CN109776678A

CN109776678A - 一种人源化pd-l1单克隆抗体、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109776678A
Application number: CN201910174374.8A
Authority: CN
Inventors: 徐婷; 杨文静; 鲍文英; 叶洪涛; 崔智强; 周伟; 宋玉; 范清林; 宋礼华
Original assignee: ANHUI ANKE BIOTECHNOLOGY (GROUP) Co Ltd
Current assignee: ANHUI ANKE BIOTECHNOLOGY (GROUP) Co Ltd
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2019-05-21

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，特别是涉及一种抗PD‑L1人源化兔单抗。本发明提供了一种新的人源化兔抗PD‑L1单克隆抗体，公布了这种人源化兔单抗的氨基酸序列，相应的表达载体和能够表达该抗体的宿主细胞，以及本发明抗体的生产方法。具体而言，本发明提供的抗PD‑L1单抗是免疫兔后经人源化改造所得，在哺乳动物细胞中具有较高的表达量，能够特异结合于胞外区PD‑L1蛋白，具有明显的抑制配体‑受体结合的能力，阻断PD1与PD‑L1的结合，恢复T细胞的功能。可作为免疫检查点抑制剂，特别是治疗和预防、或诊断PD‑L1相关病例例如肿瘤中的用途。

Description

一种人源化PD-L1单克隆抗体、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种人源化兔PD-L1单克隆抗体、其制备方法和应用。

背景技术

兔是众所周知的，可针对许多抗原产生多种抗体，包括在小鼠中不具有免疫原性的磷酸肽，碳水化合物和免疫原。来自兔的多克隆抗体已被证明在实验室中非常有用。然而，免疫期间的不一致和有限的抗体产生量阻碍其临床应用，直到可以产生兔单克隆抗体。目前，商业化的兔单抗已经发展了两代：第一代是以杂交瘤技术为基础的单抗大规模制备平台；第二代是以噬菌体展示技术为基础的大规模制备平台。但是,第一代兔单抗的发展极大地受到了骨髓瘤细胞系的局限，加之专利的缘故，价格高昂。而第二代兔单抗的出现，巧妙地绕开了骨髓瘤细胞的局限，通过融和噬菌体展示技术、基因工程抗体技术和多种表达和纯化技术，直接筛选有效抗体，成功实现了兔单抗产品的又一次发展。与传统的各种来源的抗体相比，兔单抗至少具备更广泛的抗体谱、免疫球蛋白结构简单、更高特异性和亲和力、易于人源化和优质单抗药的候选应用等多种优势。

众多的RabMAb已广泛应用于生命科学研究的各种应用如IHC、WB、IP和FCM。RabMAb已经被证明是免疫组织化学(IHC)中的优异试剂，并且在检测蛋白质的翻译后修饰，例如磷酸化和活化表现极好。此外，科学家还开发了一些RabMAb，用于检测针对癌症的靶向治疗中的生物标志物。兔单抗在科学研究领域的需求也是与日俱增，所以提供优质的兔单抗产品也显得尤为重要。

更广泛的抗体谱：从抗体开发的经验来看，兔的免疫系统可以产生识别更多独特表位的抗体。众所周知，兔有不同于人类和小鼠的免疫应答机制，当用外界抗原进行免疫时，兔能产生强于人和小鼠的免疫应答反应。人和小鼠通过组合连接重链的多个VH，D和JH基因片段和轻链的多个V(γ)和J(γ)基因片段来产生它们的主要抗体谱系。第二阶段，体细胞超突变引起基因重排而产生的VJ和VDJ进一步丰富抗体谱，增加了抗体亲和力的多样性。虽然兔子的主要抗体谱系产生机制与人和小鼠类似，但是在第二阶段抗体谱系的产生机制中，不但有体细胞超突变过程，额外还有一个基因转换机制，这就进一步丰富了兔子的抗体谱。也正因如此，兔抗甚至可以识别部分鼠抗不能识别的抗原。当你的实验应用中必须使用具有弱免疫原性的抗原时，选择兔抗体系是非常明智的策略。

免疫球蛋白结构更简单：众所周知，免疫球蛋白为五类，它们由其重链类型定义：IgG为Cγ；Cμ用于IgM；Cα用于IgA；IgE为Cε，IgD为Cδ。研究发现，兔免疫球蛋白为四类(不含IgD)。兔血清中最丰富的免疫球蛋白是IgG，血清浓度为5-20mg/ml。与其他动物的IgG不同，兔IgG没有亚类。与小鼠和人IgG相比，兔IgG在N末端和D-E环中倾向于具有较少的氨基酸，并且在重链的可变区具有额外的二硫键，这可能是使得兔单抗稳定性更高的原因。正是由于兔IgG这种更简单的结构和更稳定的性质，才使得抗体药物开发中关键抗体的分子克隆变的更加容易，也使得实验室中的各种应用实验结果更加稳定。

更高亲和力：高亲和力是免疫试验成功的前提，也是衡量一个优质单抗的基础指标。抗体药物的非特异性相互作用会引起副作用，因此高亲和力对于制备一些优质抗体药物非常重要。大多数单抗的解离常数(Kd)在纳摩尔或亚纳米级别，但是兔单抗的在皮摩尔级，具有更高亲和力。兔单抗的高亲和力和高特异性，使得其具有更好的实验应用潜力。兔单抗在IHC应用中的优异表现也验证了我们的观点，简单可靠的兔单抗已经成为部分科学家的“小红人”。

