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CN109776676A - 针对艰难梭菌的抗体 - Google Patents

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CN109776676A
CN109776676A CN201811406032.6A CN201811406032A CN109776676A CN 109776676 A CN109776676 A CN 109776676A CN 201811406032 A CN201811406032 A CN 201811406032A CN 109776676 A CN109776676 A CN 109776676A
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toxin
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R·卡桑
D·约翰斯通
L·萨沃德
J·A·乔治
J·贝里
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CNJ Holdings Inc
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Abstract

提供了用于在受试者中治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。所述组合物包含针对艰难梭菌毒素B的抗体。所述方法提供以有效地减少或消除或预防艰难梭菌细菌感染的复发的量向受试者施用抗体。

Description

针对艰难梭菌的抗体
本申请为申请日是2013年11月29日、申请号是2013800715934 (PCT/US2013/072467)、发明名称为“针对艰难梭菌的抗体”的中国申请的分案申请。
领域
本发明涉及针对艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素B的单克隆抗体。本发明还涉及用于在脊椎动物受试者中诊断、治疗或预防细菌(艰难梭菌)感染的组合物和方法。提供了以有效地减少、消除或预防感染复发的量向脊椎动物受试者施用抗体的方法。
背景
艰难梭菌(C.difficile)是常见的医院病原体和全世界住院患者的发病率和死亡率的主要原因。Kelly等人，New Eng.J.Med., 330:257-62,1994。广谱抗生素的使用增加和艰难梭菌的异常强毒株的出现已导致这样的观点，即免疫疗法可非常适合于降低与该细菌相关的疾病和死亡。艰难梭菌具有很少的常规抗生素选择，并经常导致反复发作的疾病(25％的病例)。即使进行医疗干预，艰难梭菌每年仅在美国就夺走约20,000条生命，并导致约500,000例确诊的感染。最近，产生升高水平的毒素的艰难梭菌的更强毒株已经出现，诸如 B1/NAP1/027株，其对甲硝唑也具有降低的易感性。艰难梭菌的爆发已因促进该疾病传播的孢子的持久性而迫使病房和部分医院关闭。随着老年人口的日益增加和人口的人口统计特征的变化，艰难梭菌将成为21世纪的一大难题。艰难梭菌疾病的范围为从无症状带菌者变化至轻度腹泻，变化至暴发性假膜性结肠炎。
艰难梭菌具有二态生命周期，从而其作为具有传染性且坚硬的孢子形式和具有代谢活性的产毒素营养细胞两者存在。艰难梭菌相关疾病(CDAD)被认为是由营养细胞，更具体地两种毒素(肠毒素毒素A和细胞毒素毒素B)的作用引起的。迄今为止，用于艰难梭菌的疫苗和疫苗疗法集中于毒素(A和B)、A和B的类毒素、A和B的重组片段以及营养细胞表面层蛋白质(SLPA)。
毒素B(TcdB，～269kDa)为在艰难梭菌的致病性基因座(PaLoc) 上编码的约2366个残基的单个多肽毒素，所述基因座还包括毒素(推定的穴蛋白(putative holin)(TcdE)和毒素A(TcdA))表达的两个调节剂 (TcdC和TcdR)的基因。TcdB具有至少4个功能结构域，所述结构域有助于细胞进入和细胞的胞质溶胶内的小GTP酶的糖基化。TcdB的葡萄糖基转移酶结构域包括在毒素的前543个残基中，并且是生物活性结构域，其还包括保守的DXD基序(Asp286/Asp288)和Trp102，其与Mn2+和UDP-葡萄糖形成复合物。残基544-955处的半胱氨酸蛋白酶结构域是自我蛋白酶解活性和酶促结构域至胞质溶胶内的递送所必需的。在所述半胱氨酸蛋白酶结构域与C末端结合结构域之间，提出了负责毒素转运穿过膜和将葡萄糖基转移酶递送进靶细胞的胞质溶胶的递送结构域。最后，TcdB的第四功能结构域位于毒素的羧基末端区域(1851-2366)内，并且经预测与靶细胞上的受体相互作用。然而，人中的精确毒素受体未曾被鉴定。结合后，毒素经由网格蛋白和动力蛋白依赖性途径被内吞以到达酸性内体区室，毒素从所述内体区室被转运进入胞质溶胶。最可能地在胞质溶胶中，半胱氨酸蛋白酶结构域被InsP6的结合激活，从而导致葡萄糖基转移酶结构域的自我裂解和释放，所述葡萄糖基转移酶结构域随后靶向Rho蛋白(RhoA、 -B和-C)、Rac和Cdc42。这些小的调节性蛋白质的糖基化导致细胞中至关重要的信号转导途径的破坏，从而导致肌动蛋白凝缩和细胞的随后变圆、膜起泡以及靶细胞的最终细胞凋亡和死亡。虽然TcdA和 TcdB都对范围广泛的细胞类型施加它们的活性，但TcdB展现比TcdA 高的酶活性速率，从而在一些细胞类型中导致细胞病变效应的速率加快。取决于细胞类型，在不同的研究中TcdB的细胞毒性为TcdA的4 倍至200倍。
存在对艰难梭菌相关感染的有效治疗和/或预防(包括防止CDAD 复发)的未满足的需要。本发明提供了针对毒素B的小鼠和人源化抗体以满足这些和其它需要。
概述
在一个实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:110、111和112中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:102、 103和104中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含 3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:126、127和128中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:118、 119和120中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第三实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:142、143和144中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:134、 135和136中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第四实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:206、207和208中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:198、 199和200中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第五实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:222、223和224中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR： CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:214、215 和216中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第六实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链区和轻链区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:238、239和240中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、 CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:230、231和232 中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第七实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:238、239和240中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR： CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:230、231 和232中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第八实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO.710具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.708具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第九实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:76、77和78中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:68、 69和70中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。在该实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第十实施方案中，本发明包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:44、45和46中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:36、 37和38中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。在该实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.43中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQID NO:35中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第十一实施方案中，结合艰难梭菌毒素B的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其中所述重链可变区包含与 SEQ ID NO:109、125、141、157、173、189、205、221和237中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且包含轻链可变区，其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:101、117、 133、149、165、181、197、213和229中所示的氨基酸序列具有约 80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
在第十二实施方案中，结合艰难梭菌毒素B的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，其中所述重链可变区包含与 SEQ ID NO:389、405、421、437、453、469、485、501、517、533、 549、565、571、587、603、619、635、651和709中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:381、397、413、429、445、461、477、493、 509、525、541、557、563、579、595、611、627、643和707中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列。
本发明还提供了分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区 (CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO: 76、77和78中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2 和CDR3，所述CDR分别具有与SEQID NO:68、69和70中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列。
本发明提供了分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其结合艰难梭菌毒素B并且包含：(1)重链可变区，其中所述重链可变区包含3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:76、 77和78中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(2)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、 CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:68、69和70中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(3) 重链可变区，其中所述重链包含与SEQ ID NO:75中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列具有约80％至约 100％的同源性的氨基酸序列；(4)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQ ID NO:44、45和46中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与 SEQID NO:36、37和38中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(5)重链可变区，其中所述重链可变区包含3 个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQID NO: 44、45和46中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(6)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含3个CDR： CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别具有与SEQID NO:36、37 和38中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(7)重链可变区，其中所述重链包含与SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列具有约 80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(8)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和 CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:110、111和112中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:126、127和128中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:142、143和144中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:102、103和104中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:118、119和120中所示的氨基酸序列；或分别与 (iii)SEQ ID NO:134、135和136中所示的氨基序列具有约80％至约 100％的同源性的氨基酸序列；(9)重链可变区，其中所述重链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:110、111和112中所示的的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO: 126、127和128中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:142、 143和144中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(10)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含3个CDR： CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:102、103和104中所示的的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:118、119 和120中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:134、135和 136中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(11)重链可变区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:109， 125或141中所示的的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:101、117 或133中所示的的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(12)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含3 个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:206、207和208中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:222、223和224中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO: 238、239和240中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2 和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:198、199和200中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:214、215和216中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:230、231和232中所示的氨基序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(13)重链可变区，其中所述重链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:206、207和208中所示的的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:222、223和224中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:238、239和240中所示的氨基酸序列具有约 80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(14)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR具有分别与(i)SEQ ID NO:198、199和200中所示的的氨基酸序列；分别与 (ii)SEQ ID NO:214、215和216中所示的氨基酸序列；或分别与 (iii)SEQ ID NO:230、231和232中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(15)重链可变区，其中所述重链包含与SEQ ID NO:205、221或237中所示的的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含与 SEQ ID NO:197、213或229中所示的氨基酸序列具有约80％至约 100％的同源性的氨基酸序列；(16)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个互补决定区(CDR)：CDR1、 CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:486、487和488 中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:502、503和504中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:518、519和520中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性，并且其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:478、479和480中所示的核酸序列；分别与 (ii)SEQ ID NO:494、495和496中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:510、511和512中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(17)重链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的 3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO: 486、487和488中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:502、 503和504中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:518、519和 520中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(18)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、 CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:478、479和480 中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:494、495和496中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:510、511和512中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(19)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个互补决定区(CDR)： CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:390、391 和392中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:406、407和408中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:422、423和424中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性，并且其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:382、383和384中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:398、399和400中所示的核酸序列；或分别与 (iii)SEQ ID NO:414、415和416中所示的核酸序列具有约80％至约 100％的同源性；(20)重链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与 (i)SEQ ID NO:390、391和392中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:406、407和408中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO: 422、423和424中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性； (21)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个 CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO: 382、383和384中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ IDNO:398、 399和400中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:414、415和 416中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(22)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:620、621和622中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO: 636、637和638中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:652、 653和654中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性，并且其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2 和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:612、613和614中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:628、629和630中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:644、645和646中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(23)重链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ IDNO:620、621和622中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:636、637和638中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:652、653和654中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(24)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:612、613和614中所示的的核酸序列；分别与 (ii)SEQ ID NO:628、629和630中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:644、645和646中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(25)重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:534、535和536中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:550、551和552中所示的核酸序列；或分别与 (iii)SEQ ID NO:566、567和568中所示的核酸序列具有约80％至约 100％的同源性，并且其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO: 526、527和528中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:542、543 和544中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ IDNO:558、559和560 中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(26)重链可变区，其中所述重链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2 和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:534、535和536中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:550、551和552中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:566、567和568中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(27)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含由核酸序列编码的3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述核酸序列分别与(i)SEQ ID NO:526、527和528中所示的的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:542、543和544中所示的核酸序列；或分别与(iii)SEQ IDNO:558、559和560中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性；(28)由核酸序列编码的重链可变区，所述核酸序列与SEQ ID NO:485、501和517中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性，其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO:477、493 和509中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(29)重链可变区由与SEQ ID NO:389、405或421中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO:381、397或413中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(30)重链可变区由与 SEQ ID NO:619、635或651中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO:611、627或643中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(31)重链可变区由与SEQ ID NO:533、549或565中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码，并且其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO:525、541或557中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(32)重链可变区，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11、27、43、59、75 或93中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(33)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3、 19、35、51、67或85中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(34)重链可变区，其中所述重链可变区包含与 SEQ ID NO:109、125、141、157、173、189、205、221、237或710 中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列； (35)轻链可变区，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:101、117、 133、149、165、181、197、213、229或708中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列；(36)重链可变区，其中所述重链可变区由与SEQ ID NO:253、269、285、301、317、341、 357或373中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(37)轻链可变区，其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO: 245、261、277、293、309、325、333、349或365中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(38)重链可变区，其中所述重链可变区由与SEQID NO:389、405、421、437、453、469、485、501、517、533、549、565、571、587、603、619、635 或651中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；(39)轻链可变区，其中所述轻链可变区由与SEQ ID NO:381、 397、413、429、445、461、477、493、509、525、541、557、579、 595、611、627、643或714中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码；或(40)重链可变区和轻链可变区，其分别包含与SEQ ID NO:75和67中所示的氨基酸序列具有约80％至约 100％的同源性的氨基酸序列。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分结合艰难梭菌毒素B，并且可具有小于约1x10-8M的解离常数(KD)。
分离的单克隆抗体或抗原结合部分可以是人源化的或嵌合的(例如小鼠-人)，并且可以是：(a)完整的免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)Fab 片段；(d)F(ab')2；或(e)二硫键连接的Fv，并且可包含至少一个恒定结构域，例如(a)IgG恒定结构域；(b)IgM恒定结构域；(c)IgD恒定结构域；(d)IgE恒定结构域；或(e)IgA恒定结构域。本发明的抗体或抗原结合部分可框内融合于融合伴侣或掺入结构域用于翻译后修饰以在体外促进稳定性，以影响配制/货架期(例如封装、酰化)，或在体内促进稳定性以影响PK/PD(例如聚乙二醇化、唾液酸化、糖基化)。所述融合伴侣可用作用于治疗性或诊断性应用的配体。所述抗体或抗原结合部分可被工程化来增强亲和力(通过效价(多价的))，或通过与针对其它抗原(例如TcdA、TcdB、二元毒素的不同结构域)的抗体或抗原结合部分融合或缔合被赋予特异性。
分离的单克隆抗体或抗原结合部分可结合：(i)艰难梭菌毒素B的片段4；和/或，(ii)艰难梭菌毒素B的片段1。
本发明提供了分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与被抗体识别的艰难梭菌毒素B结合于的相同表位或抗原性相似的表位，所述抗体包含：(1)分别包含与SEQ ID NO: 43和35中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区；(2)包含分别与(i)SEQ ID NO:109 和101中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:125和117中所示的氨基酸序列；分别与(iii)SEQ IDNO:141和133中所示的氨基酸序列具有约80％至约100％的同源性的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区；(3)包含分别与(i)SEQ ID NO:205和197中所示的氨基酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:221和213中所示的氨基酸序列；或分别与(iii)SEQ ID NO:237和229中所示的氨基酸序列具有约80％至约 100％的同源性的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区；(4)包含分别与(i)SEQ ID NO:389和381中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:405和397中所示的核酸序列；分别与(iii)SEQ ID NO:421和413 中所示的核酸序列；或分别与(iv)SEQ ID NO:709和707中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列的重链可变区和轻链可变区；或(5)由分别与(i)SEQ ID NO:485和477中所示的核酸序列；分别与(ii)SEQ ID NO:501和493中所示的核酸序列；或分别与 (iii)SEQ ID NO:517和509中所示的核酸序列具有约80％至约100％的同源性的核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区。
本发明提供了由命名为CAN33G1、CAN46G4、CAN46G13、 CAN46G13a、CAN46G19或CAN46G24的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或被命名为CAN33G1、CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、 CAN46G19或CAN46G24的杂交瘤。
本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中在体内毒素B攻击实验中，当在将哺乳动物暴露于约75ng或大于约75ng 的艰难梭菌毒素B之前约24小时以在约8mg/kg体重至约13mg/kg 体重范围的剂量向哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分时，所述哺乳动物的存活概率在暴露于毒素B后约4天内大于约80％。致死剂量或致死浓度取决于毒素的毒性。中和毒素所需的抗体的量可相应地变化。
本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中浓度在约25μg/ml至约100μg/ml范围的所述抗体或其抗原结合部分在体外中和测定中中和大于约40％的约5ng/ml的艰难梭菌毒素B。毒素的毒性取决于其所分离自的株系，因为其在株系之间是变化的。因此，中和所述毒素所需要的抗体的浓度取决于毒素的来源。
可与本发明一起使用的细胞包括，但不限于，细菌细胞、真核生物细胞或哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以是COS-1细胞、COS-7 细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、CHO细胞、CHOK1SV细胞、 Per.C6细胞、BSC-1细胞、Hep G2细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞。
本发明提供了由杂交瘤产生的抗体，所述杂交瘤被命名为： (1)CAN46G13-1-8，其中所述杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection)，具有ATCC专利保藏命名 PTA-13257。PTA-13257保藏于2012年8月23日。如本文中所用，CAN46G13a是指杂交瘤克隆CAN46G13-1-8或由对应的克隆产生的单克隆抗体；(2)CAN46G4-1-2，其中所述杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏命名PTA-13258。PTA-13258保藏于2012年8月23日。如本文中所用，CAN46G4是指克隆 CAN46G4-1-2或由对应的克隆产生的单克隆抗体； (3)CAN46G19-3-2，其中所述杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏命名PTA-13259。PTA-13259保藏于2012 年8月23日。如本文中所用，CAN46G19是指克隆CAN46G19-3-2 或由对应的克隆产生的单克隆抗体；(4)CAN46G13-1-5，其中所述杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心，具有ATCC专利保藏命名 PTA-13260。PTA-13260保藏于2012年8月23日。如本文中所用， CAN46G13和CAN46G24是指克隆CAN46G13-1-5或由对应的克隆产生的单克隆抗体。由CAN46G13和CAN46G24产生的单克隆抗体的序列是相同的。
本发明提供了包含分离的单克隆抗体或其抗原结合部分和至少一种药学上可接受的载体的组合物。该组合物可用作预防或治疗艰难梭菌相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分。可静脉内、皮下、肌内或经皮肤施用所述抗体或其抗原结合部分。本方法还可包括向受试者施用第二试剂或多种试剂(例如，第三、第四、第五和第六)诸如不同的抗体或其片段(例如结合艰难梭菌毒素A的抗体或其抗原结合部分)、抗寄生虫药(例如硝唑尼特)、抗生素(例如，万古霉素、甲硝唑、利福昔明或非达米星)、益生菌(具有布拉酵母(saccharomyces boulardi)、双歧杆菌属(bifidobacteria)或乳杆菌属(lactobacillus)的组合物)或粪便移植的步骤。本方法还可包括向受试者施用一种或多种其它试剂诸如不同的抗体或其片段(例如，结合艰难梭菌毒素B的不同片段的抗体或其抗原结合部分)的步骤。
附图简述
图1是显示鼠CAN33和CAN46单克隆抗体(mAb)针对完整毒素 B(TcdB)、毒素B的片段4(TcdB F4)和毒素B的片段1(TcdB F1)的结合特异性的ELISA。显示了TcdA(毒素A)阴性对照以及对照抗体 hPA-41、小鼠抗-毒素B多克隆(小鼠pAB)和抗-毒素B(CAN20G2)。
图2是显示鼠CAN33和CAN46 mAb结合不同表位并且不与 mAb MDX-1388(Medarex)竞争毒素B的竞争性ELISA。
图3是显示鼠CAN33和CAN46 mAb结合不同表位并且不与 mAb hPA-41(ProgenicsPharmaceuticals,Inc.)竞争毒素B的竞争性 ELISA。
图4显示纯化的鼠CAN46G4和CAN46G19 mAb的蛋白质免疫印迹。
