体为将全基因组shRNA文库(包含75000条shRNA，覆盖约15000个基因)以慢病毒载体的形式转染至结直肠癌细胞系HCT116/HT29中(转染效率，MOI：0.4)，经过嘌呤霉素稳定筛选后，将细胞分为照射处理组和对照组，处理后培养7天，提取DNA及扩增，再经过二代测序分析shRNA拷贝数变化，将两株细胞shRNA拷贝数均明显下调的基因挑选出来作为备选基因。

接下来，如图2所示，将结直肠癌细胞系HCT116经过长程逐级放射诱导后构建耐受放射剂量为6Gy的稳定细胞株，以备进一步的筛选。

实施例2定量PCR检测备选基因在放疗耐受与敏感细胞中的mRNA水平

使用Trizol法提取细胞中总RNA，分别取2μg总RNA逆转录为cDNA。再根据逆转录体系要求进行逆转录反应，获得cDNA。通过查询NCBI的基因数据库，获得RFC4与GAPDH(内参)的cDNA序列，根据序列设计PCR引物如下：

RFC4：

上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，

下游引物序列如SEQ ID NO：2所示。

GAPDH(内参)：

上游引物序列：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，

下游引物序列：AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

Real Time PCR：根据

Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)的使用说明，配制PCR反应液的配方如下表1所示(置于冰上配制)：

表1

再将装有PCR反应液的RNase Free Eppendorf管瞬时高速离心后，按两步法进行PCR扩增反应。

结果如图3所示，在6个候选基因中，RFC4在放疗耐受株中mRNA表达量增加情况最为明显。

实施例3 RFC4在放疗前后蛋白表达水平变化的情况

利用蛋白免疫方法检测细胞水平RFC4蛋白含量变化，主要步骤包括：提取细胞中总蛋白、制备蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE电泳、电转移至PVDF膜以及免疫印迹(一抗用anti-RFC4(PA5-21538)抗体(1∶1000)与anti-β-actin(8H10D10，美国赛信通公司)抗体(1∶1000)孵育)等。

结果如图4所示，随着放射剂量的逐渐加大，RFC4的蛋白水平也随之上调。结合实施例2中的结果，说明RFC4是备选基因中最可信的放疗耐受因子。

实施例4 RFC4在结直肠癌细胞中促进放疗耐受的功能验证

利用平板克隆实验考察RFC4表达水平不同的结直肠癌细胞在各个放射剂量下克隆形成的能力。发明人选择在结直肠癌细胞系构建RFC4过表达的HCT116/HCT15稳定细胞株，在HT29/SW480中构建RFC4敲低表达稳定细胞株，并采用蛋白免疫印迹实验方法验证。放疗后细胞的克隆形成能力使用细胞生存分数曲线表示。

结果如图5所示，在细胞水平RFC4促进结直肠癌细胞放疗耐受，其中图5a-5f表示，分别在结直肠癌细胞系HCT116/HCT15中过表达RFC4基因，结果明显促进耐受；图5g-5i表示，在HT29/SW480中敲低表达RFC4基因，结果明显致敏。其中图5a、5d、5g与5j是细胞株克隆形成的原始结果；图5b、5e、5h与5k分别代表了在4个细胞株中过表达与敲低表达结果的验证(通过蛋白免疫印迹的方法)；图5c、5f、5i与5l则表示对原始结果细胞克隆数的分析，最后使用细胞生存分数曲线表示。

同时，建立裸鼠移植瘤模型放疗评价体系，主要利用构建完成的RFC4过表达的HCT116与空载对照组、RFC4敲低表达的sh1/sh2 HT29细胞与空载对照组在裸鼠中皮下成瘤，瘤块达到一定体积后，将其剥离均分至每组小鼠中(体积为5mm³，6-7只)，当肿瘤体积达到150mm³后对其肿瘤部位按照26y/天，连续7天的照射剂量进行辐照，接受辐照后连续观察测量肿瘤体积，在辐照后4周处死取瘤，拍照，称重，测量体积。

结果如图6所示，如图6a-6c所示，从小鼠瘤块的体积与重量中可以看出，RFC4过表达能够明显促进放疗耐受，如图6d-6f所示，RFC4敲低表达则能够使放疗致敏。其中图6a与6d是瘤块的照片；图6b与6e为肿瘤体积随时间变化曲线；图6c与6f为肿瘤重量统计结果。