易于人源化：为了降低单抗药物的免疫原性，目前，已经有多种方法可以使抗体中的动物基因含量最小化，最广泛使用的就是CDR移植。该方法的实质就是将适当的CDR编码区段插入人抗体框架，并在框架区内的一些结构上比较关键的残基被突变回到亲本残基，以此来重建原始抗原的亲和力和特异性。CDR移植后90％的序列是人源的，即使如此他也存在一些问题需要解决：第一，我们还很难去预测那些特定残基对抗体的具体作用。因此，需要比较密集的在体外和体内来测试不同人源化后的版本。第二，CDR移植的抗体显示出对其抗原的亲和力降低，需要基于体外的亲和力成熟来恢复人源化抗体中的亲和力。

最近开发了一种新的人源化技术，称之为Mutational Lineage-Guided(MLG)人源化技术，使RabMAb人源化更加容易。MLG人源化在概念上和技术上都与CDR移植方法不同。将来自IgG序列集合的重链和轻链(VH和VL)的可变区的氨基酸序列对齐以形成系统发生树。相关抗体根据其序列的相似性进行分组。谱系相关组中的保守序列代表对IgG的结构和功能至关重要的残基。由于这些可变位置通常来自一个亲代B细胞的一组抗体，所以它们必须已被动物免疫系统有效地检查。因此，这些位置处的氨基酸取代人源化抗体应该是良好耐受的，并不牺牲抗体特异性和亲和力。更重要的是，这些变化不仅在框架区域中发现，而且在CDR中也被发现。因此，MLG人源化可以应用于框架区域和CDR的人源化。由于兔脾淋巴细胞数量众多，通过MLG人源化可以产生足够的有生物活性RabMAb来筛选出性能良好的人源化的RabMAb。

优质单抗药的筛选应用：21世纪初，生物医药发展迅速，单抗药已经占有了生物药的很大比重。我们也期望通过筛选优质单抗和药物靶点，来寻找治愈肿瘤和癌症的潜在药物。在这个方面，兔子同样比小鼠具有优势，因为兔子的脾脏含有比小鼠脾脏多出50倍的淋巴细胞。可以从每个免疫的脾产生数百个抗体库，提供更多数量的识别不同表位的独立单克隆抗体。因此，可以容易地获得一组具有生物活性的RabMAb用于进一步选择抗体药物。RabMAb产生的稳健性提供了更高的成功率，所以RabMAb具有在相对较短的时间内获得最理想的药物潜力。

PD-1/PD-L1信号通路在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1(programmed cell death 1，程序性细胞死亡因子1)主要表达在T细胞等免疫细胞，而PD-1的配体PD-L1主要在许多人类肿瘤组织呈高表达。应用免疫组织化学方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤等多种人类肿瘤组织中检测到PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平与患者的临床及预后紧密相关。

阻断PD-1/PD-L1信号通路可使被抑制的T细胞激活，进而攻击癌细胞。阻断PD-1/PD-L1信号可以促进肿瘤抗原特异性T细胞的增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，进而抑制局部肿瘤生长；PD-L1单抗可上调浸润CD8+T细胞IFN-γ的分泌，表明PD-1/PD-L1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用。另外，PD-L1在体内还可以与B7-1结合。已有研究表明PD-L1/B7-1复合物也是T细胞活化的负信号，二者的结合可以导致T细胞表面活化标记物的表达下降，抑制T细胞增殖等。

目前，业界普遍认为针对PD-L1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性的进展：用于治疗非小细胞性肺癌，肾细胞癌，卵巢癌，黑色素瘤(Homet M.B.,Parisi G.,etal.,Anti-PD1Therapy in Melanoma.Semin Oncol.2015Jun；42(3):466-473)，白血病以及贫血病(Held SA,Heine A,et al.,Advances in immunotherapy of chronic myeloidleukemia CML.Curr Cancer Drμg Targets.2013 Sep；13(7):768-74)。因此，开发新的具有更好的结合效率的抗PD-L1抗体，可以有效地阻断PD-1与PD-L1的结合，使T细胞恢复活力，从而增强免疫应答。目前，多株抗PD-1和PD-L1的抗体已上市，用于多种肿瘤的治疗，如Nivolumab(抗PD-1抗体)、Keytruda(抗PD-L1抗体)等。

罗氏(Roche)公司的Atezolizumab(商品名Tecentriq)的作用靶点为PD-L1，2016年5月19日FDA提前四个月批准其作为二线药物用于治疗一种叫做urothelialcarcinoma的最常见晚期膀胱癌，被认为是最有前途的新一代免疫疗法之一。

阿斯利康(AstraZeneca)针对PD-L1靶点的免疫疗法药物Imfinzi(Durvalumab)，近期在一项非小细胞肺癌(NSCLC)的3期和非小细胞肺癌(NSCLC)的3期临床试验中取得了突破性的进展。研究人员表示，抗PD-L1药物比抗PD-1药物具有更高的选择性，并可能减少肺脏及其他器官的炎症。

本发明以重组人PD-L1胞外区(rhPD-L1)蛋白为抗原，通过SMab筛选制备得到高亲和力的抗PD-L1特异性单克隆抗体，并通过体内外实验验证其高效生物学活性。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种新的氨基酸序列的人源化人PD-L1单克隆抗体，编码该单克隆抗体的核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子，作为药物用于临床上发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

首先构建抗原PD-L1表达载体pcDNA-hPD-L1-His，将重组质粒瞬时转染FreeStyleTM 293细胞，培养五天后将细胞上清通过镍柱进行纯化，得到纯化的蛋白即抗原人PD-L1-His。