图5显示纯化的鼠CAN46G13和CAN46G13a mAb的蛋白质免疫印迹。
图6显示纯化的鼠CAN46G24 mAb的蛋白质免疫印迹。
图7为鼠CAN46G4、CAN46G13a和CAN46G24的表位重新分级图(epitope binninggraph)。
图8显示使用xCelligence平台产生的HT-29细胞上的TcdB的 4-PL毒素滴定曲线。
图9为显示艰难梭菌毒素B对小鼠存活的影响以及鼠CAN33和鼠CAN46 mAb抗毒素B攻击的效力的柱形图。
图10显示用于从RNA扩增可变(V)链基因的引物。
图11显示包含来自鼠CAN46和CAN33G1亲代克隆的VH和 VL序列的鼠CAN46G4、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24、 CAN46G13和CAN33G1的可变(V)基因测序结果。
图12显示人源化CDR移植CAN46 mAb的氨基酸可变V区序列。
图13显示人源化huCAN46G mAb的氨基酸可变V区序列。
图14显示表面重塑的人源化rehuCAN46G mAb的氨基酸可变V 区序列。
图15a显示描绘在如柱形图中描绘的250pg/ml下，在HEK293F 细胞中表达的Per.C6构建体中的纯化的人源化CAN46G4变体的体外中和数据的柱形图。
图15b显示描绘在如柱形图中描绘的250pg/ml下，在HEK293F 细胞中表达的Per.C6构建体中的纯化的人源化CAN46G19变体的体外中和数据的柱形图。
图16是显示艰难梭菌毒素B对小鼠存活的影响和人源化CAN46G13a mAb(从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化的)针对毒素B攻击的效力的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线。
图17是显示艰难梭菌毒素B对小鼠存活的影响和人源化CAN46 mAb(从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化的)针对毒素 B攻击的效力的卡普兰-迈耶曲线。
图18是显示来自在毒素B攻击前(-12小时)和攻击后(72小时) 用人源化CAN46mAb注射的小鼠的总的人IgG ELISA结果的表。
图19是显示人源化CAN46G24 mAb的体外毒素B的中和的线图。
图20是显示人源化CAN46G13a mAb的体外毒素B的中和的线图。
图21是显示人源化CAN46G19 mAb的体外毒素B的中和的线图。
图22是显示人源化huCAN46G mAb的体外毒素B的中和的线图。
图23是显示人源化CAN46G mAb的体外毒素B的中和能力的线图。
图24是显示人源化CAN46G4、CAN46G13a和CAN46G19Tcd B mAb的亲和力分析的表。
图25是显示从表达基于CHO的构建体的CHOK1SV细胞纯化的人源化CAN46G mAb的体外毒素B的中和的线图
图26包括显示人源化CAN46mAb针对各种艰难梭菌临床分离株的EC50的多个柱形图。
图27是显示针对B1艰难梭菌孢子感染的人CDA1/MDX1388和人源化HeCAN20G2/HuCAN46G24 mAb的剂量对仓鼠存活的保护作用的卡普兰-迈耶曲线。
图28A显示在用艰难梭菌B1孢子感染后仓鼠体重的相对于基线的变化。
图28B显示感染了艰难梭菌B1孢子的仓鼠中的毒素特异性人 CDA1/MDX1388 mAb和人源化HeCAN20G2/HuCAN46G24 mAb的水平。
图29是显示通过从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化的抗从不同艰难梭菌菌株部分纯化的毒素的不同mAb的直接 ELISA体外测量的免疫反应性应答的表。
图30显示如从跨B1和NAP1菌株(BI-1、BI-6和BI-17)的不同实验进行的独立测定确定的不同抗体组合的中和％。
图31包含显示通过夹心ELISA测定的人源化CAN46 mAb对来自不同艰难梭菌非-NAP1和NAP1菌株的捕获的毒素的结合特征的图。
图32是显示通过ELISA测定的人源化CAN46对来自不同艰难梭菌非-NAP1菌株的捕获的毒素的免疫反应性的图。
图33是显示通过ELISA测定的人源化CAN46G mAb对来自不同NAP1艰难梭菌菌株的捕获的毒素B的免疫反应性的图。
图34显示从表达CHO构建体的CHOKS1V细胞纯化的人源化 CAN46 mAb的蛋白质免疫印迹。
图35显示从表达基于Per.C6的构建体的HEK293细胞纯化的人源化CAN46 mAb的蛋白质免疫印迹。
图36是显示来自表达基于CHO的构建体的CHOK1SV细胞的纯化的Tcd B人源化mAbCAN46G24和CAN46G13a的亲和力分析的表。
图37是显示针对毒素B和毒素A的人源化CAN46 mAb的结合特异性的柱形图。
详述
本发明提供用于诊断、预防或治疗艰难梭菌(C.difficile)的细菌感染或细菌携带的组合物和方法。所述组合物含有识别艰难梭菌的毒素 B的抗体(或抗原结合部分)，包括鼠单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体(鼠/人)或前述任何抗体的抗原结合部分。这些抗体(或其抗原结合部分)可在体外、体内中和毒素B，和/或抑制毒素B结合哺乳动物细胞。因此，本发明的抗体或抗原结合部分可以以被动免疫方式使用或可用于预防或治疗艰难梭菌相关疾病(CDAD)的方案。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分提供以下作用的一个或多个作用：保护受试者免受艰难梭菌介导的结肠炎、抗生素相关结肠炎、假膜性结肠炎(PMC)或其它肠疾病或治疗受试者的所述疾病；保护受试者免受腹泻或治疗受试者的腹泻；和/或治疗或抑制艰难梭菌介导的疾病的复发。当向哺乳动物施用时，本发明的抗体或抗原结合部分可保护哺乳动物免受毒素B的侵害，所述毒素B以否则对于未施用所述抗体或抗原结合部分的哺乳动物可以是致命的量施用。
本发明的抗体或抗原结合部分包括由杂交瘤CAN46G4、 CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24和CAN33G1产生的鼠抗体以及源自本文中描述的相同杂交瘤的人源化抗体。
本发明还包括抗体或抗原结合部分，所述抗体或抗原结合部分包括由杂交瘤CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24或CAN33G1产生的抗体的抗原结合部分；如本文中所用， CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24和 CAN33G1是指杂交瘤克隆或由对应的杂交瘤克隆产生的单克隆抗体。
所述抗体或抗原结合部分可特异性结合(i)毒素B的片段1内的表位，例如毒素B(CAN46G13a)的氨基酸残基1-592之间的表位；或毒素B的片段4内的表位，例如毒素B(CAN46G4、CAN46G13、 CAN46G19、CAN46G24或CAN33G1)的氨基酸残基1777-2366之间的表位。Babcock,G.J.等人，Infection and Immunity,74:6339-6347 (2006)。
在其它实施方案中，抗体或抗原结合部分特异性结合毒素B的片段2(氨基酸残基593-1183)或片段3(氨基酸残基1184-1776)内的表位。在某些实施方案中，抗体或抗原结合部分特异性结合毒素B的氨基酸残基1-600、400-600、415-540、1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、900-1000、1100-1200、 1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1800-1900、 1900-2000、2000-2100、2100-2200或2200-2366或其任何间隔、部分或范围内的表位。
本发明的抗体或抗原结合部分包括，但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多克隆抗体、重组抗体以及前述抗体的抗原结合部分。抗体的抗原结合部分可包括特异性结合艰难梭菌的毒素(例如，毒素B)并且可包含抗体分子的单独的重链或轻链的抗体的部分。
CDR和可变区
本发明的抗体或抗原结合部分的CDR可来自非人例如鼠(小家鼠 (Mus musculus))或人来源(智人(Homo Saipian))。本发明的抗体或抗原结合部分的框架可以是人框架、人源化框架、非人框架(例如，经修饰以在人中减小抗原性的鼠框架)或合成框架(例如，共有序列)。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分含有至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区。所述重链可变区(或轻链可变区)含有从氨基端至羧基端以下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3、FR4排列的3个CDR和4个框架区(FR)。Kabat,E.A.，等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department ofHealth and Human Services,NIH出版号91-3242,1991。 Chothia,C.等人，J.Mol.Biol.196:901-917,1987。
本发明的抗体或抗原结合部分可以以低于约10-7M、低于约10-8 M、低于约10-9M、低于约10-10M、低于约10-11M或低于约10-12M 的解离常数(KD)特异性结合毒素B。
具有与由克隆CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、 CAN46G24或CAN33G1产生的抗体的重链可变区和轻链可变区具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约70％、约75％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约 88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性的重链可变区和轻链可变区的抗体也可以结合毒素B并且被本发明包含。
在相关实施方案中，抗-毒素B抗体或抗原结合部分包括例如 CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24或 CAN33G1的可变重链和/或可变轻链的CDR。来自这些克隆的重链可变区的CDR以及来自这些克隆的轻链可变区的CDR示于表1中。
表1 序列ID NO
在表1中，对于氨基酸序列，CDR加以下划线，并且对于核苷酸序列，将CDR进行IMGT编号。H：重链；K：κ链。CDR区可使用Kabat、IMGT、Honnegger和Chothia来进行鉴定，并且可相应地变化。
如本文中所用，“与…...同源”意指与确定的氨基酸或核苷酸序列具有“至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约99％、约70％至约100％、约80至约100％、约90％至100％、约95％至约100％、约70％、约75％、约80％、约 81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约 96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同源性”。如果范围被指定为例如约80％至约100％，则如本文中所用，术语同源的具体地指该范围。
抗体或抗原结合部分可包含：(1)重链可变区，其包含与由克隆C AN33G1(SEQ IDNO.93)、CAN46G4(SEQ ID NO:11)、CAN46G1 3(SEQ ID NO:27)、CAN46G13a(SEQ ID NO:43)、CAN46G19(SE Q ID NO:59)或CAN46G24(SEQ ID NO:75)产生的抗体的重链可变区氨基酸序列同源的氨基酸序列；和/或，(2)轻链可变区，其包含与由克隆CAN33G1(SEQ ID NO.85)、CAN46G4(SEQ ID NO:3)、 CAN46G13(SEQ ID NO:19)、CAN46G13a(SEQ ID NO:35)、CAN46G19(SEQ ID NO:51)或CAN46G24(SEQ ID NO:67)产生的抗体的轻链可变区氨基酸序列同源的氨基酸序列。所述抗体或抗原结合部分可包含针对前述段落中所列的重链可变区(1)和轻链可变区(2)所示的氨基酸序列的任意组合。
抗体或抗原结合部分可特异性结合表位，所述表位与被由克隆 CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24或 CAN33G1产生的抗体(包括，但不限于源自这些克隆的人源化抗体) 结合的表位重叠、在抗原性上与其相似，或在氨基酸或核苷酸序列水平上与其同源，并且可与由克隆CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、 CAN46G19、CAN46G24或CAN33G1产生的抗体竞争对毒素B的结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分包含：(1)重链可变区，其包含与由克隆CAN33G1(SEQ ID NO:94、95和/或96)、 CAN46G4(SEQ ID NO:12、13和/或14)、CAN46G13(SEQ ID NO:28、 29和/或30)、CAN46G13a(SEQ ID NO:44、45和/或46)、 CAN46G19(SEQ ID NO:60、61和/或62)或CAN46G24(SEQ ID NO: 76、77和/或78)产生的抗体的1、2、3或更多个CDR同源的1、2、 3或更多个互补决定区(CDR)；或，(2)轻链可变区，其包含与由克隆 CAN33G1(SEQ ID NO:86、87和/或88)、CAN46G4(SEQ ID NO:4、 5和/或6)、CAN46G13(SEQID NO:20、21和/或22)、CAN46G13a(SEQ ID NO:36、37和/或38)、CAN46G19(SEQ ID NO:52、53和/或54) 或CAN46G24(SEQ ID NO:68、69和/或70)产生的抗体的1、2、3或更多个CDR同源的1、2、3或更多个CDR。所述抗体或抗原结合部分可包含针对前述段落中所列的重链可变区(1)和轻链可变区(2)所示的氨基酸序列的任意组合。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合部分可包含：(i)抗体或抗原结合部分的重链可变区，其包含与由克隆cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:110、111和/或112)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:126、127和/ 或128)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:142、143和/或144)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:158、159和/或160)、huCAN46G19(SEQ ID NO:174、175和/或176)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:190、191和/ 或192)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:206、207和/或208)、 huCAN46G24(SEQ ID NO:222、223和/或224)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:238、239和/或240)产生的抗体的1、2、3或更多个CDR同源的1、2、3或更多个互补决定区(CDR)；或(ii)抗体或抗原结合部分的轻链可变区，其包含与由克隆cdrCAN46G13a(SEQ IDNO:102、103 和/或104)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:118、119和/或120)、 rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:134、135和/或136)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:150、151和/或152)、huCAN46G19(SEQ ID NO:166、167和 /或168)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:182、183和/或184)、 cdrCAN46G24(SEQ ID NO:198、199和/或200)、huCAN46G24(SEQ ID NO:214、215和/或216)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:230、231和/ 或232)产生的抗体的轻链可变区的1、2、3或更多个CDR同源的1、 2、3或更多个CDR。所述抗体或抗原结合部分可包含针对前述段落中所列的重链可变区和轻链可变区的CDR所示的氨基酸序列的任意组合。
在第三实施方案中，抗体或抗原结合部分包含：(i)抗体或抗原结合部分的重链可变区，其包含与由克隆cdrCAN46G13a(SEQ ID NO: 110、111和/或112)、huCAN46G13a(SEQID NO:126、127和/或128)、 rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:142、143和/或144)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:158、159和/或160)、huCAN46G19(SEQ ID NO:174、175和 /或176)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:190、191和/或192)、 cdrCAN46G24(SEQ ID NO:206、207和/或208)、huCAN46G24(SEQ ID NO:222、223和/或224)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:238、239和/ 或240)产生的抗体的1、2、3或更多个CDR同源的1、2、3或更多个互补决定区(CDR)；或(ii)抗体或抗原结合部分的轻链可变区，其包含与由克隆cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:102、103和/或104)、 huCAN46G13a(SEQ ID NO:118、119和/或120)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:134、135和/或136)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:150、151和 /或152)、huCAN46G19(SEQ IDNO:166、167和/或168)、 rehuCAN46G19(SEQ ID NO:182、183和/或184)、cdrCAN46G24(SEQID NO:198、199和/或200)、huCAN46G24(SEQ ID NO:214、215和 /或216)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:230、231和/或232)产生的抗体的轻链可变区的1、2、3或更多个CDR同源的1、2、3或更多个 CDR。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含与由克隆 cdrCAN46G13a(分别与SEQ ID NO:101和109，轻链可变区-重链可变区)、huCAN46G13a(分别与SEQ ID NO:117和125，轻链可变区- 重链可变区)、rehuCAN46G13a(分别与SEQ ID NO:133和141，轻链可变区-重链可变区)、嵌合CAN46G13a(分别与SEQ ID NO:708和 710，轻链可变区-重链可变区)、cdrCAN46G19(分别与SEQ ID NO:149 和157，轻链可变区-重链可变区)、huCAN46G19(分别与SEQ ID NO: 165和173，轻链可变区-重链可变区、轻链可变区-重链可变区)、rehuCAN46G19(分别与SEQ ID NO:181和189)、cdrCAN46G24(分别与SEQ ID NO:197和205)、huCAN46G24(分别与SEQ ID NO:213 和221，轻链可变区-重链可变区)或rehuCAN46G24(分别与SEQ ID NO:229和237，轻链可变区-重链可变区)产生的抗体的轻链可变区和重链可变区同源的轻链可变区和重链可变区。
抗体或抗原结合部分可包含：(i)与如SEQ ID NO:101、117、133、 708、149、165或181、197、213或229中所示的轻链可变区同源的轻链可变区；或(ii)与如SEQ ID NO:109、125、141、710、157、173、 189、205、221或237中所示的重链可变区同源的重链可变区。在某些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含重链可变区(i)和轻链可变区 (ii)。
抗体或抗原结合部分可包含：(i)由与如SEQ ID NO:667、683、 699、389、405、421、533、549、565、709、437、453、469、571、587、603、485、501、517、619、635或651中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的重链可变区；(ii)由与如SEQ ID NO:659、675、691、 381、397、413、525、541、557、707、429、445、461、557、579、 595、477、493、509、611、627或643中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的轻链可变区；和/或，(iii)由与如SEQ ID NO:667、683、699、389、405、421、533、549、565、709、437、453、469、571、 587、603、485、501、517、619、635或651中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的重链可变区，和由与如SEQ ID NO:659、675、691、 381、397、413、525、541、557、707、429、445、461、557、579、 595、477、493、509、611、627或643中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的轻链可变区。
抗体或抗原结合部分可包含由与由如下核酸序列编码的1、2、3 或更多个CDR同源的核酸序列编码的1、2、3或更多个互补决定区 (CDR)：(i)如cdrCAN46G4(SEQ ID NO:668、669和/或670)、 huCAN46G4(SEQ ID NO:684、685和/或686)、rehuCAN46G4(SEQ ID NO:700、701和/或702)、cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)390、391 和/或392，或(b)534、535和/或536)、huCAN46G13a(SEQ ID NO: (a)406、407和/或408，或(b)550、551和/或552)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)422、423和/或424，或(b)566、567和/或568)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)438、439和440，或(b)572、573和/或 574)、huCAN46G19(SEQID NO:(a)454、455和/或456，或(b)588、 589和/或590)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)470、471和/或472，或(b)604、605和/或606)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)486、487和 /或488，或(b)620、621和/或622)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)502、 503和/或504，或(b)636、637和/或638)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO: (a)518、519和/或520，或(b)652、653和/或654)中所示的重链可变区的cdr；或(ii)如cdrCAN46G4(SEQ ID NO:660、661和/或662)、huCAN46G4(SEQ ID NO:676、677和/或678)、rehuCAN46G4(SEQ ID NO:692、693和/或694)、cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)382 383和/ 或384，或(b)526、527和/或528)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)398、 399和/或400，或(b)542、543和/或544)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)414、415和/或416，或(b)558、559和/或560)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)430、431和/或432，或(b)715、716和/或717)、 huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)446、447和/或448，或(b)580、581和 582)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)462、463和/或464，或(b)596、 597和/或598)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)478、479和/或480，或(b)612、613和/或614)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)494、495和 /或496或(b)628、629和/或630)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)510、 511和512，或(b)644、645和/或646)中所示的轻链可变区的cdr。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含重链可变区(i)和轻链可变区(ii)。具体地，抗体或抗原结合部分可包含由与由如下核酸序列编码的1、2、3或更多个CDR同源的核酸序列编码的1、2、3 或更多个互补决定区(CDR)：(i)如cdrCAN46G4(SEQ ID NO:668、669和/或670)、huCAN46G4(SEQ ID NO:684、685和/或686)、 rehuCAN46G4(SEQ ID NO:700、701和/或702)、cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)390、391和/或392，或(b)534、535和/或536)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)406、407和/或408，或(b)550、551和 /或552)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)422、423和/或424，或 (b)566、567和/或568)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)438、439和 440，或(b)572、573和/或574)、huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)454、 455和/或456，或(b)588、589和/或590)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO: (a)470、471和/或472，或(b)604、605和/或606)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)486、487和/或488，或(b)620、621和/或622)、 huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)502、503和/或504，或(b)636、637和/ 或638)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)518、519和/或520，或 (b)652、653和/或654)中所示的重链可变区的cdr；和(ii)如 cdrCAN46G4(SEQ ID NO:660、661和/或662)、huCAN46G4(SEQ IDNO:676、677和/或678)、rehuCAN46G4(SEQ ID NO:692、693和/ 或694)、cdrCAN46G13a(SEQID NO:(a)382 383和/或384，或(b)526、 527和/或528)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)398、399和/或400，或(b)542、543和/或544)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)414、415 和/或416，或(b)558、559和/或560)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO: (a)430、431和/或432，或(b)715、716和/或717)、huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)446、447和/或448或(b)580、581和582)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)462、463和/或464，或(b)596、597 和/或598)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)478、479和/或480，或 (b)612、613和/或614)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)494、495和/ 或496或(b)628、629和/或630)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)510、 511和512，或(b)644、645和/或646)中所示的轻链可变区的cdr。抗体或抗原结合部分可包含由前述段落中所示的重链可变区和轻链可变区的核酸序列编码的CDR的1、2、3或更多个的任意组合。
抗体或抗原结合部分可包含：(i)重链可变区，其包含由与如 cdrCAN46G4(SEQ IDNO:668、669和670)、huCAN46G4(SEQ ID NO: 684、685和686)、rehuCAN46G4(SEQ ID NO:700、701和702)、 cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)390、391和392；或(b)534、535和536)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)406、407和408，或(b)550、551和552)、 rehuCAN46G13a(SEQID NO:(a)422、423和424，或(b)566、567和 568)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)438、439和440，或(b)572、573 和574)、huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)454、455和456，或(b)588、 589和590)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)470、471和472，或(b)604、 605和606)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)486、487和488，或(b)620、 621和622)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)502、503和504，或(b)636、 637和638)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)518、519和520，或 (b)652、653和654)中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的3个 CDR；或，(ii)轻链可变区，其包含由与如cdrCAN46G4(SEQ ID NO: 660、661和662)、huCAN46G4(SEQ ID NO:676、677和678)、 rehuCAN46G4(SEQ ID NO:692、693和694)、cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)382 383和384，或(b)526、527和528)、huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)398、399和400，或(b)542、543和544)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)414、415和416，或(b)558、559和560)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)430、431和432，或(b)715、716和717)、huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)446、447和448，或(b)580、581和582)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)462、463和464，或(b)596、597和598)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)478、479和480，或(b)612、613和614)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)494、495和496，或(b)628、629和630)或 rehuCAN46G24(SEQID NO:(a)510、511和512，或(b)644、645和646) 中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的3个CDR。
在某些实施方案中，抗体或抗原结合部分包含重链可变区(i)和轻链可变区(ii)。具体地，重链和轻链可变区包含由与如下所示的核酸序列同源的核酸序列编码的3个CDR：(i)重链可变区，其包含由与 cdrCAN46G4(SEQ ID NO:668、669和670)、huCAN46G4(SEQ IDNO: 684、685和686)、rehuCAN46G4(SEQ ID NO:700、701和702)、 cdrCAN46G13a(SEQ IDNO:(a)390、391和392；或(b)534、535和536)、 huCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)406、407和408，或(b)550、551和552)、 rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)422、423和424，或(b)566、567和568)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)438、439和440，或(b)572、573 和574)、huCAN46G19(SEQID NO:(a)454、455和456，或(b)588、 589和590)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)470、471和472，或(b)604、 605和606)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)486、487和488，或(b)620、 621和622)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)502、503和504，或(b)636、 637和638)或rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)518、519和520，或 (b)652、653和654)中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的3个 CDR；或(ii)轻链可变区，其包含由与cdrCAN46G4(SEQ ID NO:660、 661和662)、huCAN46G4(SEQ ID NO:676、677和678)、 rehuCAN46G4(SEQ ID NO:692、693和694)、cdrCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)382 383和384，或(b)526、527和528)、huCAN46G13a(SEQ IDNO:(a)398、399和400，或(b)542、543和544)、rehuCAN46G13a(SEQ ID NO:(a)414、415和416，或(b)558、559和560)、cdrCAN46G19(SEQ ID NO:(a)430、431和432，或(b)715、716和717)、huCAN46G19(SEQ ID NO:(a)446、447和448，或(b)580、581和582)、rehuCAN46G19(SEQ ID NO:(a)462、463和464，或(b)596、597和598)、cdrCAN46G24(SEQ ID NO:(a)478、479和480，或(b)612、613和614)、huCAN46G24(SEQ ID NO:(a)494、495和496，或(b)628、629和630)或 rehuCAN46G24(SEQ ID NO:(a)510、511和512，或(b)644、645和646) 中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的3个CDR。抗体或抗原结合部分可包含由针对上述段落中所列的重链可变区和轻链可变区所示的核酸序列编码的CDR的任意组合。
在一个实施方案中，抗体或抗原结合部分含有由核酸序列编码的轻链可变区和重链可变区，所述核酸序列与cdrCAN46G4(分别与SEQ ID NO:659和667，轻链可变区和重链可变区)、huCAN46G4(分别与 SEQ ID NO:675和683，轻链可变区和重链可变区)、rehuCAN46G4(分别与691和699，轻链可变区和重链可变区)、cdrCAN46G13a(分别与 SEQ IDNO:(a)381和389，或(b)525和533)、huCAN46G13a(分别与 SEQ ID NO:(a)397和405，或(b)541和549，轻链可变区和重链可变区)、rehuCAN46G13a(分别与SEQ ID NO:(a)413和421，或(b)557和 565，轻链可变区和重链可变区)、cdrCAN46G19(分别与SEQ ID NO: (a)429和437，或(b)714和571，轻链可变区和重链可变区)、 huCAN46G19(分别与SEQ ID NO:(a)445和453，或(b)579和587，轻链可变区和重链可变区)、rehuCAN46G19(分别与SEQ ID NO:(a)461 和469，或(b)595和603，轻链可变区和重链可变区)、cdrCAN46G24(分别与SEQ ID NO:(a)477和485，或(b)611和619，轻链可变区和重链可变区)、huCAN46G24(分别与SEQ ID NO:(a)493和501，或(b)627 和635，轻链可变区和重链可变区)或rehuCAN46G24(分别与SEQ IDNO:(a)509和517，或(b)643和651，轻链可变区和重链可变区)中所示的核酸序列同源。抗体或抗原结合部分可包含针对前述段落中所列的重链可变区(1)和轻链可变区(2)所示的核酸序列的任意组合。
在另一个实施方案中，抗体或抗原结合部分含有由与 CAN46G4(SEQ ID NO:659、675或691)、CAN46G13a(SEQ ID NO: 381、397、413、525、541、557或707)、CAN46G19(SEQ IDNO:429、 445、461、714、579或595)或CAN46G24(SEQ ID NO:477、493、 509、611、627或643)中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的轻链可变区。
抗体或抗原结合部分包含由与CAN46G4(SEQ ID NO:667、683 或699)、CAN46G13a(SEQ ID NO:389、405、421、533、549、565 或709)、CAN46G19(SEQ ID NO:437、453、469、571、587或603) 或CAN46G24(SEQ ID NO:485、501、517、619、635或651)中所示的核酸序列同源的核酸序列编码的重链可变区。
人源化抗体
本发明的人源化抗体是来自非人物种的抗体，其中非抗原结合区 (和/或抗原结合区)中的氨基酸序列已被改变，以使所述抗体与人抗体更密切相似，并且仍然保留相当的特异性和亲和力。
人源化抗体可通过用来自人可变区的等同序列替换未直接参与抗原结合的可变区的序列来产生。那些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链的至少一者的可变区的全部或部分的核酸序列。此类核酸的来源对于本领域普通技术人员来说是公知的并且，例如，可从产生针对毒素B的抗体的杂交瘤获得。随后可将编码人源化抗体或片段的重组DNA克隆进适当的表达载体中。
抗体轻链或重链可变区由被称为互补决定区(CDR)的3个高变区间断的框架区组成。在一个实施方案中，人源化抗体是来自非人物种的具有来自非人物种的1个、2个或全部CDR和来自人免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子。
本发明的人源化抗体可由本领域中已知的方法产生。例如，一旦获得非人(例如，鼠)抗体，就可对可变区进行测序，并确定CDR和框架残基的位置。Kabat,E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开号91-3242。Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.,196:901-917。轻链和重链可变区可任选地被连接于对应的恒定区。 CDR移植抗体分子可通过CDR移植或CDR取代来产生。可替换免疫球蛋白链的1个、2个或全部CDR。例如，特定抗体的全部CDR 可来自非人动物(例如，小鼠，诸如表1中显示的CDR)的至少一部分或只有一些CDR可被替换。只需保留抗体对预定抗原(例如，艰难梭菌的毒素B)的结合所需的CDR。Morrison,S.L.,1985,Science, 229:1202-1207。Oi等人，1986,BioTechniques,4:214。美国专利No. 5,585,089；5,225,539；5,693,761和5,693,762.EP 519596。Jones等人， 1986,Nature,321:552-525。Verhoeyan等人，1988,Science,239:1534。 Beidler等人，1988,J.Immunol.,141:4053-4060.