综合以上结果，说明RFC4在体内外具备促进结直肠癌放疗耐受的功能，同时具备作为预测结直肠癌放疗耐受/敏感的关键因素。

实施例5临床活检样本收集

选取中山大学肿瘤防治中心2006年9月至2016年9月局部进展期直肠癌治疗前活检样本145例。

对于每个入选病例，患者入选要求为确诊直肠腺癌；距离肛门10cm下肿瘤；术前分期肿瘤浸润突破肠壁肌层(T3)，或与直肠肠壁全层(T4a)，或经直肠腔内超声显示肠周淋巴结受累(N1-2)；既往未接受过放化疗，未接受直肠手术；无肿瘤出血、急慢性感染及肠梗阻等合并症状。

对于所有纳入研究的病例，其临床病理资料均来自于中山大学肿瘤防治中心病案报告，相应的随访资料来自于中心随访科。患者的肿瘤分级均按照UICC/AJCC(第八版)的标准分级。手术病人在术后两年内每三个月随访一次，术后三到四年内每半年随访一次，术后五年及以后每一年随访一次，随访记录患者复发/转移/死亡情况并记录日期。末次随访日期是2018年12月31日。

实施例6 RFC4蛋白含量在局部进展期直肠癌组织治疗前活检标本中的测定

将活检新鲜组织包埋于石蜡封存，石蜡标本室温保存，切取的白片保存于4℃冰箱。实验时取出145例石蜡切片白片，经过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3％H₂O₂溶液去除组织中过氧化物酶、枸橼酸盐溶液微波修复、Invitrogen公司anti-RFC4(PA5-21538)抗体(1∶200)和相应种属二抗孵育、DAB与苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水，二甲苯通透两次后，中性树胶封片。

组织标本的染色评估由100-200×倒置显微镜拍照，整个组织面取5-10个视野/病例。评分方式：把染色的深浅分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性，分别标记为0、1、2、3分。在显微镜下观察组织切片，评定各部分肿瘤组织所占的比例及各自的染色评分，然后进行加权，最终得到评分结果。

结果如图7所示，其中7a与7b分别表示100×和200×镜下阴性染色结果；其中7c与7d分别表示100×和200×镜下弱阳性染色结果；其中7e与7f分别表示100×和200×镜下阳性染色结果；其中7g与7h分别表示100×和200×镜下强染色结果。

实施例7治疗前活检组织中RFC4表达水平与肿瘤退缩分级的相关性说明

在直肠癌患者中，肿瘤退缩分级(Tumor Regression Grade，TRG)是用于评价新辅助治疗后肿瘤反应情况的指标，具体上是通过评价残留的肿瘤细胞数量，并且对以下三大指标逐一进行评分后确定：包括核固缩效应、细胞坏死程度与嗜酸性粒细胞数量等在内的细胞学变化程度；包括纤维化程度与炎细胞浸润与否及程度等在内的基质变化情况；还有巨细胞周围的鬼影细胞及角质的分布情况。肿瘤退缩分级通常被分为四个等级：TRG 0：完全退缩，不存在肿瘤细胞，病理完全缓解；TRG 1：肿瘤中等反应程度，大部分肿瘤退缩，存在小部分和单个肿瘤细胞；TRG 2：肿瘤较小反应程度，仍然存在肿瘤组织，并且伴随纤维化；TRG 4：肿瘤无反应，最少或者无肿瘤被杀灭，甚至出现进展。

将上述145例病例分析其相关性，结果如图8所示，RFC4高水平表达与直肠癌退缩不良存在明显正相关。

实施例8 Kaplan-Meier生存分析局部进展期直肠癌患者预后

根据145例局部进展期直肠癌病例的总生存期数据和无进展生存期数据，利用ROC曲线最高特异性和最强灵敏度的点来确定RFC4的表达临界值(H-score＝6.78)，将RFC4分为高表达和低表达两个等级，然后使用SPSS 20.0软件中的Kaplan-Meier方法对病人预后进行分析。

其中高水平表达是指H-Score评分≥6.78；H-Score指免疫组化染色强度×阳性比率，可用H-Score具体评分值与肿瘤退缩评级(TRG)的划分对应起来，直接预测退缩效果。

如图9所示，肿瘤组织高表达RFC4的病例(H-score≥6.78)其总生存期显著长于肿瘤组织低表达RFC4的病例(H-score＜6.78)，P＝0.035。图10则显示无进展生存期的结果也是一致的，P＝0.006。

实施例9 RFC4对局部进展期直肠癌化疗药物敏感性的影响

局部进展期直肠癌新辅助放化疗一般都是同期进行的，为了进一步验证RFC4是否只对放疗耐受，对化疗无影响。因此，发明人在细胞水平利用细胞增殖实验(CCK-8)与克隆形成实验分别对相关药物敏感性进行评价。