制备重组人PD-L1抗原蛋白，选取兔2只(编号6109和6110)，经皮下注射免疫。第一次注射400μg抗原和免疫佐剂，后三次分别注射200μg抗原和免疫佐剂，第五次分别用200μg(编号6109)和400μg(编号6110)抗原和免疫佐剂，共免疫5次，免疫周期约3个月。免疫结束后取兔血清，利用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测免疫后血清阻断PD1/PD-L1的活性。选取6110号兔，利用SMab进行筛选。最终在1613个克隆中，有270个表达量>100ng/ml的ELISA阳性克隆，再对这些克隆进行阻断检测，得到13个具有潜在PDL1抑制活性的克隆。选取3个具有PD-L1/PD1阻断活性和1个具有结合活性的候选克隆，抽提总RNA，利用抗体亚型(Isotype)特异性引物或者通用引物进行反转录PCR，分别扩增抗体轻链可变区VL和重链可变区VH基因，随后连接至克隆载体进行DNA测序分析，4个克隆全部获得完整VL和VH的DNA和氨基酸序列。

选取1个特性较优且具有PD-L1抑制活性的克隆用于下游人源化改造。使用“CDR移植”技术对较优克隆的抗PD-L1兔单抗进行人源化改造。分别将轻链可变区VL和重链可变区VH基因的兔源框架区氨基酸序列替代为人源框架区氨基酸序列，保留了各3个CDR区氨基酸序列，并针对一些可能影响抗体理化性质的氨基酸设计回复突变。针对VL基因设计5个人源化氨基酸序列，针对VH基因设计3个人源化氨基酸序列，将VL和VH组合共产生15个突变体用于后续重组抗体表达质粒构建。

将得到的抗体构建为全长IgG分子，完成亲和力，细胞活性，以及动物体内活性等一系列测定，再对这些抗体可变区特别是CDR序列检索，确定具备抑制肿瘤细胞增殖作用的抗PD-L1的单克隆抗体的重链可变区CDR序列和轻链可变区CDR序列。

上述技术方案产生的有益效果在于：本发明提供的上述单克隆抗体，其用作抗PD-L1的抗体。该抗体可用于增强T细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答和用于治疗T细胞功能失调性病症，例如肿瘤免疫，和用于治疗癌症的用途。所述的PD-L1人源化兔单抗单克隆抗体，具有低免疫原性的特点，且能够特异性结合多种肿瘤细胞表面表达的PD-L1，恢复T细胞的功能，促进T细胞的增殖、活化和相关细胞因子(如IL-2和IFN-γ)的分泌，从而增强免疫应答，用于多种肿瘤的治疗。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测PD-L1基因。其中，泳道1为1kb DNA ladder，泳道2为引物扩增后的PD-L1基因，与预期的345bp大小位置一致。

图2为SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测PD-L1蛋白的纯度。其中，泳道1为蛋白Ladder，泳道2为还原性PD-L1蛋白(+DTT)。泳道3为非还原性PD-L1蛋白(－DTT)，结果表明纯化后的PD-L1蛋白纯度较高，且以单体的形式存在。

图3为ELISA测定编号6109和6110的兔血清的阻断活性。ELISA结果表明，编号6110的兔血清具有较优的PD-1/PD-L1阻断活性，选取6110号兔的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。

图4为ELISA测定候选兔单抗的结合活性。ELISA结果表明，PD-L1兔单抗可以与重组人源PD-L1(rhPD-L1)特异性抗原结合。

图5为ELISA测定候选兔单抗的阻断活性。ELISA结果表明，PD-L1兔单抗可以阻断重组人源PD-L1(rhPD-L1)与hPD1-mFc的结合。

图6为ELISA测定PD-L1人源化兔单抗的结合活性。ELISA结果表明，PD-L1人源化兔单抗可以与重组人源PD-L1(rhPD-L1)特异性抗原结合。

图7为ELISA测定PD-L1人源化兔单抗的阻断活性。ELISA结果表明，PD-L1人源化兔单抗可以阻断重组人源PD-L1(rhPD-L1)与hPD1-mFc的结合。

图8为ELISA测定PD-L1人源化兔单抗与hPD-L2和mPD-L1的交叉反应。ELISA结果表明，PD-L1人源化兔单抗能识别hPD-L1，但不与hPD-L2和m-PD-L1结合。

图9为FACS测定PD-L1人源化兔单抗的结合活性。流式检测的结果表明，PD-L1人源化兔单抗能够识别细胞表面的PD-L1蛋白，且呈现出浓度梯度依赖特性。

图10为FACS测定PD-L1人源化兔单抗的阻断活性。流式检测的结果表明，PD-L1人源化兔单抗能够阻断细胞表面的PD-L1蛋白与hPD-1-mFc的结合，且呈现出浓度梯度依赖特性。

图11为SPR测定PD-L1人源化兔单抗的结合动力学常数，测得的其KD(M)值约为7.197e-10。

图12为PD-L1单抗阻断CHO-PD-L1-TCR/Jurkat-PD-1-NFAT细胞的结合；结果表明，PD-L1人源化兔单抗可阻断CHO-PD-L1-TCR/Jurkat-PD-1-NFAT细胞PD-L1与PD-1的结合，且半数有效浓度分别为0.19μg/ml。