本发明还包括的是含有本文中公开的1个、2个或全部CDR，且其它区域被来自至少一个不同物种(包括，但不限于人、兔、羊、狗、猫、牛、马、羊、猪、猴子、猿、大猩猩、黑猩猩、鸭、鹅、鸡、两栖动物、爬行动物和其他动物)的序列替换的抗体或抗原结合部分。
嵌合抗体
嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物物种的分子。例如，抗体可含有来源于鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区。嵌合抗体可通过重组DNA技术产生。Morrison等人，Proc Natl Acad Sci, 81:6851-6855(1984)。例如，利用限制性内切酶消化编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的基因，以除去编码鼠Fc的区域，并且取代编码人Fc恒定区的基因的等同部分。嵌合抗体还可通过其中可将编码鼠 V区的DNA连接于编码人恒定区的DNA的重组DNA技术来产生。 Better等人，Science,1988,240:1041-1043。Liu等人PNAS,1987 84:3439-3443。Liu等人，J.Immunol.,1987,139:3521-3526。Sun等人 PNAS,1987,84:214-218。Nishimura等人，Cane.Res.,1987, 47:999-1005。Wood等人Nature,1985,314:446-449。Shaw等人，J.Natl. Cancer Inst.,1988,80:1553-1559。国际专利公开No.WO 1987002671和WO 86/01533。欧洲专利申请No.184,187；171,496；125,023和 173,494。美国专利No.4,816,567。
抗体的类型
抗体可以是全长的或可包括具有抗原结合部分的抗体的片段(或多个片段)，包括，但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、单链 Fv(scFv)、双价scFv(双-scFv)、三价scFv(三-scFv)、Fd、dAb片段(例如，Ward等人，Nature,341:544-546(1989))、分离的CDR、双链抗体、三链抗体、四链抗体、线性抗体、单链抗体分子以及从抗体片段形成的多特异性抗体。通过使用重组方法或合成接头连接抗体片段产生的单链抗体也包括在本发明中。Bird等人，Science,1988, 242:423-426。Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988, 85:5879-5883。
本发明的抗体或抗原结合部分可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性或双特异性抗体或其片段对于一个靶多肽(例如，毒素B)的不同表位可以是特异性的，或可含有对于超过一个靶多肽是特异性的抗原结合结构域(例如，对于毒素A和毒素B是特异性的抗原结合结构域；对于毒素B和艰难梭菌的其它抗原是特异性的抗原结合结构域；或对于毒素B和其它类型的细菌或病毒是特异性的抗原结合结构域)。在一个实施方案中，多特异性抗体或其抗原结合部分包含至少2个不同的可变结构域，其中每一个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。Tutt等人，1991,J. Immunol.147:60-69。Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22:238-244。可将本发明的抗体连接于另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质) 或与其共表达。例如，抗体或其片段可被功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或另外的方式)于一种或多种其它分子实体，诸如另一种抗体或抗体片段，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂对于毒素B是特异性的，并且免疫球蛋白的另一个臂对于第二治疗性靶是特异性的或缀合于治疗性部分诸如胰蛋白酶抑制剂。
所有抗体同种型都由本发明包括，包括IgG(例如，IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE。抗体或抗原结合部分可以是哺乳动物(例如，小鼠、人)抗体或抗原结合部分。抗体的轻链可以是κ或λ类型。抗体或抗原结合部分还可基于缺乏轻链的骆驼科动物(双峰骆驼、单峰驼和羊驼)抗体(也称为)。
抗体的变异
抗体或抗原结合部分是肽。肽还可包括展现生物活性(例如抗原的结合)的肽的变体、类似物、直系同源物、同源物和衍生物。肽可含有一个或多个氨基酸的类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、仅天然存在于不相关的生物系统中的氨基酸、来自哺乳动物系统的经修饰的氨基酸等)、具有取代的键联的肽，以及本领域中已知的其它修饰。
还在本发明范围内的是其中特定氨基酸已被取代、缺失或添加的抗体或抗原结合部分。这些改变对肽的生物学性质(诸如结合活性)没有重大影响。例如，抗体可在框架区中具有氨基酸取代，以便增强对抗原的结合、改变溶解度和/或影响药代动力学/药效学。在另一个实例中，选择的少数受体框架残基可被对应的供体氨基酸替换。供体框架可以是成熟或种系人抗体框架序列或共有序列。在Bowie等人， Science,247:1306-1310(1990)中提供了关于如何产生表型沉默的氨基酸取代的指导。Cunningham等人，Science,244:1081-1085(1989)。 Ausubel(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,Inc.(1994)。T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31 (1994)。Gonnet等人，Science 256:1443-45(1992)。
抗体或抗原结合部分可被衍生成另一种功能性分子或连接于另一种功能性分子。例如，抗体被功能性连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用等)于一种或多种其它分子实体，诸如另一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、可介导与另一种分子缔合的蛋白质或肽(诸如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标记)、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载体或用于蛋白质纯化的配体诸如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标记和葡萄球菌蛋白A。一种类型的衍生蛋白质通过交联两个或更多个蛋白质(相同类型的或不同类型的)来产生。合适的交联剂包括具有被适当的间隔子(例如，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分隔的两个不同的反应性基团的异双功能性的或同双功能性的(例如，辛二酸双琥珀酰亚胺酯)的那些交联剂。此类交联剂可获自Pierce Chemical Company,Rockford,III。可用来衍生(或标记)蛋白质的有用的可检测试剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、荧光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白质或抗体还可用可检测的酶，诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等来进行衍生。蛋白质还可用辅基(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素) 来进行衍生。
本发明的肽可以是本文中公开的抗原结合部分的抗体的功能活性变体，其例如具有少于约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约1％的取代的或缺失的氨基酸残基，但基本上保留相同的免疫性质，包括但不限于对毒素B的结合。
可对抗体或其抗原结合部分进行密码子优化。例如，通过体外诱变来将通常不被宿主细胞翻译系统使用的克隆的基因内的密码子改变成所述宿主细胞系统偏爱的密码子，而不改变合成抗体的氨基酸序列。
编码抗体可变区的核酸
本发明还包括编码特异性结合艰难梭菌的毒素B的本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸。可在细胞中表达所述核酸以产生本发明的抗体或其抗原结合部分。本发明的分离的核酸包含编码与SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、85或93同源的肽的序列。
本发明还包括表达载体，所述载体包括：(i)编码与氨基酸序列 SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、85或93同源的肽的核酸；(ii)编码与氨基酸SEQ ID NO:101、109、117、125、 133、141、149、157、165、173、181、189、197、205、213、221、 229、237、708和710同源的肽的核酸；或(iii)编码与核酸序列SEQ ID NO:381、389、397、405、413、421、429、437、445、453、461、 469、477、485、493、501、509、517、525、533、541、549、565、 557、714、571、579、587、595、603、611、619、627、635、643 和651同源的肽的核酸。可在细胞中表达所述核酸以产生本发明的抗体或其抗原结合部分。
编码本发明的抗体或其抗原结合部分的功能活性变体的核酸分子也由本发明包括。这些核酸分子可在中等严格、高严格或极高严格条件下与编码任何本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸杂交。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley&Sons,N.Y.6.3.1-6.3.6,1989(其通过引用并入本文)中。本文中提及的具体杂交条件如下：1)中等严格杂交条件：6XSSC，于约 45℃下，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中于60℃下进行1次或多次洗涤；2)高严格杂交条件：6XSSC，于约45℃下，随后在0.2XSSC、0.1％SDS中于65℃下进行1次或多次洗涤；和3)极高严格杂交条件：0.5M磷酸钠、7％SDS，于65℃下，随后在0.2XSSC、1％SDS中于65℃下进行1次或多次洗涤。
可将编码本发明的抗体或抗原结合部分的核酸引入可在适当的表达系统中表达的表达载体，随后分离或纯化表达的抗体或其抗原结合部分。任选地，可在无细胞翻译系统中翻译编码本发明的抗体或其抗原结合部分的核酸。美国专利No.4,816,567。Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA,86:10029-10033(1989)。
抗-毒素抗体或部分可由用编码所需抗体的轻链和重链(或其部分)的DNA转化的宿主细胞产生。可使用标准技术从这些培养物上清液和/或细胞中分离和纯化抗体。例如，可用编码抗体的轻链、重链或两者的DNA转化宿主细胞。重组DNA技术还可用于除去一些或全部编码对于结合不是必需的轻链和重链中的一者和两者(例如恒定区)的DNA。
可在各种适当的细胞(包括原核和真核细胞，例如细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达本发明的核酸。许多哺乳动物细胞系在本领域中是已知的并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。细胞的非限制性实例包括哺乳动物来源或哺乳动物样特征的所有细胞系，包括但不限于猴肾细胞(COS，例如，COS-1、COS-7)、HEK293 细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK，例如，BHK21)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO，例如CHOSKV1)、NS0细胞、PerC6细胞、BSC-1细胞、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、SP2/0细胞、HeLa细胞、马丁-达比(Madin-Darby) 牛肾细胞(MDBK)、骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞的亲代细胞、衍生物和 /或工程化变体。所述工程化变体包括例如聚糖分布改变和/或位点特异性整合位点的衍生物。
本发明还提供包含本文中描述的核酸的细胞。所述细胞可以是杂交瘤或转染子。所述细胞的类型已在上文中进行了论述。
可在各种细胞中表达本发明的抗体或抗原结合部分。所述细胞的类型已在上文中进行了论述。
可在无细胞翻译系统、病毒感染构建体或转基因动物中表达本发明的抗体或其抗原结合部分。
或者，本发明的抗体或抗原结合部分可通过本领域中公知的固相方法来合成。Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach by E. Atherton andR.C.Sheppard，由IRL at Oxford University Press(1989) 出版的。Methods inMolecular Biology，第35卷：Peptide Synthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn编辑)，第7章。Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)。 G.Barany和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology，编辑E.Gross和J.Meienhofer，第1卷和第2卷，Academic Press,New York,(1980)，第3-254页。M.Bodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin(1984)。
艰难梭菌毒素
本发明提供用于制备特异性结合艰难梭菌的毒素B的抗体或其抗原结合部分的方法。例如，利用包含灭活的毒素B、类毒素B、毒素B的片段、毒素B的经修饰的片段(合成变体)的组合物免疫非人动物，随后从所述动物分离特异性抗体。所述方法还包括评价抗体对毒素B的结合。
多种艰难梭菌毒素蛋白中的任何毒素蛋白，尤其是毒素B可用于本发明的实践。在一个实施方案中，从菌株VPI10463分离毒素B。艰难梭菌的毒素A和毒素B是高分子量蛋白(280至310kDa)，其具有多个功能结构域(也称为片段或结构域)。两种毒素的N末端结构域含有修饰Rho样GTP酶的葡萄糖基转移酶活性。该修饰在毒化细胞中导致细胞骨架失调和结肠上皮紧密连接的破坏。鉴于疏水区和小窝蛋白结合位点的存在，中央结构域经预测参与膜转运。毒素的C末端三分之一含有据信与在靶细胞表面上表达的糖类受体相互作用的重复亚单位。毒素A与糖类的相互作用还诱导兔红细胞的血凝集和提供用于研究毒素A受体结合的模型。两种毒素都具有细胞毒性，当在体外细胞毒性测定中测试时，毒素B的效力为毒素A的1000倍，当被静脉内或腹膜内(i.p.)注射入小鼠时，两种毒素都是致命的。毒素 A也是强效肠毒素，如通过小鼠结扎肠环腹泻模型中的积液的诱导证明的。参见，例如，Babcock,G.J.等人，Infection and Immunity,74: 6339-6347(2006)和本文中包含的关于背景的参考资料。
表2 提供艰难梭菌毒素B的氨基酸序列。下文中提供的序列的变体和片段还可用作产生抗体的抗原。
表3 提供编码表2的蛋白质的核酸序列。
抗体制备
在一个实施方案中，本发明提供用于制备表达特异性结合艰难梭菌的毒素B的抗体的杂交瘤的方法。所述方法含有下列步骤：用包含灭活的毒素B(例如，类毒素B)的组合物免疫动物；从所述动物分离脾细胞；从所述脾细胞产生杂交瘤；和选择产生特异性结合毒素B 的抗体的杂交瘤。Kohler和Milstein,Nature,256:495,1975。Harlow,E. 和Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988。
毒素可以例如通过利用甲醛、戊二醛、UDP-二醛、过氧化物、氧气处理，或通过突变(例如，使用重组方法)来灭活。Relyveld等人， Methods in Enzymology,93:24,1983。Woodrow和Levine，编辑，New Generation Vaccines,Marcel Dekker,Inc.,New York,1990。Genth等人， Inf.and Immun.,68(3):1094-1101,2000。减毒的突变的艰难梭菌毒素可使用重组方法来产生。美国专利No.5,085,862；5,221,618； 5,244,657；5,332,583；5,358,868和5,433,945。全长的毒素或类毒素或其片段可用作免疫原。
在一个实施方案中，灭活的毒素B用于腹膜内或静脉内免疫小鼠。可以给予或可以不给予一次或多次加强免疫。血浆中的抗体的滴度可通过例如ELISA(酶联免疫吸附测定)或流式细胞术来监控。具有充足的抗-毒素B抗体的滴度的小鼠用于融合。在处死和取出脾脏前 3天，可以用或可以不用抗原加强免疫小鼠。分离小鼠脾细胞，并利用PEG将其融合于小鼠骨髓瘤细胞系。随后筛选所得的杂交瘤的抗原特异性抗体的产生。将细胞涂板，随后在选择培养基中进行孵育。随后通过ELISA筛选来自单个孔的上清液的人抗-毒素单克隆抗体。将分泌抗体的杂交瘤再涂板，再次筛选，并且如果对于抗-毒素单克隆抗体仍然是阳性的，则可通过有限稀释对其进行亚克隆。例如，本发明的杂交瘤克隆CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a和CAN46 G19已被亚克隆。亚克隆包括，例如，CAN46G4-1-2、CAN46G13-1 -5、CAN46G13-1-8和CAN46G19-3-2。杂交瘤CAN46G13-1-8、CA N46G4-1-2、CAN46G13-1-5和CAN46G19-3-2已保藏在美国典型培养物保藏中心,Manassas,VA(于2012年8月23日保藏的)。每一个杂交瘤的ATCC专利保藏名称如下：PTA-13257(CAN46G13-1-8)、P TA-13258(CAN46G4-1-2)、PTA-13259(CAN46G19-3-2)和PTA-132 60(CAN46G13-1-5)。
可用于增强艰难梭菌毒素抗原的一种或多种(尤其是毒素B)的免疫原性的佐剂包括用于增强对肽或肽的组合的免疫应答的任何一种或多种化合物。佐剂的非限制性实例包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v的角鲨烯、0.5％w/v的聚山梨酯80(吐温80)、0.5％w/v 的脱水山梨醇三油酸酯(Span 85))、含CpG的核酸、QS21(皂苷佐剂)、 MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰基MPL)、来自Aquilla的提取物、ISCOMS(参见，例如，Sjolander等人(1998)J.Leukocyte Biol. 64:713；WO90/03184；WO96/11711；WO 00/48630；WO98/36772； WO00/41720；WO06/134423和WO07/026190)、LT/CT突变体、聚(D,L- 丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、Quil A、白细胞介素、弗氏佐剂、N- 乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L- 丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，被称为正-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L- 丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，被称为MTP-PE)和RIBI，所述RIBI在 2％角鲨烯/Tween 80乳液中含有从细菌提取的3种组分单磷酸脂质 A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
经免疫的动物可以是当施用免疫原时能够产生可回收的抗体的任何动物，诸如，但不限于小鼠、兔、大鼠、仓鼠、山羊、马、猴、狒狒和人。宿主可以是转基因的，但产生人抗体/美国专利No. 8,236,311；7,625,559和5,770,429，所述专利的每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文。Lonberg等人，Nature 368(6474):856-859, 1994。Lonberg,N.,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994。Lonberg,N.和Huszar,D.,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93,1995。 Harding,F.和Lonberg,N.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,764:536-546,1995。
抗体测定
在宿主被免疫并且抗体产生后，测定所述抗体以确认它们对于目标抗原是特异性的以及确定它们是否展示与其它抗原的任何交叉反应性。进行此类测定的一个方法是美国专利公开No.2004/0126829中描述的血清筛选测定。可通过多种已知的技术表征抗-毒素抗体对毒素的结合。例如，在ELISA中，用PBS中的毒素或类毒素抗原涂覆微量滴定板，随后用不相关的蛋白质诸如稀释于PBS中的牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。将来自毒素免疫的小鼠的血浆稀释物添加至每一个孔中并且进行孵育。将板洗涤，随后用缀合于酶(例如，碱性磷酸酶)的第二抗体进行孵育。洗涤后，用酶的底物(例如，ABTS)将板显色，并在特定OD下进行分析。在其它实施方案中，为了确定所选择的单克隆抗体是否结合独特表位，可将抗体生物素化，随后可用链霉抗生物素蛋白标记的探针来检测所述抗体。可通过蛋白质印迹来测试抗-毒素抗体与毒素的反应性。
中和测定还可用于测量抗-毒素抗体的活性。例如，体外中和测定可用于测量抗体抑制对培养物中的细胞的致细胞病变效应的能力 (参见下文中的实施例7)。在一个实施方案中，在体外中和测定中，浓度在约0.01μM至约50μM、约0.2μM至约40μM、约0.6μM至约30μM、约2μM至约20μM、约4μM至约10μM、约0.2μM至约7μM、约0.2μM至约10μM、约4μM至约7μM、约5μM至约 15μM、约10μM、约0.01μg/ml至约200μg/ml、约0.01μg/ml至约 150μg/ml、约0.01μg/ml至约100μg/ml、约0.01μg/ml至约50μg/ml、约0.01μg/ml至约25μg/ml、约0.01μg/ml至约10μg/ml、约0.01μg/ml 至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约2μg/ml、约1μg/ml至约2μg/ml、约 0.5μg/ml至约2μg/ml、约0.25μg/ml至约2μg/ml、约0.1pg/ml至约 2μg/ml、约0.06μg/ml至约2μg/ml或约0.03μg/ml至约2μg/ml范围的本发明的抗体或其抗原结合部分中和一定百分比的约5ng/ml、约 200pg/ml、约250pg/ml或约200-250pg/ml的艰难梭菌毒素B。被本发明的抗体或其抗原结合部分中和的毒素B的百分比可大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％或大于约99％。
体内测定也可用于测量毒素的中和。在另一个实施方案中，在体内毒素B攻击实验(例如，如实施例8以及Babcock等人，Human Monoclonal Antibodies Directed againstToxins A and B prevent Clostridium difficile-Induced Mortality inHamsters.Infection and Immunity(2006)74(11):6339中描述的方法)中，当在将哺乳动物暴露于大于约75ng或约75ng的艰难梭菌毒素B之前约24小时以在约1 mg/kg体重至约50mg/kg体重、约2mg/kg体重至约40mg/kg体重、约3mg/kg体重至约30mg/kg体重、约5mg/kg体重至约20mg/kg 体重、约8mg/kg体重至约13mg/kg体重的范围或为约10mg/kg体重的剂量向哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分时，所述哺乳动物具有存活的概率。哺乳动物的存活概率在约7天内或约4天内可大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约95％或大于约99％。
随后可亚克隆产生优选地以高亲和力结合毒素的抗体的杂交瘤，并进一步表征所述杂交瘤。随后可从每一种杂交瘤选择一个保留亲代细胞的反应性(通过ELISA)的克隆来用于制备细胞库和用于抗体纯化。
为了纯化抗-毒素抗体，可在利用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia, Piscataway,N.J.)亲和层析之前过滤并浓缩来自培养的杂交瘤的上清液。
本公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可根据它们对抗原的结合亲和力来进行描述或说明。抗体对抗原的亲和力可使用任何合适的方法(参见，例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions,”In Fundamental Immunology,Paul,W.E.，编辑，Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman andCompany:New York,N.Y.(1992)；以及本文中描述的方法)来以实验测定。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则特定抗体 -抗原相互作用的测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如，KD、Ka、Kd)的测量优选地利用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液来进行。
药物组合物
本发明还提供了含有本文中描述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体的组合物。所述组合物可含有编码本发明的抗体或其抗原结合部分的分离的核酸和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施方案中，所述组合物对于减轻、消除或预防受试者的艰难梭菌细菌感染是有效的。
本发明还表征通过以有效地抑制艰难梭菌疾病的量向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分来治疗受试者的艰难梭菌疾病的方法。本组合物的施用途径包括，但不限于静脉内、肌内、皮下、口服、局部、皮下、皮内、经皮、真皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用。
本发明的组合物可被制备成注射剂，作为液体溶液或悬浮剂，或制备成适合在注射前用于在液体媒介物中配制成溶液或悬浮剂的固体形式。所述组合物还可以以固体形式制备，被乳化或活性成分被封装在用于持续递送的脂质体媒介物或其它颗粒载体中。例如，所述组合物可以以油乳剂、油包水乳剂、水包油包水乳剂、位点特异性乳剂、长停留乳剂、粘稠乳剂、微乳剂、纳米乳剂、脂质体、微粒、微球、纳米球、纳米颗粒和各种天然或合成的聚合物(诸如不可吸收不可渗透的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯共聚物和共聚物、可溶胀的聚合物诸如水凝胶，或可再吸收的聚合物诸如胶原蛋白和某些多元酸或聚酯(诸如用于制造可再吸收缝合线的那些多元酸或聚酯))的形式存在，所述形式允许疫苗的持续释放。
本发明抗体或抗原结合部分被配制成用于递送至哺乳动物受试者的组合物。将所述组合物单独施用，和/或与药学上可接受的媒个物或赋形剂混合。合适的媒介物是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，所述媒介物可包含少量的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂。本发明的组合物还可包括辅助物质，诸如药物试剂、细胞因子或其它生物反应调节剂。制备制剂的方法对于本领域普通技术人员来说是已知的，或将是显而易见的。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany, Easton,Pennsylvania，第21版。
可按照时间安排和在适合于受试者的年龄、体重和状况、所使用的具体组合物以及施用途径的一段时期内以单剂量治疗或多剂量治疗施用组合物。
在一个实施方案中，施用单个剂量的根据本发明的组合物。在其他实施方案中，施用多个剂量。施用频率可取决多种因素的任何因素而变化，例如症状的严重程度、所需免疫保护的程度、所述组合物是用于预防目的还是治疗目的等。例如，在一个实施方案中，每月一次、每月二次、每月三次、每隔一周一次(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一日一次(qod)、每天一次(qd)、每日两次(qid)或每日三次(tid)施用根据本发明的组合物。
根据本发明的多肽的施用持续时间，例如，施用所述组合物所持续的时期可取决于多种因素的任何因素而变化，例如，受试者的反应等。例如，可在约10分钟至约1天、约30分钟至约20小时、约1 小时至约15小时、约2小时至约10小时、约3小时至约8小时、约 4小时至约6小时、约1天到约1周、约2周至约4周、约1个月至约2个月、约2个月至约4个月、约4个月至约6个月、约6个月至约8个月、约8个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间范围的一段时间内施用所述组合物。
可将本发明的抗体或其抗原结合部分与药学上可接受的载体组合。药学上可接受的载体可含有生理上可接受的化合物，所述化合物用于例如稳定，或增加或减小本发明的抗体或其抗原结合部分的吸收或清除速率。生理上可接受的化合物可包括例如糖类(诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、去垢剂、脂质体载体或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。其它生理上可接受化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Science第21版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(“Remington’s”)。
在一个方面，将本发明的抗体或其抗原结合部分溶解在药学可接受的载体，例如，含水载体中。水溶液的实例包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、汉克斯(Hank's)溶液、林格氏(Ringer's)溶液、葡萄糖/盐水，葡萄糖溶液等。所述制剂可含有如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、去垢剂等。添加剂还可以包括额外的活性成分，诸如杀细菌剂或稳定剂。例如，所述溶液可含有乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯或油酸三乙醇胺。
固体制剂可用于本发明中。它们可被配制成例如丸剂、片剂、粉剂或胶囊剂。对于固体组合物，可使用常规固体载体，其包括例如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇。
对于经粘膜或经皮施用，可在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括，例如，对于经粘膜施用，胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外，去垢剂可用于促进渗透。经粘膜施用可通过鼻喷雾或使用栓剂。Sayani,Crit.Rev.Ther. Drug Carrier Syst.13:85-184,1996。对于局部、经皮施用，所述药剂被配制成软膏、乳膏、药膏、粉剂和凝胶。透皮递送系统还可以包括，例如，贴剂。
本发明的组合物还可以以持续递送或持续释放的机制进行施用。例如，可生物降解的微球或胶囊剂或能够持续递送肽的其它可生物降解的聚合物构型可被包括在本发明的制剂中(参见，例如，Putney,Nat. Biotechnol.16:153-157,1998)。
对于吸入，可使用本领域中已知的任何系统，包括干粉气溶胶、液体递送系统、空气喷射喷雾器、推进剂系统等来递送本发明的组合物。Patton,Biotechniques 16:141-143,1998。还可用于本发明的是通过例如Dura Pharmaceuticals(San Diego,Calif.)、Aradigrn(Haywar d,Calif.)、Aerogen(Santa Clara,Calif.)、Inhale TherapeuticSystems(S an Carlos,Calif.)等提供的用于多肽大分子的产品和吸入递送系统。例如，所述药物制剂可以以气溶胶或雾的形式施用。对于气溶胶施用，可将所述制剂以细碎形式与表面活性剂和推进剂一起提供。在另一个方面，用于递送所述制剂至呼吸组织的装置是制剂在其中汽化的吸入器。其它液体递送系统包括，例如，空气喷射喷雾器。
可通过本领域中已知的任何方式(例如全身性、局域性或局部性；通过动脉内、鞘内(IT)、静脉内(IV)、肠胃外、胸膜内腔、局部、口服或局域施用，如皮下、气管内(例如，通过气雾剂)或经粘膜(例如，口腔、膀胱、阴道、子宫、直肠、鼻粘膜)将本发明的组合物或核酸、多肽或抗体单独递送，或作为药物组合物递送。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法将对于本领域普通技术人员来说是已知的或显而易见的，并且被详细地描述。Bai,J.Neuroimmunol.80:65-75, 1997。Warren,J.Neurol.Sci.152:31-38,1997。Tonegawa,J.Exp.Med. 186:507-515,1997。
在一个方面，将包含本发明的核酸、多肽、或抗体的药物制剂并入脂质单层或双层，例如脂质体内。美国专利No.6,110,490； 6,096,716；5,283,185和5,279,833。本发明的方面还提供其中本发明的核酸、肽或多肽已被附着于单层或双层的表面的制剂。例如，肽可被附着于含酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰)乙醇胺的脂质体(参见，例如， Zalipsky,Bioconjug.Chem.6:705-708,1995)。可使用脂质体或脂质膜的任何形式诸如平面脂质膜或完整细胞(例如，血红细胞)的细胞膜。脂质体制剂可以通过任何方式施用，包括静脉内、经皮(参见，例如， Vutla,J.Pharm.Sci.85:5-8,1996)、经粘膜或口服施用。本发明还提供其中将本发明的核酸、肽和/或多肽并入胶束和/或脂质体中的药物制剂(参见，例如，Suntres,J.Pharm.Pharmacol.46:23-28,1994；Woodle, Pharm.Res.9:260-265,1992)。脂质体和脂质体制剂可按照标准方法来制备，并且在本领域也是公知的。Akimaru,CytokinesMol.Ther.1: 197-210,1995。Alving,Immunol.Rev.145:5-31,1995。Szoka,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467,1980。美国专利No.4,235,871；4,501,728和 4,837,028。
在一个方面，所述组合物利用将保护肽免于快速从体内消除的载体来制备，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。脂质体悬浮剂也可被用作药学可接受的载体。美国专利No.4,522,811。
有利的是以便于施用和剂量均匀的剂量单位形式配制肠胃外或口服组合物。本文中使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理上分离的单位；每一个单位含有经计算与所需药物载体一起产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人的剂量。在一个实施方案中，此类化合物的剂量在包括ED50的具有极少毒性或不具有毒性的循环浓度的范围内。所述剂量可根据所使用的剂型和利用的施用途径在此范围内变化。在另一个实施方案中，治疗有效剂量可最初从细胞培养试验估计。剂量可以在动物模型中配制，以达到包括如在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。Sonderstrup, Springer,Sem.Immunopathol.25:35-45,2003。Nikula等人，Inhal. Toxicol.4(12):123-53,2000。
本发明的抗体或抗原结合部分的治疗性或预防性有效量的示例性非限制性范围为约0.001至约60mg/kg体重、约0.01至约30mg/kg 体重、约0.01至约25mg/kg体重、约0.5至约25mg/kg体重、约0.1 至约20mg/kg体重、约10至约20mg/kg体重、约0.75至约10mg/kg 体重、约1至约10mg/kg体重、约2至约9mg/kg体重、约1至约2 mg/kg体重、约3至约8mg/kg体重、约4至约7mg/kg体重、约5 至约6mg/kg体重、约8至约13mg/kg体重、约8.3至约12.5mg/kg 体重、约4至约6mg/kg体重、约4.2至约6.3mg/kg体重、约1.6至约2.5mg/kg体重、约2至约3mg/kg体重或约10mg/kg体重。
该组合物被配制成含有有效量的本发明的抗体或其抗原结合部分，其中所述量取决于待治疗的动物和待治疗的病状。在一个实施方案中，以在约0.01mg至约10g、约0.1mg至约9g、从约1mg至约 8g、约1mg至约7g、约5mg至约6g、约10mg至约5g、约20mg 至约1g、约50mg至约800mg、约100mg至约500mg、约0.0l mg 至约10g、约0.05μg到约1.5mg、约10μg到约1mg蛋白质、约30 μg到约500μg、约40pg至约300pg、约0.1μg至约200mg、约0.1μg 到约5μg、约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约 50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约500μg、约500μg至约 1mg、约1mg至约2mg范围的剂量施用本发明的抗体或其抗原结合部分。用于任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括特定肽的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径以及排泄速率、药物组合和正在进行治疗的特定疾病的严重程度。
在治疗应用中，以足以至少部分阻止或防止病状或疾病和/或其并发症的量向处于艰难梭菌细菌感染风险中的或遭受活动性感染的受试者施用本发明的组合物。
抗体的用途
本发明的抗体或抗原结合部分具有体外和体内治疗性、预防性和 /或诊断性用途。例如，可向培养物中的细胞(例如在体外或离体)，或向受试者(例如在体内)施用这些抗体，以治疗、抑制、防止复发和/ 或诊断艰难梭菌和与艰难梭菌相关的疾病。
所述抗体或抗原结合部分可用于培养物中的细胞，例如，在体外或离体进行。例如，可将细胞在体外培养在培养基中，并与抗-毒素抗体或其片段接触。可作为体内(例如，治疗性或预防性)方案的部分对存在于受试者中的细胞进行所述方法。对于体内实施方案，接触步骤是在受试者中进行的，并且包括在有效地允许抗体或其部分与由受试者中(例如肠中)的艰难梭菌表达的毒素(例如，毒素B)结合的条件下，向受试者施用抗毒素抗体或其部分。
可单独地或与另一种治疗剂例如第二单克隆或多克隆抗体或其抗原结合部分组合地施用所述抗体或其抗原结合部分。在一个实例中，将特异性地结合于艰难梭菌毒素B的抗体或其抗原结合部分与特异性结合于艰难梭菌毒素A的抗体(单克隆或多克隆)或其抗原结合部分组合。在另一个实例中，所述第二试剂是抗生素，例如万古霉素、杆菌肽或甲硝唑。可将所述抗体与益生菌剂如布拉酵母菌组合使用。还可将所述抗体与艰难梭菌疫苗例如类毒素疫苗组合使用。