结果如图11所示，RFC4促进使DNA发生双链断裂的药物阿霉素(Dox)与依托泊苷(Eto)化疗药物在结直肠癌细胞中耐受，但不用于结直肠癌治疗，仅为对照之用；同时，RFC4不影响局部进展期直肠癌新辅助治疗中化疗药物(5-氟尿嘧啶，5-Fu；奥沙利铂，Oxa)的疗效，说明RFC4只影响新辅助治疗中的放疗，可以作为独立的预测因子对放疗的疗效进行较为准确的预测。其中，图11a-11d分别对应依托泊苷、阿霉素、奥沙利铂与5-氟尿嘧啶对RFC4过表达与空载体组细胞的增殖与剂量效应曲线；图11e则表示对四种药物对RFC4过表达与空载体组细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)统计结果；图11f是四种药物影响RFC4过表达与空载体组细胞的克隆形成能力的原始图片；图11g则表示对图11f克隆形成数量的统计结果。

本发明选择结直肠癌细胞系使用全基因组shRNA文库筛选并逐级鉴定，实验结果显示：在诱导细胞耐受放射的过程中，发现RFC4的mRNA水平也随着逐渐上调，并且，在放疗耐受细胞株中，检测其表达量大幅度上调。因此，对其治疗前活检组织中RFC4 mRNA表达水平检测可用于判断对放疗的耐受程度。

在选定RFC4作为分子标记物后，本发明进一步选择145例局部进展期直肠癌(均已接受新辅助放化疗)治疗前活检组织，采用免疫组化检测其蛋白表达水平。实验结果显示，RFC4蛋白的表达水平与新辅助治疗后肿瘤退缩的情况相关，具体为高水平表达与肿瘤退缩不良正相关，低水平表达与肿瘤退缩良好正相关，此相关性仅指示放疗因素所致的结果，与化疗无关；RFC4蛋白在肿瘤中高水平表达指示不良预后，低水平表达指示良好预后。因此，RFC4蛋白表达水平可直接用于预测新辅助治疗中长程放疗所致的肿瘤退缩情况，即放疗疗效。此结果进一步表明RFC4高表达水平与肿瘤退缩不良存在明显的相关性，并且与不良预后正相关。本发明排除了RFC4对结直肠癌化疗所产生的影响，直接阐明RFC4是局部进展期直肠癌新辅助放疗的耐受因素，能够指示患者对放疗的敏感程度。

序列表

<110> 中山大学肿瘤防治中心

<120> 用于检测癌症放疗敏感性的试剂盒及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

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ccgctgacca aggatcgag 19

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<213> 人工合成(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

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<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

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<212> DNA

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<212> DNA

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cttcccatct gagcgacttc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

<400> 25

tcgtcctttt tgtatcgcgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

<400> 26

tcatccacac attttgggcg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

<400> 27

gcacgagaag ccaggctaac 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial)

<400> 28

taaaaggcgg acacggcttc 20

Claims

1.一种组合物在制备用于检测直肠癌放疗敏感性和/或放疗疗效预测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述组合物包括：检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：

（1）引物对1：上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

（2）引物对2：上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物序列如SEQ ID NO：4所示；

（3）引物对3：上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；

（4）引物对4：上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示；

（5）引物对5：上游引物序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物序列如SEQ ID NO：10所示；

（6）引物对6：上游引物序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物序列如SEQ ID NO：12所示；

（7）引物对7：上游引物序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物序列如SEQ ID NO：14所示；

（9）引物对8：上游引物序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物序列如SEQ ID NO：16所示；

（9）引物对9：上游引物序列如SEQ ID NO：17所示，下游引物序列如SEQ ID NO：18所示；

（10）引物对10：上游引物序列如SEQ ID NO：19所示，下游引物序列如SEQ ID NO：20所示；

（11）引物对11：上游引物序列如SEQ ID NO：21所示，下游引物序列如SEQ ID NO：22所示；

（12）引物对12：上游引物序列如SEQ ID NO：23所示，下游引物序列如SEQ ID NO：24所示；

（13）引物对13：上游引物序列如SEQ ID NO：25所示，下游引物序列如SEQ ID NO：26所示；

（14）引物对14：上游引物序列如SEQ ID NO：27所示，下游引物序列如SEQ ID NO：28所示；

所述RFC4蛋白含量检测试剂选自RFC4单克隆抗体和/或RFC4多克隆抗体。

2.检测RFC4表达水平的试剂在制备用于检测直肠癌放疗敏感性和/或放疗疗效预测的组合物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述检测RFC4表达水平的试剂包括检测RFC4基因mRNA表达水平的引物对组和/或RFC4蛋白含量检测试剂，所述引物对组选自下列引物对中的至少一对：

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述直肠癌为局部进展期直肠癌。