图13为MLR测定PD-L1单抗对T细胞的活化结果，其中13(a)为PD-L1单抗对IFN-γ的水平的影响，13(b)为PD-L1单抗对IL-2的水平的影响。

图14为PD-L1抗体对体内移植瘤作用；其中14(a)为PD-L1抗体对小鼠体重的影响，14(b)为PD-L1抗体对肿瘤体积大小的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

器材与试剂：

一、器材：

NI-NTA树脂：购自QiagenGE公司，货号30210；

超滤离心管：购自Millipore公司，规格3KD；

酶标仪：购自BIOTEK公司，型号为ELX800；

流式仪：购自Beckman公司，型号为CytoFLEX；

CO2生化培养箱；购自Thermo公司，型号为HERAcell 240i；

CountStar细胞计数仪：购自上海睿珏生物科技公司，型号为IC 1000；

涡旋仪：购自上海沪西分析仪器厂有限公司，型号为WH-2；

倒置显微镜：购自宁波舜宇仪器有限公司，型号为XD；

超净台工作台：购自苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-2F；

离心机：购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号为L535-1；

二、试剂：

Prime STAR HS DNA Polymerase：购自Takara，货号R010A；

FD BamH I:购自Thermo公司，货号FD0054；

FD Xho I：购自Thermo公司，货号FD0694；

T4DNA Ligase：购自Thermo公司，货号EL0011；

ExpiFectamine：购自Invitrogen公司，货号A14524；

pCDNA3.1+：购自Invitrogen公司；

鼠源anti-His一抗：购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号66005-1-Ig；

羊抗人HRP二抗：购自Pierce公司，货号31413；

羊抗鼠FITC二抗：购自Jackson公司，货号115-095-166；

rhPD-L2抗原：购自Acro公司，货号PD2-H5220；

mPD-L1抗原：购自Acro公司，货号PD1-M5220；

rhPD-L1抗原：自研；

rhPD1-mFc抗原：自研；

Bio-rhPD-L1-AVI-His抗原：自研；

OPD：中文名邻苯二胺，购自Sigma公司，货号P8412；

H2SO4：购自国药集团，规格500ml；

CHO-rPD-L1细胞：自主构建；

CHO-PDLI-TCR细胞：购自BPS公司；

Jurkat-PD1-NFAT细胞：购自BPS公司；

T细胞：从健康人血中分离而得；

DC细胞：从健康人血中分离CD14+细胞并刺激分化而得；

山羊血清：购自博士的博士德生物公司，货号AR0009；

生物素：购自Genecopoeia公司，货号BIRA500；

TPBS(100ml)：0.1mlTween20+99.9mlPBS；

FACS buffer(100ml)：99mlPBS+1mlBSA；

OptiMEM：购自Thermo公司，货号22600-134；

DMEM培养基：购自Sigma公司，货号D6429；

PBS缓冲液；购自Hyclone公司，货号SH30256.01；

胰酶：购自Hyclone公司，货号SH30042.01；

Penicillin-Streptomycin：购自Hyclone公司，货号SV30010；

实施例1:PD-L1抗原的表达与纯化

1.1合成PD-L1基因

NCBI数据库检索PD-L1的基因序列(GenBank Accession:AY714881.1)，分析其核苷酸序列，针对核苷酸序列进行去相关酶切位点或减少茎环结构等改造，委托通用生物系统(安徽)有限公司全基因合成抗人PD-L1全长基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

1.2克隆PD-L1基因

1.2.1PCR扩增BamH I-PD-L1-XhoI

设计PD-L1基因的上下游引物P1和P2：

P1：AATGGATCCACTGGTGACGCATTTACTGTCACGGTTCC(下划线为BamH I酶切位点)

P2:AATCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCTCCTCCATTGACTTTCACAGTAATTCGCTTGT(下划线为XhoI酶切位点)

以合成的含有PD-L1基因的质粒(P-PD-L1)为模板，使用Prime STAR HS聚合酶(Takara公司)，PCR扩增得到PD-L1基因片段。其扩增体系，具体如下：

PCR反应程序，具体如下：

1.2.2双酶切

BamH I/XhoI酶切载体pCD-cAVI-HIS(改造自pCDNA3.1+)与目的片段BamH I-PD-L1-XhoI，酶切产物经DNA胶回收后用于连接转化。酶切体系如下：

1.2.3连接转化与测序

取3μl酶连产物，转化入DH-5a感受态细胞，涂布氨苄板后挑克隆送测序，即获得真核表达质粒pCD-PD-L1-AVI-His，测序鉴定载体序列正确。

1.3抗原PD-L1蛋白表达与纯化

1.3.1PD-L1的表达与鉴定

向24孔培养板中接种Expi293细胞，接种密度2.5～3×10⁶cells/ml，接种量1ml/孔，转染时细胞活率大于90％。将1μg DNA(pCD-PD-L1-AVI-His)稀释于50μl OptiMEM，轻轻浑匀，再将2.7μl稀释于50μl OptiMEM中，轻轻浑匀，室温孵育5分钟后将所得DNA稀释液和所得ExpiFectamine稀释液混合，轻轻浑匀，室温孵育20分钟，将所得DNA--ExpiFectamine复合物(总体积约100μl)加入培养孔板中，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱继续培养16h，按照5μl/ml的添加比例加入转染Enhancer1，50μl/ml的添加比例加入转染Enhancer2，1μl/ml的添加比例加入抗生素，轻轻混匀，继续培养4天，或细胞活率低于50％时，收集全部细胞离心。