还可将所述抗体或其抗原结合部分与一种或多种附加治疗剂，例如，第二和第三单克隆或多克隆抗体或其抗原结合部分组合施用。在一个实例中，将特异性结合于艰难梭菌毒素B的抗体或其抗原结合部分与特异性结合于艰难梭菌毒素A的抗体(单克隆或多克隆)或其抗原结合部分和另一种抗体(单克隆或多克隆)或其抗原结合部分组合，所述另一种抗体或其抗原结合部分特异性结合于与第一艰难梭菌毒素B抗体不同的艰难棱菌毒素B的区域。在另一实例中，所述第二或第三单克隆或多克隆抗体或其抗原结合部分是明确针对二元毒素或艰难梭菌孢子的。在另一个实例中，所述第二试剂是抗生素，例如，万古霉素、杆菌肽或甲硝唑。在另一个实例中，所述第二试剂是抗寄生虫药，例如硝唑尼特。可将所述抗体与益生菌剂诸如布拉酵母菌组合使用。还可将所述抗体与艰难梭菌疫苗例如类毒素疫苗组合施用。在另一个用途中，还可将所述抗体或其抗原结合部分与粪便移植物组合施用。
还可将抗-毒素抗体(例如，单克隆抗体)用于通过标准技术，诸如亲和层析或免疫沉淀分离毒素。此外，抗-毒素抗体可用于检测毒素，例如，以筛选样品(例如，在粪便样品、血液样品、培养物样品、食品样品中)中艰难梭菌的存在。抗-毒素抗体可在诊断上用于监测组织中的毒素水平，作为例如测定给定治疗方案的效力的临床测试程序的部分。
疫苗
本发明还包括疫苗和含免疫原的组合物。所述疫苗或含免疫原的组合物可包含被一种或多种本发明的抗体或其抗原结合部分识别和/ 或结合的一个或多个表位。在一个实施方案中，所述疫苗或含免疫原的组合物包含被CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19、CAN46G24、CAN33G1、任何这些抗体的抗原结合部分、任何这些抗体的人源化形式或任何这些抗体的嵌合形式的一种或多种识别和/ 或结合的一个或多个表位。所述疫苗或含免疫原的组合物可含有表位，或可含有具有所述表位的肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述含表位的部分、片段或肽衍生自毒素B。例如，毒素B的含表位的部分、片段或肽通过蛋白水解切割(例如，通过肠激酶、半胱天冬酶等) 从毒素B蛋白衍生。含表位的部分、片段或肽也可通过化学或重组合成。
毒素的此类含表位的部分、片段或肽，当以疫苗或免疫原的形式向感染艰难梭菌或患有艰难梭菌相关疾病的受试者施用时，可在受试者中引发体液应答，即，抗体具有针对毒素B的特异性，从而允许受试者增强抗所述毒素的免疫应答，并在受试者中中和、阻断、减少、改善、治愈或治疗艰难梭菌相关疾病、感染或CDAD。相应地，另一个实施方案提供在有此需要的受试者中中和、阻断、减少、改善、治愈或治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关疾病的方法，包括向所述受试者施用有效量的上述疫苗或免疫原。在一个实施方案中，所述受试者引发针对艰难梭菌的毒素B的体液应答，从而在受试者中中和、阻断、减少、改善、治愈或治疗艰难梭菌相关疾病、感染或CDAD。在另一个实施方案中，所述受试者引发针对艰难梭菌的毒素B的细胞免疫应答。在另一个实施方案中，所述受试者引发针对艰难梭菌的毒素B的体液和细胞免疫应答。国际专利公开No.WO2011130650。
试剂盒
本发明还提供了含有抗-毒素抗体或其抗原结合部分的试剂盒。试剂盒的另外的组分可包括以下组分的一种或多种：使用说明；另一种治疗剂、用于将抗体偶联于标记物或治疗剂的试剂、用于制备用于施用的抗体的其它试剂或其它材料；药学上可接受的载体；和用于向受试者施用的装置或其它材料。
抗体的各种组合可被包装在一起。例如，试剂盒可以包括结合毒素B的抗体和结合毒素A的抗体(例如，单克隆抗-毒素A抗体，或与毒素A反应的多克隆抗血清)。抗体可被混合在一起，或在试剂盒内被分开包装。
使用说明书可包括用于例如患有CDAD的症状的患者的治疗性应用的说明书，包括建议的剂量和/或施用模式。其它说明书可包括关于将抗体偶联于标记物或治疗剂或关于例如从未反应的缀合组分纯化缀合的抗体的说明书。所述试剂盒可用于诊断用途，例如，以检测毒素，筛选样品(例如，在粪便样品中)的艰难梭菌的存在。所述试剂盒可在诊断上用于监测组织中的毒素水平，作为例如测定给定治疗方案的效力的临床测试程序的部分。
所述试剂盒可以包含或可以不包含至少一种编码抗-毒素抗体或其片段的核酸，和表达所述核酸的说明书。试剂盒的其它可能的组分包括表达载体和细胞。
本发明的抗体或抗原结合部分、组合物和方法可用于所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、猪、猴子、猿、大猩猩、黑猩猩、兔、鸭、鹅、鸡、两栖动物、爬行动物和其它动物。
提供用于实施本发明的具体方面的下列实施例仅为了说明目的，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：杂交瘤融合
用于产生单克隆抗体的方法和试剂是公知的，并且包括免疫方案以及用于分离和融合脾细胞的技术。使用Kohler和Milstein,Nature, 256:495,1975的标准体细胞杂交技术进行经典杂交融合。通常参见， Harlow,E和Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.1988。一般地，使用灭活的毒素或类毒素、所述毒素的片段或完整毒素来免疫小鼠。小鼠接受它们的第一次免疫(利用使用完全弗氏佐剂(CFA)或其它佐剂的抗原)，随后每隔一周(达到总共4周)利用抗原和不完全弗氏佐剂(IFA) 进行后续加强免疫。从内侧隐静脉进行试验取血，并测试血清以检查抗-毒素B抗体的滴度。如果IgG滴度足够，则一次使用1或2只小鼠进行融合。在融合前3天，用PBS中的类毒素B/毒素B组合给予小鼠最终的腹膜内(IP)推注。
在融合当天，处死小鼠并取出它们的脾脏。使用注射器和针头从脾脏洗出脾细胞，并收集在50ml管中以用于与骨髓瘤细胞融合。骨髓瘤是用作融合伴侣的永生化肿瘤细胞系，将其在8-氮鸟嘌呤(8-氮杂)(阻断补救途径的毒性核苷酸类似物)存在的情况下生长。在8-氮杂存在的情况下生长的细胞只有通过引起次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因的缺陷突变才能存活。使用聚乙二醇1500将B细胞与骨髓瘤细胞融合。将融合的细胞混入具有药物选择的半固体琼脂糖并涂版至培养皿中。将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的HAT培养基用于药物选择。氨基蝶呤是抑制HGPRT缺陷型骨髓瘤系的存活 /细胞生长所绝对必需的核苷酸代谢的从头合成途径的药物，并且允许通常在24-48小时内选择。
实施例2：杂交瘤筛选
下一步骤是正在生长的杂交瘤的筛选。使用细胞在其内于3-D基质中生长为细胞团块的商业半固体琼脂糖。这有利于手工挑拣簇(通过目测)和将这些克隆簇转移至含有合适的培养基的96孔板。使细胞生长3-7天，然后除去上清液以便筛选，并用新鲜培养基替换。ELISA(或其它测试)中的阳性结合导致继续生长杂交瘤，随着体积不断增加，将它们转移至更大的组织培养容器中。使用耗尽的上清液，利用合适的用于鼠mAb的商业同种型分型试剂盒对所述mAb进行同种型分型。将克隆移至选择的下一阶段的决定基于其与天然毒素B 的反应性(使用ELISA)和其存活，通常基于至少1/8或1/16或更高的连续稀释和反应性，以及IgG种类；因此克隆数在整个选择过程减少。经历进一步表征的鼠mAb是：CAN33G1、CAN46G4、CAN46G13、 CAN46G13a、CAN46G19和CAN46G24。
实施例3：小鼠单克隆抗体的ELISA测定
ELISA被用于测试mAb针对完整毒素B和重组毒素B的片段1 和4的结合，以及确定它们是否与完整毒素A交叉反应。将mAb克隆与纯化的抗-类毒素B小鼠pAb(多克隆Ab)相比较。用100ng毒素 B片段1、片段4或400ng完整毒素B涂覆ELISA板，以使涂层是等摩尔的。将孔用含5％脱脂牛奶进行封闭，随后用系列稀释的 CAN46系列mAb(0.1μg/ml至1μg/ml)进行探测，并用商业山羊抗小鼠IgG-HRP抗体检测结合。还进行阴性和阳性对照。多克隆类毒素B抗体(pAb)用作阳性对照，并且源自免疫的小鼠。鼠抗-毒素A mAb CAN20G2对于毒素A是特异性的并用作阴性对照。第二抗体对照是针对鼠第二抗体的。在用底物孵育15分钟后，在405nm处读取板。每一种抗体的滴定数据示于图1中。
结果：如图1中所示，除与CAN33G1的结合降低外，CAN46 系列mAb以与小鼠pAb相似的水平结合完整毒素B和毒素B片段。 CAN46G4、CAN46G19和CAN46G24以与小鼠pAb相似的水平结合毒素B片段4。CAN46G13a以与小鼠pAb相似的水平结合毒素B片段1。没有一个CAN46mAb显示与毒素A的交叉反应性。
实施例4：小鼠单克隆抗体的竞争性ELISA测定
进行ELISA以测试CAN33或CAN46 mAb是否与MDX 1388(Medarex，美国专利公开No.US 2005/0287150A1)或 hPA-41(Progenies Pharmaceuticals,Inc.，国际专利公开No.WO 2011/130650；Marozsan等人，Protection Against Clostridium difficileInfection With Broadly Neutralizing Antitoxin Monoclonal Antibodies,J.Infect.Dis.2012年9月；206(5):706-13)竞争对毒素B的结合。用400 ng的完整毒素B涂覆ELISA板。用5％脱脂牛奶封闭孔，随后如下用mAb混合物进行探测：制备鼠1μg/ml的CAN33和CAN46 mAb，并进行2倍连续稀释。为了提供约1.0的基线OD，对于用作对照的 MDX1388抗毒素B的mAb制备1/1,650,000的稀释物，稀释基于先前在室内生成的数据，并以1:1与CAN33和CAN46 mAb混合。类似地，将hPA-41稀释至1/335,000，并以1:1与如上连续稀释的CAN33 和CAN46 mAb混合。利用商业山羊抗小鼠IgG-HRP抗体检测对于 CAN33和CAN46 mAb的结合。利用商业山羊抗-人IgG-HRP抗体检测对于MDX1388和hPA-41的结合。还进行阴性和阳性对照。与 MDX1388或hPA-41以1:1混合的过量毒素B用作阳性对照。还仅用磷酸盐缓冲盐水稀释MDX1388和hPA-41以用作无竞争性mAb的阴性对照。在用底物孵育15分钟后，将板在405nm处读数。
结果：如图2和3中所示，CAN33和CAN46 mAb不与MDX-13-88 或hPA-41竞争对完整毒素B的结合。所有mAb显示与不含竞争性 mAb的阴性对照的那些结合模式相似的结合模式。所述mAb都未显示与MDX-1388或hPA-41的竞争，这表明它们结合完整毒素B上的不同表位。
实施例5：小鼠单克隆抗体的蛋白质印迹
在200伏下对艰难梭菌蛋白质：重组毒素B片段1(82kDa)、重组毒素B片段4(85kDa)、完整毒素B(280kDa)与商业BSA的组合运行4-12％梯度的SDS-PAGE凝胶，进行1.5小时。随后在45伏下将凝胶转移至硝酸纤维素膜，进行1小时15分钟。在4℃用5％的1xTBST中的脱脂牛奶将膜封闭过夜。第二天，取决于抗体，以在2μg/ml至 5μg/ml范围的浓度将mAb(1°Ab)稀释在2.5％的1xTBST中的脱脂牛奶中，并将其在振荡器上于室温(RT)下用于探测含有转移的产物的膜，进行2小时。随后用1xTBST洗涤膜，以除去未结合的1°Ab，随后在振荡器上在室温下以1:4000至1:5000的稀释度用抗-小鼠 IgG-HRP(2°Ab)探测1.5小时。
结果：如图4、5和6中所示，CAN46G4、CAN46G13、CAN46G19 和CAN46G24显示对重组毒素B片段4和完整毒素B的结合。 CAN46G13a显示对重组毒素B片段1和完整毒素B的结合。它们都未显示与阴性对照(BSA)的交叉反应性。
实施例6：小鼠单克隆抗体的亲和力分析
生物膜层干涉技术被用于测量完整毒素B与抗毒素B抗体之间的相互作用。OctetQKe仪(ForteBio)配备有链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器。将40μg/ml的生物素化抗体偶联于SA传感器并且，将在 50nM至0.78nM的稀释系列中的毒素B在抗体涂覆的针上反应，随后在PBS-Triton中进行解离步骤。随后使用ForteBio数据分析软件来分析结果以测定解离常数(KD)(所述解离常数是用于描述抗体与抗原之间的结合强度的量度)、kon(1/Ms)(抗体抗原复合物形成时的结合速率)和kdis(1/s)(抗体抗原复合物解离时的解离速率)。表4显示纯化的鼠CAN33和CAN46 mAb的亲和力(抗体与抗原之间的kdis/kon的平衡解离常数(KD)比率与亲和力反相关，从而KD越低，亲和力越高)。
表4 CAN46G和CAN33G形式、hPA-41和MDX1388的亲和力数据
抗体 K<sub>D</sub>(M) k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>dis</sub>(1/s)
CAN46G4 1.41E-09 7.18E+04 1.01E-04
CAN46G13 1.17E-09 1.28E+05 1.49E-04
CAN46G13a 8.57E-09 8.08E+05 6.93E-03
CAN46G19 1.27E-09 1.14E+05 1.45E-04
CAN46G24 1.89E-09 1.49E+05 2.80E-04
hPA-41 9.83E-11 5.38E+05 5.30E-05
CAN33G1 1.09E-08 5.44E+04 5.91E-04
MDX1388 3.84E-09 3.62E+04 1.39E-04
实施例7：小鼠单克隆抗体的表位重新分级
Octet QKe是使用一次性光纤传感器的无标记实时生物传感器，其通过生物膜层干涉技术检测生物分子相互作用。针对先前表征的 MDX1388 mAb进行表位重新分级测定以检查本发明的毒素B mAb 与MDX1388共享相似的表位还是不同的表位。其次，所述测定用于确认毒素B mAb之间共享的单个或潜在多个表位仓(epitope bin)。使用经典的夹心法，其包括将mAb偶联于传感器，结合抗原，随后结合于另一个mAb。只有在其表位不与固定的mAb的表位重叠时，第二mAb才可结合捕获的Ag。例如，生物素化的CAN46G24抗体偶联于链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器。随后用游离毒素B和游离 CAN46G24孵育结合的抗体。再次用游离抗体孵育CAN46G24-毒素 B复合物。波长的大nm位移指示分析物的结合，这表明CAN46G24 与游离抗体具有不同的表位。1代表偶联于SA生物传感器的生物素化的CAN46G24；2代表与CAN46G24形成复合物的游离完整毒素B； 3代表与生物素化的CAN46G24-毒素B复合物缔合的游离 CAN46G24；4代表缔合样品曲线；5代表解离步骤。
结果：在图7中，MDX1388和CAN46G13a样品的nm位移指示对暴露的并且不同的表位的结合。对于CAN46G4和CAN46G24样品不存在nm位移，这表明与CAN46G19共享的或空间上相关的表位。
实施例8:使用xCELLigenceTM平台进行的利用HT-29细胞(人结肠癌上皮细胞)的艰难梭菌毒素B的中和测定
细胞系
HT-29细胞是粘附人结肠癌上皮细胞系。这些细胞已被选择，因为它们代表利用TcdB感染的相关体外模型。
xCELLigenceTM平台
xCELLigenceTM是基于电子阻抗细胞传感测量的实时无标记细胞分析(RTCA)系统，它能实时评价细胞特征的变化。细胞生长和细胞毒性可通过监测称为细胞指数(CI)的无量纲参数的增加或减小来检测。当在定制的96孔板内培养粘附细胞时，可通过电阻抗的变化(如通过包埋在每一个孔中的金电极测量的)来实时监测细胞的生长特征。
CI测量基于4个参数：1)细胞数目，2)细胞尺寸和形态学，3)细胞生活力，和4)细胞粘附。这些参数的任一个的增加导致CI的增加。相反地，这些参数的任一个的减小导致CI的减小。
方法
将HT-29细胞在T-75培养瓶中经受胰蛋白酶处理，随后将所述细胞以8000个细胞/孔添加至Roche 并在37℃孵育约4 小时。在4小时的孵育过程中，在96孔U型底板上制备样品稀释物。随后用TcdB的适当稀释物(0.5-50ng/mL范围，稀释度取决于毒素批次)覆盖在样品上。随后将板在37℃孵育约60分钟。在完成初始细胞孵育后，用毒素/样品制备物覆盖细胞，随后在37℃孵育最短72小时。在整个孵育期中每隔30分钟进行阻抗测量。使用xCELLigenceTM RTCA软件将该数据实时作图。选择代表最佳时间点的单个时间点(对于毒素的细胞毒性或中和)。将来自该单个时间点的数据用于产生用于分析的4-参数逻辑(4-PL)曲线。如果将测定样品效力，则针对“参照”样品约束样品曲线。曲线约束用于约束曲线的上/下渐近线，以及斜率。这允许每一个曲线基于曲线IC50值沿x-轴水平位移。对于效力测定，将标准的IC50值除以样品的IC50值。
利用xCELLigence进行的TcdB致细胞病变性检测的初步评价
首先评价HT-29细胞上的毒素B的致细胞病变性以确定 xCELLigenceTM平台的适合性。图8显示2倍稀释的TcdB的剂量反应曲线，表明HT-29细胞上浓度递增的Tcd B导致致细胞病变性(如通过细胞指数的减小所指示的)。随TcdB的浓度递减而递增的细胞指数表明合适的细胞病变性的检测。5ng/mL的TcdB浓度正显示大致完全的细胞病变效应，并表明该浓度为评估毒素的中和的合适浓度。
细胞附着期-xCelligenceTM法
该时期包括下列步骤。(1)在源培养瓶中对细胞进行胰蛋白酶处理。(2)向培养瓶中添加2mL胰蛋白酶，并洗涤细胞以除去痕量培养基，随后吸出。(3)添加3mL胰蛋白酶，并在37℃孵育约8分钟。(4) 向培养瓶中添加6mL测定培养基。(4)以800rpm离心悬浮的细胞，进行7分钟。(5)吸出上清液，并用6mL的测定培养基重悬浮细胞。 (6)计数细胞并计算用于以8000个细胞/孔涂板所需的细胞的体积。(7) 向96孔E-板的所有孔中添100μL测定培养基。(8)在xCelligence上进行背景读数。(10)向这些孔中添加50μL的1.0x106个细胞/mL悬浮液，以获得最终8000个细胞/孔的接种密度。(11)(15)在室温孵育板 20-30分钟以使细胞能够均匀沉降。(16)将板置于37℃的培养箱中，用5％CO2覆盖4-5小时。
毒素B的制备：(1)通过将初始原液(409.6μg/mL)稀释至5ng/mL 来制备毒素B覆盖物。(2)通过将初始原液稀释至80ng/mL来制备用于滴定的毒素B。(3)如表5中所示进行初始原液的稀释。
表5
样品制备：为了测试效力，以表6中显示的适当的浓度制备所有单克隆抗体。
表6
稀释板的制备-xCelligence
使用U型底96孔板进行下列步骤：(1)向孔B2-H11和E12-H12 中添加112.5μL的测定培养基。(2)向孔A12-D12中添加225μL的培养基。(3)向孔B1–H1中添加100μL的测定培养基。(4)向如下面表7 中显示的对应孔中添加150μL的样品。(5)通过从A行转移37.5μL 并添加至B行，混合，并向下重复直至H行来对每一个样品进行4 倍系列稀释。(6)通过将50μL从A行转移至B行，混合，随后继续系列稀释直至H行来对毒素滴定孔进行3倍系列稀释。(7)用112.5μL 的毒素B(5μg/mL)覆盖样品和毒素对照(TC)。(8)用100μL的测定培养基覆盖毒素滴定孔。(9)将板在平板振荡器上摇动直至均匀。(10) 在37℃下用5％CO2孵育60-90分钟。表7显示xCelligence稀释板布局。
表7 xCelligence稀释板布局
至细胞板的样品添加：(1)在完成孵育后，从培养箱取出细胞和稀释板。(2)(3)将50μL样品从稀释板转移至细胞板的适当的孔中。 (4)在37℃下用5％CO2覆盖物孵育72小时。
数据分析：(1)使用Softmax Pro(v.5.4)软件将72小时时间点上的板数据与每一个单个样品的4-参数逻辑(4-PL)曲线拟合。(2)约束标准曲线和样品曲线(上/下渐近线，和斜率)，并将标准的IC50值除以样品的IC50值以测定效力评价(当适用时)。
还对mAb进行本实施例的方法。
结果
鼠CAN46 mAb显示与MDX-1388相似的EC50值，对于 CAN46G24显示了甚至更高的体外中和水平。
表8概述了每一种mAb的EC50数据，所述数据表明当与 MDX1388相比较时，CAN46G24和CAN46G13是最具中和能力的克隆。
表8
1EC50值是中和50％的TcdB毒素剂量的抗体的浓度。
实施例9：在利用HT-29细胞的体外中和测定中的艰难梭菌毒素 B
为了进行利用HT-29细胞的体外中和测定，从来自鼠抗体的数据汇编表9中的百分比中和范围。所使用的毒素B的浓度为5μg/ml。
表9
实施例10：小鼠体内毒素攻击
小鼠体内毒素攻击测试基于具有一些改动的先前出版物 (Babcock等人,HumanMonoclonal Antibodies Directed against Toxins A and B prevent C.difficile-Induced Mortality in Hamsters,Infection and Immunity(2006))。在第0天给予重量为20-30g的Balb/c小鼠250μg 的mAb或对照，并让所述小鼠休息。24小时后，给予所述小鼠致死剂量的TcdB(75ng)。该剂量在24小时内杀死90-100％的处于无保护状态的动物。观察小鼠的异常以及局部和全身性疾病的体征，进行4 天。记录所有观察，并测定每一个处理组的存活％。
结果
如图9中所示，研究结果显示CAN46 mAb保护小鼠免受毒素B 攻击。Can46 mAb、CAN46G4、CAN46G13、CAN46G13a、CAN46G19 和CAN46G24在0.25mg/小鼠的剂量下在抗致死毒素B攻击的保护中全部都是有效的，在毒素B攻击后4天具有100％的存活率。 CAN33G1在0.25mg/小鼠的剂量下不能保护小鼠，在毒素B攻击后 4天具有0％的存活率。
实施例11：V基因测序
使用RNeasy Mini试剂盒从每一个CAN46G亲代杂交瘤克隆细胞系分离RNA。使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒从所述RNA扩增V基因。如下使用引物组的几种组合：对于来自杂交瘤的免疫球蛋白可变区基因序列的确认，使用一组可变区基因(V基因)的亚组特异性寡核苷酸引物。这些引物可包括5’mVK-Lead-1、3’KappaConst RT、5’mVH-Lead-2、5’mVH-Lead-2A和3’mIG1-2C RT。为了排除来自已知的且内源性异常的κ轻链V基因mRNA(在P3X63骨髓瘤内发现的)的潜在污染(Yuan,X.等人，J.Immunol.Methods,294:199- 207(2004))，还使用非亚组特异性引物组进行RT-PCR，所述引物组可包括5’mVK-Lead-1A、5’mVK-Lead-1A、5’mVK-Lead-3、5’mVK- Lead-3A、5’mVH-IGHV1-Lead、5’mVH-Lead-1、5’mVH-Lead-3、5’ mVH-Lead-4和5’mVH-Lead-5。关于引物及其序列的列表参考图10。所述引物使用简并碱基符号，所述符号是用于代表简并核苷酸序列模式的IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)代码。
PCR扩增反应的结果通过在分析琼脂糖凝胶上检查PCR产物来测定，并且将在大约300-500bp上的可视化的条带进行凝胶分离以用于克隆。使用在TOPO TA克隆手册中的低熔点琼脂糖法将提取的 DNA直接TA克隆入pCR2.1-TOPO载体。使用M13正向和M13反向引物在两个方向上对每一个CAN46G克隆反应进行测序。使用 DNAStar Lasergene软件分析序列数据。图11显示相较于 IMGT/V-Quest参考目录组和相较于NCBI免疫球蛋白blast搜索的所得的重排V基因序列。该图包括鼠亲代克隆CAN46G4、CAN46G13a、 CAN46G19、CAN46G24、CAN46G13和CAN33G1的VH和VL序列的结果。CAN46G24和CAN46G13的分析显示与鼠亲代克隆的VH 和VL序列相同的序列。
实施例12：CAN46G的人源化
已产生每一个CAN46G mAb的3个人源化IgG/k形式。对于人源化形式，与人种系等位基因的最大同一性比对用于(NCBI网站)帮助鉴定受体框架。插入对应于重链和轻链的全部6个CDR。其它残基因表面暴露或参与折叠或链间接触而分别被改变或维持。这类似于“超人源化”方法，在所述超人源化方法中将CDR匹配而非总框架用于改变种系序列用作受体框架的用途。在Tan等人，J.Immunol.2002, 169:1119-1125的情况下，作者使用CDR序列，并试图匹配基于Kabat 分类系统的所谓CDR的典型类型(canonical class)。然而，因为特定CDR是种系编码的并且特定规范构象倾向于在某些框架中被发现，因此选择受体框架的“超人源化”方法并非在所有情况下导致不同候选受体框架的选择。这是经验性的，并且仍需针对多个mAb特异性来进行测试。这部分是因为就同一性而进行的框架的直接比对在比较中也固有地包括CDR。
只移植cdrCAN46GCDR(图12)
VH和Vk的最佳匹配的人种系等位基因用作用于移植CDR的受体框架。不对受体框架进行其它改变。
huCAN46和rehuCAN46的“人工程化”(图13和14)
该人源化形式使用与由Studnicka等人使用的将鼠mAb人源化成CD5的“人工程化”策略(Studnicka等人，Human-engineered monoclonal antibodies retain fullspecific binding activity by preserving non-CDR complementarity-modulatingresidues,Protein Eng.1994年6 月；7(6):805-14)最相似的策略来产生。本质上，对于CAN46G mAb VH和Vk最接近的人种系等位基因被单独地鉴定，并被设计用作受体框架。rehuCAN46 mAb可通过对暴露于表面的氨基酸进行取代以对应于采用的人框架来进一步重塑表面而不破坏CDR。
实施例13：人源化单克隆抗体的ELISA测定
ELISA被用于测试mAb对完整毒素B和毒素A的结合以确定它们是否与完整毒素A交叉反应。用400ng完整毒素B或毒素A涂覆 ELISA板，以便涂层是等摩尔的。用5％脱脂牛奶封闭孔，随后用系列稀释的CAN46系列mAb(0.1μg/ml至1μg/ml)进行探测，并利用商业山羊抗-人IgG-HRP抗体检测结合。也进行阴性和阳性对照。在用底物孵育15分钟后于405nm处读取板。每一种抗体的滴定数据示于图37中。
结果：如图37中所示，在CHOK1SV细胞中从CHO构建体表达的人源化CAN46 mAb已保留它们各自的小鼠mAb的结合特征，并且结合完整毒素B。人源化CAN46G13a mAb相较于其它Cangene mAb和对照mAb以降低的水平结合毒素B。CAN46 mAb都未显示与毒素A的交叉反应性。
实施例14：人源化单克隆抗体的蛋白质印迹
在200伏下利用艰难梭菌蛋白质：完整毒素B、重组毒素B片段 1、重组毒素B片段4和完整毒素A的组合运行4-12％梯度的 SDS-PAGE凝胶，进行1.0小时。随后在45伏将凝胶转移至硝酸纤维素膜，进行1小时。利用5％的1xTBST中的脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时，或在4℃封闭过夜。将mAb(1°Ab)以在0.038μg/ml至 5μg/ml范围的浓度(取决于抗体)稀释于5％的1xTBST中的脱脂牛奶中，并用于探测含有转移产物的膜，在振荡器上于室温(RT)下进行5 小时或在4℃下进行过夜。随后用1xTBST洗涤膜以除去未结合的1° Ab，并在振荡器上在室温下以1:4000至1:5000的稀释度用抗-人 IgG-HRP(2°Ab)探测，进行1.5小时。
结果：如图34和35中所示，CAN46G19和CAN46G24的人源化形式显示对重组毒素B片段4(85kDa)和完整毒素B(280kDa)的结合。CAN46G13a的人源化形式显示对重组毒素B片段1(82kDa)和完整毒素B(280kDa)的结合。所测试的人源化CAN46 mAb都不与毒素 A(308kDa)交叉反应。
实施例15：人源化抗体的体外中和测定
进行使用CT.26细胞的艰难梭菌毒素的体外中和测定以测试针对艰难梭菌毒素B的人源化mAb变体的中和能力。将CT.26细胞以2.5-3x104个细胞/100μl/孔的浓度接种在96孔板中，并将板在5％CO2培养箱中于37℃孵育4-5小时。板中还包括两个含有培养基(无细胞) 的空白孔。
制备毒素和毒素/Ab原液并使用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基将其稀释至所需浓度。将稀释的毒素对照和毒素/Ab测试混合物在室温孵育1小时。随后，从孔中除去培养基，并在单独的培养基(细胞对照)、单独的毒素(毒素对照)或毒素/Ab混合物存在的情况下于37℃和5％CO2下孵育48小时。将板返回以在37℃和5％CO2下孵育48小时。随后，将WST-1检测试剂添加至每一个孔(10μL的试剂/100μL的孔中的体积)，并在37℃和5％CO2下孵育另外一小时，随后振荡板，进行1分钟，并在450nm处读取吸光度。
如下基于细胞对照测定细胞生活力：
细胞生活力％＝测试的平均OD/细胞对照的平均OD x 100。
毒素的中和通过如下公式来计算：
中和％＝(样品OD-毒素对照OD)/细胞对照OD-毒素对照OD)x 100。
结果
如图15a和15b中所示，huCAN46G4、rehuCAN46G4、 huCAN46G19和rehuCAN46G19在所有mAb浓度下提供最高水平的保护(中和)。这些中和水平可与原始鼠形式相当。MDX1388mAb也显示相当的中和能力，然而当与原始鼠形式或对照mAb MDX1388 相比较时，cdrCAN46G4和cdrCAN46G19都显示降低得多的活性或无活性。
对于利用CT.26wt细胞的体外中和测定，从来自两个人源化mAb huCAN46G4和huCAN46G19的数据汇编表10中的百分比中和范围。所使用的毒素B的浓度为200-250pg/ml。
表10
此外，图19-23显示从表达基于Per.C6构建体的HEK293F细胞 (在图例中被描绘为293F)或表达基于CHO构建体的CHOK1SV细胞 (在图例中被描绘为CHO)纯化的CAN46 mAb在中和针对CT-26细胞的毒素B攻击中的能力。具体地，CHO和Per.C6构建体中的 huCAN46G24mAb显示优于rehuCAN46G24构建体的中和(图19)。在图20中，嵌合CAN46G13a mAb显示优于CHO中的 rehuCAN46G13a和两个构建体中的huCAN46G13a的中和。在图21 中，两个构建体(CHO和HEK293F)中的huCAN46G19 mAb显示优于 rehuCAN46G19构建体的中和。在图22中，3种mAbhuCAN46G4、 huCAN46G19和huCAN46G24显示相当的中和，在1-2μg/ml之间具有100％的中和。在图23中，rehuCAN46G24显示中等的毒素B的中和，并且huCAN46G13a和rehuCAN46G13a mAb显示相较于 huCAN46G24的弱的毒素B的中和。在图25中，CHO中的huCAN46G24 mAb显示所测试的CHO人源化CAN46 mAb的最高中和能力，在约0.18μg/ml下具有100％的中和。CHO中的 rehuCAN46G19和rehuCAN46G24显示中等中和，在约0.3μg/ml下具有100％的中和。综上所述，这些结果表明使用本发明中描述的具有针对毒素B的结构域1或4的特异性的人源化单克隆抗体，CAN46 mAb在体外中和毒素B针对CT26细胞的细胞毒性效应。
实施例16：小鼠体内毒素攻击
小鼠体内毒素攻击测试基于具有一些改动的先前出版物 (Babcock等人,HumanMonoclonal Antibodies Directed against Toxins A and B prevent C.difficile-induced Mortality in Hamsters,Infection and Immunity(2006))。在第0天给予重量为20-30g的Balb/c小鼠250μg 的mAb或对照，并让所述小鼠休息。24小时后，给予所述小鼠致死剂量的TcdB(75ng)。该剂量在24小时内杀死90-100％的处于无保护状态的动物。观察小鼠的异常以及局部和全身性疾病的体征，进行4 天。记录所有观察，并测定每一个处理组的存活％。
结果
如图16-17中所示，研究结果显示CAN46 mAb的人源化形式(从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化的)保护小鼠免受毒素 B攻击。图16显示，所有CAN46G13a人源化mAb、 huCAN46G13a(10％)、cdrCAN46G13a(20％)、rehuCAN46G13a(30％) 在0.25mg/小鼠的剂量下在毒素B攻击后3天，在抗致死毒素B攻击的保护中是无效的。图17显示huCAN46G4、huCAN46G19、 huCAN46G24在0.25mg/小鼠的剂量下在保护免受致死毒素B攻击中是有效的，在毒素B攻击后3天，具有100％的存活率。
实施例17：总的人IgG ELISA
使用来自Bethyl Laboratories的人IgG ELISAQuantitation Set(Cat No.E80-104)并按照试剂盒说明书进行总的人IgG ELISA。对从正在经历毒素B攻击的小鼠收集的血清样品进行ELISA。在mAb注射后 12小时从小鼠收集血清，12小时后进行毒素攻击，随后再次在研究结束时(第4天)收集血清。第一与第二样品之间的时间为84小时。可检测的循环mAb的线性下降速率通过下列计算来测定：
[(攻击前12小时的血清中的mAb浓度)-(攻击后96小时的血清中的mAb浓度)]/84小时
结果：
如图18中所示，mAb的浓度在利用huCAN46G24 mAb(75ug和 250ug)或rehuCAN46G19 mAb(250ug)注射的小鼠中在84小时的时期内是相对稳定的。利用huCAN46G19(75ug和250ug)或 rehuCAN46G24(250ug)注射的小鼠损失50-75％的可检测的循环 mAb。对于所有测试的mAb，小鼠中循环mAb的水平在攻击后4天未降至低于12ug/ml。从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化所测试的mAb。
实施例18：毒素B的亲和力
使用生物膜层干涉技术测量人源化CAN46 mAb变体与毒素B的亲和力。将原液抗体用PBS稀释至1mg/ml，随后使用商购可得的试剂盒(Fisher Cat No.P121329)，使用1mmol生物素/1mmol Ab的比率在室温进行生物素化，持续30分钟。脱盐柱用于除去过量或未结合的生物素。Octet QKe仪配备有链霉抗生物素蛋白(SA)、抗-人Fc(AHC) 或抗-小鼠Fc(AMC)生物传感器。在PBST中预先洗涤传感器直至获得稳定的基线。将浓度为40ug/ml的mAb偶联/加载至8个传感器中的每一个。再次于PBST中洗涤所述传感器，直到获得稳定的基线和除去所有未结合的mab。将传感器与毒素B的稀释系列(50nM至0nM) 结合，随后于PBST中洗涤以评估毒素与每一种mAb的解离。使用 ForteBio数据分析软件来分析结果，以测定结合的平衡解离常数(KD) 或强度、mAb:毒素复合物形成速率(kon)和mAb:毒素复合物解离速率(kdis)。
结果：
从表达基于Per.C6的构建体的HEK293F细胞纯化所测试的抗体。如图24中所示，huCAN46 mAb具有更小的KD值，从而当与它们的鼠对应物相比较时具有更高的对TcdB的亲和力。虽然 rehuCAN46 mAb不具有相较于它们的鼠对应物更小的KD值，但它们不具有显著不同的Kdis值。所有人源化mAb形式显示相似的KD 值0.15-0.42M，这表明相似水平的对于毒素B的高亲和力。从表达基于CHO的构建体的CHOK1SV细胞纯化的人源化变体的相似分析示于图36中。对于CAN46G13a变体获得相似的亲和常数，然而 CAN46G24变体在人源化方案后展示次纳摩尔亲和常数。
实施例19：使用xCELLigenceTM平台，利用Vero细胞进行的艰难梭菌临床分离株毒素B的中和测定
细胞系-Vero细胞是猴肾成纤维细胞。这些细胞已被选择，因为它们对毒素B高度敏感然而对毒素A相对抗性。
xCELLigenceTM平台
xCELLigenceTM是基于电子阻抗细胞传感测量的实时无标记细胞分析(RTCA)系统，它能实时评价细胞特征的变化。细胞生长和细胞毒性可通过监测称为细胞指数(CI)的无量纲参数的增加或减小来检测。当在定制的96孔板内培养粘附细胞时，可通过电阻抗的变化(如通过包埋在每一个孔中的金电极测量的)来实时监测细胞的生长特征。
CI测量基于4个参数：1)细胞数目，2)细胞尺寸和形态学，3)细胞生活力，和4)细胞粘附。这些参数的任一个的增加导致CI的增加。相反地，这些参数的任一个的减小导致CI的减小。
艰难梭菌临床分离株培养物上清液的制备
9个疫情流行临床分离株和一个参考株(ATCC43255)被选择用于毒素B的中和测试。将孢子原液划线在大脑心浸液+0.1％牛磺胆酸盐 (BHI-T)板上，在35℃于厌氧室中培养48小时。将单个克隆转移至 50ml的TY培养基中，并培养4天。将细菌培养物离心，并将上清液通过0.2μm滤器进行过滤。将上清液于4℃贮存，并在BHI-T板中培养48小时，以确认灭菌。用Vero培养基将培养物上清液稀释至预定浓度(表11)，所述浓度在Vero细胞上诱导80-90％的细胞毒性。
表11.用于毒素B中和的艰难梭菌菌株和用于细胞毒性的稀释因子
描述 毒素类型 用于上清液的稀释因子
ATCC 43255 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-)</sup> 1:300,000
艰难梭菌K-14 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-</sup>) 1:1,000
艰难梭菌Y-2 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-</sup>) 1:8,200
艰难梭菌B1 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-</sup>) 1:8,000
艰难梭菌J9 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-</sup>) 1:500
艰难梭菌BI-6 III(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>+</sup>) 1:10,000
艰难梭菌BI-1 III(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>+</sup>) 1:16,500
艰难梭菌BI-17 III(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>+</sup>) 1:10,000
艰难梭菌CF-2 VII(A-B+) 1:2,000
艰难梭菌R23 0(A<sup>+</sup>B<sup>+</sup>CDI<sup>-</sup>) 1:350
将Vero细胞在T-75培养瓶中经受胰蛋白酶处理，随后将所述细胞以7500个细胞/孔添加至Roche 并在37℃孵育约4 小时。在4小时的孵育过程中，在96孔U型底板上制备抗-TcdB mAb 稀释物。随后通过用移液器反复吸打将样品与TcdB的适当稀释物(0.5-50ng/mL范围，稀释度取决于毒素批次)混合。随后将板在37℃孵育约60分钟。在完成初始细胞孵育后，用毒素/mAb制备物覆盖细胞，随后在37℃孵育最短72小时。在整个孵育期中每隔30分钟进行阻抗测量。使用xCELLigenceTM RTCA软件将该数据实时作图。选择代表最佳时间点的单个时间点(对于毒素的细胞毒性或中和)。将来自该单个时间点的数据用于产生用于分析的4-参数逻辑曲线。如果将测定样品效力，则针对“参照”样品约束样品曲线。曲线约束用于约束曲线的上/下渐近线，以及斜率。这允许每一个曲线基于曲线IC50值沿x-轴水平位移。对于效力测定，将标准的IC50值除以样品的IC50值。
细胞附着阶段-xCelligenceTM法
该阶段包括下列步骤。(1)在源培养瓶中对细胞进行胰蛋白酶处理。(2)向培养瓶中添加2mL胰蛋白酶，并洗涤细胞以除去痕量培养基，随后吸出。(3)添加3mL胰蛋白酶，并在37℃孵育约8分钟。(4) 向培养瓶中添加6mL测定培养基。(4)以368xg离心悬浮的细胞，进行8分钟。(5)吸出上清液，并用6mL的测定培养基重悬浮细胞。(6) 计数细胞并计算用于以7500个细胞/孔涂板所需的细胞体积。(7)向 96孔E-板的所有孔中添100μL测定培养基。(8)在xCelligence上进行背景读数。(10)向这些孔中添加50μL的1.5x105个细胞/mL悬浮液，以获得最终7500个细胞/孔的接种密度。(11)在室温孵育板20-30分钟以使细胞能够均匀沉降。(12)将板置于37℃的培养箱中，用5％CO2覆盖4-5小时。
毒素B的制备：(1)通过将初始原液(409.6μg/mL)稀释至200 pg/mL来制备毒素B覆盖物。(2)通过将初始原液稀释至80ng/mL来制备用于滴定的毒素B。(3)如表12中所示进行初始原液的稀释。
表12
样品制备：为了测试效力，以表13中显示的适当浓度制备所有单克隆抗体。
表13
稀释板的制备-xCelligence