用鼠源anti-His作为一抗，通过免疫印迹法检测Expi293细胞转染的pCD-PD-L1-AVI-His的表达，结果如附图1所示。其中，泳道1为1kb DNA ladder，泳道2为引物扩增后的PD-L1基因，与预期的345bp大小位置一致。在确认PD-L1抗原表达后，扩大转染体系至30ml(操作同上)。

1.3.2PD-L1蛋白的纯化与纯度鉴定

收集培养基上清液，用Ni-NTA树脂纯化PD-L1-AVI-His，随后用截留分子量为3kDa的超滤离心管超滤浓缩PD-L1-AVI-His，经SDS-PAGE验证其纯度，结果如附图2所示：其中，泳道1为蛋白Ladder，泳道2为还原性PD-L1蛋白(+DTT)。泳道3为非还原性PD-L1蛋白(－DTT)。附图2表明：纯化后的PD-L1蛋白纯度较高，且是单体。

实施例2:人源化PD-L1兔单抗的产生

3.1PD-L1兔单抗的产生

制备重组人PD-L1抗原蛋白，选取兔2只(编号6109和6110)，经皮下注射免疫。第一次注射400μg抗原和免疫佐剂，后三次分别注射200μg抗原和免疫佐剂，第五次分别用200μg(编号6109)和400μg(编号6110)抗原和免疫佐剂，共免疫5次，免疫周期约3个月。

免疫结束后取兔血清，利用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测免疫后血清阻断PD1/PD-L1的活性。选取6110号兔，利用SMab平台进行筛选。最终在1613个克隆中，有270个表达量>100ng/ml的ELISA阳性克隆，再对这些克隆进行阻断检测，得到13个具有潜在PDL1抑制活性的克隆。

选取3个具有PD-L1/PD1阻断活性和1个具有结合活性的候选克隆，抽提总RNA，利用抗体亚型(Isotype)特异性引物或者通用引物进行反转录PCR，分别扩增抗体轻链可变区VL和重链可变区VH基因，随后连接至克隆载体进行DNA测序分析，4个克隆全部获得完整VL和VH的DNA和氨基酸序列。

3.2PD-L1兔单抗的人源化改造

选取1个特性较优且具有PD-L1抑制活性的克隆(编号103)用于下游人源化改造。通过对现有的人源化抗体的框架区序列的分析，尤其是已经处于临床研究的抗体，先确定轻重链框架区的氨基酸，然后将103号克隆轻重链的CDR区氨基酸拼接入待定的框架区，即形成人源化兔单抗前体轻重链：Hr-103-VL和Hr-103-VH。根据轻重链的氨基酸序列，优化编码其的核苷酸序列(参考http://sg.idtdna.com/CodonOpt)，如尽可能避免常用的酶切位点、避免连续的高GC位点、避免哺乳动物细胞偏好性低的密码子位点，优化潜在的内含子剪切序列，优化其mRNA潜在的茎环结构等等。

基因合成优化好的Hr-103-VL和Hr-103-VH核苷酸序列。设计引物并针对一些可能影响抗体理化性质的氨基酸(包含CDR区和框架区)设计回复突变。针对轻链Hr-103-VL基因设计5个人源化氨基酸序列(Hr-103-VL-53/531/532/532K/541)，针对重链Hr-103-VH基因设计3个人源化氨基酸序列(Hr-103-VH-233/2331/2332)，轻重链引物序列见表1和表2，将VL和VH组合共产生15个突变体，即为人源化PD-L1兔单抗候选克隆，用于后续重组抗体表达质粒构建。

表1：轻链引物序列

引物名	引物序列
		L53-F	:ATTGGATCCACTGGTGACATCCAGATG
L531-R	TGTTAGAGTACACGCTCTGGCTGGACCGGCAAGTGATGG
		L531-F	ATCACTTGCCGGTCCAGCCAGAGCGTGTACTCTAACAAT
L532-R	TGATGGCACTCCGGATTCGAGGGAGCTGGCCTTATAGATCAGGAGCTT
		L532-F	CTCCTGATCTATAAGGCCAGCTCCCTCGAATCCGGAGTGCCATCAAG
L53-R	AATGGTACCCTGACCGAAGGTGTACAG
		L532K-R	TGATGGCACTCCGGATTCGAGGGAGCTGGCCCAATAGATCAGGAGCTT
L532K-F	CTCCTGATCTATTGGGCCAGCTCCCTCGAATCCGGAGTGCCATCAAG
		L541-R	TGATGGCACTCCGGATTCGAGGGTGCTGGTCCAATAGATCAGGAGCTT
L541-F	CTCCTGATCTATTGGACCAGCACCCTCGAATCCGGAGTGCCATCAAG

表2：重链引物序列

引物名	引物序列
		H233-F	ATTGGATCCACTGGTGACGTGCAGCTT
H2331-R	TCATAGGAGCTCAGGGAGAAGCCAGACACGGTAC
		H2331-F	ACCGTGTCTGGCTTCTCCCTGAGCTCCTATGAC
H233-R	AATGGTACCCTGTCCCCACAG
		H2332-R	AATGGTACCCTGTCCCCACAGGTTGGTGGCAGCGCCATTGGGCCTGTCT

实施例3:ELISA测定兔血清的阻断活性

rhPD1-mFc抗原稀释至1μg/mL，4℃铺板过夜，TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入编号6109和6110的兔血清(以纯血清为其实浓度做3倍梯度稀释)及生物素标记的PD-L1，PD-L1抗体从起始浓度8μg/mL做3倍梯度稀释100μl/孔，依次稀释八个浓度梯度，生物素标记的PD-L1的浓度为50ng/mL。室温震荡孵育1h，TPBS洗3次后加入羊抗人HRP二抗，室温震荡孵育30min。TPBS洗3次，加入OPD显色，用H₂SO₄终止。

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图3所示。附图3表明：编号6110的兔血清具有较优的PD-1/PD-L1阻断活性。

实施例4:ELISA测定PD-L1兔单抗的结合活性

rhPD-L1抗原稀释至0.2μg/mL，4℃铺板过夜，TPBS(PBS+0.5％Tween-20)洗涤3次，37℃培养箱封闭1h。封闭后再用TPBS洗3次，然后加入PD-L1兔单抗，从起始浓度1μg/mL做3倍梯度稀释100μl/孔，依次稀释八个浓度梯度。室温震荡孵育1h，TPBS洗3次后加入羊抗人HRP二抗，室温震荡孵育30min。TPBS洗3次，加入OPD显色，并用H₂SO₄终止。

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图4所示。附图4表明：PD-L1兔单抗可以与重组人源PD-L1(rhPD-L1)抗原特异性结合。

实施例5:ELISA测定PD-L1兔单抗的阻断活性

rhPD1-mFc抗原稀释至1μg/mL，4℃铺板过夜，TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入PD-L1抗体及生物素标记的PD-L1，PD-L1抗体从起始浓度8μg/mL做3倍梯度稀释100μl/孔，依次稀释八个浓度梯度，生物素标记的PD-L1的浓度为50ng/mL。室温震荡孵育1h，TPBS洗3次后加入羊抗人HRP二抗，室温震荡孵育30min。TPBS洗3次，加入OPD显色，用H₂SO₄终止。

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图5所示。附图5表明：PD-L1兔单抗可以阻断重组人源PD-L1(rhPD-L1)与hPD1-mFc的结合。

实施例6:ELISA测定PD-L1人源化兔单抗的结合活性

rhPD-L1抗原稀释至0.2μg/mL，4℃铺板过夜，TPBS(PBS+0.5％Tween-20)洗涤3次，37℃培养箱封闭1h。封闭后再用TPBS洗3次，然后加入PD-L1人源化兔单抗，从起始浓度1μg/mL做3倍梯度稀释100μl/孔，依次稀释八个浓度梯度。室温震荡孵育1h，TPBS洗3次后加入羊抗人HRP二抗，室温震荡孵育30min。TPBS洗3次，加入OPD显色，并用H₂SO₄终止。

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图6所示。附图6表明：PD-L1人源化兔单抗可以与重组人源PD-L1(rhPD-L1)抗原特异性结合。

实施例7:ELISA测定PD-L1人源化兔单抗的阻断活性

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图7所示。附图7表明：PD-L1人源化兔单抗可以阻断重组人源PD-L1(rhPD-L1)与hPD1-mFc的结合。

实施例8:ELISA测定PD-L1人源化兔单抗与mPD-L1和hPD-L2的交叉反应

rhPD-L1，mPD-L1和hPD-L2抗原分别用PBS稀释至0.2μg/mL，4℃铺板过夜，TPBS洗涤3次，37℃烘箱封闭1h，TPBS洗3次后加入PD-L1人源化兔单抗，从起始浓度200μg/mL做5倍梯度稀释100μl/孔，依次稀释八个浓度梯度。室温震荡孵育1h，TPBS洗3次后加入羊抗人HRP二抗，室温震荡孵育30min。TPBS洗3次，加入OPD显色，用H₂SO₄终止。

酶标仪测定OD490mm吸光值，结果如附图8所示。附图8表明：PD-L1人源化兔单抗能识别hPD-L1，但不与hPD-L2和m-PD-L1结合。

实施例9:FACS测定PD-L1人源化兔单抗的结合活性

用胰酶消化CHO-rPD-L1细胞，细胞计数后均分成5管，每管约2-8*10⁵个细胞，1000rpmx5min离心弃培养基后，每管加入200 l FACS buffer，5μl正常山羊血清，冰浴封闭30min。用1ml FACS buffe清洗细胞一次后加入100μl FACS buffer和从10μg/mL做10倍梯度稀释的PD-L1人源化兔单抗(即10，1，0.1，0.01μg/mL)，冰浴30min后洗2次，再加入羊抗人FITC二抗(1:200)，避光冰浴30min后洗2次，加入400μl FACS buffer重悬，上BeckmanCytoFLEX流式机检测。

流式检测结果如附图9所示。附图9表明，PD-L1人源化兔单抗能够识别细胞表面的PD-L1蛋白，且呈现出浓度梯度依赖特性。

实施例10：FACS测定PD-L1人源化兔单抗的阻断活性

用胰酶消化CHO-rPD-L1细胞，细胞计数后均分成6管，每管约2-8*10⁵个细胞，1000rpmx5min离心弃培养基后每管加入200μlFACS buffer，5l正常山羊血清，冰浴封闭30min。用1ml FACS buffe清洗细胞一次后加入100μl FACS buffer和从10μg/mL做10倍梯度稀释的PD-L1人源化兔单抗(共四个浓度梯度，即10，1，0.1，0.01μg/mL)以及0.5μg/ml的hPD1-mFc，冰浴60min后洗2次，再加入羊抗鼠FITC二抗(1:200)，避光冰浴30min后洗2次，加入400μl FACS buffer重悬，上BeckmanCytoFLEX流式机检测。