使用U型底96孔板进行下列操作：(1)向孔B3-H9和C10-D11 中添加45μL测定培养基。(2)向孔B10-11中添加100μL的培养基。 (3)向如下表14中显示的对应孔B2-H2中添加50μL稀释的 mAb(10-6M或300μg/ml)。(4)通过从第2行转移5μL并添加至第3 行，混合，并重复直至第9行来对每一个样品进行10倍系列稀释，从第9行弃除5μL。(5)向C10、11添加45μL稀释的毒素B(200pg/ml)；向D10、11添加45μL稀释的分离株培养物上清液(表11)。(6)向孔B2-H9添加稀释的分离株1的培养物上清液(表11)，(7)将板在平板振荡器上摇动直至均匀。(8)在37℃下用5％CO2孵育60分钟。表13 显示xCelligence稀释板布局。
表14 xCelligence稀释板布局：艰难梭菌培养物上清液毒素B的中和的测试。板布局：分离株1，来自选择的艰难梭菌分离株的稀释的培养物上清液；CC：培养基对照；TC：纯毒素B对照(100pg/ml)。
向细胞板添加样品：(1)在完成孵育后，从培养箱取出细胞和稀释板。(2)将50μL样品从稀释板转移至细胞板的适当的孔中。(3)在 37℃下用5％CO2覆盖物孵育72小时。
数据分析：(1)使用Softmax Pro(v.5.4)软件将72小时时间点上的板数据拟合到每一个单个样品的4-参数逻辑(4-PL)曲线。(2)约束标准曲线和样品曲线(上/下渐近线，和斜率)，并将标准的IC50值除以样品的IC50值以测定效力评价(当适用时)。
结果
表26概述了每一种mAb的EC50数据，所述数据表明在 CHOK1SV细胞中产生的人源化CAN46G24、CAN46G13a和 CAN46G19变体中和艰难梭菌临床分离株的毒性的能力。柱形图显示针对艰难梭菌的特定临床分离株的每一种mAb的EC50。所述分离株包括一个参考株(ATCC43255)和9个代表性临床分离株，包括3个超毒力027株(BI-1、BI-6和BI-17)。每一种mAb针对每一种临床分离株的EC50不同。一般地，人源化CAN46G24和CAN46G19 mAb中和非-NAP1株，然而人源化CAN46G13a mAb更有效地针对NAP1 株。
实施例20：人源化毒素B的mAb在具有艰难梭菌B1孢子的仓鼠胃肠原发性感染模型中的效力
在感染前，仓鼠的组每天接受4次高剂量(50mg/kg体重)或低剂量(20mg/kg体重)的抗-毒素A和抗-毒素B的mAb的注射，进行4 天。在抗体注射的第3天，还给予仓鼠10mg/kg(体重)的克林霉素来清除肠道菌群，以增强艰难梭菌孢子感染。在抗体注射的最后一天同时向仓鼠胃内给予140B1孢子，并每天记录临床症状和存活2次，持续22天，同时每2天记录体重1次。在感染后第22天，对所有存活的仓鼠进行安乐死，并采集血清用于通过MAGPIXTM多重分析来测定抗-毒素抗体水平。关于完整实验步骤参考表15，并且关于对每一组仓鼠的注射参考表16。
通过Graphpad Prism 5软件分析存活、临床体征和体重的原始数据。在抗体注射之前(第3天)采集所有动物的血清和在第22天采集所有存活仓鼠的血清。通过Magplex分析血清样本的注射的毒素特异性抗体。
表15.实验步骤
表16.组的分配
组 仓鼠 孢子/仓鼠 其它
A 5 140 无抗-毒素(阴性对照)
B 7 140 CDA1/MDX-1388 50mg/kg的处理
C 7 140 HeCan20G2/HuCAN46G24 50mg/kg的处理
D 8 140 CDA1/MDX-1388 20mg/kg的处理
E 8 140 HeCan20G2/HuCAN46G24 20mg/kg的处理
结果：
用117CFU/动物的艰难梭菌B1孢子感染仓鼠，并每天观察2次，持续22天。在感染前-3、-2和-1天每天以50mg/kg或20mg/kg施用从表达基于CHO的构建体的CHOK1SV细胞纯化的抗-TcdA和TcdB mAb一次，在感染的当天第0天施用孢子。通过将B1孢子接种物的系列稀释物涂板在脑心浸液+0.1％牛磺胆酸盐(BHI-T)琼脂上并在厌氧室中孵育48小时来进行B1孢子和生活力的确认，并在感染过程中施用确认的117CFU/仓鼠。图27显示来自仓鼠原发性感染模型的存活数据。5只仓鼠中有4只(A组；无处理)在感染后48小时内死亡，并且在孢子施用后96小时第五只仓鼠死亡，表明感染已被建立。对于用抗体处理的动物(组B至E)，最终的存活率可从40％变化至80％以上，这与对照组A(无抗体处理)显著不同，这表明毒素特异性抗体处理的保护功能。mAb处理的仓鼠的存活率被认为是剂量和来源依赖性的。来自B组(CDA1/MDX-1388 50mg/kg)的7只仓鼠中有3只死于感染(感染后(DAI)2天一只死亡)，另外2只于13DAI死亡)，然而来自组C(HeCan20G2/HuCAN46G24 50mg/kg)的7只仓鼠中只有1 只在实验期中在第12天死于感染。对于更低剂量(20mg/kg)的处理组，组D(CDA1/MDX-1388)中8只动物中有5只死亡，并且在组 E(HeCan20G2/HuCAN46G24)处理组中8只仓鼠中有4只死亡。Cangene mAb HECAN20G2和huCAN46G24在50mg/kg的剂量上是有效的，在12天后具有100％的存活率，并且22天后具有80％的存活率。该组合在20mg/kg的剂量上也是有效的，在16天后具有100％的存活率，并且在20天后具有60％的存活率。因此，在等同的剂量上，HeCan20G2/HuCAN46G24处理导致相较于CDA1/MDX-1388处理更高的存活率，而对于相同来源的mAb，更高的剂量与更高的/更长的存活率相关。
图28A显示在原发性感染模型中所有组的平均体重(BW)在感染后降低并且在处理过程中得到恢复。组B(CDA1/MDX-1388 50mg/kg) 的BW在13DAI下降至原始基线BW的55％。在组C(HeCan20G2/HuCAN46G24 50mg/kg)中，BW在感染后下降至73％，在8DAI开始恢复，在16DAI达到基线BW的87％，并在约90％左右保持稳定。对于20mg/kg处理组，组D(CDA1/MDX-1388)和组 E(HeCan20G2/HuCAN46G24)的BW下降至基线BW的65％，并且此后开始恢复。在实验结束时，组D动物的BW达到原始重量的85％，而组E达到了原始基线BW的80％。
图28B示出了在处理组(组B、C、D和E)中在第22天存活仓鼠的血清中的毒素mAb的浓度。感染后(第22天)仓鼠血清样品显示8.83 μg/mL-308.72μg/mL范围内的抗-毒素AIgG抗体浓度。抗-毒素B IgG 抗体浓度在8.92μg/mL-85.11μg/mL范围内。
本研究的结果表明，在感染和随后的复发后，以两个剂量水平(50 mg/kg和20mg/kg)利用人源化HeCan20G2/HuCAN46G24的组合处理艰难梭菌B1感染的仓鼠有效且强劲地保护仓鼠免受疾病侵害，相较于利用CDA1/MDX-1388处理的仓鼠提高了长期存活。
实施例21：针对艰险梭菌临床分离株的源自Per.C6载体的人源化mAb的表征
艰难梭菌悬浮液的浓缩
艰难梭菌被选择来代表各种菌株，包括已知在人中引起CDI的菌株(由PFGE提供的NAP1)。从这些菌株，在厌氧培养室中在35℃下于TY培养液(200mL)中从孢子生长艰难梭菌，进行4天。通过离心沉淀细菌悬浮液，并将上清液进行过滤(0.22μm)以除去任何剩余的孢子和营养细胞。浓缩(Centricon 70plus)上清液，并用硫酸铵进行沉淀。通过在4℃缓慢搅拌10-12小时混合浆状物，并将其离心。用 Tris/NaCl洗涤所得的沉淀5次，以除去残余硫酸铵。如上利用 Centricon浓缩所得的毒素，并将其在4-8℃贮存(在Tris/NaCl)直至进行测试。
ELISA-毒素B测定，夹心ELISA
本研究中的所有艰难梭菌菌株，除CF2(A-B+)外，同时产生毒素 A和B(A+B+)。进行夹心ELISA以测定源自临床分离株的浓缩上清液中的毒素B的浓度。用试验制品(各种mAb)以1μg/mL涂覆微量滴定板(16小时，4℃)。涂覆之后，除去过量的捕获mAb，并封闭板(在 37℃，利用5％的牛奶进行1小时)。弃去该封闭试剂，洗涤板(利用 PBST，3次)。将稀释的标准和浓缩物(在2.5％牛奶中)添加至板并进行孵育(1小时，37℃)。除去所述标准/样品，将板洗涤并添加检测 Ab(针对毒素B的兔pAb)(1小时，37℃)。除去检测剂，洗涤板，并添加缀合物Ab(抗-兔HRP)(1小时，37℃)。除去和洗涤缀合物后，添加底物(TMB)，使其显影。利用1NH2SO4终止反应。在450nm处读取板。通过SoftMax进行分析。
直接ELISA-交叉反应性ELISA
此外，进行直接ELISA以测试人源化CAN46 mAb与临床分离菌株的交叉反应性。用艰难梭菌浓缩物涂覆微量滴定板(16小时， 4℃)。涂覆之后，除去过量浓缩物，并封闭板(37℃，利用5％的牛奶进行1小时)。弃去所述封闭试剂，洗涤板(利用PBST，3次)。向板中添加稀释的Ab(兔pAb，小鼠和人源化mAb，在2.5％的牛奶中)，并进行孵育(1小时，37℃)。除去Ab，并洗涤板。添加适当的缀合物 (抗-兔、抗-小鼠和抗-人，1小时，37℃)。在除去和洗涤缀合物后，添加底物(TMB)，使其显影。利用1N H2SO4终止反应。在450nm处读取板。
中和测定-CT26细胞
使CT-26细胞在RPMI-1600培养基(含有10％FBS，37℃，5％CO2) 中生长，以3x104个细胞/孔涂板，并使其附着于板(3小时)。在细胞毒性测试(生活力％)过程中预先确定所用的毒素浓度/稀释度。将毒素与Ab制备物混合(1:1)，并使其孵育(1小时，室温)。在细胞附着后，从CT-26细胞板除去培养基，并向CT-26板添加100μL的每一种毒素/Ab混合物。将板孵育约48小时(37℃，5％CO2)。孵育后，观察板以确定细胞变圆。对细胞生活力，向每一个孔中添加10μL/孔的 WST-1，并进一步孵育(1小时，37℃，5％CO2)。在440nm处读取板，并通过与细胞对照比较来分析其生活力％。
结果：将来自艰难梭菌菌株的浓缩毒素涂覆在板上，从而mAb 结合于涂覆的毒素。如下确定对涂覆的毒素的结合：高结合＝OD>0.800，中度结合＝OD<0.800并且>0.200，低结合＝OD<0.2。图 29显示，所有mAb显示高的对参考株ATCC43255的结合。 huCAN46G13a在测试的临床菌株中显示最多的高于低水平的结合。一般地，结合TcdB片段1的抗体显示相较于结合TcdB片段4的mAb 更好的对分离的毒素的结合。为了使这些反应标准化，如下进行相对兔pAb(rpAb)的免疫反应性：测试的mAb的ODx100/rpAb的OD。 CAN46G24和CAN46G13a的两种变体(Hu和rehu)具有针对不同艰难梭菌毒素B的免疫反应性。当使用夹心ELISA进行类似分析时，来自不同的临床分离株的毒素B具有不同程度的免疫反应性(图31)。图 31表明，huCAN46G13a mAb和Progenics mAb显示相似的对所有测试的NAP1菌株的结合特征。huCAN46G24 mAb和Medarex mAb显示相似的对所有测试的菌株的结合特征。为了证明两种ELISA方法之间的关系，利用皮尔逊(Pearson)相关分析来分析结果。几种mAb 的相关性和显著性值见于表17中。
1.1 表17：夹心ELISA与交叉反应性ELISA之间的皮尔逊相关分析和相关p值
r值>0表示两个ELISA结果之间存在正相关。p值<0.05，表示结果之间存在统计上显著的相关性。对于huCAN46G24、hpA41B和 MDX-1388，皮尔逊相关系数都为正的，并且是统计上显著的。对于 huCAN46G13a，相关系数是正的，但不具有统计显著性。综上所述，这表明这两种方法中的任一种都提供不同临床分离株之间的TcdB:抗 -TcdB相互作用的相对测定。由于艰难梭菌浓缩物含有毒素A和B，因此当在中和实验中使用浓缩物时，将毒素A的mAb(HECAN20G2) 与待研究的毒素B的mAb组合，以淬灭TcdA的细胞毒性活性。从 10μg/mL至0.8μg/mL测试单克隆Ab的浓度，并且在每一个Ab浓度下计算中和％。为了使反应标准化，计算5至0.16mg/mL的mAb 浓度之间的平均中和％，并将其用于对测试的mAb的效力进行分级。这些被举例说明性地显示于图30中。HECAN20G2/huCAN46G24中和B1，但具有减弱的针对NAP1株(BI-1、BI-6、BI-17)的保护作用。相反地，HECAN20G2/huCAN46G13a展示相反的趋势：减弱的针对测试的非NAP1菌株(B1)的保护作用，但中和BI-1、BI-6和BI-17。当将HECAN20G2与比较剂抗-毒素B候选物(hpA41或MDX1388) 组合时，相较于单独的比较剂组合(ProA/ProB,MDXA/MDXB)观察到更优的中和。
在图32中，与非NAP1菌株的免疫反应性表示为相对于针对毒素B的兔多克隆的百分比。所测试6种mAb显示高的针对ATCC参考菌株的免疫反应性和低的针对菌株J9、CF2、R23的免疫反应性。虽然大多数mAb显示弱的对B1、K14和Y2的结合，但huCAN46G13a 显示高的对B1和Y2的免疫反应性和中度的对K14的免疫反应性
在图33中，对NAP1菌株的免疫反应性被表示为相对于针对毒素B的兔多克隆的百分比。huCAN46G13a mAb和Progenics mAb显示高的对所有测试的菌株的免疫反应性。其它测试的mAb huCAN46G24、rehuCAN46G24、rehuCAN46G13a和Medarex mAb 显示弱的对所有测试的菌株的免疫反应性。
总之，4种测试的mAb显示相似的对所有测试的菌株的结合特征。在mAb当中，对来自艰难梭菌菌株J9的毒素的结合是最多样的， huCAN46G13a显示最弱的结合。
实施例22:人源化艰难梭菌毒素的mAb的产生
为了产生人源化艰难梭菌毒素的mAb，在启动子(包括 Kozak/HAVT20前导序列和终止子)的控制下在载体中共表达编码重链和轻链的单独的IgG序列。将内含子/外显子序列添加至每一个可变序列的3'末端，随后紧跟双终止密码子以发出终止转录物翻译的信号。对于κ轻链，这包括一个内含子/外显子(恒定外显子)。对于重链，这包括四组内含子/外显子(CH1、CH2和CH3恒定外显子)。在序列中包括内含子以允许真核生物加工mRNA转录物。表达构建体可用于在用于通过lipofectamine进行瞬时转染的适合的哺乳动物细胞系(HEK293F、CHO-S、CHOK1SV、Per.C6)中进行瞬时表达。所述表达载体还针对每一个表达系统包含适当的选择标记，以使得能够使用电穿孔在哺乳动物细胞培养中实现稳定表达。对于需要比较分析的实验，从编码CDA1(3D8κ链GenBank登录号DJ444525；重链GenBank 登录号CS483823)、MDX-1388(124-152κ链登录号CS483846，重链 CS483842)的公开序列和来自国际公开WO2011130650(A2)的hpA41 和hpA50序列合成mAb。合成重链和轻链，并将其克隆进全长IgG1 载体以用于在CHO-K1SV、HEK293F、Per.C6系统中表达。如上所概述，表达和纯化IgG1 mAb，并将其用作抗-TcdA活性(CDA1，针对TcdA片段4的特异性)(对于HeCAN20G2)，或具有针对片段 1(hpA41)(对于CAN46G13a)或片段4(MDX-1388)(对于CAN46G24、 CAN46G19和CAN46G4)的特异性的抗-TcdB活性的阳性对照。在瞬时转染后，倾析上清液，将其过滤(0.22um)，并使用搅拌细胞浓缩器和30kDa的膜进行浓缩。将浓缩物过滤(0.22um)，随后进行纯化。为了进行稳定的转染，筛选和分离克隆，以评估分批和补料-分批生长。在蛋白G柱上纯化IgG(经浓缩和过滤的上清液)，随后进行缓冲液交换和浓缩。对于最终的浓缩物，通过BCA测定或利用配备有蛋白A 生物传感器的Octet QKe仪相对人IgG等同物的标准曲线来测定蛋白质含量。
结果：表18，显示瞬时和稳定转染中的huCAN46G24和 huCAN46G13a的代表性表达滴度。根据这些平均值，提供材料以进行表征、体外和体内分析。
表18.在瞬时和稳定表达系中标准化成mg/L的代表性表达滴度 (BOG＝分批过度生长，FOG＝补料-分批过度生长)。
虽然已描述和举例说明本发明的具体方面，但这类方面应被视为仅举例说明本发明，并且不被视为限制如根据所附权利要求解释的本发明。本说明书中引用的所有出版物和专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文，就如各个单独出版物或专利申请出于所有目的被具体和单独地指出以通过引用并入一样。尽管为了理解清楚的目的已经通过说明和实施例较详细地描述了上述发明，但根据本发明的教导对于本领域普通技术人员显而易见的是，可对其进行某些改变和改进而不背离所附权利要求的精神或范围。
序列表
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<120> 针对艰难梭菌的抗体
<130> 4328-006.3-PCT
<140> PCT
<141> 2013-11-29
<150> US 61/730,790
<151> 2012-11-28
<160> 784
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 546
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 1
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg
1 5 10 15
Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu
20 25 30
Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys
35 40 45
Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys
50 55 60
Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val
65 70 75 80
Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys
85 90 95
Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn
115 120 125
Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr
130 135 140
Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met
165 170 175
Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala
180 185 190
Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr
195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr
210 215 220
Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val
225 230 235 240
Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu
245 250 255
Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu
260 265 270
Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Asp Val Asp
275 280 285
Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro
290 295 300
Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile
305 310 315 320
Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp
325 330 335
Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser
340 345 350
Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala
355 360 365
Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn
370 375 380
Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val
385 390 395 400
Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro
405 410 415
Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile
420 425 430
Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met
435 440 445
Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr
450 455 460
Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp
465 470 475 480
Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala
485 490 495
Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr
500 505 510
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Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly
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Glu Asp
545
<210> 2
<211> 590
<212> PRT
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Glu Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Lys Leu Ala Phe Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
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<213> 小家鼠
<400> 12
Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Thr Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 17
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Thr Ser Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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<213> 小家鼠
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Glu Thr Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
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<211> 17
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<213> 小家鼠
<400> 24
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ile Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
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<213> 小家鼠
<400> 26
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 小家鼠
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Thr His Val Lys Ser Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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<213> 小家鼠
<400> 28
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
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<213> 小家鼠
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<212> PRT
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<213> 小家鼠
<400> 31
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<213> 小家鼠
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Arg
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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1
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 39
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu Ile
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His
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 41
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Asn Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Ser Arg Val Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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<213> 小家鼠
<400> 44
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Ser Ala
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 45
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 46
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 47
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 48
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Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 49
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<213> 小家鼠
<400> 50
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 51
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 53
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1
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 54
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<211> 17
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<213> 小家鼠
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Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 57
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 58
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 59
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Leu Thr Val Ser Ser
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<213> 小家鼠
<400> 60
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 61
Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 62
Ala Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 63
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<213> 小家鼠
<400> 64
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Arg
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 65
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 66
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 67
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<213> 小家鼠
<400> 68
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 69
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1
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<213> 小家鼠
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<213> 小家鼠
<400> 71
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 72
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Tyr
<210> 73
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 73
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
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<210> 74
<211> 10
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<213> 小家鼠
<400> 74
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1 5 10
<210> 75
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
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100 105 110
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 76
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 77
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 78
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1 5 10
<210> 79
<211> 25
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 79
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20 25
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 80
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1 5 10 15
Arg
<210> 81
<211> 38
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 81
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 82
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 83
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Glu Tyr Thr Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 84
Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
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Gly Ala Thr
1
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 86
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1 5
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 88
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 89
<211> 36
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 89
Ser Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Glu Tyr Thr Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Glu Asp Phe Val
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 90
Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 91
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Asn Trp Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser
100 105 110
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115
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<213> 小家鼠
<400> 92
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 93
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1 5
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<212> PRT
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<400> 94
Thr Arg Ser Asn Trp Glu Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
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<400> 95
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 96
Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 97
<211> 38
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 97
Asn Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
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35
<210> 98
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 98
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 99
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1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 101
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1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 102
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 103
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 104
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1 5 10 15
Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 105
Lys Leu Ala Phe Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 106
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
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<220>
<223> 人源化的
<400> 108
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 109
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 111
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 112
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1 5 10 15
Arg
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 113
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 115
Glu Lys Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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50 55 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 117
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 118
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 119
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 120
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1 5 10 15
Tyr
<210> 121
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 121