流式检测的结果如附图10所示。附图10表明，PD-L1人源化兔单抗能够阻断细胞表面的PD-L1蛋白与hPD-1-mFc的结合，且呈现出浓度梯度依赖特性。

实施例11：SPR测定PD-L1人源化兔单抗与PD-L1的结合动力学常数

将放入SA芯片放入GE T200芯片槽，用PBS作流动相，Prime两次，用PBS稀释生物素标记的Bio-rhPD-L1-AVI-His抗原至50ng/ml标记通道2，留通道1做空白对照。当2通道的RU值30～40时，停止标记。然后将用PBS稀释PD-L1单抗至10μg/ml，做2倍浓度梯度稀释，共6个浓度梯度。设定程序，确定结合2分钟，解离10分钟，再生1分钟。

测定结果如附图11所示。附图11表明：KD(M)值约为7.197×10^-10。

实施例12：PD-L1抗体阻断CHO/Jurkat细胞的结合测试

取对数生长期的CHO-PDLI-TCR细胞，胰酶消化后用F12+10％FBS+1％PS培养基重悬细胞使细胞浓度达到5ⅹ10⁵cells/ml。在96孔板中加入100μl细胞混悬液，每个浓度3个复孔，细胞浓度50000cells/well,并在黑色康宁96孔板四周加入100μl PBS缓冲液，CO₂培养箱培养16-24h。用1640+10％FBS培养基稀释抗体终浓度为100μg/ml，再做3倍梯度稀释，共9个梯度。准备Jurkat-PD1-NFAT细胞，用理论Buffer混悬使细胞浓度达到6.25ⅹ10⁵cells/ml。弃去96孔板中全部CHO-PDLI-TCR培养上清，加入PD-L1单抗稀释液40μl每孔并室温孵育20min后，黑色康宁96孔板中加入40μlJurkat-PD1-NFAT，细胞浓度25000cells/孔，96孔板周围加入80μl的PBS，随后放入CO2培养箱中培养6h后每孔加入80μl已经达到室温的Promega Bio-GloTM luciferase Assary System，并放置在室温用振荡器震荡10min后上机检测。

测试结果如附图12所示。附图12表明：人源性PD-L1单抗可阻断CHO-PD-L1-TCR/Jurkat-PD-1-NFAT细胞PD-L1与PD-1的结合，且半数有效浓度分别为0.19μg/ml。

实施例13：MLR反应测定PD-L1人源化兔单抗对T淋巴细胞的活化

Ficoll离心法分离PBMC后，利用磁珠法(CD14beads，Mitenyi Biotec)分离CD14细胞，刺激培养分化成DC细胞，在DC细胞培养的第7天，抽健康志愿者20ml血分离PBMC，再分离CD4+T细胞，重悬于1640完全培养基(含有50uM bta巯基乙醇)，调整细胞密度至2x106/ml。收集DC细胞，重悬于1640完全培养基，细胞计数，调整DC细胞密度至2x105/ml。合并T细胞和DC细胞，传96孔平底细胞培养板，每孔加入100μl(相当于1x10⁵CD4+T细胞和1x10⁴DC细胞。配制不同浓度的测试或对照抗体(实验组加入40，4，0.4μg/ml的PD-L1抗体，阴性对照组加入40μg/ml的赫赛汀单抗，阴性对照组加入30nM PMA+3uM Ionomycin)，体积100μl，每个抗体浓度做3平行。培养3天，收集100μl细胞上清，离心500g x10分钟，取上清立即使用或者保存于-80C冰箱，Human IFN-γFlex Set和Human IL-2Flex Set(BD公司)试剂盒检测INF-γ和IL-2表达。

活化结果如附图13所示。其中13(a)为PD-L1单抗对IFN-γ的水平的影响，13(b)为PD-L1单抗对IL-2的水平的影响。T细胞和树突细胞混合培养体系中加入赫赛汀不会导致IFN-γ和IL-2明显释放，但是在培养的T细胞中加入PMA和Ionomycin能够明显促进IFN-γ和IL-2的释放。在0.4-40μg/mL浓度范围内，PD-L1人源化兔单抗抗体对IFN-γ和IL-2的表达具有明显的促进作用，且作用效果具有显著地浓度依赖性。

实施例14：PD-L1抗体对NSG小鼠异种移植瘤模型的治疗作用

流式细胞仪测HCC827细胞表面PD-L1高表达。外周血单个核细胞获取：无菌条件下收取健康人血100ml于肝素钠抗凝管颠倒混匀后，加入Ficoll淋巴细胞分离液再缓缓向内加入血液使体积为1：1混合，垂直静止1min，轻拿离心管置于Backman温控离心机离心，离心管由上至下分为4层：轻轻吸取第二层乳白色细胞，用PBS洗涤次，弃上清，离心，再洗涤，重复3次后细胞计数。细胞接种：将0.1ml 5ⅹ10⁶个HCC827细胞皮下接种于每只小鼠的右后背，在细胞接种7天后0.1ml 5ⅹ10⁶-1ⅹ10⁷个外周血单个核细胞尾静脉接种于小鼠体内，同时开始给药PD-L1抗体10μl/g,浓度为1mg/ml，一周两次给药并称重量瘤。

PD-L1抗体对体内移植瘤作用如附图14所示。其中14(a)为PD-L1抗体对肿瘤体积大小的影响，14(b)为PD-L1抗体对小鼠体重的影响。

序列表

<110> 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司

<120> 一种人源化PD-L1单克隆抗体、其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Gln Gln Ser Gln Asn Val Tyr Ser Xaa Asn Arg Leu Ser Xaa Asn Asp