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 122
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<210> 123
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
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Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 124
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1 5
<210> 125
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 125
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1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 126
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 127
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 128
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1 5 10 15
Arg
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 129
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
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35
<210> 130
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 130
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<210> 131
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 131
Glu Lys Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
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35 40 45
Glu Thr Ser Lys Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 132
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1 5
<210> 133
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 133
Glu Thr Ser
1
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 134
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 135
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 135
Glu Lys Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 136
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 137
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 137
Lys Leu Ala Phe Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 138
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1 5 10
<210> 139
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 139
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Thr Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 140
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 141
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 141
Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 142
Thr Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 143
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 143
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 144
Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 145
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 145
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 146
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 147
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 148
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 149
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 149
Arg Thr Ser
1
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 150
Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 151
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 153
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 154
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 155
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 155
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 156
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp Ser Ala
1 5
<210> 157
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 157
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 158
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 158
Ala Arg Arg Ser Arg Val Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 159
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 161
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 162
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 163
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 163
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
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<213> 小家鼠
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 165
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1
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 166
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1 5
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 167
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 168
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1 5 10 15
His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 169
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1 5 10 15
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
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35
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 171
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 172
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<213> 小家鼠
<400> 173
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1 5
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 174
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 175
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 176
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1 5 10 15
Tyr
<210> 177
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 177
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1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 178
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1 5 10
<210> 179
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 179
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 182
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 185
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 186
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 187
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
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Ser Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
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Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 188
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 189
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1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 190
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<210> 191
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 191
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 192
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1 5 10 15
Tyr
<210> 193
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 193
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
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35
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 194
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 195
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 195
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 197
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1
<210> 198
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 198
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1 5
<210> 199
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 199
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<210> 200
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 200
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1 5 10 15
Tyr
<210> 201
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 201
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20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 202
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 202
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 203
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 203
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 204
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1 5
<210> 205
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 205
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1 5
<210> 206
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 206
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1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<400> 207
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20 25
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 208
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1 5 10 15
Arg
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<211> 38
<212> PRT
<213> 智人
<400> 209
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 210
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
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1 5 10
<210> 211
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 211
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50 55 60
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 212
Ser Ser Val Thr Tyr
1 5
<210> 213
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 213
Glu Thr Ser
1
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 214
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1 5
<210> 215
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 215
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 216
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1 5 10 15
Tyr
<210> 217
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 217
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 218
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 218
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 219
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 219
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
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100 105 110
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115
<210> 220
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 220
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 221
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 221
Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala
1 5
<210> 222
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 222
Ala Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 223
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 223
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 224
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 224
Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 225
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 225
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 226
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 226
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 227
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 227
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105
<210> 228
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 228
Ser Ser Val Thr Tyr
1 5
<210> 229
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 229
Glu Thr Ser
1
<210> 230
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 230
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 231
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 231
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
20 25
<210> 232
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 232
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 233
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 233
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asn Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 234
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 234
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 235
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
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<213> 小家鼠
<400> 236
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<211> 8
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<400> 237
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 239
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 240
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1 5 10 15
Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 241
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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<213> 小家鼠
<400> 242
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 243
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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<212> PRT
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<400> 246
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<213> 智人
<400> 249
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Thr Tyr Tyr Cys
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<400> 250
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 251
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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<400> 254
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<400> 258
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<213> 人工序列
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<400> 259
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 264
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Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 265
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<223> 人源化的
<400> 275
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20 25 30
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Tyr
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 281
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<400> 282
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<212> PRT
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<220>
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115
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 284
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 285
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 285
Ile Phe Pro Tyr Asn Gly Ala Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 286
Ala Arg Trp Leu Arg Val Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 287
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 288
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 288
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1 5 10 15
Arg
<210> 289
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 289
Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys
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35
<210> 290
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 290
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1 5 10
<210> 291
<211> 318
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 291
gaaaaggttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga agaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcatt ggtaccagca gaagtcaagc 120
acctccccca aactctggat ttatgaaaca tccaaactgg cttttggagt cccaggtcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg aaactcttac tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa 240
gatgttgcca cttattactg ttttcagggg agtgggtacc cattcacgtt cggctcgggg 300
acaaagttgg aagtaaaa 318
<210> 292
<211> 15
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 292
tcaagtgtaa gttac 15
<210> 293
<211> 9
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 293
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<210> 294
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 294
tttcagggga gtgggtaccc attcacg 27
<210> 295
<211> 78
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 295
gaaaaggttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga agaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagc 78
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 296
atgcattggt accagcagaa gtcaagcacc tcccccaaac tctggattta t 51
<210> 297
<211> 108
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 297
aaactggctt ttggagtccc aggtcgcttc agtggcagtg gatctggaaa ctcttactct 60
ctcacgatca gcagcatgga ggctgaagat gttgccactt attactgt 108
<210> 298
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 298
ttcggctcgg ggacaaagtt ggaagtaaaa 30
<210> 299
<211> 351
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 299
gaggtccagc tgctacagtc tggccctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctgatta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaagcaaagc 120
catgtaaaga gccttgagtg gattggacgt atttttcctt acaatggtgc tgctagctac 180
aaccagaatt tcaaggacaa ggccaccttg actgtagata agtcttccag cacagcctac 240
atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attattgtac aagatggtta 300
agggtctact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 300
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 300
gattactcat tcactggcta ctac 24
<210> 301
<211> 24
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 301
atttttcctt acaatggtgc tgct 24
<210> 302
<211> 30
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 302
acaagatggt taagggtcta ctttgactac 30
<210> 303
<211> 75
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 303
gaggtccagc tgctacagtc tggccctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttct 75
<210> 304
<211> 51
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 304
atgcactggg tgaagcaaag ccatgtaaag agccttgagt ggattggacg t 51
<210> 305
<211> 114
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 305
agctacaacc agaatttcaa ggacaaggcc accttgactg tagataagtc ttccagcaca 60
gcctacatgg agctccacag cctgacatct gaggactctg cagtctatta ttgt 114
<210> 306
<211> 33
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 306
tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tca 33
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<213> 小家鼠
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gaggtccagc tgctacagtc tggccctgag ctggtgaagc ctgggacttc agtgaagata 60
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<213> 小家鼠
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ggttactcat tcactggcta ctac 24
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gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 384
atgcactggg tgaagcagag ccatggaaag agccttgagt ggattggacg t 51
<210> 385
<211> 114
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 385
aattacaacc agaatttcaa ggacaaggcc atattaactg tagacaagtc agccagtaca 60
gcctacatgg agttccgcag cctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgt 114
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 386
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<210> 387
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 387
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<210> 388
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 388
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<210> 389
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<223> 人源化的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<213> 人工序列
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<223> 人源化的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 395
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<213> 人工序列
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<223> 人源化的
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<213> 人工序列
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<223> 人源化的
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<213> 人工序列
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tttcagggga gtgggtaccc attcacg 27
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<223> 人源化的
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<223> 人源化的
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<220>
<223> 人源化的
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人源化的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 437
atttttcctt acaatggtgc tgct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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gcaagatggt taagggtcta ctttgactac 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 439
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tcctgcaagg cttct 75
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 441
agctacaatc agaatttcaa gggcaaggcc accttgactg tagataagtc ctccagcaca 60
gcctacatgg agctccacag cctgacatct gaggactctg cagtctattt ctgt 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 442
tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcag 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 443
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
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cccggcaagg cccccaagct gctgatctac cgcacctcca ccctggcctc cggcgtgccc 180
tcccgcttct ccggctccgg ctccggcacc gacttcacct tcaccatctc ctccctgcag 240
cccgaggaca tcgccaccta ctactgccag cagtggtccg gctaccccta caccttcggc 300
cagggcacca aggtggagat caagc 325
<210> 444
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 444
tcctccgtgt cctcctccta c 21
<210> 445
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 445
cgcacctcc 9
<210> 446
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 446
cagcagtggt ccggctaccc ctacacc 27
<210> 447
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 447
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgct ccgcctcc 78
<210> 448
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 448
ctgcactggt accagcagaa gcccggcaag gcccccaagc tgctgatcta c 51
<210> 449
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 449
accctggcct ccggcgtgcc ctcccgcttc tccggctccg gctccggcac cgacttcacc 60
ttcaccatct cctccctgca gcccgaggac atcgccacct actactgc 108
<210> 450
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 450
ttcggccagg gcaccaaggt ggagatcaag c 31
<210> 451
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 451
caggtgcagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctcccagac cctgtccctg 60
acctgcaccg tgtccggcgg ctccatctcc tccgactccg cctggaactg gatccgccag 120
ccccccggca agggcctgga gtggatcggc tacatctcct actccggctc cacctcctac 180
aacccctccc tgaagtcccg cgtgaccatg tccgtggaca cctccaagaa ccagttctcc 240
ctgaaggtga actccgtgac cgccgccgac accgccgtgt actactgcgc ccgccgctcc 300
cgcgtgtcct tctacttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctccg 358
<210> 452
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 452
ggcggctcca tctcctccga ctccgcc 27
<210> 453
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 453
atctcctact ccggctccac c 21
<210> 454
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 454
gcccgccgct cccgcgtgtc cttctacttc gactac 36
<210> 455
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 455
caggtgcagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctcccagac cctgtccctg 60
acctgcaccg tgtcc 75
<210> 456
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 456
tggaactgga tccgccagcc ccccggcaag ggcctggagt ggatcggcta c 51
<210> 457
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 457
tcctacaacc cctccctgaa gtcccgcgtg accatgtccg tggacacctc caagaaccag 60
ttctccctga aggtgaactc cgtgaccgcc gccgacaccg ccgtgtacta ctgc 114
<210> 458
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 458
tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc tccg 34
<210> 459
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 459
gagaacgtgc tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgtcc tcctcctacc tgcactggta ccagcagaag 120
cccggcaagt cccccaagcc cctgatccac cgcacctcca ccctggcctc cggcgtgccc 180
tcccgcttct ccggctccgg ctccggcacc tcctactccc tgaccatctc ctccctgcag 240
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<223> 人源化的
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 740
ggctatacat ttaccgggta ctat 24
<210> 741
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 741
attttcccat acaacggagc cgcc 24
<210> 742
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 742
gcccggtggc tgagagtgta cttcgattat 30
<210> 743
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 743
caggtccagc tggtccagtc tggggctgag gtcaaaaaac ccggctcttc cgtcaaagtc 60
tcctgcaaag catct 75
<210> 744
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 744
atgcactggg tgagacaggc acctgggcag ggactggagt ggatcgggag g 51
<210> 745
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 745
agctataacc agaacttcaa ggacaaagcc actatcaccg ctgatgaaag tacaaatact 60
gcctacatgg agctgagctc cctgaggtct gaagacactg cagtctacta ttgc 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 746
tggggccagg ggacactggt caccgtgagc agtg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 747
gagaaggtcc tgacacagtc acccgctacc ctgtccctga gccctggcga gagagccact 60
atgacctgct cagcttccag ctctgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagccagga 120
acctctccca aactgtggat ctacgaaacc agtaagctgg ctttcggggt gccagcacgc 180
ttttctggca gtggatcagg gaactcctat agcctgacca ttagttcact ggaaccagaa 240
gacttcgctg tgtactattg ctttcagggt agcggctacc ccttcacctt tggacagggg 300
acaagactgg agatcaagc 319
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<212> DNA
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agctctgtgt cctac 15
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gaaaccagt 9
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<220>
<223> 人源化的
<400> 751
gagaaggtcc tgacacagtc acccgctacc ctgtccctga gccctggcga gagagccact 60
atgacctgct cagcttcc 78
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<223> 人源化的
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atgcactggt atcagcagaa gccaggaacc tctcccaaac tgtggatcta c 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 753
aagctggctt tcggggtgcc agcacgcttt tctggcagtg gatcagggaa ctcctatagc 60
ctgaccatta gttcactgga accagaagac ttcgctgtgt actattgc 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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tttggacagg ggacaagact ggagatcaag c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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gaagtgcagc tgctgcagtc cggagctgag gtcaagaaac ccgggtcatc cgtgaagatt 60
agctgtaaag catctgatta cagttttacc ggctactata tgcactgggt gaagcaggca 120
cctggtcagg gactggagtg gatcggtaga attttcccct acaatggcgc tgcatcctat 180
aaccagaatt ttaaggacaa agctaccctg acagtggata agagctctag taccgcatat 240
atggagctgc attcactgcg ctccgaagac acagccgtct actattgcac taggtggctg 300
cgggtgtact tcgattattg gggacagggg accctggtca cagtgtcatc cg 352
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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gattacagtt ttaccggcta ctat 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
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attttcccct acaatggcgc tgca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 758
actaggtggc tgcgggtgta cttcgattat 30
<210> 759
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 759
gaagtgcagc tgctgcagtc cggagctgag gtcaagaaac ccgggtcatc cgtgaagatt 60
agctgtaaag catct 75
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<212> DNA
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<220>
<223> 人源化的
<400> 760
atgcactggg tgaagcaggc acctggtcag ggactggagt ggatcggtag a 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 761
tcctataacc agaattttaa ggacaaagct accctgacag tggataagag ctctagtacc 60
gcatatatgg agctgcattc actgcgctcc gaagacacag ccgtctacta ttgc 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 762
tggggacagg ggaccctggt cacagtgtca tccg 34
<210> 763
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 763
gaaaaggtcc tgactcagtc ccccgctact ctgtcagcat cccctggcga gagagtcacc 60
atgagctgct ctgcctccag ctctgtgtct tacatgcact ggtatcagca gaagcctggt 120
cagagtccca aactgtggat ctacgaaact tcaaagctgg cattcggcgt gccagcccgc 180
tttagtggct caggatccgg gaccgactat tccctgacaa ttagttcaat ggagccagaa 240
gatttcgcta catactattg ctttcagggt agcggctacc ccttcacttt tggacagggg 300
accagactgg agatcaagc 319
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 764
agctctgtgt cttac 15
<210> 765
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 765
gaaacttca 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 766
tttcagggta gcggctaccc cttcact 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 767
gaaaaggtcc tgactcagtc ccccgctact ctgtcagcat cccctggcga gagagtcacc 60
atgagctgct ctgcctcc 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 768
atgcactggt atcagcagaa gcctggtcag agtcccaaac tgtggatcta c 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 769
aagctggcat tcggcgtgcc agcccgcttt agtggctcag gatccgggac cgactattcc 60
ctgacaatta gttcaatgga gccagaagat ttcgctacat actattgc 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 770
tttggacagg ggaccagact ggagatcaag c 31
<210> 771
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 771
gaagtgcagc tgctgcagtc cggtgcagag gtggtcaagc caggatcatc cgtgaagatt 60
agctgtaaag ctagcggtta ctcttttacc ggctactata tgcactgggt gaagcaggca 120
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aaccagaatt ttaaggacaa agccacactg actgctgata agtccaccaa tacagcatat 240
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 772
ggttactctt ttaccggcta ctat 24
<210> 773
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 773
attttcccct acaacggggc tgca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 774
accaggtggc tgcgggtgta cttcgattat 30
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 775
gaagtgcagc tgctgcagtc cggtgcagag gtggtcaagc caggatcatc cgtgaagatt 60
agctgtaaag ctagc 75
<210> 776
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 776
atgcactggg tgaagcaggc acctggtcag ggcctggagt ggatcggaag a 51
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<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 777
tcttataacc agaattttaa ggacaaagcc acactgactg ctgataagtc caccaataca 60
gcatatatgg agctgagctc tctgcgcagt gaagactcag ccgtctacta ttgc 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 778
tggggacagg ggaccctggt cacagtgagt tcag 34
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 779
gagaatgtcc tgactcagtc ccctgctatt atggccgctt ccctggggca gaaagtgact 60
atgacctgtt ccgcttcctc ttccgtcagc tcctcttacc tgcactggta tcagcagaag 120
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gcagaagacg atgccaccta ctattgccag cagtggtctg ggtaccctta tacctttggc 300
gggggaacaa agctggagat caaa 324
<210> 780
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 780
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu
35 40 45
Ile His Arg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 781
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 781
gacgtgcagc tgcaggaatc tgggcctggg ctggtgaaac ctagtcagtc tctgtctctg 60
acctgtaccg tgaccggata ctcaatcacc tccgattctg cctggaactg gatcaggcag 120
ttccctggca acaatctgga gtggatggga tacattagtt attcaggcag cacatcctac 180
aatccatccc tgaagtctag gatcagtatt acccgcgaca caagtaaaaa ccagttcttt 240
ctgcagctga attcagtgac cacagaagat accgctacat actattgcgc acggagatca 300
cgggtgagct tctactttga ctattggggg cagggaacta ccctgactgt cagctcc 357
<210> 782
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的
<400> 782
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Asn Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Arg Val Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 783
<211> 2366
<212> PRT
<213> 艰难梭菌
<400> 783
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gln Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg
1 5 10 15
Phe Arg Thr Gln Glu Asp Glu Tyr Val Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu
20 25 30
Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys
35 40 45
Leu Lys Asp Ile Asn Ser Leu Thr Asp Ile Tyr Ile Asp Thr Tyr Lys
50 55 60
Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val
65 70 75 80
Thr Glu Val Leu Glu Leu Lys Asn Asn Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys
85 90 95
Asn Leu His Phe Val Trp Ile Gly Gly Gln Ile Asn Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Asn Tyr Ile Asn Gln Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn
115 120 125
Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu Ile Asn Thr Leu Lys Lys Thr
130 135 140
Val Val Glu Ser Ala Ile Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Arg Phe Asp Tyr Asn Lys Phe Phe Arg Lys Arg Met
165 170 175
Glu Ile Ile Tyr Asp Lys Gln Lys Asn Phe Ile Asn Tyr Tyr Lys Ala
180 185 190
Gln Arg Glu Glu Asn Pro Glu Leu Ile Ile Asp Asp Ile Val Lys Thr
195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Glu Ile Asp Glu Leu Asn Thr Tyr
210 215 220
Ile Glu Glu Ser Leu Asn Lys Ile Thr Gln Asn Ser Gly Asn Asp Val
225 230 235 240
Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Asn Gly Glu Ser Phe Asn Leu Tyr Glu
245 250 255
Gln Glu Leu Val Glu Arg Trp Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu
260 265 270
Arg Ile Ser Ala Leu Lys Glu Ile Gly Gly Met Tyr Leu Asp Val Asp
275 280 285
Met Leu Pro Gly Ile Gln Pro Asp Leu Phe Glu Ser Ile Glu Lys Pro
290 295 300
Ser Ser Val Thr Val Asp Phe Trp Glu Met Thr Lys Leu Glu Ala Ile
305 310 315 320
Met Lys Tyr Lys Glu Tyr Ile Pro Glu Tyr Thr Ser Glu His Phe Asp
325 330 335
Met Leu Asp Glu Glu Val Gln Ser Ser Phe Glu Ser Val Leu Ala Ser
340 345 350
Lys Ser Asp Lys Ser Glu Ile Phe Ser Ser Leu Gly Asp Met Glu Ala
355 360 365
Ser Pro Leu Glu Val Lys Ile Ala Phe Asn Ser Lys Gly Ile Ile Asn
370 375 380
Gln Gly Leu Ile Ser Val Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asn Leu Ile Val
385 390 395 400
Lys Gln Ile Glu Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asn Ser Leu Asn Pro
405 410 415
Ala Ile Ser Glu Asp Asn Asp Phe Asn Thr Thr Thr Asn Thr Phe Ile
420 425 430
Asp Ser Ile Met Ala Glu Ala Asn Ala Asp Asn Gly Arg Phe Met Met
435 440 445
Glu Leu Gly Lys Tyr Leu Arg Val Gly Phe Phe Pro Asp Val Lys Thr
450 455 460
Thr Ile Asn Leu Ser Gly Pro Glu Ala Tyr Ala Ala Ala Tyr Gln Asp
465 470 475 480
Leu Leu Met Phe Lys Glu Gly Ser Met Asn Ile His Leu Ile Glu Ala
485 490 495
Asp Leu Arg Asn Phe Glu Ile Ser Lys Thr Asn Ile Ser Gln Ser Thr
500 505 510
Glu Gln Glu Met Ala Ser Leu Trp Ser Phe Asp Asp Ala Arg Ala Lys
515 520 525
Ala Gln Phe Glu Glu Tyr Lys Arg Asn Tyr Phe Glu Gly Ser Leu Gly
530 535 540
Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gln Asn Ile Val Val Asp Lys Glu
545 550 555 560
Tyr Leu Leu Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ala Arg Ser Ser Glu Arg Gly
565 570 575
Tyr Ile His Tyr Ile Val Gln Leu Gln Gly Asp Lys Ile Ser Tyr Glu
580 585 590
Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Asp Ser Val Leu Phe
595 600 605
Gln Lys Asn Ile Glu Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro Gly
610 615 620
Asp Gly Glu Ile Gln Glu Ile Asp Lys Tyr Lys Ile Pro Ser Ile Ile
625 630 635 640
Ser Asp Arg Pro Lys Ile Lys Leu Thr Phe Ile Gly His Gly Lys Asp
645 650 655
Glu Phe Asn Thr Asp Ile Phe Ala Gly Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser
660 665 670
Thr Glu Ile Glu Ala Ala Ile Asp Leu Ala Lys Glu Asp Ile Ser Pro
675 680 685
Lys Ser Ile Glu Ile Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr Ser
690 695 700
Ile Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Val Lys
705 710 715 720
Asp Lys Ile Ser Glu Leu Met Pro Ser Ile Ser Gln Asp Ser Ile Ile
725 730 735
Val Ser Ala Asn Gln Tyr Glu Val Arg Ile Asn Ser Glu Gly Arg Arg
740 745 750
Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp Ile Asn Lys Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Ile Lys Asp Ile Ser Ser Lys Glu Tyr Ile Ser Phe Asn Pro Lys Glu
770 775 780
Asn Lys Ile Thr Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr Leu
785 790 795 800
Leu Gln Glu Ile Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp Ile Glu Leu Glu
805 810 815
Glu Lys Val Met Leu Thr Glu Cys Glu Ile Asn Val Ile Ser Asn Ile
820 825 830
Asp Thr Gln Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Lys Asn Leu Thr
835 840 845
Ser Asp Ser Ile Asn Tyr Ile Lys Asp Glu Phe Lys Leu Ile Glu Ser
850 855 860
Ile Ser Asp Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gln Gln Asn Glu Leu Glu Asp
865 870 875 880
Ser His Phe Ile Ser Phe Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Phe
885 890 895
Ser Ile Arg Phe Ile Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser Ile Phe Val Glu
900 905 910
Thr Glu Lys Thr Ile Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His Ile Thr Glu Glu
915 920 925
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Thr Ile Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys Leu
930 935 940
Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu Asn
945 950 955 960
Ala Ala Phe Phe Ile Gln Ser Leu Ile Glu Tyr Asn Ser Ser Lys Glu
965 970 975
Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gln Val Tyr Ala Gln
980 985 990
Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr Ile Thr Asp Ala Ala Lys Val Val
995 1000 1005
Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr Ile Asp Leu Leu Pro
1010 1015 1020
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile Ala Thr Ile Ile Asp Gly
1025 1030 1035
Val Ser Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp
1040 1045 1050
Pro Leu Leu Arg Gln Glu Ile Glu Ala Lys Ile Gly Ile Met Ala
1055 1060 1065
Val Asn Leu Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr Ser Ser Leu
1070 1075 1080
Gly Ile Ala Ser Gly Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly
1085 1090 1095
Ile Ser Ala Gly Ile Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu
1100 1105 1110
Arg Asp Lys Ala Thr Lys Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser
1115 1120 1125
Leu Val Glu Thr Glu Gly Val Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile
1130 1135 1140
Met Met Pro Gln Asp Asp Leu Val Ile Ser Glu Ile Asp Phe Asn
1145 1150 1155
Asn Asn Ser Ile Val Leu Gly Lys Cys Glu Ile Trp Arg Met Glu
1160 1165 1170
Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Phe
1175 1180 1185
Ser Ala Pro Ser Ile Thr Tyr Arg Glu Pro His Leu Ser Ile Tyr