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Trp Thr Ser Xaa Leu Ala Ser Xaa Thr Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Ala Gly Gly Tyr Ser Gly Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Val Leu Xaa Thr Asn

1 5 10 15

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Tyr Xaa Ile Phe Xaa Asp Ser Xaa Ser Asn

1 5 10 15

Xaa Ser Asp

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Val Tyr Xaa Ser Asp Xaa Arg Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Asp Arg Pro Asp Gly Xaa Xaa Thr Asn Leu Xaa Ala Thr Xaa Ala Thr

1 5 10 15

<210> 7

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gcatttactg tcacggttcc caaggaccta tatgtggtag agtatggtag caatatgaca 60

attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa ttagacctgg ctgcactaat tgtctattgg 120

gaaatggagg ataagaacat tattcaattt gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag 180

catagtagct acagacagag ggcccggctg ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct 240

gcacttcaga tcacagatgt gaaattgcag gatgcagggg tgtaccgctg catgatcagc 300

tatggtggtg ccgactacaa gcgaattact gtgaaagtca atgccccata caacaaaatc 360

aaccaaagaa ttttggttgt cgatccagtc acctctgaac atgaactgac atgtcaggct 420

gagggctacc ccaaggccga agtcatctgg acaagcagtg accatcaagt cctgagtggt 480

aagaccacca ccaccaattc caagagagag gagaagctgt tcaatgtgac cagcacactg 540

agaatcaaca caacaactaa tgagattttc tactgcactt ttaggagatt agatcctgag 600

gaaaaccata cagctgaatt ggtcatccca gaacta 636

<210> 8

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

50 55 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

85 90 95

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

100 105 110

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

145 150 155 160

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

165 170 175

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

180 185 190

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

195 200 205

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220

Gly Lys

225

Claims

1.人源化PD-L1单克隆抗体，所述抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式或IgG4形式的抗体或抗原结合片段，为人源化兔的单克隆抗体，其特征在于：包含轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3和重链HCDR1、HCDR2、HCDR3；

所述LCDR1序列是QQSQNVYSX1NRLS(SEQ ID NO：7)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

所述LCDR2序列是WTSX2LAS(SEQ ID NO：8)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

所述LCDR3序列是AGGYSGNX3YX4(SEQ ID NO：9)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

所述HCDR1序列是GX5X6LX7X8Y(SEQ ID NO：10)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

所述HCDR2序列是SYX9X10X11(SEQ ID NO：11)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

所述HCDR3序列是DRPDGX12X13TNL(SEQ ID NO：12)或与其具有至少80％序列同一性的同源序列；

其中X1是N或D；X2是T或F；X3是V或L；X4是T或N；X5是I或F；X6是D或S；X7是S或N；X8是S或D；X9是V或Y，X10是S或D；X11是R或T；X12是A或T；X13是A或T。

2.一种如权利要求1所述的人源化PD-L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备PD-L1抗原：构建含有PD-L1-ECD序列(GenBank Accession:AY714881.1)的真核表达的载体pCD-PD-L1-AVI-His，瞬转Expi293细胞后收集上清，Ni-NTA亲和树脂纯化得到PD-L1蛋白；

(2)兔单抗的产生：制备重组人PD-L1抗原蛋白，选取兔2只，经皮下注射免疫，免疫结束后取兔血清，利用ELISA检测免疫后血清阻断PD1/PD-L1的活性，选取阻断活性高的兔，利用SMab平台进行筛选，最终得到13个具有潜在PD-L1抑制活性的克隆，择优选取了3个具有阻断活性的候选克隆，扩增其抗体轻链可变区VL和重链可变区VH基因，连接至克隆载体进行DNA测序分析，3个克隆全部获得完整VL和VH的DNA和氨基酸序列；

(3)兔抗人源化改造：选取1个特性较优且具有PD-L1抑制活性的克隆用于下游人源化改造，使用“CDR移植”技术对较优克隆的抗PD-L1兔单抗进行人源化改造，分别将轻链可变区VL和重链可变区VH基因的兔源框架区氨基酸序列替代为人源框架区氨基酸序列，保留了各3个CDR区氨基酸序列，并针对一些可能影响抗体理化性质的氨基酸设计回复突变。

3.一种如权利要求1所述的一种人源化PD-L1单克隆抗体衍生物，其特征在于，衍生物为所述抗PD-L1人源化兔单抗的片段、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物；所述抗PD-L1人源抗体的片段为Fab、Fab’、F(ab’)²、Fv或scFv。

4.一种多核苷酸，其特征在于：编码权利要求1-3任一权利要求所述的抗PD-1人源化兔单抗的重链和/或轻链的可变区或全长氨基酸。

5.一种载体或载体组，其特征在于：包含权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求5所述的载体或载体组，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

7.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：与治疗剂或诊断剂连接的如权利要求1-3中任一项所述的人源化PD-L1单克隆抗体。

8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的人源化PD-L1单克隆抗体，或包含权利要求5所述的载体或载体组，或包含权利要求7所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体和第二治疗剂，所述第二治疗剂是在放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗、外科手术或其组合中使用的药剂。

9.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任意一项所述的抗体或如权利要求8所述的药物组合物。

10.一种生产PD-L1抗体的方法，所述方法包括在表达所述多核苷酸的条件下培养如权利要求6所述的宿主细胞。

11.一种权利要求8所述药物组合物的用途，其特征在于，所述药物组合物用于制备药物，所述药物用于治疗与PD-L1信号(通路)相关的疾病。