1190 1195 1200
Asp Val Leu Glu Val Gln Lys Glu Glu Leu Asp Leu Ser Lys Asp
1205 1210 1215
Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala Trp Glu
1220 1225 1230
Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly Thr
1235 1240 1245
Lys Leu Leu Asp Arg Ile Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr
1250 1255 1260
Trp Arg Tyr Phe Ala Phe Ile Ala Asp Ala Leu Ile Thr Thr Leu
1265 1270 1275
Lys Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Arg Ile Asn Leu Asp Ser
1280 1285 1290
Asn Thr Arg Ser Phe Ile Val Pro Ile Ile Thr Thr Glu Tyr Ile
1295 1300 1305
Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr
1310 1315 1320
Ala Leu Ser Leu Ser Gln Tyr Asn Met Gly Ile Asn Ile Glu Leu
1325 1330 1335
Ser Glu Ser Asp Val Trp Ile Ile Asp Val Asp Asn Val Val Arg
1340 1345 1350
Asp Val Thr Ile Glu Ser Asp Lys Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ile
1355 1360 1365
Glu Gly Ile Leu Ser Thr Leu Ser Ile Glu Glu Asn Lys Ile Ile
1370 1375 1380
Leu Asn Ser His Glu Ile Asn Phe Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser
1385 1390 1395
Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser Ile Leu Glu Gly Ile Asn
1400 1405 1410
Ala Ile Ile Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys Ser Tyr Lys Leu Leu
1415 1420 1425
Ile Ser Gly Glu Leu Lys Ile Leu Met Leu Asn Ser Asn His Ile
1430 1435 1440
Gln Gln Lys Ile Asp Tyr Ile Gly Phe Asn Ser Glu Leu Gln Lys
1445 1450 1455
Asn Ile Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu Asn Gly
1460 1465 1470
Phe Ile Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu Leu
1475 1480 1485
Pro Asp Val Val Leu Ile Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys
1490 1495 1500
Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val
1505 1510 1515
Ile Thr Lys Asp Asn Val Asn Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys
1520 1525 1530
Asp Asp Ile Lys Ile Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gln Asp Glu Lys
1535 1540 1545
Thr Ile Lys Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala
1550 1555 1560
Glu Ile Leu Lys Phe Met Asn Arg Lys Gly Asn Thr Asn Thr Ser
1565 1570 1575
Asp Ser Leu Met Ser Phe Leu Glu Ser Met Asn Ile Lys Ser Ile
1580 1585 1590
Phe Val Asn Phe Leu Gln Ser Asn Ile Lys Phe Ile Leu Asp Ala
1595 1600 1605
Asn Phe Ile Ile Ser Gly Thr Thr Ser Ile Gly Gln Phe Glu Phe
1610 1615 1620
Ile Cys Asp Glu Asn Asp Asn Ile Gln Pro Tyr Phe Ile Lys Phe
1625 1630 1635
Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Val Gly Asn Arg Gln
1640 1645 1650
Asn Met Ile Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu Asp Asp Ser Gly Asp
1655 1660 1665
Ile Ser Ser Thr Val Ile Asn Phe Ser Gln Lys Tyr Leu Tyr Gly
1670 1675 1680
Ile Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val Ile Ser Pro Asn Ile Tyr
1685 1690 1695
Thr Asp Glu Ile Asn Ile Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn Asn Thr
1700 1705 1710
Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu Asp Ala Asn Tyr Ile Asn Glu Lys
1715 1720 1725
Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu Ser Ile Arg Tyr Val Trp Ser
1730 1735 1740
Asn Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn
1745 1750 1755
Lys Val Ser Gln Val Lys Ile Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp
1760 1765 1770
Lys Thr Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gln
1775 1780 1785
Asp Val Pro Val Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr
1790 1795 1800
Tyr Glu Asp Gly Leu Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu
1805 1810 1815
Tyr Asn Glu Lys Phe Tyr Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser
1820 1825 1830
Gly Leu Ile Tyr Ile Asn Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro
1835 1840 1845
Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys
1850 1855 1860
Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly Ala Ala Ser Ile Gly Glu
1865 1870 1875
Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe Asn Gln Ser Gly Val
1880 1885 1890
Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe
1895 1900 1905
Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly Glu Ala Ile
1910 1915 1920
Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr Tyr Phe
1925 1930 1935
Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp Gly
1940 1945 1950
Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly
1955 1960 1965
Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly
1970 1975 1980
Val Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr
1985 1990 1995
Phe Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp
2000 2005 2010
Gly Lys His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly
2015 2020 2025
Val Phe Asn Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn
2030 2035 2040
Glu Asp Leu Gly Asn Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly
2045 2050 2055
Ile Leu Asn Phe Asn Asn Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe
2060 2065 2070
Thr Ala Val Val Gly Trp Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr
2075 2080 2085
Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu
2090 2095 2100
Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gln
2105 2110 2115
Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val Phe Tyr Phe Ser Asp
2120 2125 2130
Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile Asp Asp Asn Tyr
2135 2140 2145
Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly Val Phe Asp
2150 2155 2160
Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Val Asn
2165 2170 2175
Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val Arg
2180 2185 2190
Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu
2195 2200 2205
Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr
2210 2215 2220
Phe Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile
2225 2230 2235
Asp Asp Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr
2240 2245 2250
Gly Leu Ile Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn
2255 2260 2265
Gly Glu Met Gln Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe
2270 2275 2280
Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr
2285 2290 2295
Pro Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu
2300 2305 2310
Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu
2315 2320 2325
Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr
2330 2335 2340
Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp
2345 2350 2355
Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu
2360 2365
<210> 784
<211> 7101
<212> DNA
<213> 艰难梭菌
<400> 784
atgagtttag ttaatagaaa acagttagaa aaaatggcaa atgtaagatt tcgtactcaa 60
gaagatgaat atgttgcaat attggatgct ttagaagaat atcataatat gtcagagaat 120
actgtagtcg aaaaatattt aaaattaaaa gatataaata gtttaacaga tatttatata 180
gatacatata aaaaatctgg tagaaataaa gccttaaaaa aatttaagga atatctagtt 240
acagaagtat tagagctaaa gaataataat ttaactccag ttgagaaaaa tttacatttt 300
gtttggattg gaggtcaaat aaatgacact gctattaatt atataaatca atggaaagat 360
gtaaatagtg attataatgt taatgttttt tatgatagta atgcattttt gataaacaca 420
ttgaaaaaaa ctgtagtaga atcagcaata aatgatacac ttgaatcatt tagagaaaac 480
ttaaatgacc ctagatttga ctataataaa ttcttcagaa aacgtatgga aataatttat 540
gataaacaga aaaatttcat aaactactat aaagctcaaa gagaagaaaa tcctgaactt 600
ataattgatg atattgtaaa gacatatctt tcaaatgagt attcaaagga gatagatgaa 660
cttaatacct atattgaaga atccttaaat aaaattacac agaatagtgg aaatgatgtt 720
agaaactttg aagaatttaa aaatggagag tcattcaact tatatgaaca agagttggta 780
gaaaggtgga atttagctgc tgcttctgac atattaagaa tatctgcatt aaaagaaatt 840
ggtggtatgt atttagatgt tgatatgtta ccaggaatac aaccagactt atttgagtct 900
atagagaaac ctagttcagt aacagtggat ttttgggaaa tgacaaagtt agaagctata 960
atgaaataca aagaatatat accagaatat acctcagaac attttgacat gttagacgaa 1020
gaagttcaaa gtagttttga atctgttcta gcttctaagt cagataaatc agaaatattc 1080
tcatcacttg gtgatatgga ggcatcacca ctagaagtta aaattgcatt taatagtaag 1140
ggtattataa atcaagggct aatttctgtg aaagactcat attgtagcaa tttaatagta 1200
aaacaaatcg agaatagata taaaatattg aataatagtt taaatccagc tattagcgag 1260
gataatgatt ttaatactac aacgaatacc tttattgata gtataatggc tgaagctaat 1320
gcagataatg gtagatttat gatggaacta ggaaagtatt taagagttgg tttcttccca 1380
gatgttaaaa ctactattaa cttaagtggc cctgaagcat atgcggcagc ttatcaagat 1440
ttattaatgt ttaaagaagg cagtatgaat atccatttga tagaagctga tttaagaaac 1500
tttgaaatct ctaaaactaa tatttctcaa tcaactgaac aagaaatggc tagcttatgg 1560
tcatttgacg atgcaagagc taaagctcaa tttgaagaat ataaaaggaa ttattttgaa 1620
ggttctcttg gtgaagatga taatcttgat ttttctcaaa atatagtagt tgacaaggag 1680
tatcttttag aaaaaatatc ttcattagca agaagttcag agagaggata tatacactat 1740
attgttcagt tacaaggaga taaaattagt tatgaagcag catgtaactt atttgcaaag 1800
actccttatg atagtgtact gtttcagaaa aatatagaag attcagaaat tgcatattat 1860
tataatcctg gagatggtga aatacaagaa atagacaagt ataaaattcc aagtataatt 1920
tctgatagac ctaagattaa attaacattt attggtcatg gtaaagatga atttaatact 1980
gatatatttg caggttttga tgtagattca ttatccacag aaatagaagc agcaatagat 2040
ttagctaaag aggatatttc tcctaagtca atagaaataa atttattagg atgtaatatg 2100
tttagctact ctatcaacgt agaggagact tatcctggaa aattattact taaagttaaa 2160
gataaaatat cagaattaat gccatctata agtcaagact ctattatagt aagtgcaaat 2220
caatatgaag ttagaataaa tagtgaagga agaagagaat tattggatca ttctggtgaa 2280
tggataaata aagaagaaag tattataaag gatatttcat caaaagaata tatatcattt 2340
aatcctaaag aaaataaaat tacagtaaaa tctaaaaatt tacctgagct atctacatta 2400
ttacaagaaa ttagaaataa ttctaattca agtgatattg aactagaaga aaaagtaatg 2460
ttaacagaat gtgagataaa tgttatttca aatatagata cgcaaattgt tgaggaaagg 2520
attgaagaag ctaagaattt aacttctgac tctattaatt atataaaaga tgaatttaaa 2580
ctaatagaat ctatttctga tgcactatgt gacttaaaac aacagaatga attagaagat 2640
tctcatttta tatcttttga ggacatatca gagactgatg agggatttag tataagattt 2700
attaataaag aaactggaga atctatattt gtagaaactg aaaaaacaat attctctgaa 2760
tatgctaatc atataactga agagatttct aagataaaag gtactatatt tgatactgta 2820
aatggtaagt tagtaaaaaa agtaaattta gatactacac acgaagtaaa tactttaaat 2880
gctgcatttt ttatacaatc attaatagaa tataatagtt ctaaagaatc tcttagtaat 2940
ttaagtgtag caatgaaagt ccaagtttac gctcaattat ttagtactgg tttaaatact 3000
attacagatg cagccaaagt tgttgaatta gtatcaactg cattagatga aactatagac 3060
ttacttccta cattatctga aggattacct ataattgcaa ctattataga tggtgtaagt 3120
ttaggtgcag caatcaaaga gctaagtgaa acgagtgacc cattattaag acaagaaata 3180
gaagctaaga taggtataat ggcagtaaat ttaacaacag ctacaactgc aatcattact 3240
tcatctttgg ggatagctag tggatttagt atacttttag ttcctttagc aggaatttca 3300
gcaggtatac caagcttagt aaacaatgaa cttgtacttc gagataaggc aacaaaggtt 3360
gtagattatt ttaaacatgt ttcattagtt gaaactgaag gagtatttac tttattagat 3420
gataaaataa tgatgccaca agatgattta gtgatatcag aaatagattt taataataat 3480
tcaatagttt taggtaaatg tgaaatctgg agaatggaag gtggttcagg tcatactgta 3540
actgatgata tagatcactt cttttcagca ccatcaataa catatagaga gccacactta 3600
tctatatatg acgtattgga agtacaaaaa gaagaacttg atttgtcaaa agatttaatg 3660
gtattaccta atgctccaaa tagagtattt gcttgggaaa caggatggac accaggttta 3720
agaagcttag aaaatgatgg cacaaaactg ttagaccgta taagagataa ctatgaaggt 3780
gagttttatt ggagatattt tgcttttata gctgatgctt taataacaac attaaaacca 3840
agatatgaag atactaatat aagaataaat ttagatagta atactagaag ttttatagtt 3900
ccaataataa ctacagaata tataagagaa aaattatcat attctttcta tggttcagga 3960
ggaacttatg cattgtctct ttctcaatat aatatgggta taaatataga attaagtgaa 4020
agtgatgttt ggattataga tgttgataat gttgtgagag atgtaactat agaatctgat 4080
aaaattaaaa aaggtgattt aatagaaggt attttatcta cactaagtat tgaagagaat 4140
aaaattatct taaatagcca tgagattaat ttttctggtg aggtaaatgg aagtaatgga 4200
tttgtttctt taacattttc aattttagaa ggaataaatg caattataga agttgattta 4260
ttatctaaat catataaatt acttatttct ggcgaattaa aaatattgat gttaaattca 4320
aatcatattc aacagaaaat agattatata ggattcaata gcgaattaca gaaaaatata 4380
ccatatagct ttgtagatag tgaaggaaaa gagaatggtt ttattaatgg ttcaacaaaa 4440
gaaggtttat ttgtatctga attacctgat gtagttctta taagtaaggt ttatatggat 4500
gatagtaagc cttcatttgg atattatagt aataatttga aagatgtcaa agttataact 4560
aaagataatg ttaatatatt aacaggttat tatcttaagg atgatataaa aatctctctt 4620
tctttgactc tacaagatga aaaaactata aagttaaata gtgtgcattt agatgaaagt 4680
ggagtagctg agattttgaa gttcatgaat agaaaaggta atacaaatac ttcagattct 4740
ttaatgagct ttttagaaag tatgaatata aaaagtattt tcgttaattt cttacaatct 4800
aatattaagt ttatattaga tgctaatttt ataataagtg gtactacttc tattggccaa 4860
tttgagttta tttgtgatga aaatgataat atacaaccat atttcattaa gtttaataca 4920
ctagaaacta attatacttt atatgtagga aatagacaaa atatgatagt ggaaccaaat 4980
tatgatttag atgattctgg agatatatct tcaactgtta tcaatttctc tcaaaagtat 5040
ctttatggaa tagacagttg tgttaataaa gttgtaattt caccaaatat ttatacagat 5100
gaaataaata taacgcctgt atatgaaaca aataatactt atccagaagt tattgtatta 5160
gatgcaaatt atataaatga aaaaataaat gttaatatca atgatctatc tatacgatat 5220
gtatggagta atgatggtaa tgattttatt cttatgtcaa ctagtgaaga aaataaggtg 5280
tcacaagtta aaataagatt cgttaatgtt tttaaagata agactttggc aaataagcta 5340
tcttttaact ttagtgataa acaagatgta cctgtaagtg aaataatctt atcatttaca 5400
ccttcatatt atgaggatgg attgattggc tatgatttgg gtctagtttc tttatataat 5460
gagaaatttt atattaataa ctttggaatg atggtatctg gattaatata tattaatgat 5520
tcattatatt attttaaacc accagtaaat aatttgataa ctggatttgt gactgtaggc 5580
gatgataaat actactttaa tccaattaat ggtggagctg cttcaattgg agagacaata 5640
attgatgaca aaaattatta tttcaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt 5700
acagaagatg gatttaaata ttttgcccca gctaatacac ttgatgaaaa cctagaagga 5760
gaagcaattg attttactgg aaaattaatt attgacgaaa atatttatta ttttgatgat 5820
aattatagag gagctgtaga atggaaagaa ttagatggtg aaatgcacta ttttagccca 5880
gaaacaggta aagcttttaa aggtctaaat caaataggtg attataaata ctatttcaat 5940
tctgatggag ttatgcaaaa aggatttgtt agtataaatg ataataaaca ctattttgat 6000
gattctggtg ttatgaaagt aggttacact gaaatagatg gcaagcattt ctactttgct 6060
gaaaacggag aaatgcaaat aggagtattt aatacagaag atggatttaa atattttgct 6120
catcataatg aagatttagg aaatgaagaa ggtgaagaaa tctcatattc tggtatatta 6180
aatttcaata ataaaattta ctattttgat gattcattta cagctgtagt tggatggaaa 6240
gatttagagg atggttcaaa gtattatttt gatgaagata cagcagaagc atatataggt 6300
ttgtcattaa taaatgatgg tcaatattat tttaatgatg atggaattat gcaagttgga 6360
tttgtcacta taaatgataa agtcttctac ttctctgact ctggaattat agaatctgga 6420
gtacaaaaca tagatgacaa ttatttctat atagatgata atggtatagt tcaaattggt 6480
gtatttgata cttcagatgg atataaatat tttgcacctg ctaatactgt aaatgataat 6540
atttacggac aagcagttga atatagtggt ttagttagag ttggtgaaga tgtatattat 6600
tttggagaaa catatacaat tgagactgga tggatatatg atatggaaaa tgaaagtgat 6660
aaatattatt tcaatccaga aactaaaaaa gcatgcaaag gtattaattt aattgatgat 6720
ataaaatatt attttgatga gaagggcata atgagaacgg gtcttatatc atttgaaaat 6780
aataattatt actttaatga gaatggtgaa atgcaatttg gttatataaa tatagaagat 6840
aagatgttct attttggtga agatggtgtc atgcagattg gagtatttaa tacaccagat 6900
ggatttaaat actttgcaca tcaaaatact ttggatgaga attttgaggg agaatcaata 6960
aactatactg gttggttaga tttagatgaa aagagatatt attttacaga tgaatatatt 7020
gcagcaactg gttcagttat tattgatggt gaggagtatt attttgatcc tgatacagct 7080
caattagtga ttagtgaata g 7101

Claims (35)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，
其中所述重链可变区包含3个互补决定区(CDR)：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别由SEQID NO:76、77和78中所示的氨基酸序列组成或分别由SEQ ID NO:206、77和78中所示的氨基酸序列组成，并且其中所述轻链可变区包含3个CDR：CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR分别由SEQID NO:68、69和70中所示的氨基酸序列组成，
其中所述抗体或其抗原结合部分特异性结合艰难梭菌毒素B。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重量可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:75、205、221或237。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述轻链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:67、197、213或229。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:75并且所述轻链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:67。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:205并且所述轻链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:197。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:221并且所述轻链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:213。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分,其中所述重链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:237并且所述轻链可变区包括氨基酸序列SEQ ID NO:229。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中结合至艰难梭菌毒素B的所述抗体或其抗原结合部分的解离常数(KD)小于1.9x10-9。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的或嵌合的。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分选自：(a)完整的免疫球蛋白分子；(b)scFv；(c)Fab片段；(d)F(ab')2；和(e)二硫键连接的Fv。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含选自(a)IgG恒定结构域、(b)IgA恒定结构域、(c)IgD恒定结构域和(d)IgE恒定结构域的至少一个恒定结构域。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合艰难梭菌毒素B的片段4。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其功能上连接于另一种分子。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述功能上连接的分子是抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药物试剂、介导与另一种分子缔合的蛋白质或肽、氨基酸接头、信号序列或免疫原性载体。
15.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中在体内毒素B攻击实验中，当在将哺乳动物暴露于大于75ng的艰难梭菌毒素B之前约24小时以在8mg/kg体重至13mg/kg体重范围的剂量向所述哺乳动物施用所述抗体或其抗原结合部分时，所述哺乳动物的存活概率在暴露于毒素B后4天内大于80％。
16.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中在25μg/ml至100μg/ml范围的浓度的所述抗体或其抗原结合部分在体外中和测定中中和大于40％的约5ng/ml的艰难梭菌毒素B。
17.一种核酸，其包括编码权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列。
18.一种细胞，其包含权利要求17所述的所述核酸。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
20.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
21.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞是COS-1细胞、COS-7细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、CHO细胞、BSC-1细胞、Hep G2细胞、HeLa细胞、Per.C6细胞、骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述骨髓瘤细胞是SP2/0细胞。
24.一种组合物，其包含根据权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分和至少一种药学上可接受的载体。
25.根据权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分或权利要求24所述的组合物在制造用于预防或治疗艰难梭菌相关疾病的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物的剂量包括有效量的抗体或其抗原结合部分。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分或组合物被配制用于经静脉内施用、皮下施用、肌内施用或经皮施用。
28.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物还包括第二试剂。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述第二试剂是抗生素。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述抗生素是万古霉素、甲硝唑或非达米星。
31.根据权利要求28所述的用途，其中所述第二试剂是结合艰难梭菌毒素A的抗体或其抗原结合部分。
32.一种试剂盒，其包括权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，进一步包括：使用说明；治疗剂；偶联剂；艰难梭菌完整毒素B、类毒素B、毒素B片段4或毒素B片段1中的一种或多种；或其药学上可接受的载体。
34.权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分在制造用于检测艰难梭菌毒素B的检测剂中的用途，其包括将怀疑或已知包含艰难梭菌毒素B的样品与检测剂接触，并且检测所述抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B的结合。
35.一种从样品中分离艰难梭菌毒素B的方法，其包括将包括或怀疑包括艰难梭菌毒素B的样品与权利要求1至16任一项所述的抗体或其抗原结合部分接触。
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